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CN110785494B - 用于生产生物制品的通用自调节哺乳动物细胞系平台 - Google Patents

用于生产生物制品的通用自调节哺乳动物细胞系平台 Download PDF

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CN110785494B CN201880040140.8A CN201880040140A CN110785494B CN 110785494 B CN110785494 B CN 110785494B CN 201880040140 A CN201880040140 A CN 201880040140A CN 110785494 B CN110785494 B CN 110785494B
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Abstract

公开了利用阻遏物多肽响应条件变化降低外源治疗性多肽编码基因的转录速率的方法、遗传控制回路和细胞。

Description

用于生产生物制品的通用自调节哺乳动物细胞系平台
相关申请
本申请要求2017年6月16日提交的美国序列号：62/521,005的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
发明领域
本发明涉及用于调节产物(例如重组蛋白)表达的方法和组合物，通过利用对细胞应激有响应的遗传控制回路的细胞和细胞系实现上述调节。
背景技术
重组治疗蛋白通常在细胞表达系统(例如哺乳动物细胞表达系统)中表达。2014年，市场批准的生物药物总数为212，而FDA批准投放市场的治疗产品中有56％是在哺乳动物细胞系中生产的。但是，与生产相关的高成本导致全球健康成本增加。
此外，下一代蛋白质生物制品(NGB)，如下一代融合蛋白、多聚糖蛋白或下一代抗体，通常具有复杂和/或非天然结构，并且被证明比分子(例如单克隆抗体)更难表达。当前的宿主细胞系没有进化出用于高效合成和分泌NGB的途径，从而导致生长显著降低，生产率降低，并常导致产品质量(PQ)属性较差。因此，这些NGB被认为难以表达，其生产率和产品质量无法满足临床和市场需求。因此，越来越需要在保持最终产品质量的同时快速、高效和高成本效益地开发和生产重组生物治疗剂。
当前用于利用哺乳动物细胞系合成重组蛋白的基因表达系统具有组成性活性，并且指导重组蛋白产物基因的转录，与细胞培养条件或宿主细胞的代谢无关。此类系统无法使产物基因转录与宿主细胞系的细胞内状态协调，例如对于内源宿主细胞蛋白的情况而发生，导致细胞应激和不良的产物结果，特别是对于NGB。随着NGB将我们当前的细胞系和基因表达系统推向极限，需要更好地协调重组蛋白产物基因的转录与宿主细胞的整体代谢。这将有助于降低细胞应激水平，并更好地利用我们的哺乳动物细胞工厂的现有能力来生产高水平的具有正确产品质量属性(例如糖基化概况，正确折叠结构等)的产品。
当哺乳动物宿主细胞系被约束以组成性地合成高水平的重组蛋白产物，尤其是NGB或难以表达的蛋白质时，被称为未折叠蛋白质应答(UPR)的细胞应激途径将被错误折叠的蛋白质的积累活化。这导致蛋白质翻译普遍全局化下降，使细胞有足够时间正确加工并折叠当前的蛋白质负载。这种应激反应的活化不仅抑制重组蛋白产物的总产量，而且抑制期望的PQ概况。
发明概述
一方面，本公开的特征在于一种遗传控制回路，其利用阻遏物多肽(例如，缺乏核酸酶活性的Cas9蛋白的一种形式(dCas9)(来自CRISPR-Cas9基因编辑系统))，响应条件变化(例如，细胞应激的增加)，降低外源治疗性多肽编码基因的转录速率。响应条件变化，条件依赖性基因启动子增加了阻遏物多肽基因的转录速率。产生的阻遏物多肽结合至外源治疗性多肽编码基因或结合至与外源性治疗性多肽编码基因操作性地连接的控制元件。在一些实施方式中，在阻遏物多肽包含Cas9的一种形式的情况中，阻遏物多肽结合至外源治疗性多肽编码基因或结合至与外源治疗性多肽编码基因操作性地连接的控制元件，这归因于至少一种指导RNA(gRNA)与外源治疗性多肽编码基因(或与之操作性地连接的控制元件)同源性共表达。当阻遏物多肽结合至外源治疗性多肽编码基因或与其操作性地连接的控制元件时，外源治疗性多肽编码基因的转录速率降低，导致治疗性多肽的胞内mRNA拷贝数减少。在一些实施方式中，条件的改变是细胞应激的改变，例如细胞应激的增加或从未应激状态到应激状态的转变，并且细胞应激的改变是哺乳动物UPR的活化，尽管其它细胞应激反应也适用于此。在一个实施方式中，在hCMV启动子的控制下转录外源治疗性多肽编码基因，尽管也可以使用其它启动子(例如mCMV和杂合CMV启动子)。通过降低外源治疗性多肽编码基因转录的速率，宿主细胞上外源治疗性多肽的生物合成负荷降低，由此减轻了初始细胞应激反应。通过这种方式，宿主细胞系可以自调节重组蛋白产物基因的转录速率，并且避免了初始细胞应激反应的延长的活化。一旦缓解了初始应激反应，外源治疗性多肽的转录速率就会随着时间的推移而去阻遏。随着时间的推移，这可能导致重组蛋白产量的整体增加，因为细胞可以最佳方式协调重组基因的表达与细胞的整体生理状态，从而更好地利用细胞生物合成能力。
一方面，本公开的特征在于遗传控制回路，其包括：第一控制元件，例如第一启动子元件，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和第二控制元件，例如第二启动子元件，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在下，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，遗传控制回路还任选地包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本公开的特征在于一种细胞，例如CHO细胞，其包含：第一控制元件，例第一启动子，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，且在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在下，治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，细胞还任选地包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。在一些实施方式中，细胞还任选地包括第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或更多控制元件。在一个实施方式中，通过使用本文公开的方法控制途径中的单个节点来控制整个信号转导途径。在一些实施方式中，整个信号转导途径是通过控制信号转导途径的多个代谢分支来控制的，例如通过使用不同的启动子来调节该途径的不同序列。因此，本发明的方法提供了自调节细胞(self-regulating cell)中的几层控制。例如，翻译延伸起始因子是可以控制多个途径的整体节点的一个例子。或者，局部节点的示例是编码半乳糖基转移酶的基因，其将半乳糖残基添加至重组抗体重链多肽的Asn297附连的聚糖，并且是用半乳糖和唾液酸残基生成N-聚糖所必需的。
一方面，本公开的特征在于一种细胞，例如CHO细胞，其包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至插入位点例如限制性位点或SSI位点；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，该插入位点适合于插入编码外源治疗性多肽的序列，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件下存在时，治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，细胞还任选地包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本发明公开了一种用于表达治疗性多肽的试剂盒，该试剂盒包含细胞，例如CHO细胞，其包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在下，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，细胞还任选地包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本发明公开了一种用于表达治疗性多肽的试剂盒，该试剂盒包含细胞，例如CHO细胞，其包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至插入位点例如限制性位点或SSI位点；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，该插入位点适合于插入编码外源治疗性多肽的序列，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，细胞还任选地包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本发明公开了一种用于表达治疗性多肽的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种核酸，其包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在下，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，所述试剂盒还任选包含核酸，该核酸包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本公开的特征在于一种用于表达治疗性多肽的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种核酸，所述核酸包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至插入位点例如限制性位点；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，该插入位点适于插入编码外源治疗性多肽的序列，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，所述试剂盒还任选包含核酸，该核酸包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本公开特征在于一种制备治疗性多肽的方法，该方法包括：a)获得细胞，例如CHO细胞，其包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低，和b)在允许制备该治疗性多肽的条件下培养所述细胞，由此制备治疗性多肽。在一些实施方式中，a)的细胞还任选地包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本公开的特征在于一种制备治疗性多肽的方法，所述方法包括：a)获得细胞，例如CHO细胞；b)在所述细胞中形成或提供编码第一控制元件(例如第一启动子)的第一核酸序列，所述第一控制元件操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和c)在所述细胞中形成或提供编码第二控制元件(例如第二启动子)的第二核酸，所述第二控制元件操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低；和d)在允许制备治疗性多肽的条件下培养细胞，由此制备治疗性多肽。在一些实施方式中，该方法进一步任选地包括c)和d)之间的另一步骤，包括：在细胞中形成或提供编码第三控制元件(例如第三启动子)的第三核酸，所述第三控制元件操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本公开特征在于一种制备治疗性多肽的方法，其包括：a)获得细胞，例如CHO细胞；b)在细胞中形成或提供编码第一控制元件(例如第一启动子)的第一核酸序列，所述第一控制元件操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；c)在细胞中形成或提供编码第二控制元件(例如第二启动子)的第二核酸，所述第二控制元件操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和任选地d)在细胞中形成或提供编码第三控制元件的第三核酸，所述第三控制元件操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列，其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低；和e)在允许制备治疗性多肽的条件下培养细胞，由此制备治疗性多肽。在实施方式中，步骤a-d可以任何顺序执行。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本公开的特征在于一种核酸，其包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，所述核酸还任选地包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本公开的特征在于一种核酸，其包含：第一控制元件，例如第一启动子，其操作性地连接至插入位点例如限制性位点；和第二控制元件，例如第二启动子，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，该插入位点适于插入编码外源治疗性多肽的序列，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低。在一些实施方式中，所述核酸还包含第三控制元件，例如第三启动子，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)gRNA的序列。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本发明公开内容的特征在于一种制备本公开的细胞的方法，其包括：a)在所述细胞中形成或提供编码第一控制元件(例如第一启动子)的第一核酸序列，所述第一控制元件操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和b)在所述细胞中形成或提供编码编码第二控制元件(例如第二启动子)的第二核酸，所述第二控制元件操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，该治疗性多肽的表达被调节，例如降低或增加，由此制备所述细胞。在一些实施方式中，该方法还包括步骤c)，包括：在所述细胞中形成或提供编码第三控制元件(例如第三启动子)的第三核酸序列，所述第三控制元件操作性地连接至编码一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、8、10或更多个)gRNA的序列。在实施方式中，步骤a-c可以任何顺序执行。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本发明公开的特征在于一种使细胞能够产生经济上提高的多肽(例如，具有期望产物质量性质的外源治疗性多肽)产量的方法，包括：a)在所述细胞中形成或提供编码第一控制元件(例如第一启动子)的第一核酸序列，所述第一控制元件操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和b)在所述细胞中形成或提供编码第二控制元件(例如第二启动子)的第二核酸，所述第二控制元件操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，所述治疗性多肽的表达被调节，例如降低或增加，由此使所述细胞能够产生经济上提高的多肽(例如具有期望产物质量性质的外源治疗性多肽)产量。在一些实施方式中，该方法还包括步骤c)，包括：在所述细胞中形成或提供编码编码第三控制元件(例如第三启动子)的第三核酸序列，所述第三控制元件操作性地连接至编码一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、8、10或更多个)gRNA的序列。在实施方式中，步骤a-c可以任何顺序执行。在一些实施方式中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
一方面，本发明公开的特征在于一种细胞，其包含：选自表5的第一控制元件，其操作性地连接至编码选自表1-4的外源治疗性多肽的序列；选自表6的第二控制元件，其操作性地连接至编码Cas9(aCas9)多肽的序列；和，组成型表达的一个或多个gRNA序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，调节治疗性多肽的表达。
一方面，本发明公开的特征在于本文所述的多个细胞，其中一个或多个细胞包含第一条件，并且一个或多个细胞包含第二条件。
附图简要说明
图1A，1B，1C和1D显示了遗传控制回路的设计原理的示意图，所述遗传控制回路响应于某一条件(例如细胞应激)来调节重组或治疗性多肽产物基因的转录。在图1A中，重组蛋白的产生诱导应激/毒性，这激活了阻遏物的生成，由此引起对重组或治疗性多肽表达的直接抑制。在图1B中，在1A中对重组或治疗性多肽表达的这种抑制最终消除了应激/毒性，消除了阻遏物的活化，并间接导致重组或治疗性多肽表达的被动增加。实际上，该系统可能导致重组或治疗性多肽表达在特定水平附近发生暂时性振荡，该特定水平在宿主细胞中诱导应激/毒性(图1C)。可将其它任选的控制层施用于该基础回路，包括重组或治疗性多肽表达的正向活化剂，一旦细胞应激/毒性得到缓解，该活化剂便具有活性(图1D)。
图2描绘了示例性遗传控制回路，显示由第一控制元件(例如第一启动子元件，例如hCMV启动子)驱动的重组或治疗性多肽(rP)转录，其在不存在阻遏物多肽(例如dCas9)的情况下是组成性的，其由第二控制元件(例如第二启动子元件，例如未折叠蛋白质应答(UPR)活化的启动子)控制。在该示例中，在UPR活化(其可能在合成rP时发生)时产生阻遏物多肽(例如dCas9)。与gRNA联用，dCas9结合至hCMV启动子并抑制rP产生，直到UPR应激反应缓解。
图3A描绘了遗传控制回路，显示由第一控制元件(例如第一启动子元件，例如hCMV启动子)驱动的GFP转录，其在不存在阻遏物多肽(例如dCas9)的情况下是组成性的，其受第二控制元件(例如第二启动子元件，例如组成型mCMV启动子)控制。在该示例中，组成型表达的dCas9与gRNA 1、2或3(对hCMV具有特异性并由U6启动子组成型地产生)组合以结合hCMV启动子并抑制GFP表达。图3B描绘了流式细胞术直方图，显示稳定表达hCMV-eGFP的CHO细胞的GFP荧光，其中CHO细胞用以下物质转染：1)空表达载体(UTC)，2)编码dCas9的表达载体或3)编码dCas9的表达载体和编码对hCMV具有特异性的三个gRNA的表达载体。
图4A描绘了遗传控制回路，显示由两个单独的第一控制元件(例如，第一启动子元件，例如，hCMV启动子)驱动的Mab HC和Mab LC转录，其在不存在阻遏物多肽(例如dCas9)的情况下是组成型的，其受第二控制元件(例如第二启动子元件，例如mCMV组成型启动子)控制。在该示例中，组成型表达的dCas9与gRNA 1、2或3(对hCMV具有特异并由U6启动子组成型地产生)组合以结合hCMV启动子并抑制Mab HC和Mab LC表达。图4B的图描绘了转染后3、4或5天，CHO细胞的hCMV-Mab水平，该细胞瞬时转染了：无DNA、编码dCas9的表达载体，或编码dCas9和对hCMV具有特异性的1、2、3个gRNA的表达载体。
图5A描绘了遗传控制回路，显示由第一控制元件(例如第一启动子元件，例如hCMV启动子)驱动的GFP转录，其在不存在阻遏物多肽(例如dCas9)的情况下是组成性的，其受第二控制元件(例如第二启动子元件，例如未折叠蛋白质应答(UPR)应激诱导型Grp78启动子)控制。在该示例中，UPR应激促进dCas9表达，其与gRNA 1、2或3(对hCMV具有特异性且从U6启动子组成型地产生)组合以结合hCMV启动子并抑制GFP表达。图5B描绘了流式细胞术数据的图，显示稳定表达hCMV-eGFP的CHO细胞的GFP荧光，其中CHO细胞已经用1)空表达载体(WT)，2)编码在Grp78启动子下dCas9的表达载体(Grp78 dCas9控制)，或3)编码在Grp78启动子下dCas9的表达载体和编码对hCMV启动子有特异性的gRNA的表达载体瞬时转染，并且其中CHO细胞用400ng/mL衣霉素(TM)处理或未用TM(0TM)处理。
图6A-6C显示遗传控制回路对CHO宿主细胞系中瞬时重组蛋白表达的影响。图6A显示表达载体上包含的遗传控制回路，其中dCas9基因在Grp78启动子下，并且对hCMV启动子具有特异性的三个gRNA序列(gRNA 1、2和3)分别位于分开的组成型U6启动子下(gRNA123回路)。该载体的变体包含gRNA14序列，代替gRNA 1、2和3序列(sgRNA14回路)。图6B显示用编码几种难以表达的重组蛋白的表达载体瞬时转染后，由含有控制回路的稳定CHO库产生的重组蛋白浓度。在瞬时转染后6天测定重组蛋白的浓度。亲代CHO细胞系缺乏遗传控制回路。误差线表示所有数据点的三重复转染的标准偏差，除了用博纳吐单抗(blinatumomab)载体转染亲代细胞系外，其设双重复进行。图6C显示在用编码高度聚集的Mab H9K7的表达载体瞬时转染后，包含控制回路的稳定CHO库在第6天产生的重组蛋白浓度。转染后24小时，用0.1μg/mL浓度的UPR诱导剂衣霉素(TM)处理一半的瞬时转染培养瓶。误差线表示三重复转染的标准偏差。
图7A和7B显示由用编码几种难以表达的重组蛋白的表达载体瞬时转染(如图6A-6C所述)之后，包含控制回路的稳定CHO库合成的蛋白质的重组蛋白聚集水平。重组蛋白聚集水平由细胞培养物上清液样品通过寡聚物检测试验(ODA)确定，如Obrezanova等.MAbs.2015；7(2):352-63所述。使用该试验法，蛋白质聚集的减少以450nm处的吸光度的减少表示。图7A显示图6B中进行了浓度试验的细胞培养物上清液样品的聚集数据，图7B显示图6C中进行了浓度试验的细胞培养物上清液样品的聚集数据。
发明详述
定义
本文引用的各专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。尽管已经参考特定方面公开了本发明，但是显然，本领域的其它技术人员可在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计出本发明的其它方面和变化形式。所附权利要求旨在解释为包括所有这样的方面和等同变化形式。
除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。标题、小标题或带编号或字母的元素(例如(a)，(b)，(i)等)仅出于阅读目的而提供。在本文中使用标题或带编号或字母的元素不需要步骤或元素按字母顺序执行，或步骤或元素必须彼此分离。本发明的其它特征、目的和优势将通过说明、附图以及权利要求书得以清楚展现。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不是限制性的目的。
本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例来说，“一种/个细胞”可以表示一种/个细胞或多于一种/个细胞。
如本文所使用的，术语“遗传控制回路”是指基因表达元件(例如蛋白质编码序列，控制元件或启动子元件)的排列，其中遗传控制回路包含编码重组或治疗性多肽产物的至少一种蛋白质编码序列，并且其中所述遗传控制回路包含以条件依赖性方式调节重组或治疗性多肽产物的表达的其它基因表达元件。在一个实施方式中，遗传控制回路可包含，代替编码重组或治疗性多肽产物编码序列的至少一种蛋白质，合适的插入位点(例如限制位点、重组靶位点，或着陆坪(landing pad))，用于插入一种或多种蛋白质编码序列。在一些实施方式中，遗传控制回路可包含单个核酸分子的连续部分，单个核酸分子的多个离散部分，或分布在多于一个核酸分子上。
本文中所用术语“控制元件”指适于调节(例如，增加或减少)编码序列(例如基因)表达的核酸。调节元件可包含启动子序列，增强子序列或启动子和增强子序列两者。控制元件可以包含连续的核酸序列，不连续的核酸序列(被其它编码或非编码核酸序列打断的序列)或两者。单个控制元件可以包含在单个核酸或多于一个核酸上。在一个实施方式中，控制元件可包含编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的序列5'或3'。在一个实施方式中，控制元件可包含基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子中的序列。在一个实施方式中，控制元件可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的5'或3'序列中。在一个实施方式中，控制元件可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)内。在一个实施方式中，控制元件可以部分或全部包含在基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子内。在一个实施方式中，单个控制元件可包含核酸序列，该核酸序列i)在基因(例如，编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的近端(例如，邻近于或包含在其中)，或ii)在基因(例如，编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的远端(例如，被10或更多，100或更多，1000或更多或10,000或更多的碱基隔开，或置于不同且分开的核酸上)。
