CN110787291A - 一种加强型佐剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种加强型佐剂，包括矿物油3:1羊毛脂（v/m），0.01%skl(m/v），1mg/ml灭活卡介苗，50微克/ml IL32γ活性蛋白，12%Tween80；降低了卡介苗的使用量，对免疫动物更安全；增加了IL32，增强了动物的免疫反应性，提高了抗体的得量；tween80降低了乳化难度，增强了乳化强度，使乳化变得更简单，使抗原在体内释放更科学，机体免疫反应时间更长4.SKL增加了抗原的活性存在率，使抗原最大程度的以活性蛋白状态被乳化，能提高抗体对抗原的特异性识别，提高抗体对抗原三维结构的识别率，抗原使用量减少。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种加强型佐剂。
背景技术
疫苗制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。疫苗制品不同于一般医用药品，它是通过刺激机体免疫系统，产生免疫物质（如抗体）才发挥其功效，在人体内出现体液免疫、细胞免疫或细胞介导免疫；它是人类对事物认识的深入和科技的进步所带来的产物，是人类抵御外界不利因素的威胁、提高健康质量的一大利器。从最早的10世纪时中国人发明的用于预防天花的人痘接种法，到现代微生物学、免疫学和分子生物及其他学科的发展而产生的灭活疫苗、减毒活疫苗、多肽疫苗、单克隆抗体等，人类已经在疫苗制品领域跨出了一大步。
然而随着疫苗制品的不断推广，其自然属性所造成应用局限性也不断的暴露出来。大多数疫苗制品在单独状态下，其半衰期都比较短，尤其是在温度的催化下，其半衰期更是随着温度的升高而直线下降。因而，大多数疫苗制品都需要一个合适的保存条件，以维持其稳定性，其中所处的液体环境对稳定性的维持更起着尤为关键的作用。而液体环境的酸碱度、离子强度以及其他一些维持稳定的成分（如一些糖类分子、氨基酸组分、酯类等）的加入都可能影响疫苗制品稳定周期，因此，寻找一个合适的制剂配方来保护疫苗制品在生产、储存、运输过程中的稳定性对于疫苗制品本身的应用与推广有着极为重要的意义。
同时，对于疫苗类的生物制品而言，其单一的有效成分在进行免疫提呈的过程中，受到各种生物途径的影响，使得其无法实现预期的免疫效果，因此需要一些可增强机体对疫苗抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的佐剂作为辅助。而目前最为常用的疫苗佐剂为氢氧化铝佐剂，此外还有脂多糖、细胞因子、明矾等。这些物质主要通过改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间；刺激单核吞噬细胞对抗原的提呈能力；刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力等机制来增强免疫应答。
例如常用的弗氏佐剂，其中，对灭活卡介苗的用量较多，由于该抗原的使用量较大，当注射到动物体内时，会在该动物体内病菌，对动物的生命健康安全造成危害。
发明内容
本发明提供一种加强型佐剂，旨在减少了抗原的使用量，对免疫动物更安全。
本发明是这样实现的，包括矿物油3:1羊毛脂（v/m），0.01%skl(m/v），1mg/ml灭活卡介苗，50微克/ml IL32γ活性蛋白，12%Tween80。
其中，所述IL32γ还包括IL32Beta，IL32Delta，IL32Alpha等6个不同的isform，氨基酸序列为：31Ala-234Arg。
其中碱基序列为：
TTCCCGAAGGTCCTCTCTGATGACATGAAGAAGCTGAAGGCCCGAATGGTAATGCTCCTCCCTACTTCTGCTCAGGGGTTGGGGGCCTGGGTCTCAGCGTGTGACACTGAGGACACTGTGGGACACCTGGGACCCTGGAGGGACAAGGATCCGGCCCTTTGGTGCCAACTCTGCCTCTCTTCACAGCACCAGGCCATAGAAAGATTTTATGATAAAATGCAAAATGCAGAATCAGGACGTGGACAGGTGATGTCGAGCCTGGCAGAGCTGGAGGACGACTTCAAAGAGGGCTACCTGGAGACAGTGGCGGCTTATTATGAGGAGCAGCACCCAGAGCTCACTCCTCTACTTGAAAAAGAAAGAGATGGATTACGGTGCCGAGGCAACAGATCCCCTGTCCCGGATGTTGAGGATCCCGCAACCGAGGAGCCTGGGGAGAGCTTTTGTGACAAGGTCATGAGATGGTTCCAGGCCATGCTGCAGCGGCTGCAGACCTGGTGGCACGGGGTTCTGGCCTGGGTGAAGGAGAAGGTGGTGGCCCTGGTCCATGCAGTGCAGGCCCTCTGGAAACAGTTCCAGAGTTTCTGCTGCTCTCTGTCAGAGCTCTTCATGTCCTCTTTCCAGTCCTACGGAGCCCCACGGGGGGACAAGGAGGAGCTGACACCCCAGAAGTGCTCTGAACCCCAATCCTCAAAATGA
