CN110755427A

CN110755427A - 一种治疗视网膜退行性疾病的药物

Info

Publication number: CN110755427A
Application number: CN201810849680.2A
Authority: CN
Inventors: 刘木根; 唐朝晖; 胡雪斌; 于珊珊; 刘飞; 韩云巧
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2018-07-28
Filing date: 2018-07-28
Publication date: 2020-02-07

Abstract

本发明公开了雷帕霉素及其衍生物在制备治疗视网膜退行性疾病药物中的应用，本发明构建了视网膜退行性疾病动物模型，确定其自噬能力受到影响；在视网膜色素上皮细胞中通过RNA干扰的方法，建立视网膜退行性疾病致病基因缺陷的细胞模型，确定基因缺陷破坏细胞的自噬能力；在视网膜色素变性的细胞中，通过用含有雷帕霉素的完全培养基替换原有培养基，分析雷帕霉素是否可以提高视网膜色素上皮细胞的自噬水平。本发明实验研究揭示，雷帕霉素及其衍生物能够提高视网膜细胞的自噬水平，修复视网膜受损的自噬功能，减少感光细胞的凋亡，从而缓解视网膜退行性疾病的病理进程，延缓视力损害，证实雷帕霉素及其衍生物可用于制备治疗视网膜退行性疾病的药物。

Description

一种治疗视网膜退行性疾病的药物

技术领域

本发明属于医药卫生技术领域，涉及治疗视网膜退行性疾病的药物，具体涉及雷帕霉素及其衍生物在治疗视网膜退行性疾病中的应用。

背景技术

视网膜退行性疾病是一类人类视网膜感光细胞渐进性变性的眼科疾病，其主要临床表现为感光细胞或视网膜色素上皮细胞变性和死亡，最终导致不可逆的视觉功能丧失，严重影响人类的生活质量。包括视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)、视锥-视杆营养不良(cone-rod dystrophy,CRD)、leber氏先天性黑朦症，以及老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)等。视网膜退行性疾病是世界上引起失明最主要的遗传性原因，约一半的老年人失明都是由于老年性黄斑变性而导致。在发达国家中70岁以上老人约有30％患有不同程度的黄斑变性。视网膜色素变性和先天性黑朦发病较早，在早期发病并可以逐渐加重且导致失明。在全球范围内视网膜色素变性的发病率约为1/3000。

视网膜退行性疾病具有高度的遗传异质性。约有近200多个该病相关的基因位点被报道，100多个致病基因被克隆。这些基因具有不同的结构和功能，但其突变却最后都引起视网膜功能受损和感光细胞渐进性死亡。视网膜退行性疾病发病原因复杂，其致病的病理机制目前尚不清楚，已成为世界眼科重点研究的难题之一。

对视网膜退行性疾病，目前国内外临床上尚没有有效的治疗干预措施。近年来研究者在基因治疗方面取得了重大的突破，但视网膜退行性疾病的高度遗传异质性使得基因治疗必须建立在知悉患者的致病基因的基础上，同时建立不同致病基因的动物模型，成为临床动物实验的关键所在；细胞移植临床应用存在伦理道德问题，同种异体移植有免疫排斥的风险；诱导干细胞并应用CRISPR/cas9技术进行基因编辑，再将诱导的视网膜干细胞进行移植，以修复突变的感光细胞也是目前科学家努力的重要方向。针对干性黄斑变性的VEGF的抗体治疗取得了重大成功，但多次玻璃体腔注射会引起许多并发症；人工视网膜成为另一个重要的研究方向，但距离成功应用还有很长的路要走。药物治疗比较方便，且副作用小，但市面上现存药物如维生素A、维生素E等治疗效果非常有限。因此，对视网膜退行性疾病而言，寻找能够有效阻止或延缓疾病进程的治疗药物，是该领域长久以来的重要课题。

视网膜退行性疾病基因众多、发病原因复杂，其疾病发生发展的病理机制尚不清楚，这是临床上长期找不到有效治疗药物的重要原因。阐明视网膜退行性疾病的致病机制是发现该病的治疗药物的关键。