如本文所用，术语“启动子元件”是指具有来自天然产生或工程改造的启动子的足够序列的序列，从而将编码序列操作性地连接至启动子元件导致编码序列的表达。例如，巨细胞病毒(CMV)启动子元件包含CMV启动子的全部或活性片段，例如CMV启动子的全部或活性片段，包括任选的内含子A和/或UTR序列。在一个实施方式中，CMV启动子元件与天然产生或经工程改造的变体CMV启动子的差异不超过5、10、20、30、50或100个核苷酸。在一个实施方式中，CMV启动子元件与天然产生或工程改造的CMV启动子的核苷酸差异不超过1、5、10或50％。经工程改造的启动子是包含合成(非天然产生)序列的启动子。在一个实施方式中，经工程改造的启动子包含天然产生的转录调节元件的非天然产生的重排(例如，如Brown等，Biotechnology and Bioengineering，第111卷，第8期，2014年8月中所述)。在一个实施方式中，用于本公开细胞、核酸和方法中的启动子元件具有来自工程改造启动子(例如，包含合成(非天然产生)序列的启动子)的足够序列，其将编码序列操作性地连接至启动子元件，导致编码序列的表达。如本文所用，启动子元件可以是组成型，调节型，阻遏型，强型，弱型或启动子元件包含的启动子序列的其它特性。在一个实施方式中，启动子元件可包含编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的序列5'或3'。在一个实施方式中，启动子元件可包含基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子内的序列。在一个实施方式中，启动子元件可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的5'或3'序列中。在一个实施方式中，启动子元件可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)内。在一个实施方式中，启动子元件可以部分或全部包含在基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子内。
如本文所用，术语“操作性地连接”是指编码多肽的核酸序列与控制元件之间的关系，其中，如果编码多肽的序列和控制元件以适于控制元件调节多肽编码序列表达的方式配置，则它们操作性地连接。因此，对于不同的控制元件，操作性地连接将相对于控制元件构成多肽编码序列的不同配置。例如，如果启动子元件和多肽编码序列彼此相邻并且位于同一核酸上，则多肽编码序列可与包含启动子元件的控制元件操作性地连接。在另一个实例中，如果增强子序列和多肽编码序列在同一核酸上相隔合适数量的碱基或甚至在不同且分开的核酸上，则多肽编码序列可操作性地连接至包含远程操作的增强子序列的控制元件。如果插入到插入位点的多肽编码序列将被操作性地连接至控制元件，则插入位点，例如限制性位点、着陆垫或SSI位点也可被操作性地连接。
如本文所用，术语“内源(的)”指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在其内部天然产生的任何物质。
如本文所用，术语“重组靶位点”是一段核苷酸，该段核苷酸对于与重组酶联合进行的靶向重组而言是必需的且允许该靶向重组发生，并且该段核苷酸确定了所述重组的位置。
如本文所用，术语“重组靶位点”与基因“侧翼”或“侧接”结合使用，所述基因例如是编码重组(例如治疗性、阻遏物或选择性)标志物、多肽的基因，表示重组靶位点位于所述基因的5'和3'，这意味着一个靶位点位于感兴趣基因编码序列的5'，而另一个靶位点位于感兴趣基因编码序列的3'。重组靶位点可紧邻感兴趣基因编码序列或位于距该基因限定距离之处。侧接序列，特别是侧接重组靶位点，以正向或反向定位，优选地都正向或优选地都反向。
如本文所用，术语“外源(的)”是指引入生物体、细胞、组织或系统的或在其外部产生的任何物质。因此，“外源核酸”是指被引入生物体、细胞、组织或系统或在其之外产生的核酸。在一个实施方式中，外源核酸的序列不是天然产生的，或不天然存在于该外源核酸所引入的生物体、细胞、组织或系统之内。类似地，“外源多肽”指这样的多肽，其不是天然产生的或无法天然存在于该外源多肽(例如通过由外源核酸序列表达)所引入的生物体、细胞、组织或系统之内。
如本文所用，术语“异源的”是指来自一种物种的任何物质被引入不同物种的生物体、细胞、组织或系统。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可互换使用，指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或DNA或其RNA的组合，以及其单链或双链形式的聚合物。术语“核酸”包括但不限于基因，cDNA或mRNA。在一个实施方式中，核酸分子是合成的(例如化学合成的或人工的)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的类似物或衍生物的分子，所述天然核苷酸的类似物或衍生物具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然或非天然产生的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直系同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代形式(Batzer等，NucleicAcid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键或除肽键以外的方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。在一个实施方式中，蛋白质可包含多于一个，例如，两个，三个，四个，五个或多于五个的多肽，其中每个多肽通过共价或非共价键/相互作用彼此结合。多肽包括包含通过肽键或通过除肽键以外的方式彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语指两条短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，也指长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，包括很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。
如本文所用，“重组多肽”或“重组蛋白”指可由本文所述的细胞产生的多肽。重组多肽是这样的多肽：编码该多肽的序列的至少一个核苷酸或控制该多肽表达的序列的至少一个核苷酸通过遗传工程改造(细胞或前体细胞)形成。例如，至少一个核苷酸被改变，例如，其被引入细胞中，或者它是遗传工程改造的重排的产物。例如，重组多肽也可以是治疗性多肽。
如本文所用，“治疗性多肽”是指对人或动物健康或医学有用的多肽，其由经修饰或工程改造以产生治疗性多肽的细胞产生，例如表达。在一个实施方式中，治疗性多肽是天然产生的多肽或非天然产生的多肽，例如合成多肽。在一个实施方式中，治疗性多肽的部分是天然产生的，而治疗性多肽的另一部分是非天然产生的。在一个实施方式中，治疗性多肽是重组多肽。在个一实施方式中，治疗性多肽适合于诊断或临床前用途。在另一个实施方式中，治疗性多肽适合用于治疗用途，例如用于治疗疾病。在个一实施方式中，治疗性多肽选自表1-4。在一些实施方式中，经修饰或经工程改造的细胞包含控制治疗性多肽表达或编码治疗性多肽的外源核酸。在其它实施方式中，经修饰或经工程改造的细胞包含其它分子，例如非核酸分子，其控制治疗性多肽在细胞中的表达或构建。
如本文所用，“阻遏物多肽”指控制另一种多肽(例如，治疗性多肽)的表达的多肽，所述另一种多肽由经修饰或经工程改造以产生该阻遏物多肽的细胞产生(例如表达)。在一个实施方式中，阻遏物多肽是天然产生的多肽或非天然产生的多肽，例如合成多肽。在一个实施方式中，阻遏物多肽的部分是天然产生的，而阻遏物多肽的另一部分是非天然产生的。在一个实施方式中，阻遏物多肽是重组多肽。在一些实施方式中，阻遏物多肽降低治疗性多肽的表达。在一些实施方式中，阻遏物多肽完全消除治疗性多肽的表达。在一些实施方式中，阻遏物多肽的表达被调节。例如，阻遏物多肽在一组条件下高度表达，而阻遏物多肽的表达在另一组条件下被抑制，例如降低或完全消除。
如本文所用，“活性水平”是指由控制元件或启动子元件诱导的表达强度的量度。例如，控制元件可具有高水平的活性，从而使操作性地连接至该控制元件的编码序列强表达。
如本文所用，“条件”指可影响控制元件或启动子元件的活性水平的细胞和/或环境参数的值。条件可包括一个细胞和环境参数值，或者条件可包括多于一个(例如，两个，三个，四个，五个，六个或更多个)细胞和环境参数值。例如，控制元件在第一条件下可具有第一活性水平，而在第二条件下可具有第二活性水平。细胞和环境参数包括但不限于一种或多种多肽的水平，一种或多种多肽在区室中的定位水平(例如，核、胞质或内质网定位)，细胞信号转导途径的活化水平，例如，应激反应、未折叠的蛋白质反应、热休克反应等，信号转导分子的水平(例如Ca+2，cAMP，葡萄糖，ATP等)，温度，pH，细胞周期/生长期，细胞培养密度和营养利用率。
如本文所用，Cas9分子或Cas9多肽指可与引导RNA(gRNA)分子相互作用并且与gRNA分子联合作用而归位(home)或定位于包含靶结构域和PAM序列的位点的分子或多肽。如本文使用的那些术语，Cas9分子和Cas9多肽，包括天然产生的Cas9分子和经工程改造、改变或修饰的Cas9分子或Cas9多肽，其与例如参考序列(最相似的天然产生的Cas9分子或序列)相差例如至少一个氨基酸残基。示例性的Cas9分子或Cas9多肽序列可见于WO2015/157070，其通过引用全文方式纳入本文。Cas9分子或Cas9多肽包括具有DNA切割和缺刻活性等的Cas9分子，例如dCas9分子或dCas9多肽，其不明显切割或缺刻DNA。
概述
一方面，本公开提供遗传控制回路，核酸，细胞，用于制备细胞或细胞系的方法，以及用于响应细胞或环境条件变化而微调(fine-tuning)一种或多种重组或治疗性蛋白质产物基因的转录速率的方法，所述条件变化例如细胞应激反应的改变，例如未折叠蛋白质反应(UPR)。图1A和图1B中描绘了本发明的遗传控制回路的一般设计原理的示例。在该非限制性的示意性实例中，重组蛋白产物的生成诱导应激/毒性，其活化阻遏物多肽的生成，从而抑制重组多肽产物的表达。应激信号的去除使阻遏物多肽的表达失活。抑制的减轻需要重新活化重组多肽产物生成。
产物
本文提供了用于鉴定、选择或制备能够产生高产量的产物(例如外源治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法、细胞，以及遗传控制回路。本公开内容涵盖的产物包括但不限于可以例如在细胞中表达产生的分子，核酸，多肽(例如重组和/或治疗性多肽)或其杂合体。在一些实施方式中，细胞经工程改造或修饰以产生产物。这样的修饰包括引入控制或导致产物生成的分子。例如，通过引入编码多肽(例如重组多肽)的外源核酸来修饰细胞，并且在适合于例如多肽(例如重组多肽)的生成，例如表达和分泌的条件下培养细胞。在另一个实例中，细胞通过引入外源核酸来修饰，所述外源核酸控制(例如增加)由细胞内源表达的多肽的表达，从而使细胞产生的该多肽水平或量高于未修饰细胞中内源产生的水平或量。在实施方式中，通过本文所述的方法鉴定、选择或产生的细胞或细胞系产生可用于治疗医学病症、紊乱或疾病的产物，例如重组多肽。医学病症、紊乱或疾病的示例包括但不限于：代谢疾病或紊乱(例如，代谢酶缺乏症)，内分泌病症(例如，激素缺乏症)，止血，血栓形成，造血功能紊乱，肺部疾病，胃肠道疾病疾病，免疫调节(例如免疫缺陷)，不育，移植，癌症和感染性疾病。
重组多肽是外源蛋白质，例如细胞不天然表达的蛋白质。重组多肽可以是治疗性蛋白质或诊断性蛋白质，例如可用于药物筛选。治疗性或诊断性蛋白质可以是抗体分子，例如抗体或抗体片段，融合蛋白，激素，细胞因子，生长因子，酶，糖蛋白，脂蛋白，报告蛋白，治疗性肽，或所述这些任何一种的结构和/或功能片段或杂合体。在实施方式中，产物，例如外源治疗性多肽，包含多条多肽链，例如含有重链和轻链的抗体或抗体片段。
在一个实施方式中，产物，例如重组多肽是抗体分子。本文涵盖的产物是可用于成像技术的诊断性抗体分子，例如单克隆抗体或其抗体片段，以及适合于给予对象的治疗性抗体分子，例如可用于治疗疾病或紊乱。抗体分子是源自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。在一个实施方式中，抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白质(multiformat protein)可以是多克隆或单克隆，多链或单链或完整免疫球蛋白，并且可源自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。抗体可以是人抗体或人源化抗体。在一个实施方式中，抗体是IgA，IgG，IgD或IgE抗体。在一个实施方式中，抗体是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4抗体。
“抗体片段”指完整抗体或其重组变体的至少部分，并且指完整抗体的抗原结合结构域(例如抗原决定性可变区域)，其使该抗体片段足以识别和特异性结合靶标，例如抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段，scFv抗体片段，线性抗体，单域抗体，如sdAb(VL或VH)，骆驼科动物VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体，所述抗体片段例如是包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，以及抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可被纳入单结构域抗体，最大抗体(maxibody)，迷你抗体(minibody)，纳米抗体，内抗体(intrabody)，双抗体，三抗体，四抗体，v-NAR和双-scFv(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可基于多肽例如III型纤连蛋白(Fn3)移植到支架中(参见描述纤连蛋白多肽迷你抗体的美国专利号6,703,199)。
在实施方式中，重组或治疗性多肽是例如BOTOX，B型肉毒毒素(Myobloc)，Neurobloc，Dysport(或肉毒杆菌神经毒素的其它血清型)，葡糖苷酶α，达托霉素，YH-16，绒毛膜促性腺激素α，非格司亭，西曲瑞克，白介素2，醛固酮，特斯莱素(Teceleulin)，地尼白介素(Denileukin Diftitox)，干扰素α-n3(注射)，干扰素α-nl，DL-8234，干扰素，Suntory(γ-1a)，干扰素γ，胸腺素α1，他索纳明，DigiFab，ViperaTAb，EchiTAb，CroFab，奈西立肽，阿巴西普，阿法赛特，利比(Rebif)，伊托特肽-α(Eptotermin-α)，特立帕肽，降钙素，依那西普，血红蛋白谷氨酸250(牛)，多去科肽-α(Drotrecogin-α)，胶原酶，卡培肽，重组人表皮生长因子，DWP401，达贝泊汀-α(Darbepoetin-α)，依泊汀Ω，依泊汀β，来匹卢定，比伐卢定，诺那凝血素α，莫诺宁，依他凝血素α(活化)，重组因子VIII+VWF，重组物，重组因子VIII，因子VIII(重组)，阿芬酸，辛凝血素α，因子VIII，帕利夫明，印地激酶(indikinase)，替奈普酶，阿替普酶，帕米特普酶，瑞替普酶，那特普酶，蒙替普酶，促卵泡激素α，rFSH，hpFSH，米卡芬净，乙二醇化非格司亭，来格司亭，那托司亭，舍莫林，胰高血糖素，艾塞那肽，普兰林肽，依尼格西酶(imiglucerase)，加硫酶(galsulfase)，莱科去肽(Leucotropin)，莫拉司亭，醋酸曲普瑞林，组氨瑞林(Hydron)，德舍瑞林，组氨瑞林，那法瑞林，亮丙瑞林(ATRIGEL)，亮丙瑞林(DUROS)，戈舍瑞林，尤得盼(Eutropin)，生长激素，美卡舍明，恩夫韦肽，Org-33408，甘精胰岛素，赖谷胰岛素，胰岛素(吸入)，赖脯胰岛素，去酯胰岛素，胰岛素(RapidMist)，美卡舍明-林菲培，阿那白滞素，西莫白介素，99mTc-阿普西肽，髓体(Myeloid)，倍他塞隆，醋酸格拉替雷，Gepon，沙格司亭，奥普瑞白介素，人白细胞衍生的α干扰素，倍尔来福(Bilive)，胰岛素(重组)，重组人胰岛素，门冬胰岛素，甲卡西林，罗扰素-A，干扰素-α2，阿法飞龙(Alfaferone)，奥氟康-1(alfercon-1)干扰素，干扰素α，Avonex重组人黄体生成激素，链道酶α，曲弗明，齐考诺肽，他替瑞林，地博特明-α(Dibotermin-α)，阿托西班，贝卡普勒明，依替巴肽，Zemaira，CTC-111，Shanvac-B，奥曲肽，兰瑞肽(Lanreotide)，安斯特林(Ancestirn)，阿加糖苷酶β，阿加糖苷酶α，拉罗尼德酶，普雷扎肽醋酸铜，拉布立酶，兰尼单抗，Actimmune，PEG-Intron，采尼(Tricomin)，重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84，依泊汀δ，转基因抗凝血酶III，大环蛋白，透明质酸酶(Vitrase)，重组胰岛素，干扰素-α，GEM-21S，戊酸肽，艾杜硫酶，奥马拉(Omnapatrilat)，重组血清白蛋白，赛妥珠单抗(CertolizumbPegol)，羧肽酶(Glucarpidase)，人重组C1酯酶抑制剂，拉替普酶，重组人生长激素，恩夫韦肽，VGV-1，干扰素(α)，光敏剂，阿维帕地尔，依卡替班，依卡兰肽，奥米加南，奥罗格拉布，派西加南乙酸酯，ADI-P EG-20，LDI-200，地加瑞克，星区德林(Cintredelinbesudotox)，Favld，MDX-1379，ISAtx-247，利拉鲁肽，特立帕肽，替卡可银，AA4500，T4N5脂质体洗剂，卡妥莫昔单抗，DWP413，ART-123，克林索林，去氨普酶，安地普酶，克里夫力α(Corifollitropinα)，TH-9507，替度鲁肽，Diamyd，DWP-412，生长激素，重组G-CSF，胰岛素，胰岛素(Technosphere)，胰岛素(AERx)，RGN-303，DiaPep277，干扰素β，干扰素α-n3，贝拉西普，透皮胰岛素贴片，AMG-531，MBP-8298，Xerecept，奥培巴康，AIDSVAX，GV-1001，LymphoScan，豹蛙酶(Ranpirnase)，Lipoxysan，卢苏普肽(Lusupultide)，MP52，西普鲁塞-T，CTP-37，Insegia，Vitespen，人凝血酶，凝血酶，TransMID，阿米帕酶，普瑞凯希，特利加压素，EUR-1008M，重组FGF-1，BDM-E，罗替卡肽，ETC-216，P-113，MBI-594AN，杜拉霉素，SCV-07，OPI-45，内皮抑素，血管抑制素，ABT-510，包曼-伯克型抑制剂，XMP-629、99mTc-Hynic-膜联蛋白V，卡哈拉里德F(Kahalalide F)，CTCE-9908，替维瑞克，奥匝瑞里(Ozarelix)，若尼德鑫(Rornidepsin)，BAY-504798，白介素4，PRX-321，肽扫描，波塔德金(Iboctadekin)，rhLactoferrin，TRU-015，IL-21，ATN-161，西仑吉肽，白蛋白干扰素(Albuferon)，Biphasix，IRX-2，Ω干扰素，PCK-3145，CAP-232，帕雷肽，huN901-DMI，SB-249553，Oncovax-CL，OncoVax-P，BLP-25，CerVax-16，MART-1，gp100，酪氨酸酶，奈米非特，rAAT，CGRP，派森那赛(Pegsunercept)，胸腺素β4，普立肽，GTP-200，雷莫普林，GRASPA，OBI-1，AC-100，鲑鱼降钙素(Eligen)，阿考瑞林，己糖莫林，Cardeva，薇拉氟明(Velafermin)，131I-TM-601，KK-220，T-10，奥利肽，地来司他，亥玛肽(Hematide)，Chrysalin，rNAPc2，重组因子V111(聚乙二醇化脂质体)，bFGF，聚乙二醇化重组葡激酶激酶变体，V-10153，SonoLysis Prolyse，NeuroVax，CZEN-002，rGLP-1，BIM-51077，LY-548806，艾塞那肽(控释，Medisorb)，AVE-0010，GA-GCB，阿佛瑞林，ACM-9604，醋酸利那洛特，CETi-1，Hemospan，VAL，速效胰岛素(注射剂，Viadel)，胰岛素(Eligen)，重组蛋氨酸人瘦素，匹揣金那(Pitrakinra)，多可因(Multikine)，RG-1068，MM-093，NBI-6024，AT-001，PI-0824，Org-39141，Cpn10，他乳铁蛋白，rEV-131，rEV-131，重组人胰岛素，RPI-78M，奥普瑞白介素，CYT-99007CTLA4-Ig，DTY-001，伐拉司特，干扰素α-n3，IRX-3，RDP-58，Tauferon，胆盐刺激脂肪酶，莫里酶(Merispase)，阿兰磷酸酶(Alaline Phosphatase)，EP-2104R，美拉诺坦-II，布雷莫来肽，ATL-104，重组人微纤溶酶，AX-200，SEMAX，ACV-1，Xen-2174，CJC-1008，强啡肽A，SI-6603，LAB GHRH，AER-002，BGC-728，ALTU-135，重组神经氨酸酶，Vacc-5q，Vacc-4x，Tat类毒素，YSPSL，CHS-13340，PTH(1-34)(Novasome)，Ostabolin-C，PTH类似物，MBRI-93.02，MTB72F，MVA-Ag85A，FARA04，BA-210，重组鼠疫FIV，AG-702，OxSODrol，rBetV1，Der-p1/Der-p2/Der-p7，PR1肽抗原，突变ras疫苗，HPV-16E7脂肽疫苗，拉贝林，WT1肽，IDD-5，CDX-110，Pentrys，Norelin，CytoFab，P-9808，VT-111，艾罗卡肽，替柏明(Telbermin)，芦平曲韦(Rupintrivir)，网状糖，rGRF，HA，α-半乳糖苷酶A，ACE-011，ALTU-140，CGX-1160，血管紧张素，D-4F，ETC-642，APP-018，rhMBL，SCV-07，DRF-7295，ABT-828，ErbB2特异性免疫毒素，DT3SSIL-3，TST-10088，PRO-1762，Combotox，胆囊收缩素B/胃泌素受体结合肽，111In-hEGF，AE-37，曲妥珠单抗-DM1，拮抗剂G，IL-12，PM-02734，IMP-321，rhIGF-BP3，BLX-883，CUV-1647，基于L-19的Ra，Re-188-P-2045，AMG-386，DC/1540/KLH，VX-001，AVE-9633，AC-9301，NY-ESO-1(肽)，NA17.A2肽，CBP-501，重组人乳铁蛋白，FX-06，AP-214，WAP-8294A，ACP-HIP，SUN-11031，肽YY[3-36]，FGLL，阿塞西普，BR3-Fc，BN-003，BA-058，人甲状旁腺激素1-34，F-18-CCR1，AT-1100，JPD-003，PTH(7-34)(Novasome)，杜拉霉素，CAB-2，CTCE-0214，糖聚乙二醇化促红细胞生成素，EPO-Fc，CNTO-528，AMG-114，JR-013，因子XIII，氨基抗生物素，PN-951，716155，SUN-E7001，TH-0318，BAY-73-7977，替维瑞克，EP-51216，hGH，OGP-1，西夫韦肽，TV4710，ALG-889，Org-41259，rhCC10，F-991，胸腺五肽，r(m)CRP，肝选择性胰岛素，亚苏林，L19-IL-2融合蛋白，弹力素，NMK-150，ALTU-139，EN-122004，rhTPO，血小板生成素受体激动剂，AL-108，AL-208，神经生长因子拮抗剂，SLV-317，CGX-1007，INNO-105，特立帕肽(Eligen)，GEM-OS1，AC-162352，PRX-302，LFn-p24融合体，EP-1043，gpE1，gpE2，MF-59，hPTH(1-34)，768974，SYN-101，PGN-0052，阿维斯卡宁，BIM-23190，多表位酪氨酸酶肽，安卡斯汀(enkastim)，APC-8024，GI-5005，ACC-001，TTS-CD3，血管靶向型TNF，去氨加压素，奥诺普和TP-9201。
在一些实施方式中，多肽是阿达木单抗(Adalimumab)(HUMIRA)，英夫利昔单抗(Infliximab)(REMICADETM)，利妥昔单抗(Rituximab)(RITUXANTM/MAB THERATM)，依那西普(Etanercept)(ENBRELTM)，贝伐单抗(Bevacizumab)(AVASTINTM)，曲妥珠单抗(Trastuzumab)(HERCEPTINTM)，派革利革斯丁(Pegrilgrastim)(NEULASTATM)，或任何其它合适的多肽，包括生物类似物和生物改良剂。
其它合适的多肽是下文和US2016/0097074的表1中列出的那些：
表1
在实施方式中，多肽是如表2所示的激素、血液凝固/凝结因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白疫苗或肽。
表2：示例性产物
在实施方式中，蛋白质是多特异性蛋白，例如，双特异性抗体，如表3所示。
表3：双特异性形式
表4
表4
表4
表4
表4
表4
在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是癌细胞表达的抗原。在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方式中，重组或治疗性多肽选自HER2，CD20，9-O-乙酰基-GD3，βhCG，A33抗原，CA19-9标志物，CA-125标志物，钙网蛋白，碳酸酐酶IX(MN/CA IX)，CCR5，CCR8，CD19，CD22，CD25，CD27，CD30，CD33，CD38，CD44v6，CD63，CD70，CC123，CD138，癌胚抗原(CEA；CD66e)，桥粒芯蛋白4，E-钙粘蛋白新表位，内皮唾液酸蛋白，肝配蛋白A2(EphA2)，表皮生长因子受体(EGFR)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，ErbB2，胎儿乙酰胆碱受体，成纤维细胞活化抗原(FAP)，岩藻糖基GM1，GD2，GD3，GM2，神经节苷脂GD3，Globo H，糖蛋白100，HER2/neu，HER3，HER4，胰岛素样生长因子受体1，Lewis-Y，LG，Ly-6，黑色素瘤特异性软骨素硫酸盐蛋白聚糖(MCSCP)，间皮素，MUC1，MUC1变体(例如MUC1 A，B，C，D，X，Y，Z，REP或SEC)，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC7，MUC16，穆勒抑制型物质(MIS)受体II型，浆细胞抗原，多聚SA，PSCA，PSMA，音猬因子(SHH)，SAS，STEAP，sTn抗原，TNF-α前体及其组合。