选择重组表达系统为Ecoli表达系统，Ecoli内部存在密码子偏好性，所以根据密码子优化工具JCat
优化密码子，结果为：
GCTTGGGTTTCTGCTTGCGACACCGAAGACACCGTTGGTCACCTGGGTCC；
GTGGCGTGACAAAGACCCGGCTCTGTGGTGCCAGCTGTGCCTGTCTTCTC；
AGCACCAGGCTATCGAACGTTTCTACGACAAAATGCAGAACGCTGAATCT；
GGTCGTGGTCAGGTTATGTCTTCTCTGGCTGAACTGGAAGACGACTTCAA；
AGAAGGTTACCTGGAAACCGTTGCTGCTTACTACGAAGAACAGCACCCGG；
AACTGACCCCGCTGCTGGAAAAAGAACGTGACGGTCTGCGTTGCCGTGGT；
AACCGTTCTCCGGTTCCGGACGTTGAAGACCCGGCTACCGAAGAACCGGG
TGAATCTTTCTGCGACAAAGTTATGCGTTGGTTCCAGGCTATGCTGCAG；
GTCTGCAGACCTGGTGGCACGGTGTTCTGGCTTGGGTTAAAGAAAAAGTT；
GTTGCTCTGGTTCACGCTGTTCAGGCTCTGTGGAAACAGTTCCAGTCTTT；
CTGCTGCTCTCTGTCTGAACTGTTCATGTCTTCTTTCCAGTCTTACGGTG；
CTCCGCGTGGTGACAAAGAAGAACTGACCCCGCAGAAATGCTCTGAACCG；
CAGTCTTCTAAATAA（615BP，23.4KD）。
基因合成，构建到Pet28a载体的MCS中带有IL32基因的载体Pet28a-IL32转化到感受态BL21（DE3）中，卡纳青霉素培养基挑取阳性克隆，IPTG诱导IL32表达，经金属离子亲和纯化，得到纯度≥95%的蛋白，然后做细胞活性试验，检测IL32蛋白活性，使用有活性的IL32用于研发新的增强型免疫佐剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种加强型佐剂，降低了卡介苗的使用量，对免疫动物更安全；增加了IL32，增强了动物的免疫反应性，提高了抗体的得量；tween80降低了乳化难度，增强了乳化强度，使乳化变得更简单，使抗原在体内释放更科学，机体免疫反应时间更长4.SKL增加了抗原的活性存在率，使抗原最大程度的以活性蛋白状态被乳化，能提高抗体对抗原的特异性识别，提高抗体对抗原三维结构的识别率，抗原使用量减少（对珍贵抗原特别重要）；
总之，提高了佐剂的安全性，减少了抗原使用量，降低了乳化的难度、提高了乳化成功率，减少了佐剂对抗原的损伤，使抗原保持自由三维结构，增强了抗体对抗原三维立体结构的特异性识别率，增强了抗体的特异性。
附图说明
图1为本发明Pet28a-IL32质粒NheI、XhoI双酶切结果图；
图2为本发明的细胞培养图；
图3为本发明的免疫效价对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：包括矿物油3:1羊毛脂（v/m），0.01%skl(m/v），1mg/ml灭活卡介苗，50微克/ml IL32γ活性蛋白，12%Tween80。
进一步的，所述IL32γ还包括IL32Beta，IL32Delta，IL32Alpha等6个不同的isform，氨基酸序列为：31Ala-234Arg。