CERKL基因是一个重要的视网膜色素变性致病基因，约有5％的常染色体隐性突变的患者是有该基因突变所致。发明人实验室长期对该基因突变引起视网膜色素变性的分子机制进行研究，取得一批世界领先的研究成果。这些成果包括：首先在中国人群中发现该基因的复合型杂合突变；首次发现CERKL和硫氧还蛋白TRX2相互作用，从而通过调控TRX2维持视网膜感光细胞的氧化还原稳态，从而保护感光细胞；构建了世界上迄今报道的唯一一个CERKL基因敲除的动物模型，首次发现CERKL突变可破坏视网膜色素上皮细胞的吞噬功能，从而为揭示该病发生的分子机制打下了扎实的基础。最近在此基础上，我们通过细胞模型和CERKL基因敲除的斑马鱼模型，发现自噬功能缺陷可能是引起视网膜感光细胞变性的细胞学基础。

正常的自噬对于感光细胞和视网膜色素上皮细胞维持细胞稳态，抵抗氧化压力，以及对RPE的吞噬能力有着至关重要的作用。自噬功能的缺陷在退行性疾病的发病过程中发挥重要的作用。发明人成功建立了视网膜色素变性的斑马鱼动物模型和RPE细胞模型，进一步研究发现在视网膜退行性疾病模式动物的视网膜细胞中均存在自噬受损的现象。提示致病基因缺陷引起视网膜细胞的自噬缺陷可能是导致视网膜色素变性发生的细胞学基础。首次提出可以通过激活视网膜变性患者的细胞自噬能力对该疾病进行治疗。目前，尚未见关于从恢复视网膜自噬水平治疗视网膜退行性疾病的相关报道。

雷帕霉素及其衍生物，一种新型高效的免疫抑制剂，临床上用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，也有消除肿瘤耐药性、抗肿瘤和抗增殖的作用。雷帕霉素也是一种自噬激活剂，可以用来激活细胞自噬，国外有研究报道在AMD小鼠模型中使用雷帕霉素恢复自噬水平，一定程度上能够缓解AMD的症状。但直到目前，还未见关于使用雷帕霉素及其衍生物用于治疗视网膜退行性疾病的相关报道。

发明内容

本发明的任务是提供一种治疗视网膜退行性疾病的药物。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的治疗视网膜退行性疾病的药物是雷帕霉素或雷帕霉素衍生物，所述的雷帕霉素(Rapamycin)为以下式I所示结构的化合物：

所述的雷帕霉素衍生物可以是替西罗莫司(Temsirolimus)、依维莫司(Everolimus)或42-(二甲基亚膦酰)雷帕霉素(Deforolimus)。

所述的替西罗莫司(Temsirolimus)为以下式II所示结构的化合物：

所述的依维莫司(Everolimus)为以下式III所示结构的化合物：

所述的42-(二甲基亚膦酰)雷帕霉素(Deforolimus)为以下式IV所示结构的化合物：

本发明

所述的视网膜退行性疾病为以下所列疾病之一种：

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)；

视锥-视杆营养不良(cone-rod dystrophy,CRD)；

leber氏先天性黑朦症(Leber congenital amaurosis,LCA)；

亚瑟综合征(Usher syndrome)；

Bardet-Biedl综合征或或视锥萎缩(Cone dystrophy)；

视网膜脉络膜萎缩(Chorioretinal atrophy)；

先天性静止的夜盲症(Congenital stationary night)；

老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)。

本发明实验研究揭示，雷帕霉素及其衍生物能够提高视网膜细胞的自噬水平，修复视网膜受损的自噬功能，减少感光细胞的凋亡，从而缓解视网膜退行性疾病的病理进程，延缓视力损害。因此，雷帕霉素及其衍生物能够用于制备治疗视网膜退行性疾病的药物。