在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是活化受体，并且选自2B4(CD244)，α4β1整联蛋白，β2整联蛋白，CD2，CD16，CD27，CD38，CD96，CD100，CD160，CD137，CEACAM1(CD66)，CRTAM，CS1(CD319)，DNAM-1(CD226)，GITR(TNFRSF18)，活化形式的KIR，NKG2C，NKG2D，NKG2E，一种或多种天然细胞毒性受体，NTB-A，PEN-5及其组合，任选地其中β2整联蛋白包含CD11a-CD 18，CD11b-CD 18或CD11c-CD 18，任选地其中KIR的活化形式包括KlR2DS1，KIR2DS4或KIR-S，并且任选地其中天然细胞毒性受体包括NKp30，NKp44，NKp46或NKp80。
在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是抑制型受体，并且选自KIR，ILT2/LIR-1/CD85j，抑制型形式的KIR，KLRG1，LAIR-1，NKG2A，NKR-P1A，Siglec-3，Siglec-7，Siglec-9及其组合，任选地其中抑制型形式的KIR包括KIR2DL1，KIR2DL2，KIR2DL3，KIR3DL1，KIR3DL2或KIR-L。
在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是活化型受体并且选自CD3，CD2(LFA2，OX34)，CD5，CD27(TNFRSF7)，CD28，CD30(TNFRSF8)，CD40L，CD84(SLAMF5)，CD137(4-1BB)，CD226，CD229(Ly9，SLAMF3)，CD244(2B4，SLAMF4)，CD319(CRACC，BLAME)，CD352(Lyl08，NTBA，SLAMF6)，CRTAM(CD355)，DR3(TNFRSF25)，GITR(CD357)，HVEM(CD270)，ICOS，LIGHT，LTβR(TNFRSF3)，OX40(CD134)，NKG2D，SLAM(CD150，SLAMF1)，TCRα，TCRβ，TCRδγ，TIM1(HAVCR，KIM1)及其组合。
在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是抑制型受体，并且选自PD-1(CD279)，2B4(CD244，SLAMF4)，B71(CD80)，B7Hl(CD274，PD-L1)，BTLA(CD272)，CD160(BY55，NK28)，CD352(Ly108，NTBA，SLAMF6)，CD358(DR6)，CTLA-4(CD152)，LAG3，LAIR1，PD-1H(VISTA)，TIGIT(VSIG9，VSTM3)，TIM2(TIMD2)，TIM3(HAVCR2，KIM3)及其组合。
其它示例治疗性或诊断性蛋白质包括但不限于Leader等“蛋白质治疗剂：概述和药理学分类(Protein therapeutics:a summary and pharmacological classification)”,Nature Reviews Drug Discovery,2008,7:21-39(通过引用纳入本文)的表1-10中描述的任何蛋白质；或本文所述重组多肽的任何偶联物，变体，类似物或功能片段。
其它重组产物包括非抗体支架或替代性蛋白质支架，例如但不限于：锚蛋白重复蛋白(DARPin)，亲和体(affibody)和阿迪连接素(adnectin)。可以将此类非抗体支架或替代性蛋白质支架工程改造以识别或结合至一个或两个或更多个，例如1、2、3、4或5个或更多个不同的靶标或抗原。
核酸
本文还提供核酸，例如编码产物(例如本文所述的重组多肽)的外源核酸。可用本领域已知的重组方法来获得编码所需重组多肽的核酸序列，例如，通过从表达所需核酸序列(例如基因)的细胞筛选文库，通过从已知包含该核酸序列的载体衍生该核酸序列，或通过从含有该核酸序列的细胞和组织进行直接分离，采用标准技术。或者，编码重组多肽的核酸可以合成产生，而不是克隆。重组DNA工艺和技术在本领域中是高度发达和完善的。因此，具有本文所述的重组多肽的氨基酸序列知识的普通技术人员可容易地设想或生成编码重组多肽的核酸序列。
重组多肽的表达通常通过将编码重组多肽或其部分的核酸操作性地连接至启动子，并将该构建体掺入表达载体中来实现。载体可适于复制和整合真核生物或原核生物。典型的克隆载体包含其它调节元件，例如转录和翻译终止子，起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
在实施方式中，产物，例如外源治疗性多肽，包含多条多肽链，例如含有重链和轻链的抗体或抗体片段。编码包含多条多肽链的外源治疗性多肽的核酸序列可以排列在一起(例如，每条多肽链编码序列排列在同一核酸上)或分开排列(例如，每条多肽链编码序列排列在不同核酸上)。编码包含多条多肽链的外源治疗性多肽的序列可以操作性地连接至单个控制元件，例如第一控制元件，或不同、分开的控制元件(例如，每个多肽链编码序列操作性地连接至其自身的第一控制元件)。在其中编码包含多条多肽链的外源治疗性多肽的序列与不同、分开的控制元件操作性地连接的一个实施方式中，一个或多个(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个或全部)控制元件在第一条件下可具有第一活性水平，而在第二条件下可具有第二活性水平，并且一个或多个(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多)控制元件可以是组成型的。
可以将编码重组多肽的核酸序列克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒，噬菌粒，噬菌体衍生物，动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体，复制载体，探针生成载体和测序载体。在实施方式中，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Sambrook等，2012，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)》，第1-4卷，纽约州冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，以及其它病毒学和分子学生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起点，包含启动子元件和任选增强子元件的控制元件，方便的限制性核酸内切酶位点以及一种或多种选择性标志物(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。源自病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定地整合及其在子代细胞中的繁衍。
载体还可包括例如促进分泌的信号序列，聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)，允许附加型复制和原核生物复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域已知的其它元件)和/或允许选择的元件(例如选择性标志物或报告基因)。
所设想的载体可包含适合插入多肽(例如是外源治疗性多肽或阻遏物多肽)编码序列的插入位点。
插入位点可包含限制性核酸内切酶位点。
插入位点可包含重组靶位点，其中所述重组靶位点位于编码多肽(例如外源治疗性多肽或阻遏物多肽)的序列的侧面。在一个实施方式中，重组靶位点是lox位点。在重组靶位点是lox位点的情况下，宿主细胞需要Cre重组酶的存在和表达以实现交换或重组事件。
在一个实施方式中，重组靶位点是FRT位点。在重组靶位点是FRT位点的情况下，宿主细胞需要FLP(FLP重组酶)的存在和表达才能实现交叉或重组事件。
插入位点可包含着陆坪(landing pad)，例如，DNA的部分，例如，选择性标志物，侧接约25bp的短独特序列和/或限制位点。所设想的材料和方法包括本领域已知的并且例如在美国临时申请62/460,420(其通过引用其全文纳入本文)中已知的着陆坪位点特异性的整合技术。
在一些实施方式中，载体包含SEQ ID No.17、18、19的分离的核苷酸序列或其同源物中的至少一个(例如，一个，两个或更多个)。在一个实施方式中，载体包含编码选择性标志物的至少一个序列，其本身在其5'和3'端各侧接一个重组靶位点，并且其中SEQ IDNo.17或18的核苷酸序列中至少一个或其同源序列位于编码选择性标志物的序列的3'末端。在一个实施方式中，载体包含编码选择性标志物的至少一个序列，其本身在其5'和3'端各侧接一个重组靶位点，并且其中SEQ ID No.19中所给出或其同源序列中至少一个核苷酸序列位于编码选择性标志物的序列的5'末端。
第一控制元件
在一个实施方式中，包含编码产物(例如多肽，例如重组或治疗性多肽)的核酸序列的载体还包含第一控制元件，例如第一启动子元件，其负责募集聚合酶以实现多肽(例如重组或治疗性多肽)表达的转录起始。第一控制元件可包括远端元件，例如，在相对于多肽编码序列的远端(例如，相距一定碱基长度)调节多肽表达的元件，和近端元件，例如，部分因其处于紧密接近多肽编码序列处或处于多肽编码序列内而调节多肽表达的元件。在一些实施方式中，与编码多肽(例如重组或治疗性多肽)的序列操作性地连接的第一控制元件(例如启动子元件)是组成型控制元件。在一些实施方式中，操作性地连接至编码多肽(例如重组或治疗性多肽)的序列的第一控制元件(例如启动子元件)是调节型控制元件(例如，由内源或外源多肽调节的控制元件)。在一些实施方式中，操作性地连接至编码多肽(例如重组或治疗性多肽)的序列的第一控制元件(例如第一启动子元件)在第一条件下(例如在细胞生长的第一阶段，例如指数生长)具有第一水平的活性，并且在第二条件下(例如细胞的生长的第二阶段，例如具有小于指数生长的阶段，例如生长稳定阶段)具有第二活性水平。在一个实施方式中，适用于本文所述方法的控制元件通常与增强子相关联以驱动大量转录并因此递送靶外源mRNA的大量拷贝。在一个实施方式中，第一控制元件(例如第一启动子元件)包括巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子(Xia,Bringmann等，2006)和SV40启动子(Chernajovsky,Mory等，1984)，两者均源自同名病毒或由其衍生的启动子。当包含在含有劳斯肉瘤(Rous Sarcoma)病毒长末端重复序列(RSV-LTR)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)LTR的表达载体中，其它几种较不常见的病毒启动子已成功用于驱动转录(Papadakis,Nicklin等2004)。在另一个实施方式中，特异性内源哺乳动物启动子可用于驱动感兴趣的基因的组成型转录(Pontiller,Gross等2008)。CHO特异性中国仓鼠延伸因子1-α(CHEF1α)启动子为基于病毒的序列提供了高产的替代选择(Deer,Allison 2004)。在一些实施方式中，用于驱动重组体(例如治疗性多肽)的转录的第一控制元件(例如第一启动子元件)可包括胸苷激酶(TK)启动子，肌动蛋白启动子(例如β-肌动蛋白启动子)，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)启动子，细胞周期蛋白T1启动子，CAG启动子，RNA聚合酶III U3启动子，亲环蛋白启动子，加利福尼亚州志单胞菌核多角体病毒(AcNPV)P10启动子，β3-半乳糖基转移酶5(β3GAL-T5)启动子，Fer1启动子，复合启动子(例如CMV-EF1α启动子)以及基础启动子和三部分前导分子复合启动子。前述启动子元件总结在表5中并且是本领域已知的。设想本发明不限于一个或多个特定启动子。在第一和/或第二控制元件的上下文中也考虑了在WO2004/009823，WO2006/111387和WO2014044845中描述的启动子和转录控制机制(通过引用其全文纳入本文)。在一些实施方式中，第一控制元件，例如启动子元件，是包含合成(非天然产生)序列的工程改造的启动子。例如，第一控制元件，例如启动子元件，可包含如Brown等Biotechnology and Bioengineering,第111卷,第8期,2014年8月所述的启动子。
表5
第二控制元件
在一个实施方式中，包含编码多肽(例如重组或阻遏物多肽)的核酸序列的载体还包含与多肽编码序列操作性地连接的第二控制元件(例如第二启动子元件)，第二控制元件负责募集聚合酶，以使转录起始以表达多肽(例如重组或阻遏物多肽)。第二控制元件可包括远端元件，例如，在相对于多肽编码序列的远端(例如，相距一定碱基长度或在远且分开的核酸上)调节多肽表达的元件，和近端元件，例如，部分因其处于紧密接近多肽编码序列处或处于多肽编码序列内而调节多肽表达的元件。在一个实施方式中，与编码多肽(例如重组或阻遏物多肽)的序列操作性地连接的第二控制元件(例如第二启动子元件)是组成型控制元件。在一些实施方式中，操作性地连接至编码多肽(例如重组或阻遏物多肽)的序列的第二控制元件(例如第二启动子元件)是调节型控制元件，例如由内源或外源多肽调节的启动子。在一些实施方式中，与编码多肽(例如重组或阻遏物多肽)的序列操作性地连接的第二控制元件(例如第二启动子元件)在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
在一些实施方式中，与编码多肽(例如重组或阻遏物多肽)的序列操作性地连接的第二控制元件(例如第二启动子元件)在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，其中，相对于第一活性水平，第二活性水平被调节(例如更高或更低)。
在一些实施方式中，第一条件和第二条件对可选自以下内容：第一(例如较低)水平的应激和第二(例如较高)水平的应激；第一(例如较低)水平的未折叠或错误折叠多肽和第二(例如较高)水平的未折叠或错误折叠多肽；第一(例如较低)水平的胞液中未折叠或错误折叠多肽和第二(例如较高)水平的胞液中未折叠或错误折叠多肽；第一(例如较低)水平的内质网(ER)未折叠或错误折叠多肽和第二(例如较高)水平的ER未折叠或错误折叠多肽；第一(例如较低)水平的热休克反应(HSR)活化和第二(例如较高)水平的HSR活化；第一(例如较低)水平的未折叠蛋白质反应(UPR)活化和第二(例如较高)水平的UPR活化；第一(例如较高)水平的游离ER伴侣(例如BiP)，和第二(例如较低)水平的游离ER伴侣(例如BiP)；第一(例如较低)温度和第二(例如较高)温度；第一(例如较低)水平的氧化应激和第二(例如较高)水平的氧化应激；第一(例如较高)水平的ER Ca2+和第二(例如较低)水平的ER Ca2+；第一(例如较高氧化性)水平的ER氧化态和第二(例如较低氧化性)水平的ER氧化态；第一(例如较高)细胞能量水平和第二(例如较低)细胞能量水平；第一(例如较高)ATP水平和第二(例如较低)ATP水平；第一(例如较高)葡萄糖水平和第二(例如较低)葡萄糖水平；第一(例如较低)水平的活化Hsf1多肽和第二(例如较高)水平的活化Hsf1多肽；第一(例如较低)水平的磷酸化三聚Hsf1多肽和第二(例如较高)水平的磷酸化三聚Hsf1多肽；第一(例如较低)水平的活性(例如剪接的)Xbp1多肽和第二(例如较高)水平的活性(例如剪接的)Xbp1多肽；第一(例如较低)水平的ATF4多肽和第二(例如较高)水平的ATF4多肽；第一(例如较低)水平的NRF2多肽和第二(例如较高)水平的NRF2多肽；和第一(例如较低)水平的ATF6(例如，ATF6α或ATF6β)多肽和第二(例如较高)水平的ATF6(例如，ATF6α或ATF6β)多肽。
在一些实施方式中，第二控制元件在第N个条件下具有第N个活性水平，其中N为3、4、5、6、7、8、9、10或更大，并且在第N个条件下，相对于先前条件(例如条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)下的治疗性多肽的表达，治疗性多肽的表达被调节，例如降低或增加。对于本文所述的第一和第二各对条件，可以设想另外的第N个(例如，第三，第四，第五等)条件，其中，该另外的第N个条件是另外的相关条件。例如，其中第一(例如更低)水平的应激和第二(例如较高)水平的应激如上所述时，还设想另外的第N(例如，第三、第四、第五等)(例如较低或较高)水平的应激，具有对应的第N水平的活性。
在一些实施方式中，第一条件抑制多肽(例如重组或阻遏物多肽)的表达。在一些实施方式中，第二条件诱导多肽(例如重组或阻遏物多肽)的表达。在一些实施方式中，第二条件诱导多肽(例如阻遏物多肽)的表达，并且阻遏物多肽抑制另一多肽(外源治疗性多肽)的表达。在一些实施方式中，在第二条件下，外源治疗性多肽的表达，例如转录水平，与第一条件下的表达相比，降低至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。
在一些实施方式中，第二控制元件在第一条件下不诱导多肽(例如重组或阻遏物多肽)的表达(例如，重组或阻遏物多肽未明显表达)，而在第二条件下诱导所述多肽(例如，重组或阻遏物多肽)的表达(例如，重组体或阻遏物多肽被明显表达)。明显表达可以是多肽(例如重组或阻遏物多肽)的(例如，通过本领域已知的方法)可检测的累积，或编码该多肽(例如重组或阻遏物多肽)的mRNA的可检测的积累。
在一些实施方式中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第三条件下具有第三活性水平。第一活性水平可导致缺乏多肽(例如重组或阻遏物多肽)的明显表达。第二活性水平可导致多肽(例如重组或阻遏物多肽)的明显表达。第三活性水平可导致多肽(例如重组或阻遏物多肽)的表达相对于第二活性水平的调节(例如增加或减少)。
在一些实施方式中，第二控制元件在第N个条件下具有第N个活性水平，其中N为3、4、5、6、7、8、9、10或更大，并且在第N个条件下，相对于先前条件(例如条件1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)下的治疗性多肽的表达，治疗性多肽的表达被调节，例如降低或增加。在一个实施方式中，第二控制元件的第N个活性水平基于第N个条件的波动而波动。例如，给定第一条件是第一细胞应激水平，第二条件是第二细胞应激水平，第二控制元件可具有第一活性水平和第二较高活性水平(例如，该示例性第二控制元件具有与细胞应激成比例的活性)。第二较高活性水平可增加多肽(例如阻遏物多肽)的表达，其在积累时改变(例如减少)重组或治疗性多肽的表达。重组或治疗性多肽表达的变化(例如减少)产生了第三条件(例如，低于第二细胞应激水平的第三细胞应激水平)。第三条件具有第二控制元件的对应第三活性水平；在当前示例中，第三活性水平相对于第二活性水平而言可有所降低，导致阻遏物多肽表达降低。第三条件下阻遏物多肽表达的降低可导致重组或治疗性多肽表达的增加，从而产生第四条件(例如，高于第三细胞应激水平的第四细胞应激水平)。等等。在一些实施方式中，与条件波动相关的第二控制元件活性的波动可随时间推移达到平衡，例如，达到这样的状态：第二控制元件在第N个条件下和第N+1个条件下的活性差异可忽略不计。在一个实施方式中，第二控制元件(例如第二启动子元件)包含以下一种或多种(例如，两种、三种、四种或更多种)：热休克元件(HSE)，包含对应于SEQ ID NO:8-11之一或更多序列的HSE，cAMP反应元件(CRE)，包含对应于SEQ ID NO:12的序列的CRE，抗氧化反应元件(ARE)，包含对应于SEQ ID NO:13的序列的ARE，内质网应激反应元件(ERSE)，和包含对应于SEQ ID NO:14的序列的ERSE。在一些实施方式中，第二控制元件(例如第二启动子元件)可包含一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多)：HSE，CRE，ARE或ERSE，其包含相对于本领域已知相关共有序列含有零、一、二、三、四或五个取代的序列。在一些实施方式中，第二控制元件(例如第二启动子元件)可包含一个或多个(例如，二、三、四或更多)HSE，CRE，ARE或ERSE，其含有表6所列的共有序列。在一些实施方式中，第二控制元件(例如第二启动子元件)可包含一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多)：HSE，CRE，ARE或ERSE，其包含相对于表6中所列或本领域已知的对应共有序列含有零、一、二、三、四或五个取代的序列。设想本发明不限于一个或多个特定启动子。
表6：
元件 示例性共有序列
热休克元件(HRE) SEQ ID NO:8-11
cAMP反应元件(CRE) SEQ ID NO:12
抗氧化反应元件(ARE) SEQ ID NO:13
ER应激反应元件(ERSE) SEQ ID NO:14
在一些实施方式中，第二控制元件(例如，第二启动子元件)包含一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多个)元件，所述元件被例如热休克反应或未折叠蛋白质反应(UPR)的元件调节(例如活化)。在一些实施方式中，第二控制元件(例如，第二启动子元件)包含一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多个)元件，所述元件由错误折叠蛋白质的积累调节(例如活化)。在一些实施方式中，第二控制元件(例如，第二启动子元件)包括一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多个)Xbp1响应性启动子元件。在一些实施方式中，第二控制元件(例如，第二启动子元件)包含一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多个)ATF6响应性启动子元件。在一些实施方式中，第二控制元件(例如，第二启动子元件)包含一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多个)ATF4响应性启动子元件。在一些实施方式中，第二控制元件(例如，第二启动子元件)包含一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多个)NRF2响应性启动子元件。在一些实施方式中，第二控制元件(例如，第二启动子元件)包括一个或多个(例如，两个，三个，四个或更多个)Hsf1响应性启动子元件。
第三控制元件
在一些实施方式中，本发明的细胞、载体、核酸以及包含它们的试剂盒和方法还包括或使用编码一种或多种gRNA(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个gRNA)的核酸序列，其操作性地连接至第三控制元件，例如第三启动子元件。第三控制元件负责募集聚合酶，以使转录起始以表达一种或多种gRNA。在一些实施方式中，第三控制元件(例如第三启动子元件)操作性地连接至编码多个gRNA的序列，所述多个gRNA和/或编码所述多个gRNA的序列可按下列文献中所述提供、生产、排列或加工：Gao,Y.和Y.Zhao(2014).J Integr Plant Biol56(4):343-349；Martick,M.等.(2008).Nature 454(7206):899-902；Xie,K.等.(2015).Proc Natl Acad Sci USA 112(11):3570-3575；Nissim,L.等.(2014).Mol Cell 54(4):698-710；和Port,F.和S.L.Bullock(2016)."通过tRNA侧接的sgRNA增强果蝇中的CRISPR应用(Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.)"Nat Meth[提前线上公开]，其各自通过引用其全文方式纳入本文。第三控制元件可包括远端元件，例如，在相对于编码一个或多个gRNA的序列的远端(例如，相距一定碱基长度或在远且分开的核酸上)调节多肽表达的元件，和近端元件，例如，部分因其处于紧密接近一个或多个gRNA编码序列处或处于一个或多个gRNA编码序列内而调节所述一个或多个gRNA表达的元件。在一个实施方式中，操作性地连接至编码一个或多个gRNA的序列的第三控制元件(例如第三启动子元件)是组成型控制元件。在一些实施方式中，操作性地连接至编码一个或多个gRNA的序列的第三控制元件(例如第三启动子元件)是调节型控制元件，例如，由内源或外源多肽调节的启动子。在一些实施方式中，操作性地连接至编码一个或多个gRNA的序列的第三控制元件(例如第三启动子元件)在第一条件下具有第一活性水平，且在第二条件下具有第二活性水平。
在一些实施方式中，操作性地连接至编码一个或多个gRNA的序列的第三控制元件(例如第三启动子元件)，是本文所述的第一控制元件的拷贝。在一些实施方式中，操作性地连接至编码一个或多个gRNA的序列的第三控制元件(例如第三启动子元件)是本文所述的第二控制元件的拷贝。
在一些实施方式中，第三控制元件(例如第三启动子元件)是包含合成(非天然产生)序列的工程改造的启动子。例如，第三控制元件(例如第三启动子元件)可包括如Brown等人所述的启动子，Brown等.Biotechnology and Bioengineering,第111卷,第8期,2014年8月。