在本实施方式中，白细胞介素32γ（IL-32γ）是一种白细胞介素，是免疫系统中的一种细胞因子信号分子。IL-32γ主要通过其对T细胞的直接作用在免疫系统、耐受性和免疫的关键功能中发挥重要作用。在胸腺中，T细胞成熟时，它通过促进某些未成熟T细胞分化为调节性T细胞来抑制自身免疫性疾病，从而抑制其他T细胞，否则这些T细胞被激活攻击身体中的正常健康细胞。当初始T细胞也被抗原刺激时，IL-32γ也促进T细胞向效应T细胞分化并进入记忆T细胞，从而帮助机体抵抗感染。为了测量IL-32γ对细胞增殖的影响，将CTLL-2细胞接种到96孔板的三重威尔斯中，密度为2000细胞/孔，2%血清标准1640含有不同浓度的重组人IL-32γ。孵育96h后，倒置显微镜观察细胞，用细胞计数KIT-8（CCK-8）测定细胞增殖情况。简单地，将10克L的CCK-8溶液加入到板的每个孔中，然后在37℃培养板1-4小时后用微板读数仪测量450 nm处的吸光度。倒置显微镜观察IL-32γ孵育96h后CTLL-2细胞的增殖情况。用重组人IL-32γ孵育96h后，用CCK-8法检测细胞活力，结果显示在图2中。IL-32γ明显增加CTLL-2细胞的存活率。
如图3，为本实施方式的免疫效价对比图，其中，特异性对比如下：
抗原乳化及免疫过程：
（1）抗原乳化：
初次免疫选用弗氏完全佐剂，后续免疫则选用弗氏不完全佐剂。于-20℃取一管待免疫抗原蛋白，于冰盒或碎冰上解冻，根据免疫剂量（兔一次0.8 mg，大鼠一次0.2 mg，小鼠一次0.1 mg）取至EP管中并加入等体积佐剂，于银汞调和器震荡乳化，乳化时间设置为40 s。乳化完全特征为整体呈乳白色，取乳化抗原滴一滴至冷水中油滴不扩散）。如乳化效果不好则再次乳化40 s直至乳化完全为止。乳化好的抗原保存于4 ℃，一天内完成免疫过程。乳化完成后将抗原吸入1 mL无菌注射器中，并于标签上标明“项目号”及“免疫序列号”，以此作为后续抗血清及抗体信息查找凭据。
（2）免疫（皮下）：
新西兰大白兔：兔免疫剂量为0.8 mg/次，乳化后免疫总量约为600-800 μL，于背部两侧每间隔4cm免疫一点，采取皮下免疫6-8个点，每点100μL。每次免疫完后间隔两周再次免疫。
小鼠：免疫剂量为0.1mg/次，乳化后免疫总量约为120-160μL，于小鼠背部免疫，首次免疫后间隔2周进行加强免疫，后续免疫间隔为1周。
大鼠：免疫剂量为0.2mg/次，乳化后免疫总量约为240-320μL，于大鼠背部免疫，首次免疫后间隔2周进行加强免疫，后续免疫间隔为1周。
此外，还包括感受态制作过程和蛋白纯化过程，如下：
感受态制作过程：从固体平板上挑取E.coliBL21单菌落接种到灭过菌的盛有5mLLB液体培养基的样品瓶中，在37℃条件下，220rpm振荡培养8~10h。
500μL菌液接种到50mLLB培养基中，37℃、22rpm振荡培养至OD600=0.4~0.6。
菌液分装到预冷的灭过菌的1.5mLEP中，12，000g，4℃离心2min，弃上清，吸尽残余液体。
每管加入800μL预冷的MgCl2/CaCl2混合溶液（80mM/20mM）悬浮细胞，12，000rmp，4℃离心2min（分钟），弃上清，吸尽残液。
每管加入100μL预冷的100mMCaCl2溶液（含20%甘油）悬浮细胞，得到大肠杆菌感受态细胞。
其中，注意事项为：
制备大量感受态细胞时，可按上述体积等比例扩大，制备好的感受态细胞按100μL/管分装到预冷的已灭菌的1.5mL离心管中-70℃保存（6个月内）。
刚制备好的大肠杆菌感受态细胞置于4℃或冰浴中保存12~24h，转化效率会增加4~6倍。
转化过程如下：取100微升冰上融化的BL21(DE3）感受态，加入目的质粒轻轻混匀，冰上放置30min
42℃水浴热激45s，迅速放到冰上并放置2min，晃动会降低转化率
向离心管中加入700微升无抗性的LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min
5000rpm离心1min收菌，留取100微升左右上清，轻轻吹打重悬菌体，并涂布在含有卡那霉素抗性的LB培养板上，37℃培养过夜。
表达过程如下：平板上保存的菌株从平板上挑取含重组质粒的单菌落，接种于含抗性的5mLLB培养基中，37℃过夜培养。
500μL菌液接种到含相应抗性的50mLLB培养基中，37℃培养至OD600=0.6～0.8之间。
在无菌操作台中取1mL菌液加入已灭菌的2mLEP中作为未诱导对照。剩余菌液中加入IPTG储存液至IPTG终浓度0.5mM，诱导和未诱导菌液按下列条件培养：
pET载体表达：30℃培养5h以上；
pCold载体表达：15℃培养12h以上。
保种管保存的菌株
从-80℃冰箱取出一管目的菌株保种管，迅速插入盛满冰的冰盒中复融，复融后接种于含抗性的5mLLB培养基中，置于37℃摇床12h。
按1/100的体积量接种于待盛LB培养基的摇瓶中，在37℃摇床中培养至OD600=0.6左右。
在无菌操作台中取1mL菌液加入已灭菌的2mLEP中作为未诱导对照。剩余菌液中加入IPTG储存液至IPTG终浓度0.5mM，诱导和未诱导菌液按下列条件培养：pET载体表达：37℃培养5h以上。
蛋白纯化过程如下：无水乙醇