本发明专利申请实施例部分提供了雷帕霉素用于治疗视网膜退行性疾病的相关实验资料，包括以下内容：

(1)构建视网膜退行性疾病动物模型，检测模式动物的表型，确定其临床症状类似于人类的视网膜色素变性症状；

(2)检测模式动物发病前视网膜自噬水平，确定自噬能力受到影响；

(3)在视网膜色素上皮细胞中通过RNA干扰的方法，建立视网膜退行性疾病致病基因缺陷的细胞模型；

(4)检测视网膜色素变性的细胞模型，分析该模型的细胞自噬情况，确定是否基因缺陷破坏细胞的自噬能力；

(5)在视网膜色素变性的细胞中，通过用含有0-200nm雷帕霉素的完全培养基替换原有培养基，培养细胞2小时，分析雷帕霉素是否可以提高视网膜色素上皮细胞自噬水平。

附图说明

图1：包括图1(A)和图1(B)。其中图1(A)为7天WT与CERKL-/-斑马鱼中ERG结果图；图1(B)为比较WT(n＝9)与CERKL-/-(n＝11)斑马鱼b波振幅均值图。对5-7dpf野生型与突变型斑马鱼进行暗适应ERG检测，用一定强度光柱对斑马鱼眼睛持续照射1s，每次实验，选取其中波峰最高的5个b波波峰值取其平均值进行统计，并且野生型与突变型各选取10条以上斑马鱼进行数据统计，发现在野生型斑马鱼中，b波峰值在500-1000μv之间波动，大部分位于600μv左右；而在CERKL-/-斑马鱼中，b波峰值均位于500μv以下，大小约300-400μv之间，下降约30％左右。(数据以平均值±标准偏差的形式体现，**代表P值小于0.01。)说明CERKL-/-斑马鱼在早期即出现视觉损伤，视网膜退行性疾病动物模型成功模拟了视网膜退行性疾病表型。

图2：包括图2(A)和图2(B)。图2(A)为1mpf野生型和敲除型斑马鱼的视网膜HE染色图。图2(B)为2mpf的野生型和敲除型斑马鱼的视网膜HE染色图。对1mpf和2mpf的野生型和敲除型斑马鱼的视网膜进行冰冻切片，使用苏木素-伊红染色，观察视网膜组织的病理变化。可以看出在1mpf时敲除型斑马鱼的视网膜外核层厚度与野生型斑马鱼相比并无明显变化，而到2mpf时敲除型斑马鱼的视网膜外核层厚度明显变薄。说明建立的CERKL敲除斑马鱼模型良好模拟了视网膜退行性疾病的症状。

图3：包括图3(A)和图3(B)。其中图3(A)为1mpf野生型斑马鱼视网膜感光细胞层“LC3 punctae”免疫荧光检测图；图3(B)为1mpfCERKL敲除斑马鱼视网膜感光细胞层“LC3punctae”免疫荧光检测图。将1mpf斑马鱼视网膜进行冰冻切片，-20℃保存后取出进行免疫荧光。其中白色光点为LC3 punctae信号。可以看出1mpf时在敲除鱼视网膜的感光细胞层中“LC3 punctae”的数量相对于野生型存在明显的减少，说明1mpf视网膜退行性疾病斑马鱼模型在视网膜变性发病前自噬已经受损。

图4：包括图4(A)和图4(B)。其中图4(A)为1mpf野生型斑马鱼视网膜视网膜色素上皮细胞层“LC3 punctae”免疫荧光检测图；图4(B)为1mpfCERKL敲除斑马鱼视网膜视网膜色素上皮细胞层“LC3 punctae”免疫荧光检测图。将1mpf斑马鱼视网膜进行冰冻切片，-20℃保存后取出进行免疫荧光。其中白色光点为LC3 punctae信号。可以看出1mpf时在敲除鱼视网膜的视网膜色素上皮细胞中“LC3 punctae”的数量相对于野生型存在明显的减少，说明1mpf视网膜退行性疾病斑马鱼模型在视网膜退行性病变发病前自噬已经受损。

图5：为1mpf野生型和CERKL敲除斑马鱼视网膜LC3 western blot检测图。采用冰冻法将1mpf斑马鱼处死后，立即摘取两侧眼球提取蛋白进行western blot.可以看出1mpf时CERKL敲除鱼中LC3-II/LC3-I相对于野生型斑马鱼有明显的降低,说明视网膜退行性疾病斑马鱼模型中视网膜自噬受损。

图6为ARPE-19细胞敲低CERKL基因后LC3 western blot检测图。使用Invitrogen公司的LipofectamineTM 3000试剂将siRNA转入细胞。转染前一天铺需要的细胞平板，待APRE-19细胞汇合度达到30％-50％时，用Opti-MEM培养基分别配置siRNA悬液和LipofectamineTM 3000悬液，将两种悬液混合均匀后静置10min，之后加入待转染的细胞中，培养72小时进行western blot检测。可以看出在ARPE-19细胞中干扰CERKL基因后LC3-II/LC3-I明显下降，说明CERKL基因干扰后ARPE-19细胞自噬受损。