除启动子外，本文所述的载体还包含如上所述的增强子区；靠近核心启动子的特定核苷酸基序区域，其可募集转录因子以上调转录速率(Riethoven 2010)。与启动子序列相似，这些区域通常来源于病毒，并被包含在启动子序列中，例如hCMV和SV40增强子序列，或者可以另包含在腺病毒衍生的序列中(Gaillet,Gilbert等，2007)。
其它核酸特征
在一个实施方式中，包含本文所述的编码产物(例如多肽，例如重组多肽)的核酸序列的载体还包含编码选择性标志物的核酸序列。在个一实施方式中，选择性标志物包括谷氨酰胺合成酶(GS)；二氢叶酸还原酶(DHFR)，例如提供对甲氨蝶呤(MTX)的抗性的酶；或抗生素标志物，例如提供对抗生素抗性的酶，所述抗生素例如潮霉素，新霉素(G418)，博来霉素，嘌呤霉素或杀稻瘟素。在另一个实施方式中，选择性标志物包含Selexis选择系统(例如，SUREtechnology PlatformTM和Selexis Genetic ElementsTM，市售可得自Selexis SA)或Catalant选择系统或与其相容。
在一个实施方式中，包含编码本文所述重组产物的核酸序列的载体包含选择性标志物，其可用于鉴定包含编码本文所述重组产物的核酸的一个或多个细胞。在另一个实施方式中，如本文所述，选择性标志物可用于鉴定包含编码重组产物的核酸序列整合到基因组中的一个或多个细胞。已经整合有编码重组蛋白的核酸序列的一个或多个细胞的鉴定对于选择和工程改造稳定表达该产物的细胞或细胞系而言是有用的。
使用的合适载体是市售可得的，并且包括与以下所列相关的载体：GS ExpressionSystemTM，GS XceedTM基因表达系统或CHOK1SV技术，可获自隆萨生物公共有限公司(Lonza Biologics,PLC)，例如，Fan等所述的载体：Fan等,Pharm.Bioprocess.(2013)；1(5):487-502，其通过引用其全文纳入本文。GS表达载体包含GS基因或其功能片段(例如GS迷你基因)，以及一个或多个(例如1、2或3个或更多个)高效转录盒，用于表达感兴趣的基因，例如编码本文所述的重组多肽的核酸。所述迷你基因包含GS基因的单一内含子和大约1kb的3'侧接DNA，并且转录自SV40晚期启动子。在一个实施方式中，GS载体包含GS基因，其操作性地连接至SV40L启动子，和一个或两个多聚A信号。在另一个实施方式中，GS载体包含GS基因，其操作性地连接至SV40E启动子，和SV40内含子剪接和聚腺苷酸化信号。在此类实施方式中，例如用于表达本文所述的感兴趣基因或重组多肽的转录盒包括hCMV-MIE启动子和来自hCMV-MIE基因的5'非翻译序列，包括第一内含子。可以基于GS表达载体构建其它载体，例如，其中其它选择性标志物代替本文所述的表达载体中的GS基因。
适用于本文所述方法的载体包括但不限于其它市售可得的载体，例如pcDNA3.1/Zeo，pcDNA3.1/CAT，pcDNA3.3TOPO(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，先前英杰公司(previously Invitrogen))；pTarget，HaloTag(普洛麦格公司(Promega))；pUC57(金斯瑞公司(GenScript))；pFLAG-CMV(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))；pCMV6(傲锐东源公司(Origene))；pEE12或pEE14(隆萨生物公司(Lonza Biologics))，或pBK-CMV/pCMV-3Tag-7/pCMV-Tag2B(斯塔基公司(Stratagene))。
细胞
重组蛋白或多肽(例如治疗性多肽)可通过重组DNA技术产生，由宿主细胞表达，并且可从宿主细胞(例如CHO细胞)纯化，也可分泌到液体(例如细胞培养基)中，其中培养宿主细胞并从液体中纯化宿主细胞。在本领域中，非常需要能够以高产量和适当质量产生重组蛋白或多肽的细胞。细胞，制备细胞的方法，制备重组(例如，治疗性)多肽的方法以及与之相关的试剂盒可用于制备具有提高的活力、高生产率的细胞，以获得高产量的重组(例如，治疗性)多肽产品或提供更高质量的重组多肽产物的制剂，例如，包含较高量的正确折叠蛋白质，较低量的聚集蛋白质，所需的糖基化模式或所需的糖基化水平的重组多肽产物的制剂。细胞，制备细胞的方法，制备重组(例如，治疗性)多肽的方法以及与之相关的试剂盒对于生产重组(例如，治疗性)多肽特别有用，其中需要高效的细胞系开发、大量的重组治疗性多肽产品，和高质量的患者治疗用药物。
细胞和细胞培养
一方面，本公开涉及用于评估，分类，鉴定，选择或制备产生产物(例如本文所述的重组或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法。在另一方面，本公开涉及用于评估，分类，鉴定，选择或制备具有改善的(例如增加的)生产率和产品质量的细胞或细胞系的方法和组合物。
在实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在其它实施方式中，细胞是不同于哺乳动物细胞的细胞。在一个实施方式中，该细胞来自小鼠，大鼠，中国仓鼠，叙利亚仓鼠，猴，猿，狗，马，雪貂或猫。在实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或啮齿动物细胞，例如仓鼠细胞，小鼠细胞或大鼠细胞。在另一个实施方式中，细胞来自鸭，鹦鹉，鱼，昆虫，植物，真菌或酵母。在个一实施方式中，细胞是古细菌。在一个实施方式中，细胞是放线菌的物种，例如结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
在一个实施方式中，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方式中，所述细胞是CHO-K1细胞，CHOK1SV细胞，DG44 CHO细胞，DUXB11 CHO细胞，CHO-S，CHO GS敲除细胞，CHOK1SV FUT8敲除细胞，CHOZN或CHO衍生的细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞(隆萨生物公司)。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1SV FUT8敲除(隆萨生物公共有限公司)。
在一个实施方式中，所述细胞是位点特异性整合(SSI)宿主细胞。在一个实施方式中，SSI宿主细胞包含内源Fer1L4基因，其中外源核苷酸序列整合在所述Fer1L4基因中。在一些实施方式中，外源核苷酸序列包含至少一种感兴趣的基因编码序列，例如，编码治疗性、阻遏性或选择性标志物多肽的基因。在一些实施方式中，外源核苷酸序列包含至少两个重组靶位点。在一些实施方式中，重组靶位点侧接于至少一个感兴趣的基因编码序列。在其它实施方式中，重组靶位点邻接且不侧接至少一个感兴趣的基因编码序列。在一些实施方式中，感兴趣的基因编码序列包含至少一个选择性标志物基因。
在一个实施方式中，SSI宿主细胞的特征在于存在外源核苷酸序列，即编码重组(例如治疗或阻遏物)多肽的至少一个序列，其自身在其5'和3'端各侧接一个重组靶标位点，并且其中SEQ ID No.17或18的核苷酸序列或其同源序列中至少一个位于整合进入宿主细胞基因组的外源核苷酸序列的3'端。在一个实施方式中，SSI宿主细胞的特征在于存在外源核苷酸序列，即编码重组(例如治疗或阻遏物)多肽的至少一个序列，其自身在其5'和3'端各侧接一个重组靶标位点，并且其中SEQ ID No.19所示核苷酸序列或其同源序列中至少一个位于整合进入宿主细胞基因组的外源核苷酸序列的5'端。
在一个实施方式中，所述细胞是位点特异性整合(SSI)宿主细胞。在一个实施方式中，SSI宿主细胞的特征在于存在外源核苷酸序列，即编码选择性标志物的至少一个序列，其自身在其5'和3'端各侧接一个重组靶标位点，并且其中SEQ ID No.17或18的核苷酸序列或其同源序列中至少一个位于整合进入宿主细胞基因组的外源核苷酸序列的3'端。在一个实施方式中，SSI宿主细胞的特征在于存在外源核苷酸序列，即编码选择性标志物的至少一个序列，其自身在其5'和3'端各侧接一个重组靶标位点，并且其中SEQ ID No.19所示核苷酸序列或其同源序列中至少一个位于整合进入宿主细胞基因组的外源核苷酸序列的5'端。
在另一个实施方式中，细胞是HeLa，HEK293，HT1080，H9，HepG2，MCF7，Jurkat，NIH3T3，PC12，PER.C6，BHK(小仓鼠肾细胞)，VERO，SP2/0，NS0，YB2/0，Y0，EB66，C127，L细胞，COS，例如COS1和COS7，QC1-3，CHOK1，CHOK1SV，PotelligentTM(CHOK1SV FUT8-KO)，CHO GS敲除，XceedTM(CHOK1SV GS-KO)，CHOS，CHO DG44，CHO DXB11和CHOZN或从中衍生的任何细胞。
在一个实施方式中，真核细胞是干细胞。例如，干细胞可以是多潜能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)，成体干细胞，诱导型多能干细胞(iPSC)，组织特异性干细胞(例如，造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。
在一实施方式中，细胞是本文所述任何细胞的分化形式。在一实施方式中，细胞是源自培养中的任何原代细胞的细胞。
在实施方式中，细胞是肝细胞，如人肝细胞、动物肝细胞或非薄壁组织细胞。例如，细胞可以是可铺板(plateable)的代谢合格的人肝细胞，可铺板的诱导合格的人肝细胞，可铺板的Qualyst Transporter CertifiedTM人肝细胞，悬浮合格的人肝细胞(包括10供体和20供体汇集的肝细胞)，人肝枯氏细胞(Kupffer cell)，人肝星状细胞，狗肝细胞(包括单一和汇集的比格尔(Beagle)肝细胞)，小鼠肝细胞(包括CD-1和C57BI/6肝细胞)，大鼠肝细胞(包括Sprague-Dawley、Wistar Han和Wistar肝细胞)，猴肝细胞(包括食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus monkey)肝细胞)，猫肝细胞(包括短毛家猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白兔肝细胞)。示例性的肝细胞可商购自三角研究实验室有限公司(TriangleResearch Labs,LLC)，美国北卡罗纳州Davis Drive研究三角科技园6，27709。
在一实施方式中，真核细胞是低等真核细胞，例如，酵母细胞(例如，毕赤酵母(Pichia)属(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，和安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta))，孔玛氏酵母(Komagataella)属(例如，巴斯德孔玛氏酵母(Komagataellapastoris)，假巴斯德孔玛氏酵母(Komagataella pseudopastoris)或菲氏孔玛氏酵母(Komagataella phaffii))，酵母(Saccharomyces)属(例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)，葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)属(例如，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis))，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))，假丝酵母(Candida)属(例如，产朊假丝酵母(Candida utilis)，卡卡假丝酵母(Candida cacaoi)，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))，地丝菌(Geotrichum)属(例如，发酵地丝菌(Geotrichumfermentans))，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选的是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)种。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株的示例是X33、GS115、KM71、KM71H；和CBS7435。
在一个实施方式中，真核细胞是真菌细胞(例如，曲霉种(Aspergillus sp.)(例如，黑曲霉(A.niger)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.orzyae)、构巢曲霉(A.nidula))、枝顶孢种(Acremonium sp.)(例如嗜热支顶孢(A.thermophilum))、毛壳菌种(Chaetomiumsp.)(例如嗜热毛壳菌(C.thermophilum))、金孢子菌种(Chrysosporium sp.)(例如嗜热金孢子菌(C.thermophile))、虫草种(Cordyceps sp.)(例如蛹虫草(C.militaris))、棒囊壳种(Corynascus sp.)、栉霉种(Ctenomyces sp.)、镰刀菌种(Fusarium sp.)(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))、小丛壳种(Glomerella sp.)(例如禾生小丛壳菌(G.graminicola))、肉座菌种(Hypocrea sp.)(例如红褐肉座菌(H.jecorina))、巨座壳种(Magnaporthe sp.)(例如奥载巨座壳菌(M.orzyae))、毁丝霉种(Myceliophthora sp.)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophile))、丛赤壳种(Nectria sp.)(例如红球丛赤壳菌(N.heamatococca))、脉孢菌种(Neurospora sp.)(例如粗糙脉孢霉(N.crassa))、青霉种(Penicillium sp.)、孢子丝菌种(Sporotrichum sp.)(例如嗜热孢子丝菌(S.thermophile))、梭孢壳种(Thielaviasp.)(例如疣革菌(T.terrestris)、异梭孢壳霉(T.heterothallica))、木霉种(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei))或轮枝孢种(Verticillium sp.)(例如大丽轮枝菌(V.dahlia)))。
在一实施方式中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9，MimicTM Sf9，Sf21，HighFiveTM(BT1-TN-5B1-4)，或BT1-Ea88细胞)，藻类细胞(例如，双眉藻种(Amphora sp.)，硅藻种(Bacillariophyceae sp.)，杜氏藻种(Dunaliella sp.)，小球藻种(Chlorella sp.)，衣藻种(Chlamydomonas sp.)，蓝绿藻种(Cyanophyta sp.)(蓝藻细菌)，微拟球藻种(Nannochloropsis sp.)，螺旋藻种(Spirulina sp.)或棕鞭藻种(Ochromonas sp.))或植物细胞(例如，来自单子叶植物(例如，玉米、水稻、小麦或狗尾草(Setaria sp.))，或来自双子叶植物(例如，木薯，土豆，大豆，番茄，烟草，紫花苜蓿，小立碗藓(Physcomitrellapatens)或拟南芥(Arabidopsis sp.))。
在一实施方式中，细胞是细菌或原核细胞。
在实施方式中，原核细胞是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌种(Bacillus sp.)，链霉菌种(Streptomyces sp.)，链球菌种(Streptococcus sp.)，葡萄球菌种(Staphylococcus sp.)或乳酸菌种(Lactobacillus sp.)。可用的芽孢杆菌种(Bacillussp.)是，例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，纳豆芽孢杆菌(B.natto)，或巨大芽胞杆菌(B.megaterium)。在实施方式中，所述细胞是枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌种可获自，例如，芽孢杆菌遗传贮藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)，生物科学(Biological Sciences)556，俄亥俄州哥伦布西第12大道484号(43210-1214)。
在一个实施方式中，原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌种(Salmonellasp.)或大肠杆菌(Escherichia coli)，例如TG1，TG2，W3110，DH1，DHB4，DH5a，HMS 174，HMS174(DE3)，NM533，C600，HB101，JM109，MC4100，XL1-Blue和Origami，以及衍生自大肠杆菌B菌株，例如BL-21或BL21(DE3)，或BL21(DE3)pLysS，所有这些都是市售可得的。
合适的宿主细胞是市售可得的，例如购自诸如DSMZ(德国微生物和细胞培养有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH)，德国不伦瑞克)的培养物保藏中心或美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
在一个实施方式中，细胞是本文所述的任何细胞，其包含编码重组多肽(例如表达重组多肽，例如选自表1-4的重组多肽)的外源核酸。
在一个实施方式中，细胞培养以分批培养，分批补料培养，抽取和填充培养或连续培养形式进行。在一个实施方式中，细胞培养是悬浮培养。在一个实施方式中，将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如置于模式生物或人类对象中。
在个一实施方式中，培养基不含血清。无血清、无蛋白质和化学成分明确的无动物成分(CDACF)培养基市售可得，例如可来自隆萨生物公司(Lonza Biologics)。
哺乳动物细胞系的合适培养基和培养方法是本领域公知的，如美国专利号5,633,162所述。用于实验室培养瓶或低密度细胞培养及适应具体细胞类型需求的标准细胞培养基的示例有，例如：罗斯维尔公园纪念学院(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI)1640培养基(Morre,G.,The Journal of the American Medical Association,199,第519页f.1967)，L-15培养基(Leibovitz,A.等,Amer.J.of Hygiene,78,1第173页ff,1963)，杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM)，伊氏最低基础培养基(Eagle's minimal essential medium)(MEM)，汉氏(Ham's)F12培养基(Ham,R.等,Proc.Natl.Acad.Sc.53,第288页ff.1965)或艾氏(Iscoves')改良的DMEM，其缺乏白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂(Iscoves等,J.Exp.med.1,第923页ff.,1978)。例如，汉氏F10或F12培养基是专为CHO细胞培养而设计的。在EP-481 791中描述了其它特别适合CHO细胞培养的培养基。已知这种培养基可以补充胎牛血清(FBS，也称为胎牛血清FCS)，后者提供了大量激素和生长因子的天然来源。如今，哺乳动物细胞的细胞培养是在科学教科书和手册中充分描述的常规操作，其详细内容包括例如R.Ian Fresney著，《动物细胞培养手册(Culture ofAnimal cells,a manual)》，第4版，Wiley-Liss出版公司/纽约，2000。
其它合适的培养方法是技术人员已知的，并且可能取决于重组多肽产物和所用的宿主细胞。确定或优化适于细胞表达的重组或治疗性多肽的表达和生产的条件在普通技术人员的技术范围内。
一方面，细胞或细胞系包含编码产物(例如重组或治疗性多肽)的外源核酸。在一个实施方式中，细胞或细胞系表达产物(例如治疗性或诊断性产物)。用于遗传修饰或工程化细胞以表达所需多肽或蛋白质的方法是本领域众所周知的，包括例如转染、转导(例如病毒转导)或电穿孔。
用于将核酸(例如本文所述的外源核酸或载体)引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀，脂转染，粒子轰击，显微注射，电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法为本领域所熟知。参见例如，Sambrook等,2012,《分子克隆：实验室手册(MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL)》，第1-4卷，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约州)。
用于将核酸(例如，本文所述的外源核酸或载体)导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂，胶束，混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送载剂的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。现有技术的核酸靶向递送的其它方法是可用的，例如采用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米尺寸递送系统的多核苷酸的递送。
在实施方式中，期望将外源核酸整合进入宿主细胞的核酸，例如宿主细胞的基因组或染色体核酸。用于确定是否已经将外源核酸整合到宿主细胞的基因组中的方法可包括GS/MSX选择方法。GS/MSX选择方法利用重组GS基因对谷氨酰胺营养缺陷型的互补作用来选择细胞中蛋白质的高水平表达。简言之，GS/MSX选择方法包括在载体上包含编码谷氨酰胺合成酶的核酸，所述载体包含编码重组多肽产物的外源核酸。甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的给予选择已将编码重组、治疗性或阻遏性多肽和GS的外源核酸稳定整合到基因组中的细胞。由于GS可以通过某些宿主细胞(例如CHO细胞)内源表达，因此可以优化MSX的浓度和选择持续时间，以鉴定将编码重组、治疗性或阻遏物多肽产物的外源核酸稳定整合进入宿主基因组的高产细胞。GS选择及其系统进一步描述于以下文献中：Fan等,Pharm.Bioprocess.(2013)；1(5):487-502，其通过引用其全文纳入本文。
用于鉴定和选择已将外源核酸稳定整合到宿主细胞基因组中的细胞的其它方法可包括但不限于：在外源核酸上包含报告基因并评估该报告基因在所述细胞中的存在，以及对外源核酸进行PCR分析和检测。
在一个实施方式中，相较于仅用用于稳定表达(例如整合)编码重组或治疗性多肽的外源核酸的选择方法选择的细胞而言，使用本文所述的方法选择、鉴定或产生的细胞(例如，所述细胞包含：第一控制元件(例如第一启动子元件)，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；和第二控制元件(例如第二启动子元件)，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，且在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在下，治疗性多肽的表达经调节(例如下降))能够产生较高或更一致产量的蛋白质产物。在一个实施方式中，与仅用于稳定表达(例如整合)编码重组或治疗性多肽的外源核酸而选择、鉴定或产生的细胞相比，使用本文所述的方法选择、鉴定或产生的细胞产生2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍或10倍或更多的该产物(例如重组或治疗性多肽)。在一个实施方式中，与仅用于稳定表达(例如整合)编码重组或治疗性多肽的外源核酸而选择、鉴定或产生的细胞相比，就一段时间或一定数量的细胞传代而言，使用本文所述的方法选择、鉴定或产生的细胞产生2倍，3倍，4倍，5倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍或更多的产物(例如重组或治疗性多肽)。在一个实施方式中，与仅用于稳定表达(例如整合)编码重组或治疗性多肽的外源核酸而选择、鉴定或产生的细胞相比，使用本文所述的方法选择、鉴定或产生的细胞产生多10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％或300％的正确折叠产物(例如，重组或治疗性多肽)。在一个实施方式中，与仅用于稳定表达(例如整合)编码重组或治疗性多肽的外源核酸而选择、鉴定或产生的细胞相比，使用本文所述的方法选择、鉴定或产生的细胞产生少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的聚集蛋白质或产物(例如，重组或治疗性多肽)。在一个实施方式中，与仅用于稳定表达(例如整合)编码重组或治疗性多肽的外源核酸而选择、鉴定或产生的细胞相比，使用本文所述的方法选择、鉴定或产生的细胞产生多10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％或300％的糖基化产物(例如，重组或治疗性多肽)。在一个实施方式中，与仅用于稳定表达(例如整合)编码重组或治疗性多肽的外源核酸而选择、鉴定或产生并用于生成产物的细胞相比，使用本文所述的方法选择、鉴定或产生并用于生成产物的细胞具有高10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％或300％的活力。