0.5MNaOH
StockSolutionA（贮备液A）(10X)：
29.3gNaCl和2.76gNaH2PO4溶于90mL的去离子水中，完全溶解后调100mL
StockSolutionB（贮备液B）(10X)：
2.84gNa2HPO4和29.3gNaCl溶于90mL的去离子水中，完全溶解后100mL
5XNativePurificationBuffer（天然纯化缓冲液）：
配制200mL的溶液取180mL的无菌去离子水，称量7gNaH2PO4和29.2gNaCl完全溶，用NaOH调至pH8.0，加水至200mL，室温保存。
3MImidazolepH6.0（咪唑）：
配制100ml的溶液，取85ml的无菌去离子，加Imidazole（咪唑）20.6g，StockSolutionA（贮备液A）(10X)8.77mL，StockSolutionB（贮备液B）(10X)1.23ml，混匀用HCl或NaOH调pH至6.0，加水至100ml。室温保存。
1XNativePurificationBuffer：（1X天然纯化缓冲液）：
100ml1XNativePurificationBuffer，（100ML1X天然纯化缓冲液）配制方法:80ml无菌蒸馏水20mLof5XNativePurificationBuffer（20毫升5X天然纯化缓冲液）混匀，NaOH或HCl.调PH至8.0
BindingBuffer：（绑定缓冲器）
即1XNativePurificationBuffer1X（天然纯化缓冲液）
WashBuffer：洗涤缓冲液
50mlof1XNativePurificationBuffer50毫升（1X天然纯化缓冲液），335μlof3MImidazole，pH6.0，335μm3（咪唑），pH值6.0混匀，NaOH或HCl.调PH至8.0
ElutionBuffer（洗脱缓冲液）：
13.75mLof1XNativePurificationBuffer（天然纯化缓冲液），1.25mlof3MImidazole（咪唑），pH6.0，混匀，NaOH或HCl.调PH至8.0。
细胞裂解：
一定体积细菌培养液转入50mL离心管5000rpm，离心5min收集细胞，弃上清，加入XmLBindingBuffer（绑定缓冲器），重悬细胞；
50ml离心管插入盛满冰的烧杯中，在450w的条件下声破碎，超声1s，停3s，共15min，重复一次操作，破碎完后取40μL裂解液备用（记为样1）；
破碎后的菌液12，000rpm离心30min，上清转移到新的50ml离心管中，取上清液40μL（样2）和少量下沉沉淀（样3）备用；
样1、样2和样3做SDS-PAGE分析，其余的-20℃保存。
纯化：
缓慢颠倒瓶中Ni-NTAAgarose（琼脂糖）10次；
吸取3mL树脂加入10mL纯化柱中，树脂自然沉淀5–10minutes（分钟）；
无菌蒸馏水洗柱3-5个柱体积；
BindingBuffer（绑定缓冲器）绑定缓冲器洗柱3-5个柱体积；
上样目的蛋白量低于70mg的样品液（流穿液保存在4℃冰箱，取样跑胶分析）；
WashBuffer（洗涤缓冲液）洗柱3-5个柱体积（流出液保存在4℃冰箱，取样跑胶分析）；
ElutionBuffer（洗脱缓冲液）洗脱目的蛋白；
从洗脱开始，每0.5mL接一管，直到无蛋白洗脱出来；
0.5MNaOH洗柱3-5个柱体积；
无菌蒸馏水洗柱3-5个柱体积；
20%乙醇洗柱3个柱体积，用超出填料2cm20%乙醇浸泡填料，2-8℃储藏。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种加强型佐剂，其特征在于，包括矿物油3:1羊毛脂（v/m），0.01%skl(m/v），1mg/ml灭活卡介苗，50微克/ml IL32γ活性蛋白，12%Tween80。
2.如权利要求1所述的一种加强型佐剂，其特征在于，所述IL32γ还包括IL32Beta，IL32Delta，IL32Alpha等6个不同的isform，氨基酸序列为：31Ala-234Arg。
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| CN104667272A (zh) * | 2015-01-22 | 2015-06-03 | 宿迁恒瑞生物科技有限公司 | 一种动物免疫佐剂及其制备方法和使用方法 |
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2018
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