图7：包括图7(A)和图7(B)。其中图7(A)为ARPE-19细胞对照组“LC3 punctae”免疫荧光检测图，图7(B)为ARPE-19细胞CERKL敲除组“LC3 punctae”免疫荧光检测图。使用Invitrogen公司的LipofectamineTM 3000试剂将siRNA转入细胞。转染前一天铺需要的细胞平板，待APRE-19细胞汇合度达到30％-50％时，用Opti-MEM培养基分别配置siRNA悬液和LipofectamineTM 3000悬液，将两种悬液混合均匀后静置10min，之后加入待转染的细胞中，培养72小时进行免疫荧光检测。其中白色光点为LC3 punctae信号。可以看出相比于对照组在ARPE-19细胞中干扰CERKL基因后，每个细胞中“LC3 punctae”的数量明显减少，说明CERKL基因干扰后RPE-19细胞自噬受损。

图8为雷帕霉素处理后ARPE-19细胞LC3 western blot检测图。在干扰72小时的ARPE-19细胞中，将培养基替换为溶有0.1％DMSO、0～200Nm雷帕霉素的培养基，培养2小时。WB检测经雷帕霉素处理后敲除组的LC3-II/LC3-I相对于未经雷帕霉素处理的干扰组和对照组均有明显升高。说明雷帕霉素有效恢复了ARPE-19细胞中的自噬水平。

具体实施方式

以下以实施例方式对本发明作更进一步地说明，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1.本实施例通过敲除视网膜色素变性致病基因CERKL构建RP斑马鱼动物模型。具体实施如下：

1.1 CERKLTALEN载体的构建及TALEN效果验证

在NCBI中查询CERKL基因cDNA序列(NM_001089474.1)，将CERKLcDNA序列输入TALEN在线设计软件，为了在翻译起始位点之后尽早制造移码突变，最终我们选择了位于1号外显子的一个TALEN靶位点。此位点左臂与右臂长度(含T)分别为17bp与19bp，中间的spacer区长度为16bp，并且含有一个Mlu1的限制性酶切位点，便于后续筛选，符合TALEN设计的基本原则。

根据斯丹赛试剂盒说明书以及所设计的TALEN识别序列，依次将试剂盒中的模块编号取出，具体顺序如下：

TALEN-L：AA1AT2C3GA4T5AA6GT7GT8CC9

TALEN-R：CG1CG2CA3AC4TC5TT6CC7TG8AC9

质粒构建完成后，左臂与右臂各挑取9个克隆，摇菌，提取质粒，根据载体图谱，应用BamH1与Pst1双酶切的方法对所提质粒进行酶切鉴定。左臂的TALEN骨架为3817bp，连接的识别序列为16个碱基，则酶切后出现的两条带分别为3286bp与2163bp(计算公式为16x102+531，一个TALEN蛋白模块识别一个碱基，每个蛋白识别模块由34个氨基酸组成，即102bp；531bp为同时切下的TALEN骨架一部分片段)；右臂TALEN骨架为3820bp，连接的识别序列为18个碱基，则酶切后出现的两条带分别为3289与2367bp。将酶切片段大小正确的质粒测序验证。

测序正确的质粒用Not1限制性内切酶于进行酶切线性化，经PCR产物纯化试剂盒回收，进行体外转录。左臂与右臂均用Sp6RNA聚合酶进行体外转录，获得的mRNA经琼脂糖凝胶电泳验证其大小及完整性。转录出的mRNA条带清晰，大小正确，完整性好，可用于斑马鱼显微注射实验。将TALEN左臂与右臂的mRNA，分别稀释成200ng/μl，等体积混合，使两者终浓度均为100ng/μl，用于斑马鱼显微注射；注射结束后，收集鱼卵于E3培养基中，置于30℃培养箱中培养；待鱼卵成长到2-3dpf，取30颗鱼卵，提取基因组DNA进行PCR扩增，用Mlu1进行酶切验证。酶切后，野生型PCR产物产生两条不同大小的条带(265bp与112bp)，而注射的斑马鱼卵的PCR产物包含3条不同大小的条带，即377bp、265bp与112bp，表明设计的TALEN靶向作用于CERKL。将鉴定有突变的斑马鱼卵进一步养大，即为F0代斑马鱼。

1.2 CERKL敲除斑马鱼筛选

(1)F0代斑马鱼筛选：F0代斑马鱼为嵌合体，为验证其所携带的突变是否能够遗传给下一代，将性成熟的F0代斑马鱼与野生型斑马鱼进行杂交产卵，收集10颗鱼卵，提取基因组，进行PCR扩增；纯化PCR产物，将其克隆到pGEM-TEasy载体中，转化摇菌，通过菌液PCR以及Mlu1酶切验证发现F0代突变率高达50％以上。将有突变的F0代斑马鱼与野生型斑马鱼产生的后代饲养长大，便于筛选突变体。