细胞的评估、分类、选择或鉴定
一方面，本公开的特征在于用于评估细胞(例如候选细胞)的产物(例如重组或治疗性多肽)生成能力的方法。这样的评估的结果可提供用于选择或鉴定用于产生高产量细胞或细胞系的细胞或细胞系的细胞的有用信息。在另一个实施方式中，响应于本文所述的评估，可以将细胞或细胞系分类为例如具有高产量能力的细胞或细胞系。
与参比细胞或尚未通过本文所述的方法选择或产生的细胞相比，高产量细胞或细胞系能够产生更高产量的重组或治疗性多肽产物。在一个实施方式中，高产量细胞系能够产生100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L，600mg/L，700mg/L，800mg/L，900m g/L,1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，或100g/L或更多的产物(例如，重组多肽产物)。在一个实施方式中，高产量细胞系产生100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L，600mg/L，700mg/L，800mg/L，900mg/L，1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，45g/L，50g/L，55g/L，60g/L，65g/L，70g/L，75g/L，80g/L，85g/L，90g/L，95g/L，或100g/L或更多的产物(例如，重组或治疗性多肽产物)。产生的产物的量可以根据细胞类型(例如物种)和要表达的重组或治疗性多肽而变化。例如，高产量细胞能够产生至少1g/L，2g/L，5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，或25g/L或更多的重组或治疗性多肽，例如，如本文所述。
在产物难以表达的实施方式中，高产量细胞可能产生较低浓度的产物，例如小于0.1g/L，0.5g/L或1g/L，但是，生产率高过或高于不包含含有与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的核酸的细胞观察到的结果。例如，与不包含含有与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的核酸的细胞产生的水平、量或数量相比，由鉴定或选择的细胞产生的产物的水平、量或数量增加例如1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，50倍或100倍或更多。
本文所述用于评估细胞的方法包括评估阻遏物多肽对细胞功能相关的一个或多个参数的作用。细胞功能相关的参数包括但不限于，细胞存活率，培养物活力，增殖能力，产生产物的能力和蛋白质降解。在实施方式中，将阻遏物多肽的表达对细胞功能相关的一个或多个参数的作用的值与参比值进行比较，以确定阻遏物多肽对细胞功能相关的参数的作用，例如，用于确定包含含有与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的核酸的细胞是否导致细胞功能相关的参数之一的增加或减少。在一个实施方式中，作为对细胞功能相关的一个或多个参数的增加或减少的确定的响应，可选择或鉴定细胞以开发为细胞生产系。在一个实施方式中，作为对细胞功能相关的一个或多个参数的增加或减少的确定的响应，细胞可被鉴定为高产量细胞，例如能够产生更高产量的产物的细胞。
在本文所述的任何实施方式中，参比值可以是阻遏物多肽对与参比细胞(例如具有预定生产率的细胞)的细胞功能有关的参数的作用的值。或者或另外地，在本文所述的任何实施方式中，参比值可以是与被测试的同一细胞的细胞功能相关的参数的值，其中该细胞不包含含有与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的核酸，例如，在将细胞与含有与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的核酸接触之前测量该参数的值，或测量未与含有与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的核酸接触的分开的细胞试样的该参数的值。
在一个实施方式中，可以通过确定或定量细胞活力来测量细胞存活率，例如，存活并在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中表达重组或治疗性多肽的细胞的数量或量。细胞存活率的增加包括，与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中的重组或治疗性多肽的表达后情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达所述重组或治疗性多肽之后，剩余多1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，3倍，4倍或5倍或更多的细胞(例如完整或活细胞)数量。或者，细胞存活率的增加包括：与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中重组或治疗性多肽的表达后情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中表达所述重组或治疗性多肽之后，凋亡细胞数量减少1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。检测细胞存活或凋亡的方法是本领域已知的，例如膜联蛋白V测定法，活细胞浓度(IVC)的时间积分，最大活细胞浓度和细胞比生产率(specificproductivity rate)。
在一个实施方式中，可以通过确定或定量活细胞(例如，培养物或细胞群中的活细胞)或具有活力相关特征(例如，增殖标志物、完整DNA或不显示凋亡标志物)的细胞的数量或量来测量培养物活力。培养物活力的增加包括，与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中的重组或治疗性多肽的表达后情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达所述重组或治疗性多肽之后，剩余多1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，3倍，4倍或5倍或更多的细胞(例如完整或活细胞)数量。确定培养物活力的方法是本领域已知的。评估培养物活力的其它方法包括但不限于：台盼蓝排除法，然后使用血球计数器或Vi-CELL(Beckman-Coulter)进行计数。评估培养物活力的其它方法可包括确定活生物量，包括使用射频阻抗或电容(例如Carvell和Dowd，2006年，Cytotechnology，50:35-48)，或使用拉曼光谱法(例如，Moretto等，2011，American Pharmaceutical Review，第14卷)。
在一个实施方式中，细胞增殖的能力可以通过定量或计数细胞的数目、细胞倍增或细胞的生长速率来测量。或者，增殖细胞可通过如下方式鉴定：分析细胞的基因组含量(例如复制DNA)，例如通过流式细胞术分析，或增殖标志物(例如，Ki67)，细胞周期中涉及的磷酸化细胞周期蛋白-CDK复合物的存在。增殖能力的增加包括，与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中的重组或治疗性多肽的表达后情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达所述重组或治疗性多肽之后，表达增殖标志物的细胞的数量或细胞数量增加1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，3倍，4倍或5倍或更多。或者，增殖能力的增加包括，与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中的重组或治疗性多肽的表达后情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达所述重组或治疗性多肽之后，细胞倍增或生长速率增加1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，3倍，4倍或5倍或更多。确定培养物活力的方法是本领域已知的。
本文提供的方法可用于鉴定、选择或制备细胞或细胞系，所述细胞或细胞系具有提高的生产重组或治疗性多肽(例如产物)的能力。在一个实施方式中，本文提供的方法还可用于鉴定、选择或制备产生提高质量的重组或治疗性多肽的细胞或细胞系。
在一个实施方式中，可通过确定或定量所产生的产物的量或浓度来测量细胞的产物生成能力。产物生成能力的增加包括，与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞中的重组或治疗性多肽的表达后情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达所述重组或治疗性多肽之后，蛋白质产量增加1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1倍，2倍，3倍，4倍或5倍或更多。
在一个实施方式中，产物(例如表达的重组或治疗性多肽)的质量可通过确定或定量正确折叠的产物、功能产物或非聚集产物的量或浓度来测量。细胞生产的产物质量的增加包括：与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达重组或治疗性多肽之后的情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达重组或治疗性多肽之后，正确折叠产物、功能产物或非聚集产物(例如，表达的重组或治疗性多肽)的量或浓度的增加1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，一倍，两倍，三倍，四倍，或五倍或更多。
在一个实施方式中，产物(例如表达的重组或治疗性多肽)的质量可通过确定或定量具有正确糖基化概况、宏观异质性(即位点占有率)和糖基化一致性的产物的量或浓度来测量。细胞生产的产物质量的增加包括：与不包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达重组或治疗性多肽之后的情况相比，在还包含与阻遏物多肽的编码序列操作性地连接的控制元件的细胞表达重组或治疗性多肽之后，具有正确糖基化概况、具有增加的位点占有率或具有增加的糖基化一致性的产物的量或浓度的增加1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，一倍，两倍，三倍，四倍，或五倍或更多。
测量增加的蛋白质产量的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，重组或治疗性蛋白质产量的增加可以小规模通过ELISA测量组织培养基中的效价来测量(Smales等.2004 Biotechnology Bioengineering 88:474-488)。其也可通过ForteBio Octet来定量地确定，例如，用于高通量测定培养基中重组单克隆抗体(mAb)浓度(Mason等.2012Biotechnology Progress 28:846-855)，或以大规模通过蛋白A HPLC来测量(Stansfield等.2007 Biotechnology Bioengineering 97:410-424)。用于确定产物(例如本文所述的重组或治疗性多肽)的产量的其它方法可以指产物(特别是细胞中的重组或治疗性多肽)的比生产率(qP)和/或活力细胞浓度的时间积分(IVC)。重组或治疗性多肽的产量或生产率，定义为培养基中多肽的浓度，与这两个参数(qP和IVC)呈函数关系，根据Porter等的方法计算(Porter等.2010 Biotechnology Progress 26:1446-1455)。
测量由本文所述产生的细胞系产生的产物的质量提高的方法是本领域已知的。在一个实施方式中，用于确定表达的重组或治疗性多肽产物的一级序列的保真度的方法是本领域已知的，例如质谱，HPLC，SDS-PAGE，肽作图和IEF。正确折叠产物(例如表达的重组或治疗性多肽)的量或浓度的增加可通过圆二色性或评估表达的重组或治疗性多肽的固有荧光来确定。取决于重组或治疗性多肽的特性(identity)，可使用多种不同的功能测定法来测试功能产物的量或浓度的增加。例如，可以通过ELISA或其它免疫亲和测定法测试抗体。
用于细胞系和重组多肽生成的方法
哺乳动物和微生物选择系统中的当前技术水平是在DNA转录成RNA的水平上施加选择压力。感兴趣的基因与选择性标志物偶联，使选择性标志物的高水平表达可能导致感兴趣的基因的高表达。以足够高的水平表达选择性标志物的细胞能够存活和增殖，不如此表现的那些细胞不大可能存活和增殖。通过该方式，可以富集细胞群中表达选择性标志物的细胞，并通过高水平的感兴趣的基因表示。已经证明该方法对于表达不难表达的蛋白质而言非常成功。
在一些实施方式中，可以进行附加步骤来改善产物的表达，例如产物的转录、翻译和/或分泌，或产物的质量，例如一级序列的正确折叠和/或保真度。这样的附加步骤包括引入改善产品表达或产品质量的物质。在一个实施方式中，改善产物表达或产物质量的物质可以是小分子，多肽或编码改善蛋白质折叠的多肽(例如，伴侣蛋白)的核酸。在一个实施方式中，协助蛋白质折叠的物质包括编码伴侣蛋白(例如BiP，PD1或ERO1)的核酸(Chakravarthi和Bulleid 2004；Borth等.2005；Davis等.2000)。提高产品产量和质量的其它附加步骤包括过表达转录因子(例如SBP1和ATF6)(Tigges和Fussenegger 2006；Cain等，2013；Ku等，2008)以及凝集素结合伴侣蛋白(例如钙调蛋白和钙网蛋白)(Chung等.2004)。协助或改善蛋白质折叠和产品质量并产生本文所述的蛋白质的物质的过表达可以通过引入编码所述蛋白质的外源核酸来实现。在另一个实施方式中，改善产物表达或产物质量的物质是可被添加至细胞培养物中以增加产物表达或产物质量的小分子。在一个实施方式中，细胞培养物处于较低温度，例如比细胞正常生长的温度低1℃，2℃，3℃，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃，9℃或10℃。
本文所述的任何方法还可包括用于鉴定具有高生产率或产生高质量产物的细胞的附加选择步骤。例如，FAC选择可用于选择具有所需特征(例如较高蛋白质折叠蛋白(例如伴侣蛋白)表达)的特定细胞。
一方面，本公开内容提供了包括用于回收(recover)或收回(retrieve)重组或治疗性多肽产物的步骤的方法。在其中重组或治疗性多肽从细胞分泌的实施方式中，所述方法可包括从细胞、细胞群或其中培养细胞的培养基中收回、收集或分离重组或治疗性多肽的步骤。在其中重组或治疗性多肽处于细胞内的实施方式中，重组或治疗性多肽产物的纯化包括：将细胞产生的重组或治疗性多肽与以下任何一种或多种分离：宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、宿主细胞脂质和/或来自宿主细胞的其它碎片。
在实施方式中，本文所述的方法提供了基本上纯的蛋白质产物。如本文所用，“基本上纯的”是指基本上不含热解物质，基本上不含核酸，和/或基本上不含来自宿主细胞的内源性细胞蛋白酶和组分，例如聚合酶，核糖体蛋白和伴侣蛋白。基本上纯的蛋白质产品包含例如少于25％，20％，15％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的来自宿主细胞的污染内源性蛋白质(又称宿主细胞蛋白质)、核酸或其它大分子。
回收和纯化产物(例如重组或治疗性多肽)的方法在本领域中是成熟的。为了回收重组或治疗性多肽产物，使用物理或化学或物理化学方法。物理或化学或物理化学方法可以是过滤法，离心法，超速离心法，提取法，冻干法，沉淀法，色谱法或其两种或更多种方法的组合。在一个实施方式中，色谱法包括尺寸排阻色谱法(或凝胶过滤)，离子交换色谱法，例如阴离子或阳离子交换色谱法，亲和色谱法，疏水相互作用色谱法和/或多峰色谱法中的一种或多种。
阻遏物多肽
本文提供了可用于遗传控制回路的阻遏物多肽和阻遏物多肽编码序列、细胞，和用于鉴定、选择或制备能够产生高产量的产物(例如重组或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法。一般而言，阻遏物多肽以调节的方式抑制产物(例如重组或治疗性多肽)的表达。在一些实施方式中，阻遏物多肽编码序列在控制元件的转录控制下，该控制元件根据一种或多种条件活化阻遏物多肽编码序列的转录。在一些实施方式中，阻遏物多肽结合控制元件(例如启动子元件)，所述控制元件操作性地连接至重组或治疗性多肽编码序列。在一些实施方式中，阻遏物多肽与控制元件的结合抑制操作性地连接的重组或治疗性多肽编码序列的转录。在一些实施方式中，阻遏物多肽与编码重组或治疗性多肽的转录物的非翻译区的序列结合。在一些实施方式中，阻遏物多肽与重组或治疗性多肽的转录物的非翻译区的结合抑制重组或治疗性多肽编码序列的翻译。在一些实施方式中，阻遏物多肽与重组或治疗性多肽编码序列的编码序列结合。在一些实施方式中，阻遏物多肽与重组或治疗性多肽的编码序列的结合抑制重组或治疗性多肽编码序列的转录、翻译或转录和翻译。
设想本公开对特定的阻遏物多肽不是特异性的。示例性阻遏物多肽包括但不限于：Cas9分子、TALE分子和锌指分子。在一些实施方式中，阻遏物多肽是本领域已知的Cas相关蛋白。在一些实施方式中，阻遏物多肽是来自I，II或III型CRISPR/Cas系统的蛋白质(例如，如K.S.Makarova等,Nat.Rev.Microbiol.9,467(2011)；K.S.Makarova,N.V.Grishin,S.A.Shabalina,Y.I.Wolf,E.V.Koonin,Biol.Direct 1,7(2006)；或K.S.Makarova,L.Aravind,Y.I.Wolf,E.V.Koonin,Biol.Direct 6,38(2011)中所述)。
在一些实施方式中，阻遏物多肽是Cas9分子。Cas9分子阻遏物多肽需要一个或多个(例如，一个，两个，三个，四个或多于四个)合适的gRNA来抑制重组或治疗性多肽的表达。
在一些实施方式中，阻遏物多肽是TALE分子。
在一些实施方式中，阻遏物多肽是锌指分子。
在一些实施方式中，阻遏物多肽是第一控制元件(例如第一启动子元件)的内源性阻遏物。在一个实施方式中，编码阻遏物多肽的内源基因是无活性的，例如已被敲除或突变以形成功能丧失。
Cas9分子
待在本公开的遗传控制回路、细胞和方法中使用的Cas9分子可包含源自多种物种的多肽。另外，可以将来自一种物种的Cas9分子的一个或多个结构域与来自另一物种的Cas9分子的一个或多个结构域，例如在融合蛋白中组合。其它含Cas9多肽的物种包括：燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)，猪放线杆菌(Actinobacillus suis)，放线菌(Actinomyces sp.)，反硝化环胞菌(cycliphilus denitrificans)，阿米诺单胞菌(Aminomonas paucivorans)，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，史密斯杆菌(Bacillussmithii)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，拟杆菌(Bacteroides sp.)，滨海囊胚(Blastopirellula marina)，缓生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)，侧孢短杆菌(Brevibacillus laterosporus)，大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)，布氏念珠菌(Candidatus Puniceispirillum)，纤维素分解梭菌(Clostridium cellulolyticum)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)，白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)，疣状棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii)，石贝二氮杆菌(Dinoroseobacter shibae)，细长真杆菌(Eubacterium dolichum)，γ蛋白杆菌(gamma proteobacterium)，醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)，副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)，痰嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)，加拿大螺杆菌(Helicobacter canadensis)，西奈螺旋藻(Helicobacter cinaedi)，鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)，多营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)，金格杆菌(Kingellakingae)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，依氏利斯特菌(Listeria ivanovii)，单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，李斯特菌科细菌(Listeriaceaebacterium)，甲基孢囊菌(Methylocystis sp.)，甲烷氧化菌(Methylosinustrichosporium)，羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)，杆状奈瑟菌(Neisseriabacilliformis)，灰奈瑟菌(Neisseria cinerea)，金黄奈瑟氏球菌(Neisseriaflavescens)，乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)，奈瑟氏菌(Neisseria sp.)，瓦茨瓦尔西奈瑟菌(Neisseriawadsworthii)，亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.)，灌洗科特迪瓦小杆菌(Parvibaculumlavamentivorans)，多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)，琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacterium succinatutens)，多杀巴氏杆菌(Ralstonia syzygii)，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，小红卵菌(Rhodovulum sp.)，米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，葡萄芽孢杆菌(Sporolactobacillus vineae)，路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)，链球菌(Streptococcus sp.)，罕见小球菌(Subdoligranulum sp.)，运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis)，密螺旋体菌(Treponema sp.)或艾森氏菌(Verminephrobacter eiseniae)。
Cas9结构和活性
晶体结构对于天然产生的Cas9多肽(Jinek等,Science,343(6176):1247997,2014)和带引导RNA(例如，crRNA和tracrRNA的合成融合体)的酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9(Nishimasu等,Cell,156:935-949,2014；和Anders等,Nature,2014,doi:10.1038/nature13579)而言是可获得的。
在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽包含一个或多个以下结构域：RuvC样结构域和HNH样结构域。在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽是dCas9分子或dCas9多肽，并且dCas9分子或dCas9多肽包含RuvC样结构域，例如缺乏核酸酶活性的RuvC样结构域，和/或HNH样结构域，例如缺乏核酸酶活性的HNH样结构域。
在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽可包含多于一个的RuvC样结构域(例如，一个，两个，三个或更多个RuvC样结构域)。在一个实施方式中，RuvC样结构域包含改变其活性的一个或多个突变，从而RuvC结构域不切割DNA或具有降低的DNA切割活性。在一个实施方式中，RuvC样结构域的长度为至少5、6、7、8个氨基酸，但长度不超过20、19、18、17、16或15个氨基酸。在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽包含长度为约10-20个氨基酸，例如长度为约15个氨基酸的N端RuvC样结构域。
在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽可包含多于一个的HNH样结构域(例如，一个，两个，三个或更多个HNH样结构域)。在一个实施方式中，HNH样结构域包含改变其活性的一个或多个突变，从而HNH样结构域不切割DNA或具有降低的DNA切割活性。在一个实施方式中，HNH样结构域的长度为至少15、20、25个氨基酸，但长度不超过40、35或30个氨基酸，例如，长度为20-35个氨基酸，例如长度为25-30个氨基酸。
在实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽具有与gRNA分子相互作用的能力，并且与gRNA分子联合定位于核心靶结构域，但是无法切割靶核酸，或者无法以高效速率进行切割。没有切割活性或无实质切割活性的Cas9分子在本文中称为dCas9分子或dCas9多肽。例如，dCas9分子或dCas9多肽可能缺乏切割活性或其切割活性基本上小于，例如小于参比Cas9分子或Cas9多肽的切割活性的20％，10％，5％，1％或0.1％，通过本领域已知测定法或本文所述测定法测量。
靶向和PAM
Cas9分子或Cas9多肽是可与引导RNA(gRNA)分子相互作用的多肽，并且与gRNA分子联合，位于包含靶结构域和PAM序列的位点。
在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽与靶核酸相互作用的能力是PAM序列依赖性的。PAM序列是靶核酸中的序列。来自不同细菌物种的Cas9分子可以识别不同的序列基序(例如PAM序列)。可以改造Cas9分子以改变Cas9分子的PAM特异性。示例性的天然产生的Cas9分子描述于Chylinski等,RNA Biology 2013 10:5,727-737。
Cas9结构中的变化
在一些实施方式中，例如在一个或多个RuvC样结构域中可存在一个或多个突变；所述RuvC样结构域例如，N末端RuvC样结构域；HNH样结构域；Cas9分子或Cas9多肽的HNH样结构域和RuvC样结构域之外的区域。在一些实施方式中，一种或多种突变存在于RuvC样结构域，例如N末端RuvC样结构域中。在一些实施方式中，一种或多种突变存在于HNH样结构域中。在一些实施方式中，突变存在于RuvC样结构域(例如N末端RuvC样结构域)和HNH样结构域两者中。
在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽(例如dCas9分子或dCas9多肽)包含氨基酸序列：
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列具有60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性；
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列相比相差不多于2，5，10，15，20，30或40％的氨基酸残基；
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列相差至少1、2、5、10或20个氨基酸，但不多于100、80、70、60、50、40或30个氨基酸；或
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列等同，所述天然产生的Cas9分子序列例如是来自本文所列或以下文献所述的物种的Cas9分子：Chylinski等,RNA Biology 2013 10:5,727-737；Hou等,PNAS Early Edition 2013,1-6。在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽包含一种或多种以下活性：解旋酶活性；或与gRNA分子一起定位到靶核酸的能力。在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽不包含切口酶活性或双链切割活性(例如，核酸内切酶和/或核酸外切酶活性)。
参照化脓链球菌序列，可以在RuvC结构域或HNH结构域中进行的示例性突变包括：D10A，E762A，H840A，N854A，N863A和/或D986A。
示例性的Cas9多肽和Cas9结构域序列可见于WO2015/157070的表50-54。
dCas9阻遏物多肽
在一个实施方式中，Cas9分子或Cas9多肽是与参比Cas9分子相比在RuvC结构域和/或在HNH结构域中包含一个或多个差异的dCas9分子或dCas9多肽，并且所述dCas9分子或dCas9多肽不切割核酸，或以比野生型切割效率低得多的效率切割，例如，如本文所述，在如本文所述的切割试验中，当与野生型比较时，切割参比Cas9分子的少于50％、25％、10％或1％，如本文所述的测定所测量。
Cas9蛋白的两个DNA切割结构域中的关键残基的突变(例如D10A和H840A突变)会导致催化失活的Cas9(dCas9，也称为死亡Cas9)分子的产生。酶失活Cas9(例如dCas9)与gRNA形成复合物，并定位到由该gRNA的靶向结构域指定的DNA序列；但是，它不切割靶DNA。当被募集到编码序列的早期区域时，酶失活(例如dCas9)Cas9分子可阻止转录。附加阻遏可通过将转录阻遏结构域(例如KRAB、SID或ERD)融合到酶失活的Cas9(例如dCas9)上并将其募集到靶序列(例如起始密码子的3'序列的1000bp范围内或例如基因起始密码子的5'的控制元件(例如启动子元件)的1000bp内)来实现。靶向启动子的DNA酶I高敏位点(DHS)(例如，通过使gRNA与DHS互补)可能是基因阻遏(例如，抑制重组或治疗性多肽编码序列)的另一种策略，因为这些区域更可能触及酶失活Cas9(例如dCas9)，并且也可能包含供于内源转录因子的位点。尽管不希望受到理论的束缚，但本文预期阻断内源转录因子或RNA聚合酶的结合位点将有助于下调基因表达，例如重组或治疗性多肽编码序列的表达。在一个实施方式中，一种或多种酶失活Cas9(例如dCas9)分子可用于阻断一种或多种内源转录因子的结合。在另一个实施方式中，可将酶失活Cas9(例如dCas9)分子融合至效应物结构域，例如，阻遏结构域，活化结构域，甲基化酶等。将酶失活Cas9(例如dCas9)融合至效应物结构域能够将效应物募集到gRNA指定的任何DNA位点。改变染色质状态可能会导致靶基因表达的减少。与一种或多种染色质修饰蛋白融合的一种或多种酶失活Cas9分子(例如dCas9)可用于改变染色质状态。
在一个实施方式中，gRNA分子可靶向控制元件(例如启动子元件)，例如与重组或治疗性多肽编码序列操作性地连接的控制元件。在一个实施方式中，gRNA分子可靶向编码重组或治疗性多肽的序列。
gRNA分子
本文中使用的术语gRNA分子是指促进gRNA分子/Cas9分子复合物特异性靶向或归巢至靶序列的核酸。gRNA分子可以是单分子的(包含一个RNA分子)，有时在本文中称为“嵌合”gRNA，也可以是模块式的(包含多于一个，通常是两个独立的RNA分子)。gRNA分子包含多个结构域。
在一个实施方式中，单分子或嵌合gRNA通常包含(从5'至3')：
靶向结构域
第一互补结构域；
连接结构域；
第二互补结构域(其与第一互补结构域互补)；
近端结构域；和
任选地，尾部结构域。
在一个实施方式中，模块式gRNA包含：
第一链，其包含(通常从5’至3’)：
靶向结构域
第一互补结构域；和
第二链，其包含(通常从5’至3’)：
任选地，5’延伸结构域；
第二互补结构域；
近端结构域；和
任选地，尾部结构域。
在一个实施方式中，gRNA包含含有tracrRNA的第一链和含有crRNA的第二链。示例性的tracrRNA和crRNA及其设计方法可见于本领域，例如，见于Jinek等，Science 2012年8月17日:第337卷,第6096期,第816-821页。
示例性gRNA和用于设计gRNA的方法可见于WO2015/157070，Xu,H.等,GenomeRes.2015年8月；25(8):1147-57，和本领域已知方法。
gRNA结构域
靶向结构域包含与靶核酸上的靶序列互补的，例如至少80％、85％、90％或95％互补的(例如完全互补的)核苷酸序列。靶向结构域是RNA分子的部分，因此将包含碱基尿嘧啶(U)，而编码gRNA分子的任何DNA都将包含碱基胸腺嘧啶(T)。在一个实施方式中，据信靶向结构域与靶序列的互补性有助于gRNA分子/Cas9分子复合物与靶核酸的相互作用的特异性。在一个实施方式中，靶向结构域的长度为5-50个核苷酸。在一些实施方式中，靶向结构域与第一控制元件(例如第一启动子元件)，编码重组或治疗性多肽的序列或第一控制元件(例如第一启动子元件)内包含的非翻译区或内含子，或编码重组或治疗性多肽的序列具有互补性。与靶向结构域互补的靶核酸的链在本文中称为互补链。
第一互补结构域与第二互补结构域互补，并且在一个实施方式中，在至少一些生理条件下与第二互补结构域具有足够的互补性以形成双链体区。
第一互补结构域可与天然产生的第一互补结构域共有同源性，或第一互补结构域衍生自天然产生的第一互补结构域。在一个实施方式中，其与来自酿脓链球菌(S.pyogenes)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)或嗜热链球菌(S.thermophilus)的第一互补结构域具有至少50％同源性。连接结构域用于将第一互补结构域与单分子gRNA的第二互补结构域连接。连接结构域可以共价或非共价连接第一和第二互补结构域。在一个实施方式中，连接是共价的。通常，连接结构域包含一个或多个，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
在模块化gRNA分子中，这两个分子通过互补结构域的杂交而相关联。
在一个实施方式中，模块化gRNA可包含第二互补结构域5'的附加序列，在本文中称为5'延伸结构域。在一个实施方式中，5'延伸结构域的长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸。
第二互补结构域与第一互补结构域互补，并且在一个实施方式中，在至少一些生理条件下与第二互补结构域具有足够的互补性以形成双链体区。在一个实施方式中，第二互补性结构域可包括与第一互补性结构域缺乏互补性的序列，例如，从双链体区域环出(loop out)的序列。在一个实施方式中，第二互补结构域的长度为5-27个核苷酸。在一个实施例中，它比第一互补区域长。第二互补性结构域可以与天然产生的第二互补性结构域共有同源性，或第二互补性结构域衍生自天然产生的第二互补性结构域。在一个实施方式中，其与来自酿脓链球菌(S.pyogenes)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)或嗜热链球菌(S.thermophilus)的第二互补结构域具有至少50％同源性。
在一个实施方式中，近端结构域的长度为5-20个核苷酸。在一个实施方式中，近端结构域可与天然产生的近端结构域共有同源性，或近端结构域衍生自天然产生的近端结构域。在一个实施方式中，其与来自酿脓链球菌(S.pyogenes)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)或嗜热链球菌(S.thermophilus)的近端结构域具有至少50％同源性。
在一个实施方式中，尾部结构域的长度为0(缺失)，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一个实施方式中，尾部结构域核苷酸衍生自天然尾部结构域的5'端的序列，或与之同源。在一个实施方式中，其与本文公开的尾部结构域(例如酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌的尾部结构域)具有至少50％同源性。在一个实施方式中，尾部结构域包括彼此互补的序列，并且在至少一些生理条件下，其形成双链体区。
在一个实施方式中，尾部结构域在3'末端包括与体外或体内转录方法相关的核苷酸。当U6启动子用于体内转录时，这些核苷酸可以是序列UUUUUU。
gRNA的设计方法
用于选择和验证gRNA靶序列以及脱靶分析物的方法描述于，例如，Mali等,2013Science 339(6121):823-826；Hsu等Nat Biotechnol,31(9):827-32；Fu等,2014 NatBiotechnol,doi:10.1038/nbt.2808.PubMed PMID:24463574；Heigwer等,2014 NatMethods 11(2):122-3.doi:10.1038/nmeth.2812.PubMed PMID:24481216；Bae等,2014Bioinformatics PubMed PMID:24463181；Xiao A等,2014 Bioinformatics PubMed PMID:24389662。
例如，可以使用软件工具来优化用户靶序列中gRNA的选择，例如，以最小化整个基因组的脱靶活性。脱靶活性可能是DNA结合、DNA切割、DNA切刻或其它活性。对于使用酿脓链球菌Cas9进行的各种可能gRNA选择而言，该工具均可识别整个基因组中的所有脱靶序列(在NAG或NGG PAM之前)，最多包含一定数量(例如1、2、3、4、5，6、7、8、9或10个)错配碱基对。然后，根据每种可能的gRNA的总预测脱靶核酸切割对它们进行排序；排名靠前的gRNA表示可能具有最大中靶切割和最小脱靶切割的gRNA。该工具还可包括其它功能，例如用于CRISPR构造的自动化试剂设计，用于中靶Surveyor分析的引物设计，和用于通过下一代测序进行脱靶切割的高通量检测和定量的引物设计。可以通过本领域已知的方法评估候选gRNA分子。
TALE分子
如本文所用，转录活化因子样效应物(TALE)分子或TALE多肽是指包含多个TALEDNA结合重复结构域(TALE DBD)的分子或多肽，其可归位或定位于由TALE DBD确定的核酸位置。如本文所用，TALE分子和TALE多肽是指天然产生的TALE分子，以及经过工程改造、改变或修饰的TALE分子或TALE多肽，它们与参考序列(例如，本领域已知的最相似的天然产生的TALE分子)相差，例如，至少一个氨基酸残基。
如本文所用的，术语TALE DBD是指33-35个氨基酸的基序，在该基序的第12和第13位上包含两个高变残基(即重复可变双残基，RVD)。TALE DNA结合域(DBD)的RVD指定TALEDBD针对其具有结合亲和性的一个或多个DNA碱基对。当TALE DBD在TALE分子或TALE多肽内以阵列形式组合时，TALE DBD(及其RVD)的顺序决定了TALE分子或TALE多肽针对其具有结合亲和性的DNA序列。天然产生的TALE多肽和TALE DBD是由黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌产生的。
如本文所用，重复可变双残基(RVD)指TALE DBD的第12位和第13位的两个高变氨基酸残基。RVD确定TALE DBD的DNA碱基对亲和性。RVD及其各自的碱基对亲和性的所有可能组合是本领域已知的。参见例如，Cong L.等.Nat Commun.2012年7月24日；3():968；Juillerat A.等.Sci Rep.2015年1月30日；5():8150；Miller J.C.等.Nat Methods 12,465–471(2015)；Streubel J.等.Nat Biotechnol 30,593–595(2012)；和Yang J.等.CellRes 24,628–631(2014)，其各自通过引用其全文的方式纳入本文。考虑将所有可能的RVD与本文所述的阻遏物多肽(例如TALE分子)一起使用。
本文中所用的，术语TALE DBD阵列指TALE分子或TALE多肽内的TALE DBD的特征(identity)和顺序，例如每个TALE DBD的RVD。TALE DBD阵列确定TALE分子或TALE多肽的序列特异性结合亲和性。
在一些实施方式中，阻遏物多肽是TALE分子或TALE多肽。任何黄单胞菌物种的TALE DBD和TALE多肽均可用于遗传控制回路，细胞，以及用于鉴定、选择或制备能够产生高产量的产物(例如重组或治疗性产品，如本文所述)的细胞或细胞系的方法。在一些实施方式中，阻遏物多肽是天然产生的TALE分子或TALE多肽。在一些实施方式中，阻遏物多肽是经工程改造的TALE分子或TALE多肽，即与天然产生的TALE分子或TALE多肽或与本领域已知的另一种经工程改造的TALE分子或TALE多肽相差一个或多个氨基酸的TALE分子或TALE多肽。
在一些实施方式中，经工程改造的TALE分子或TALE多肽包含氨基酸序列：
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列具有60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性；
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列相比相差不多于2，5，10，15，20，30或40％的氨基酸残基；
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列相差至少1、2、5、10或20个氨基酸，但不多于100、80、70、60、50、40或30个氨基酸；或
该氨基酸序列与本文所述的任何TALE分子序列或天然产生的TALE分子(例如，来自本文列出或在本文引用的出版物中描述的物种的TALE分子)序列相同。
在一些实施方式中，TALE分子定位于由该TALE分子的TALE DBD阵列指定的靶DNA序列。在一些实施方式中，当TALE分子被募集到编码序列(例如重组或治疗性多肽的编码序列)的早期区域时，其可阻断转录。在一些实施方式中，当TALE分子被募集至操作性地连接至重组或治疗性多肽编码序列的控制元件(例如启动子元件)时，其可阻断转录。在一些实施方式中，可通过将转录阻遏结构域(例如，KRAB，SID或ERD)融合到TALE分子上来实现附加阻遏，从而能够将效应物募集到由TALE DBD阵列指定的任何DNA位点。
在一些实施方式中，TALE分子包含两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个)TALE DBD。
在一些实施方式中，阻遏物多肽(例如TALE分子)的TALE DBD阵列指定靶DNA序列。在一些实施方式中，由TALE DBD阵列指定的靶序列包含在与重组或治疗性多肽编码序列操作性地连接的控制元件(例如启动子元件)内。在一些实施方式中，由TALE DBD阵列指定的靶序列包含重组或治疗性多肽编码序列。
示例性的天然产生和经工程改造的TALE多肽序列以及用于设计和测试TALE多肽的方法(其伴随本文所述的遗传控制回路、细胞，以及用于鉴定、选择或制备能够产生高产量的产物(例如重组多肽或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法使用)可见于本领域中，例如，描述于Zhang F等.Nat Biotechnol.2011；29:149–153；Geissler R等.PLoS One.2011；6:e19509；Garg A等.Nucleic Acids Res.2012；Bultmann S等.Nucleic Acids Res.2012；40:5368–5377；Cermak T等.定制的TALEN和其他基于TAL效应子的构建体的高效设计和组装以进行DNA靶向(Efficient design and assembly of custom TALEN and other TALeffector-based constructs for DNA targeting).Nucleic Acids Res.2011；39:e82；Cong L等.Nat Commun.2012；3:968；和Miller JC等.Nat Biotechnol.2011；29:143–148，其通过引用其全文的方式纳入本文。
锌指分子
如本文中所使用的，锌指分子是指包含多个锌指结构域(ZFD)的分子或多肽。锌指分子对特定DNA序列具有亲和性，该特定DNA序列由锌指分子包含的ZFD的特征和顺序决定。
如本文所用的锌指结构域(ZFD)指以序列特异性方式结合DNA并且需要锌离子配体以结合DNA的多肽家族中的任何一个。已经研究和表征了许多ZFD家族(参见例如，Krishna,SS.等.Nucl.Acids Res.(2003)31(2):532-550)。本公开内容设想了锌指分子，其可包含本领域技术人员已知的任何类型或来源的ZFD。不意在受限于任何特定类型的ZFD，本公开内容设想了包含Cys2His2 ZFD的锌指分子，其是本领域中最流行和研究最充分的ZFD。Cys2His2 ZFD包含两条β链，其形成反平行β折叠，和一个α螺旋。已知α螺旋的-1、1、2、3、5和6位通过与DNA碱基对相互作用来指定DNA序列特异性结合。在一个实施方式中，Cys2His2ZFD可对3个碱基对的靶序列具有特异性结合亲和性。在一个实施方式中，Cys2His2 ZFD可以情况特定的方式(context specific manner)与靶序列附近的其它碱基对特异性相互作用，即取决于锌指分子内相邻ZFD的存在和特性。
如本文中所使用的，锌指结构域阵列或ZFD阵列是指锌指分子或锌指多肽内ZFD的特性和顺序。ZFD阵列确定锌指分子或锌指多肽的序列特异性结合亲和性。
在一些实施方式中，阻遏物多肽是锌指分子或锌指多肽。来自任何物种(例如哺乳动物物种，例如人类)的ZFD和锌指多肽可用于遗传控制回路，细胞，以及鉴定、选择或制备能够产生高产量的产物(例如本文所述的重组或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法。在一些实施方式中，阻遏物多肽是天然产生的锌指分子或锌指多肽。在一些实施方式中，阻遏物多肽是经工程改造的锌指分子或锌指多肽，即这样的锌指分子或锌指多肽，其与天然产生的锌指分子或锌指多肽或本领域已知的另一种经工程改造的锌指分子或锌指多肽相差一个或多个氨基酸。
在一些实施方式中，经工程改造的锌指分子或锌指多肽包含氨基酸序列：
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列具有60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同源性；
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列相比相差不多于2，5，10，15，20，30或40％的氨基酸残基；
该氨基酸序列与本文所述的任何Cas9分子序列或天然产生的Cas9分子序列相差至少1、2、5、10或20个氨基酸，但不多于100、80、70、60、50、40或30个氨基酸；或
该氨基酸序列与本文所述的任何锌指分子序列或天然产生的锌指分子(例如，来自本文列出或在本文引用的出版物中描述的物种的锌指分子)序列相同。
在一些实施方式中，锌指分子定位于该锌指分子的ZFD阵列所指定的靶DNA序列。在一些实施方式中，当锌指分子被募集到编码序列(例如重组或治疗性多肽的编码序列)的早期区域时，其可以阻断转录。在一些实施方式中，当锌指分子被募集至操作性地连接至重组或治疗性多肽编码序列的控制元件(例如启动子元件)时，其可阻断转录。在一些实施方式中，可通过将转录阻遏结构域(例如，KRAB，SID或ERD)融合到锌指分子上来实现附加阻遏，从而能够将效应物募集到由ZFD阵列指定的任何DNA位点。
在一些实施方式中，锌指分子包含两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多)ZFD。在一些实施方式中，可从具有已知靶序列亲和性的ZFD构建ZFD阵列，以产生具有所需特定靶序列的锌指分子或锌指多肽。
在一些实施方式中，阻遏物多肽(例如锌指分子)的ZFD阵列指定靶DNA序列。在一些实施方式中，由ZFD阵列指定的靶序列包含在与重组或治疗性多肽编码序列操作性地连接的控制元件(例如启动子元件)内。在一些实施方式中，由ZFD阵列指定的靶序列包含重组或治疗性多肽编码序列。
示例性的天然产生和经工程改造的锌指多肽序列，和用于设计和测试锌指多肽(其伴随本文所述的遗传控制回路、细胞，和以及鉴定、选择或制备能够产生高产量的产物(例如重组或治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法使用)的方法可见于本领域，例如描述于Wolfe SA等.Annu Rev Biophys Biomol Struct.2000；29:183–212；Pabo CO等.Annu RevBiochem.2001；70:313–340；Greisman HA,Pabo CO.Science.1997；275:657–661；Isalan M等.Proc Natl Acad Sci USA.1997；94:5617–5621；Wolfe SA等.J Mol Biol.1999；285:1917–1934，其通过引用其全文纳入本文。
用于设计ZFD和ZFD阵列以结合特定靶DNA序列的方法可见于本领域，例如，描述于Maeder ML等.Mol Cell.2008；31:294–301；Sander JD等.Nat Methods.2011；8:67–69；和Meng X等.Nat Biotechnol.2008；26:695–701，其通过引用其全文纳入本文。
生产应用
本文公开的细胞，方法，试剂盒，反应混合物和核酸可用于生物反应器或加工容器或罐中，或更一般地与任何进料源一起使用。本文所述的装置，设备和方法适用于培养任何所需的细胞系，包括原核和/或真核细胞系。还包括工业设备，其包括适合于培养悬浮细胞或锚定依赖性(贴壁)细胞，且适合于配置用于生产药物和生物药物产品(例如多肽产品，核酸产品(例如DNA或RNA)，或哺乳动物或微生物细胞和/或病毒，例如用于细胞和/或病毒和微生物群疗法的那些)的生产操作的组件或组分。
在实施方式中，细胞表达或产生产物，例如重组治疗或诊断性产物。如下更加详细的描述，细胞产生的产物的实例包括但不限于抗体分子(例如，单克隆抗体，双特异性抗体)，抗体模拟物(特异性结合抗原的多肽分子，但是与抗体诸如DARP素、亲和体、阿迪连接素(adnectin)或IgNAR结构上不相关的抗原)，融合蛋白(例如，Fc融合蛋白，嵌合细胞因子)，或其它重组蛋白(例如，糖基化蛋白，酶，激素)，病毒治疗(例如，基因疗法和病毒免疫疗法的病毒载体，抗癌溶瘤细胞)，细胞治疗(例如，多能干细胞，间充质干细胞和成体干细胞)，疫苗或脂质包封的颗粒(例如，外来体，病毒样颗粒)，RNA(例如，siRNA)或DNA(例如，质粒DNA)，抗生素或氨基酸。在实施方式中，装置、设备和方法可以用于产生生物仿制药。