(2)F1代斑马鱼筛选：F1代斑马鱼成长到1个月左右大小，剪尾鳍提取基因组DNA，通过PCR-RFLP的方法鉴定F1代斑马鱼是否携带突变；将酶切鉴定有突变的F1代斑马鱼的PCR产物进行测序，确定F1代斑马鱼的突变类型。通过筛选，我们总共鉴定出7种突变类型，其中有5种为碱基缺失造成的移码突变，一种是额外碱基插入造成的移码突变，还有一种突变缺失3个碱基，类似点突变，造成一个氨基酸的缺失，不会对蛋白的稳定性造成影响。MT1-MT6这几种突变缺失或者插入的碱基数目非3的倍数，移码造成该点之后的蛋白质三联体密码子阅读框发生改变，蛋白质翻译提前终止，通常会影响蛋白的翻译与稳定性。斑马鱼中CERKL基因的CDS全长为1784bp，编码577个氨基酸。在几种缺失突变体中，c.43_49delTGGTCGG突变体中CERKL基因缺失的7个碱基为CDS中43-49bp，碱基缺失导致CERKL蛋白从第15个氨基酸开始，翻译出异常的21个氨基酸(15aa-35aa)，然后提前终止，仅获得含有35个氨基酸的异常蛋白，是几种突变类型中产生的蛋白产物最短的一种，对CERKL蛋白功能的破坏更加彻底。因此，我们主要以这种突变为主开展后续实验。将F1代斑马鱼饲养至性成熟时期，选择与其携带相同突变的F1代斑马鱼进行杂交，产生的后代即为F2代斑马鱼。

(3)F2代斑马鱼筛选：根据孟德尔遗传定律，F2代斑马鱼包含野生型、杂合子与纯合子3种基因型，其比例应该大致等于1:2:1。待F2代斑马鱼成长到1个月大时，剪尾鳍提取基因组，通过PCR-RFLP的方法鉴定出3种不同的酶切条带：产生265bp与112bp两条不同大小条带的为野生型，产生377bp、265bp与112bp三条不同大小条带的为杂合子，而纯合子仅有一条完整的没有切开的377bp的条带。与理论值相比，F2中纯合子比例略低于1/4，表明敲除CERKL可能对斑马鱼的生存能力产生些许影响。对F2代纯和斑马鱼进行测序验证。

1.3 CERKL突变对CERKLmRNA及蛋白水平的影响

为了验证CERKL突变是否影响其mRNA与蛋白水平，我们分别提取4个月斑马鱼眼睛总RNA以及9个月斑马鱼眼睛总蛋白。通过荧光定量PCR的方法检测CERKL mRNA水平，同时，用我们自己制备的CERKL斑马鱼抗体检测CERKL蛋白水平的变化。我们发现，与野生型相比，CERKL敲除的斑马鱼中CERKL的mRNA水平没有受到影响，表明CERKL基因碱基的缺失并没有影响CERKLmRNA的稳定性。用我们自己制备的针对斑马鱼CERKL的抗体，通过westernblot的方法检测野生型与CERKL-/-斑马鱼中CERKL的蛋白水平，虽然在野生型与突变型斑马鱼中有非特异性条带存在，但是我们仍然能在野生型斑马鱼中明显分辨出CERKL条带，而在CERKL-/-斑马鱼中相同的位置检测不到CERKL蛋白条带，表明在斑马鱼中敲除CERKL造成的截短蛋白不能在斑马鱼体内稳定存在而被降解，同时也表明我们成功获得CERKL完全敲除斑马鱼。

实施例2

2.本实施例通过对实施例1中视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型进行表型检测，确定其临床症状类似于人类的视网膜色素变性症状。具体实施如下：

2.1视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型的视觉功能受损检测。

具体操作如下：

对5-7dpf野生型与突变型斑马鱼进行暗适应ERG检测，用一定强度光柱对斑马鱼眼睛持续照射1s，此时会出现3种波峰，由于a波通常与b波重合，因此，我们检测到的a波波峰相对较低。由于持续光照时间达到1s，因此可见明显的b波与d波。每次实验，我们选取其中波峰最高的5个b波波峰值取其平均值进行统计，并且野生型与突变型各选取10条以上斑马鱼进行数据统计，发现在野生型斑马鱼中，b波峰值在500-1000μv之间波动，大部分位于600μv左右；而在CERKL-/斑马鱼中，b波峰值均位于500μv以下，大小约300-400μv之间，下降约30％左右，表明CERKL-/-斑马鱼在早期即出现视觉损伤，如图1。