还包括工业设备，其包括允许进行下述活动的组件或组分：产生真核细胞，例如，哺乳动物细胞或低等真核细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞，或原核细胞，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞和/或真核或原核细胞的产物，例如，蛋白质，肽，抗生素，氨基酸，核酸(如DNA或RNA)，由真核细胞以大规模方式合成。除非在本文中另外说明，装置、设备和方法可以包括任何体积或生产能力，包括但不限于，实验室规模，中试规模和全面生产规模能力。
此外，除非在本文中另外说明，设备可包括任何合适的反应器，包括但不限于，搅拌槽，空运，纤维，微纤维，中空纤维，陶瓷基质，流化床，固定床和/或喷射床生物反应器。本文所用的“反应器”可包括发酵罐或发酵单元，或任何其它反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可以互换使用。例如，在一些方面中，示例性的生物反应器单元可以进行下述内容的一种或多种或所有：营养物和/或碳源的进料，注入合适的气体(例如氧气)，发酵或细胞培养基的入口和出口流动，气相和液相的分离，维持温度，维持氧气和CO2水平，维持pH水平，搅拌(例如，混合)和/或清洁/消毒。示例性反应器单元，如发酵单元，在单元内可以包含多个反应器，例如，单元在各单元中可以具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或更多个生物反应器，和/或设备可以包含在设备内具有单个或多个反应器的多个单元。在各种实施方式中，生物反应器可以适用于批次，半批次、分批补料、灌注和/或连续发酵过程。可采用任何合适的反应器。在实施方式中，生物反应器可以具有约100mL至约50,000L的体积。非限制性的实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升的体积。此外，合适的反应器可以是多次使用，单次使用，一次性或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包括金属合金，如不锈钢(例如，316L或任何其它合适的不锈钢)和铬镍铁合金，塑料和/或玻璃。
在实施方式中并且除非本文另外说明，本文所述的设备还可包括并未另外提及的任何合适的单元操作和/或器材，如用于分离、纯化和/或分离这些产物的操作和/或器材。可以使用任何合适的设备和环境，如传统的粘贴建立设备，模块化，流动和临时设备，或任何其它合适的结构，设备和/或布置。例如，在一些实施方式中，可使用模块化的清洁室。此外，并且除非另外说明，本文所述的装置、系统和方法可以封装于单一位置或设备和/或在其中进行，或者，可以封装于分开的或多个位置和/或设备中和/或在其中进行。
作为非限制实例且不构成任何限制，美国专利公开号2013/0280797；2012/0077429；2011/0280797；2009/0305626；和美国专利号8,298,054；7,629,167；和5,656,491描述了可能合适的示例性设备、装置和/或系统，其通过引用其全文纳入本文。
示例性序列
hCMV启动子和内含子中的示例性引导RNA靶序列
(PAM序列带下划线)
全为5’至3’
gRNA 1
TGTCAACATGGCGGTAATGTTGG(SEQ ID NO:1)
gRNA 2
TACCGCCCATTTGCGTCAATGGG(SEQ ID NO:2)
gRNA 3
CTACCGCCCATTTGCGTCAATGG(SEQ ID NO:3)
gRNA14
ACCGTTAACAGCACCGCAACGGG(SEQ ID NO:4)
序列5–被gRNA靶向的hCMV-MIE区域
>pEE12.4(5421bp-7528bp,直接)2108bp
CTGCAGTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAAAAATCGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAACTGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTCCAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACGATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTA
ACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACG(SEQ ID NO:5)
序列6–U6启动子
TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC(SEQ ID NO:6)
序列7–Grp78启动子
>GA_Grp78_dCas9_Ub_Puro_U6_RGR_2+1+3(15bp-1508bp,直接)1494bp
TAGCATAAGCTACAGATCAACCAGGTTATCAATTCTACCTGTACCACTCACCAGTGACTATTCTATTTAGCCACCCCCCCCCCAATGATCTCTTCTGGAAAATGGGAAACATCTACCAAGAATTAATCAAAGGACTAAATGACACATGCAAAAAAAAAAAAACCTTAGAACAGTGTTTTAAGCAGGATAAGTAGTTCAAGACCAGTTTGGACCATGTCTCAAAACTAAAGGAACAACGAAGTACATTTAGTATTTTTTGCAACATGTTATTATTACATAGCATCAGGAAGACAATTTTTTCTTTGTCTGCTAAATGCCTTTGTCATATCAGACCTATTTCAAGAGTCAGGATAGAATGGTGTCAAGAAGGGATGAGGAAGGACTTGTAAATTATAACCAAGCCACAAATGAAAATGATAGACAAGGATCGGGAACATTATGGGGCGACAAGCTAGAGAAAAAAAATGATATATTCCAGGGTGGAAAGTGC
TCGCTTGACTATTCATAGAACAGAATAGCCACAGCATAGCGGGGGGCTCAGTACTAGGTTGCAAATGGCCAGGCCAATTCTGGGACTTAACCCCAAGAAAAGAAAAATTGGCAAGGCCAGGATAGACAAATGCAGCTGGCCTAGGGGTGAAGGGAAAACAGTTGGCTGAGAAGAGCCACGATTCGCAGAGAGGCAGAACACAGACTAGGACCCAGCTCGAGACGTGCAGGCCGGGTGGGTAACATAGAGCCCGGGCGCTCGGCTACCCGAGAACGTGAGGGAGGCTGGGAAGGGCAGAGATGCGTTCCCAGGCGACCACAGCATCTATGCTGAGGCTGAGCAGCTCGGGACCCGAGGGGACTTAGGAGGAGAAAAGGCCGCATACTGCTTCGGGGTAAGGGACAGACCGGGGAAGGACCCAAGTCCCACCGCCCAGAGGGAACTGACACGCAGACCCCGCAGCAGTCCCCGGGGGCCGGGTGACGGGAGGACCTGGACGGTTACCGGCGGAAACGGTCTCGGGTTGAGAGGTCACCTGAGATGCTGCCTCTCATTGGCGGCCGTTGAGAGTAACCAGTAGCCAATGAGTCAGCCCGGGGGGCGTAGCGGTGACGTAAGTTGCGGAGGAGGCCGCTTCGAATCGGCAGCGGCCAGCTTGGTGGCATGGACCAATCAGCGTCCTCCAACGAGAAGCGCCTTCACCAATCGGAGGCCTCCACGACGGGGCTGGGGGGAGGGTATATAAGCCAAGTCGGCGGCGGCGCGCTCCACACTGGCCAAGACAACAGTGACCGGAGGACCTGCCTTTGCGGCTCCGAGAGGTAAGCGCCGCGGCCTGCTCTTGCCAGACCTCCTTTGAGCCTGTCTCGTGGCTCCTCCTGACCCGGGGGGCTTCTGTCGCCCTCAGATCGGAACGCCGCCGCGCTCCGGGACTACAGCCTGTTGCTGGACTTCGAGACTGCAGACGGACCGACCGCTGAGCACTGGCCCACAGCGCCGGCAAG(SEQ ID NO:7)
HRE共有序列1:
nGAAnnTTCnnGAA(SEQ ID NO:8)
HRE共有序列2:
nGAAnnGAAnnTTCn(SEQ ID NO:9)
HRE共有序列3:
nGAAnnGAAnnGAAn(SEQ ID NO:10)
HRE共有序列4:
nTTCnnGAAnnGAAn(SEQ ID NO:11)
CRE共有序列:
TGACGTCA(SEQ ID NO:12)
ARE共有序列:
TGAG/CnnnGC(SEQ ID NO:13)
ERSE共有序列:
CCAAT(N9)CCACG(SEQ ID NO:14)
野生型酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9:
dCas9:
GAAGTTACTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC(SEQ ID NO:17)
GAAGTTACTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGATAGTATAGGAACTTC(SEQ ID NO:18)
GAAGTTACTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTACTTAGTATAGGAACTTC(SEQ ID NO:19)
编号的实施方式
1.一种细胞，其包含：
第一控制元件，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；
第二控制元件，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
任选地，第三控制元件，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)gRNA的序列；
其中：
i)第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平；或
ii)第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，和
其中，在第二条件存在下，所述治疗性多肽的表达被调节。
2.一种细胞，其包含：
第一控制元件，其操作性地连接至插入位点；
第二控制元件，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
任选地，第三控制元件，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)gRNA的序列；
其中：
i)第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平；或
ii)第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，
其中，所述插入位点适合于插入编码外源治疗性多肽的序列，和
在第二条件存在下，所述治疗性多肽的表达被调节。
3.如段落1或2中任一段所述的细胞，其中，所述调节是可逆的。
4.如段落1或2中任一段所述的细胞，其中，所述调节是不可逆的。
5.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第二控制元件在第N个条件下具有第N个活性水平，其中N为3、4、5、6、7、8、9或10，并且在第N个条件存在下，相对于先前条件下的治疗性多肽的表达，所述治疗性多肽的表达经调节。
6.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第三控制元件在第N个条件下具有第N个活性水平，其中N为3、4、5、6、7、8、9或10，并且在第N个条件存在下，相对于先前条件下的治疗性多肽的表达，所述治疗性多肽的表达经调节。
7.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一控制元件和编码外源治疗性多肽的序列位于第一核酸上，并且所述第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于第二核酸上。
8.如段落7所述的细胞，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第一核酸上。
9.如段落7所述的细胞，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第二核酸上。
10.如段落7所述的细胞，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第三核酸上。
11.如段落1-6中任一段所述的细胞，其中，所述第一控制元件，编码外源治疗性多肽的序列，所述第二控制元件，和编码阻遏物多肽的序列位于同一核酸上。
12.如段落11所述的细胞，其中，所述第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列与所述第一控制元件、编码外源治疗性多肽的序列、所述第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于同一核酸上。
13.如段落11所述的细胞，其中，所述第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列与所述第一控制元件、编码外源治疗性多肽的序列、所述第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于分开的核酸上。
14.如段落7-13中任一段所述的细胞，其中，一种或多种核酸包含在适于稳定表达的载体(例如质粒)内。
15.如段落7-13中任一段所述的细胞，其中，一种或多种核酸包含在适于瞬时表达的载体内。
16.如段落14或15所述的细胞，其中一种或多种核酸包含在同一载体内。
17.如段落14或15所述的细胞，其中，各核酸包含在不同的载体上。
18.如段落7-13中任一段所述的细胞，其中一种或多种核酸包含在单一染色体内。
19.如段落7-13中任一段所述的细胞，其中，各核酸包含在不同的染色体内。
20.如段落7-10中任一段所述的细胞，其中，所述第一核酸包含在载体内，而所述第二核酸包含在染色体内。
21.如段落7-10中任一段所述的细胞，其中，所述第一核酸包含在染色体内，而所述第二核酸包含在载体内。
22.如段落10所述的细胞，其中，所述第一核酸包含在载体内，所述第二核酸包含在染色体内，并且所述第三核酸包含在载体内。
23.如段落10所述的细胞，其中，所述第一核酸包含在染色体内，所述第二核酸包含在载体内，并且所述第三核酸包含在载体内。
24.如段落10所述的细胞，其中，所述第一核酸包含在载体内，所述第二核酸包含在染色体内，并且所述第三核酸包含在染色体内。
25.如段落10所述的细胞，其中，所述第一核酸包含在染色体内，所述第二核酸包含在载体内，并且所述第三核酸包含在染色体内。
26.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，应激反应诱导来自第二控制元件或第三控制元件的阻遏物多肽的表达。
27.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽抑制治疗性多肽的表达。
28.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一控制元件响应阻遏物多肽。
29.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一控制元件包括第一启动子元件，并且所述第一启动子元件在阻遏物多肽不存在时具有以下特性之一：
a)其为组成型的；
b)其为经调节的；或
c)其在细胞生长的第一阶段具有第一表达水平，在生长的第二阶段具有第二表达水平。
30.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，在阻遏物多肽不存在时，所述第一启动子元件是组成型的。
31.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一启动子元件选自表5。
32.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述治疗性多肽包含：
融合蛋白；
多结构域多肽；
双特异性抗体分子；
多特异性抗体分子；
多特异性分子；和
包含配体和抗体分子的分子。
33.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述治疗性多肽选自表1-4。
34.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第二控制元件或第三控制元件选自表5或表6，或包含启动子，所述启动子包含与选自表5或6的序列相比具有0、1、2或3个碱基取代的序列。
35.如段落34所述的细胞，其中，所述第三控制元件选自表6，并且所述第二控制元件选自表5。
36.如段落34所述的细胞，其中，所述第三控制元件选自表5，并且所述第二控制元件选自表6。
37.如段落1-34中任一段所述的细胞，其中，所述第二控制元件包括第二启动子元件，并且所述第二启动子元件是组成型的，并且其中，所述第三控制元件包括第三启动子元件，所述第三启动子元件在第一条件下具有第一活性水平，且在第二条件下具有第二活性水平。
38.如段落1-34中任一段所述的细胞，其中，所述第二控制元件包括第二启动子元件，其在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且其中，所述第三控制元件包含第三启动子元件，并且所述第三启动子元件是组成型的。
39.如段落1-38中任一段所述的细胞，其中，第二控制元件或第三控制元件包括一个或多个热休克元件(HSE)，cAMP反应元件(CRE)，抗氧化反应元件(ARE)或内质网反应元件(ERSE)。
40.如段落1-38中任一段所述的细胞，其中，第二控制元件或第三控制元件由热休克反应或未折叠蛋白质反应(UPR)的元件调节。
41.如段落1-38中任一段所述的细胞，其中，第二控制元件或第三控制元件由错误折叠蛋白质的积累来调节。
42.如段落1-38中任一段所述的细胞，其中，第二控制元件或第三控制元件包含Xbp1响应性启动子元件。
43.如段落1-38中任一段所述的细胞，其中，第二控制元件或第三控制元件包含Grp78启动子元件。
44.如段落1-38中任一段所述的细胞，其中，第二控制元件或第三控制元件包含ATF6响应性启动子元件、ATF4响应性启动子元件、NRF2响应性启动子元件或Hsf1响应性启动子元件。
45.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，阻遏物多肽导致外源治疗性多肽的活性、水平或表达降低。
46.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽特异性结合靶核酸序列。
47.如段落1-46中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽特异性结合控制元件。
48.如段落1-46中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽特异性结合启动子。
49.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽导致外源治疗性多肽的转录减少。
50.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽结合至编码所述外源治疗性多肽的核酸，或者结合至与编码所述外源治疗性多肽的核酸操作性地连接的第一启动子。
51.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽减少外源治疗性多肽的翻译。
52.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽包含Cas9分子。
53.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽包含与天然产生的Cas9相比具有修饰的切割活性的Cas9分子。
54.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽包含在HNH和RuvC结构域之一或两者中均缺乏切割活性的Cas9分子。
55.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽包含dCas9分子。
56.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述阻遏物多肽包含Cas9分子，所述Cas9分子还包含使所述外源治疗性多肽的阻遏增强的异源阻遏物结构域。
57.如段落56所述的细胞，其中，所述异源阻遏物结构域选自下组：Kox1的KRAB(Krupel相关盒)结构域，HP1α的CS(染色体阴影(chromoshadow))结构域，Hes1的WPRW结构域，和mSin3相互作用结构域的四个串联拷贝(SID4X)。
58.如段落52-57中任一段所述的细胞，其中，当与gRNA复合时，Cas9分子以序列特异性方式结合至靶核酸。
59.如段落52-58中任一段所述的细胞，其中，当与gRNA复合时，Cas9分子与非翻译序列结合。
60.如段落52-59中任一段所述的细胞，其中，所述Cas9分子:gRNA复合物结合至所述第一控制元件。
61.如段落52-60中任一段所述的细胞，其中，所述Cas9分子:gRNA复合物结合至编码所述外源治疗性多肽的序列。
62.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞还包含第N个序列，其编码操作性地连接至第三控制元件的第N个gRNA，其中N为2、3、4、5、6、7、8、9或10。
63.如前述权利要求中任一段所述的细胞，其中，所述第三控制元件是所述第二控制元件的另一拷贝。
64.如段落1-62中任一段所述的细胞，其中第三控制元件是第一控制元件的另一拷贝。
65.如段落1-63中任一段所述的细胞，其中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，gRNA的表达被调节。
66.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第三控制元件具有以下特性之一：
a)其为组成型的；
b)其为经调节的；或
c)其在细胞生长的第一阶段具有第一表达水平，在细胞生长的第二阶段具有第二表达水平。
67.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，第二活性水平大于第一活性水平。
68.如前述权利要求中的任一段所述的细胞，其中，所述第一条件是第一应激水平，并且所述第二条件是第二应激水平。
69.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一条件是未折叠或错误折叠的多肽的第一水平，并且所述第二条件是未折叠或错误折叠的多肽的第二水平。
70.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一条件是折叠的外源治疗性多肽的第一水平，并且所述第二条件是折叠的外源治疗性多肽的第二水平。
71.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一条件是胞液中未折叠或错误折叠的多肽的第一水平，并且所述第二条件是胞液中未折叠或错误折叠的多肽的第二水平。
72.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述第一条件是内质网(ER)中未折叠或错误折叠的多肽的第一水平，并且所述第二条件是所述ER中未折叠或错误折叠的多肽的第二水平。
73.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，第一条件/第二条件对选自下组：
蛋白质聚集的第一水平和蛋白质聚集的第二水平；
外源治疗性多肽上的第一糖基化模式的第一水平和外源治疗性多肽上的第一糖基化模式的第二水平；
外源治疗性多肽上的第一糖基化模式的水平和外源治疗性多肽上的第二糖基化模式的水平；
细胞活力的第一水平和细胞活力的第二水平；
热休克反应(HSR)活化的第一水平和HSR活化的第二水平；
未折叠蛋白质反应(UPR)活化的第一水平和UPR活化的第二水平；
游离ER分子伴侣的第一水平和游离ER分子伴侣的第二水平；
第一温度和第二温度；
氧化应激的第一水平和氧化应激的第二水平；
ER Ca+2的第一水平和ER Ca+2的第二水平；
第一ER氧化态和第二ER氧化态；
第一细胞能量水平和第二细胞能量水平；
第一ATP水平和第二ATP水平；
第一葡萄糖水平和第二葡萄糖水平；
活化的Hsf1多肽的第一水平和活化的Hsf1多肽的第二水平；
磷酸化三聚体Hsf1多肽的第一水平和磷酸化三聚体Hsf1多肽的第二水平；
活性Xbp1多肽的第一水平和活化Xbp1多肽的第二水平；
ATF4多肽的第一水平和ATF4多肽的第二水平；
NRF2多肽的第一水平和NRF2多肽的第二水平；和
ATF6多肽的第一水平和ATF6多肽的第二水平。
74.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，应激反应诱导阻遏物多肽的表达，其中阻遏物多肽抑制治疗性多肽的表达。
75.如前述段落中任一段所述的细胞，其中，与第一条件下的表达相比，在第二条件下，外源治疗性多肽的表达降低至少5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。
76.一种用于表达治疗性多肽的试剂盒，其包含前述段落中任一段所述的细胞。
77.一种核酸，其包括：
第一控制元件，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；
第二控制元件，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
任选地，第三控制元件，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)gRNA的序列；
其中：
i)第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平；或
ii)第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，和
其中，在第二条件存在下，所述治疗性多肽的表达被调节。
78.一种核酸，其包括：
第一控制元件，其操作性地连接至插入位点；
第二控制元件，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
任选地，第三控制元件，其操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)gRNA的序列；
其中：
i)第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平；或
ii)第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，
其中，所述插入位点适合于插入编码外源治疗性多肽的序列，和
在第二条件存在下，所述治疗性多肽的表达被调节。
79.如段落77或78所述的核酸，其中，所述第一控制元件和编码外源治疗性多肽的序列包含在第一核酸上，并且所述第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列包含在第二核酸上。
80.如段落79所述的核酸，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第一核酸上。
81.如段落79所述的核酸，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第二核酸上。
82.如段落79所述的核酸，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第三核酸上。
83.如段落77或78所述的核酸，其中，第一控制元件、编码外源治疗性多肽的序列、第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列包含在同一核酸上。
84.如段落83所述的核酸，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列与第一控制元件，编码外源治疗性多肽的序列，第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于同一核酸上。
85.如段落83所述的核酸，其中，第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列与第一控制元件，编码外源治疗性多肽的序列，第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于分开的核酸上。
86.如段落79-85中任一段所述的核酸，其中，一种或多种核酸包含在适于稳定表达的载体内。
87.如段落79-85中任一段所述的核酸，其中，一种或多种核酸包含在适于瞬时表达的载体内。
88.如段落86或87所述的核酸，其中，一种或多种核酸包含在同一载体内。
89.如段落86或87所述的核酸，其中，各核酸包含在不同的载体上。
90.如段落79-85中任一段所述的核酸，其中，一种或多种核酸包含在单一染色体内。
91.如段落79-85中任一段所述的核酸，其中，各核酸包含在不同的染色体内。
92.如段落79-82中任一段所述的核酸，其中，第一核酸包含在载体内，而第二核酸包含在染色体内。
93.如段落79-82中任一段所述的核酸，其中，第一核酸包含在染色体内，而第二核酸包含在载体内。
94.如段落82所述的核酸，其中，所述第一核酸包含在载体内，所述第二核酸包含在染色体内，并且所述第三核酸包含在载体内。
95.如段落82所述的核酸，其中，所述第一核酸包含在染色体内，所述第二核酸包含在载体内，并且所述第三核酸包含在载体内。
96.如段落82所述的核酸，其中，所述第一核酸包含在载体内，所述第二核酸包含在染色体内，并且所述第三核酸包含在染色体内。
97.如段落82所述的核酸，其中，所述第一核酸包含在染色体内，所述第二核酸包含在载体内，并且所述第三核酸包含在染色体内。
98.一种用于表达治疗性多肽的试剂盒，其包含段落77-97中任一段所述的核酸。
99.一种制备如段落1-75中任一段所述的细胞的方法，包括：
a)在细胞中形成或提供编码第一控制元件的第一核酸序列，所述第一控制元件操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；
b)在细胞中形成或提供编码第二控制元件的第二核酸，所述第二控制元件操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
c)任选地，在细胞中形成或提供编码第三控制元件的第三核酸，所述第三控制元件操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9，10个或更多)gRNA的序列，
其中：
i)第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平；或
ii)第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，和
其中，在第二条件存在下，所述治疗性多肽的表达被调节，
由此制备所述细胞。
100.如段落99所述的方法，其中，在细胞中形成或提供第一核酸序列包括将第一核酸序列引入所述细胞。
101.如段落100所述的方法，其中，将第一核酸序列引入所述细胞包括选自以下的技术：瞬时转染，稳定转染，转导和转化。
102.如段落99-101中任一段所述的方法，其中，在细胞中形成或提供第二核酸序列包括将第二核酸序列引入所述细胞。
103.如段落102所述的方法，其中，将第二核酸序列引入所述细胞包括选自以下的技术：瞬时转染，稳定转染，转导和转化。
104.如段落99-102中任一段所述的方法，其中，在细胞中形成或提供第三核酸序列包括将第三核酸序列引入所述细胞。
105.如段落104所述的方法，其中，将第三核酸序列引入所述细胞包括选自以下的技术：瞬时转染，稳定转染，转导和转化。
106.如段落99所述的方法，其中(a)、(b)和任选地(c)包括将第一、第二和第三核酸同时引入所述细胞。
107.如段落99所述的方法，其中(a)、(b)和可选地(c)顺序发生。
108.如段落99所述的方法，其中，在细胞中形成或提供第一核酸序列包括将编码外源治疗性多肽的序列插入到所述细胞中与第一控制元件操作性地连接的合适的插入位点。
109.如段落99所述的方法，其中，在细胞中形成或提供第二核酸序列包括将编码阻遏物多肽的序列插入到所述细胞中与第二控制元件操作性地连接的合适的插入位点。
110.如段落99所述的方法，其中，在细胞中形成或提供第三核酸序列包括将编码一个或多个gRNA的序列插入到所述细胞中与第三控制元件操作性地连接的合适的插入位点。
111.一种制备治疗性多肽的方法，包括：
a)获取段落1-75中任一段所述的细胞，和
b)在允许制备所述治疗性多肽的条件下培养所述细胞，
由此制备所述治疗性多肽。
112.一种制备治疗性多肽的方法，包括：
a)获取细胞；
b)在细胞中形成或提供编码第一控制元件的第一核酸序列，所述第一控制元件操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；
c)在细胞中形成或提供编码第二控制元件的第二核酸，所述第二控制元件操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
d)任选地，在细胞中形成或提供编码第三控制元件的第三核酸，所述第三控制元件操作性地连接至编码一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9，10个或更多)gRNA的序列，
其中：
i)第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平；或
ii)第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，和
其中，在第二条件存在下，所述治疗性多肽的表达被调节，和
e)在允许制备所述治疗性多肽的条件下培养所述细胞，
由此制备所述治疗性多肽。
113.一种反应混合物，包含：
如段落1-75中任一段所述的细胞，和
培养基；
其中，所述培养基适于表达所述治疗性多肽。
114.一种遗传控制回路，包括：
第一控制元件，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；
第二控制元件，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
任选地，第三控制元件，其操作性地连接至编码一个或多个gRNA的序列，
其中：
i)第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平；或
ii)第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，和
其中，在第二条件存在下，所述治疗性多肽的表达被调节。
115.如段落114所述的遗传控制回路，其中，所述调节是可逆的。
116.如段落114或115所述的遗传控制回路，其中，应激反应诱导来自第二控制元件的阻遏物多肽的表达。
117.如段落114-116中任一段所述的遗传控制回路，其中，所述阻遏物多肽抑制治疗性多肽的表达。
118.如段落114-117中任一段所述的遗传控制回路，其中，第一控制元件响应阻遏物多肽。
119.如段落114-118中任一段所述的遗传控制回路，其中，所述治疗性多肽包括：
融合蛋白；
多结构域多肽；
双特异性抗体分子；
多特异性抗体分子；
多特异性分子；和
包含配体和抗体分子的分子。
120.如段落114-119中任一段所述的遗传控制回路，其中，所述治疗性多肽选自表1-4。
121.如段落114-120中任一段所述的遗传控制回路，其中，第二控制元件或第三控制元件选自表5或表6。
122.如段落114-120中任一段所述的遗传控制回路，其中，第三控制元件选自表6，第二控制元件选自表5。
123.如段落114-120中任一段所述的遗传控制回路，其中，第三控制元件选自表5，第二控制元件选自表6。
124.如段落114-120中任一段所述的遗传控制回路，其中，第二控制元件包括第二启动子元件，并且第二启动子元件是组成型的，并且其中，第三控制元件包括第三启动子元件，其在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平。
125.如段落114-120中任一段所述的遗传控制回路，其中，第二控制元件包括第二启动子元件，其在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，其中，第三控制元件包括第三启动子元件，并且第三启动子元件是组成型的。
126.如段落114-121中任一段所述的遗传控制回路，其中，第三控制元件是第一控制元件的拷贝。
127.如段落114-121中任一段所述的遗传控制回路，其中，第三控制元件是第二控制元件的拷贝。
128.如段落114-127中任一段所述的遗传控制回路，其中，所述阻遏物多肽导致外源治疗性多肽的活性、水平或表达降低。
129.一种细胞，其包含：
选自表5的第一控制元件，其操作性地连接至编码选自表1-4的外源治疗性多肽的序列；
选自表6的第二控制元件，其操作性地连接至编码Cas9多肽的序列；和
组成型表达的一个或多个gRNA序列；
其中，第二控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，所述治疗性多肽的表达被调节。
130.一种细胞，其包含：
选自表5的第一控制元件，其操作性地连接至编码选自表1-4的外源治疗性多肽的序列；
选自表5的第二控制元件，其操作性地连接至编码Cas9多肽的序列；和
第三控制元件，其选自表6，并且操作性地连接至一个或多个gRNA序列；
其中，第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且在第二条件存在时，所述治疗性多肽的表达被调节。
131.多个如段落1-75、129或130中任一段所述的细胞，其中，一个或多个细胞包含第一条件，且一个或多个细胞包含第二条件。
132.如段落1-30、32-75、77-97、99-112和114-128中任一段所述的细胞、方法、核酸或遗传控制回路，其中，第一控制元件是经工程改造的启动子。
133.如段落1-62、65-75、77-97、99-112、114-121、124-126和128中任一段所述的细胞、方法、核酸或遗传控制回路，其中，第三控制元件是经工程改造的启动子。
实施示例
实施例1
在下面的实施例中，使用图1A和1B中所示的遗传控制回路的设计原理。在该实施例中，使用图3A所示的回路测试利用阻遏物(即dCas9)抑制重组蛋白基因(即GFP)表达的原理。现有稳定表达重组多肽基因GFP的CHOK1SV衍生的GS-KO(XceedTM)细胞系，该重组多肽基因GFP操作性地连接至第一控制元件(例如，第一启动子元件，hCMV)，该细胞系用以下物质瞬时转染：1)仅编码阻遏物多肽dCas9的表达载体，该dCas9操作性地连接至组成型mCMV启动子，或2)编码阻遏物多肽(dCas9)的表达载体加表达gRNA 1、2和3的载体，其各由分开的U6启动子控制(图3A)。转染后四天，通过流式细胞仪确定GFP荧光，并且观察到与仅转染dCas9的细胞或未转染的对照细胞(UTC)相比，用dCas9+gRNA 1-3转染导致群体GFP荧光减少(图3B)。这表明使用阻遏物多肽、dCas9和gRNA抑制重组多肽(GFP)的表达。
实施例2
在该实施例中，使用图4A所示的回路测试了使用阻遏物(即dCas9)抑制重组单克隆抗体重链(HC)和轻链(LC)基因表达的原理。在该实施例中，我们证明，通过操作性地连接至组成型mCMV启动子的抑制性多肽dCas9，抑制了操作性地连接至第一控制元件(例如启动子元件hCMV)的治疗性多肽IgG4 Mab cB72.3的表达。使用稳定表达各由分开的hCMV启动子驱动的IgG4 Mab cB72.3 HC和LC基因的CHO细胞系库，测试了利用dCas9和靶向hCMV启动子的gRNA 1-3来下调Mab表达的能力。该库用仅dCas9质粒(dCas9)或dCas9质粒+/-gRNA编码质粒(dCas9+g1-g3，见图4B)瞬时转染，并在转然后第3、4和5天使用Octet生物分析仪确定Mab浓度(图4B)。误差线代表三重复转染的标准偏差。细胞还仅用缓冲液转染作为阴性对照(无DNA)。这表明使用dCas9+gRNA抑制了Mab的表达。
实施例3
在该实施例中，证明了使用图5A所示的遗传控制回路抑制重组多肽GFP的表达。将稳定表达操作性地连接至第一控制元件(例如启动子元件hCMV)的GFP的CHOK1SV衍生的GS-KO(XceedTM)细胞用一组质粒瞬时转染：包含编码阻遏物多肽dCas9的序列的质粒，该序列操作性地连接至第二控制元件，例如启动子元件Grp78启动子，以及编码gRNA 1-3的质粒，其中gRNA 1-3各在分开的U6启动子控制下表达。Grp78启动子由未折叠蛋白质反应(UPR)活化，在这种情况下，其通过在转染后24小时加入衣霉素(TM)来人工活化。瞬时转染后四天，通过流式细胞仪测量GFP输出。可见，与类似转染但未用衣霉素(0TM)处理的细胞或仅用dCas9(Grp78 dCas9对照)转染的细胞相比，在400ng/mL衣霉素(TM)处理后用dCas9和gRNA质粒1-3两者转染的细胞(Grp78 dCas9+gRNA)的GFP输出被遏制(图5)。
实施例4
在该实施例中，证明了图2中描绘的遗传控制回路增加几种重组蛋白(包括难表达的蛋白质)的产量的能力。使用图6A所示的载体构建稳定表达遗传控制回路的CHEK1SV衍生的GS-KO(XceedTM)细胞。该载体包含在Grp78启动子控制下的dCas9基因，以及对hCMV启动子具有特异性的三个gRNA序列(gRNA 1、2和3)，其各在分开的组成型U6启动子控制下。该载体的变体包含单一gRNA14序列来代替gRNA 1、2和3序列，并且还使用该变体载体构建稳定表达遗传控制回路的CHOK1SV衍生的GS-KO(XceedTM)细胞。遗传控制回路载体还包含在SV40启动子控制下的嘌呤霉素抗性基因(嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(“嘌呤霉素”))，以允许通过用抗生素嘌呤霉素处理来对转染后稳定导入遗传控制回路的细胞进行正选择。然后，用编码几种难表达的重组蛋白的表达载体瞬时转染稳定的CHOK1SV衍生的GS-KO(XceedTM)库，该库表达具有单个gRNA14序列或gRNA1、2和3的遗传控制回路，所述几种难表达的重组蛋白为：H1K1和H9K7(均为高度聚集的Mab)，依那西普(Etanercept)(符合Fc融合蛋白)和博纳吐单抗(blinatumomab)(复合双特异性T细胞接合子(BiTE))以及IgG4 Mab cB72.3。转染后6天产生的重组蛋白浓度如图6B所示，使用Octet生物分析仪进行测定。结果表明，相较于缺乏控制回路的亲代CHOK1SV衍生的GS-KO(XceedTM)细胞系，对于所有重组蛋白(除H9K7外)，遗传控制回路中至少有一个与平均重组蛋白浓度的增加相关。这表明遗传控制回路可能会增加一些蛋白质(包括复杂的、难以表达的分子)的生产率。为了进一步研究遗传控制回路增加重组蛋白表达的能力，通过在转染后24小时添加衣霉素(TM)(0.1μg/ml)使稳定表达该回路并用H9K7编码载体瞬时转染的CHO细胞经历UPR升高(图6C)。添加TM时，含有遗传控制回路的细胞在转染后第6天产生增加的H9K7平均浓度，而缺乏控制回路的亲代CHO宿主细胞系则显示无效果。这表明，在活化的UPR存在下，遗传控制回路可以提高外源难表达蛋白质的表达和产量。这也表明遗传控制回路对外源蛋白质表达的作用与UPR相关。
在上述转染组中，细胞培养物上清液中蛋白质聚集的水平也通过ODA分析确定(Obrezanova等.MAbs.2015；7(2):352-63)(图7A和7B)。在该分析中，已知cB72.3显示低水平的聚集，而已知H1K1、H9K7和依那西普在亲代细胞系CHOK1SV衍生的GS-KO(XceedTM)中高度聚集，因此显示更高的450nm吸光度值(图7A)。预期控制回路在减少H9K7和依那西普聚集的方面不会显示任何实质性的益处，因为已知它们显示高到严重的聚集水平，因此对于该参数而言可能超出了回路控制的动态范围。然而，通过比较，已知H1K1显示稍低的聚集水平，即便依旧很高，但可能能够被改善(即，聚集减少)。实际上，在该测定法中，尽管总产物浓度增加，但与亲代宿主细胞系相比，控制回路的这两个变体均与平均H1K1聚集的减少相关联(比较图6B和7A)。在衣霉素存在时，尽管gRNA14和gRNA123变体的总产物浓度增加了(比较图6C与7B)，但使用控制回路仍未观察到H9K7聚集的改善(即减少)，这再次表明了H9K7抗体的聚集表现超出了所述控制回路的影响的动态范围。
在上述转染组中，可以测量其它关键产品质量(PQ)属性，例如N-聚糖微观/宏观异质性(例如通过UPLC或LC-MS)，以期改善含控制回路的细胞中的PQ。

Claims (18)

1.一种细胞，其包含：
第一控制元件，其操作性地连接至编码外源治疗性多肽的序列；
第二控制元件，其操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
第三控制元件，其操作性地连接至编码与外源性治疗性多肽编码序列具有同源性或与第一控制元件具有同源性的一个或多个gRNA的序列；
其中：
(i)所述阻遏物多肽是dCas9分子；
(ii)所述阻遏物多肽，与一个或多个gRNA联合，抑制所述治疗性多肽的表达；
(iii)a)第二控制元件或第三控制元件在第一条件下具有第一活性水平，且在第二条件下具有第二活性水平，或者b)第二控制元件和第三控制元件均在第一条件下具有第一活性水平，且在第二条件下具有第二活性水平；并且
(iv)其中第二控制元件或第三控制元件是：
启动子元件，其包含内质网反应元件(ERSE)；
其中，第一和第二条件是(i)分别为内质网(ER)中较低水平的未折叠或错误折叠多肽和ER中较高水平的未折叠或错误折叠多肽；或(ii)分别为未折叠蛋白质反应(UPR)活化的较低水平和UPR活化的较高水平；
其中，在第二条件存在下，所述阻遏物多肽，与一个或多个gRNA联合，抑制所述治疗性多肽的表达。
2.如权利要求1所述的细胞，其中：
(a)所述第一控制元件和编码外源治疗性多肽的序列位于第一核酸上，并且所述第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于第二核酸上，其中：
(i)第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第一核酸上，
(ii)第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第二核酸上，或
(ii)第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列位于第三核酸上；或
(b)第一控制元件、编码外源治疗性多肽的序列、第二控制元件，和编码阻遏物多肽的序列位于同一核酸上，其中：
(i)第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列与第一控制元件、编码外源治疗性多肽的序列、第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于同一核酸上，或
(ii)第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列，与第一控制元件、编码外源治疗性多肽的序列、第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列位于分开的核酸上。
3.如权利要求2所述的细胞，其中，
(a)第一核酸包含在载体内，第二核酸包含在染色体内，
(b)第一核酸包含在染色体内且第二核酸包含在载体内，
(c)第一核酸包含在载体内，第二核酸包含在染色体内，且第三核酸包含在载体内，
(d)第一核酸包含在染色体内，第二核酸包含在载体内，且第三核酸包含在载体内，
(e)第一核酸包含在载体内，第二核酸包含在染色体内，且第三核酸包含在染色体内，或
(f)第一核酸包含在染色体内，第二核酸包含在载体内，且第三核酸包含在染色体内。
4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞，其中，所述第一控制元件响应阻遏物多肽。
5.如权利要求1所述的细胞，其中，所述第一控制元件选自：
6.如权利要求1所述的细胞，其中，所述治疗性多肽包含：
融合蛋白；
多结构域多肽；
双特异性抗体分子；
多特异性分子；和/或
包含配体和抗体分子的分子。
7.如权利要求1所述的细胞，其中，所述治疗性多肽包含：多特异性抗体分子。
8.如权利要求1所述的细胞，其中，所述第二控制元件或第三控制元件选自：
或
。
9.如权利要求1所述的细胞，其包含操作性连接至编码一个或多个gRNA的序列的第三控制元件。
10.如权利要求9所述的细胞，其中：
(a)所述第二控制元件包括第二启动子元件，并且所述第二启动子元件是组成型的，并且其中，所述第三控制元件包括第三启动子元件，所述第三启动子元件在第一条件下具有第一活性水平，且在第二条件下具有第二活性水平，或
(b)所述第二控制元件包括第二启动子元件，其在第一条件下具有第一活性水平，在第二条件下具有第二活性水平，并且其中，所述第三控制元件包含第三启动子元件，并且所述第三启动子元件是组成型的。
11.如权利要求1所述的细胞，其中，所述第二控制元件或第三控制元件包含Grp78启动子元件。
12.如权利要求1所述的细胞，其是哺乳动物细胞系。
13.一种用于制备如权利要求1-12中任一项所述的细胞的试剂盒，用于表达治疗性多肽，其中所述试剂盒包含：
第一核酸，所述第一核酸包含第一控制元件，所述第一控制元件操作性地连接至插入位点，其适合于引入编码治疗性多肽的外源序列，从而所述外源序列操作性地连接至第一控制元件；
第二核酸，所述第二核酸包含第二控制元件，所述第二控制元件操作性地连接至编码阻遏物多肽的序列；和
第三核酸，所述第三核酸包含第三控制元件，所述第三控制元件操作性地连接至编码与治疗性多肽编码基因或与其操作性连接的控制元件具有同源性的一个或多个gRNA的序列，如权利要求1-11中任一项所定义。
14.如权利要求13所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：
编码所述治疗性多肽外源序列，其操作性连接至第一控制元件。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其包含第三核酸。
16.如权利要求14所述的试剂盒用于制备表达治疗性多肽的细胞系的用途。
17.一种制备治疗性多肽的方法，包括：
在允许制备所述治疗性多肽的条件下培养如权利要求1-12中任一项所述的细胞，由此制备所述治疗性多肽。
18.一种表达载体，其包含
核酸，包含(i)第一控制元件和编码外源治疗性多肽的序列，(ii)第二控制元件和编码阻遏物多肽的序列，和(iii)第三控制元件和编码一个或多个gRNA的序列，其中所述第三控制元件是组成型控制元件或调节控制元件；
其中
(i)所述阻遏物多肽是dCas9分子；
(ii)所述阻遏物多肽，单独或与一个或多个gRNA联合，抑制所述治疗性多肽的表达；并且
(iii)第二控制元件或第三控制元件是：
启动子元件，其包含内质网反应元件(ERSE)。
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