2.2视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型的视网膜组织学结构缺陷检测。

具体操作如下：

对1mpf和2mpf的野生型和CERKL敲除型斑马鱼的视网膜进行冰冻切片，使用苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色，观察视网膜组织的病理变化。

(1)冰冻切片

将要进行冰冻组织切片的斑马鱼提前避光处理3h以上，然后将其麻醉后处死，并立即摘取整个眼球置于4％多聚甲醛溶液中进行固定(室温固定时间2-4h；4℃冰箱可固定过夜)，之后用1×PBS溶液清洗3次，每次5min，最后加入30％蔗糖溶液过夜脱水。

提前1h开启冰冻切片机，待冰冻切片机的机箱温度和冻头温度分别降到-24℃和-26℃后，开始准备样品包埋。在样品包埋过程中需要注意调整样品的方向，包埋好之后放于机箱冷冻盘上冷冻10min，然后可以开始进行切片。本文中所有样品的切片厚度为8-15um。切好的片子需在37℃恒温培养箱中烤片20min至1h，然后置于-20℃或-80℃保持。

(2)HE染色

将要进行HE染色的片子从-20℃冰箱中取出之后于室温放置20min左右，待其完全晾干后，用蒸馏水洗1-2min，目的是洗掉切片上的包埋剂；将片子浸入苏木素染液中浸泡5min，之后用自来水进行冲洗1-2min，直到蓝色消失为止；将片子浸入盐酸酒精溶液(70％的乙醇溶液+1％的浓盐酸)中分化数秒，当看到片子发红后立即加入1％氨水溶液返蓝数秒，之后用自来水冲洗1-2min；将片子浸入伊红溶液中浸泡5-10min，然后进行酒精梯度脱水，依次是：80％酒精浸泡5min、95％酒精浸泡5min、100％酒精浸泡5min，二甲苯I透明5min，二甲苯II透明5min，最后用中性树胶进行封片，显微镜下拍照。

如图2所示，在1mpf时CERKL敲除型斑马鱼的视网膜外核层厚度与野生型斑马鱼相比并无明显变化，而到2mpf时CERKL敲除型斑马鱼的视网膜外核层厚度明显变薄。表明视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型呈现类似于人类RP患者的渐进性病变特征。

实施例3

3.本实施例通过检测实施例1中视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型视网膜自噬水平，确定其视网膜自噬能力受到影响。

具体操作如下：

3.1免疫荧光检测视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型在1mpf时视网膜中“LC3punctae”的数量。

将要进行免疫荧光染色的冰冻组织切片从-20℃冰箱中取出，室温晾干20min左右；将切片放入PDT溶液中浸泡10min，期间可以轻轻晃动片子，之后再重新浸泡10min，彻底清除包埋剂；将切片擦干后放入湿盒中，用组化笔将载玻片上的组织圈起来，加入100μL封闭液PBDT(封闭液的量依组化笔画的圈的大小而定，主要是保证所有组织都浸泡在封闭液中)，室温放置1h；吸掉封闭液，并加入对应的一抗稀释液(一抗用含2％山羊血清的PBDT稀释)，4℃孵育过夜，如果一抗抗体本身带有荧光标记，则需要避光后4℃孵育过夜；第二天，可将一抗稀释液回收，然后将片子放入PDT溶液中浸泡10min，重复3次，尽量将一抗洗掉，同样，如果一抗抗体本身带有荧光标记，则整个过程中需要注意避光；将切片擦干净后重新放入湿盒中，用组化笔再次将载玻片上的组织圈起来，加入100μL二抗稀释液(二抗用PBDT稀释)，放于37℃恒温培养箱中避光孵育1h；吸掉二抗稀释液，加100μL DAPI溶液(1×PBS稀释)，室温避光放置5-10min；吸掉DAPI溶液，将切片放入1×PBS溶液中浸泡15min，重复3次，用50％甘油溶液进行封片，之后放于暗盒并4℃保存，或直接于荧光显微镜下观察。

结果如图3、图4所示，1mpf时在CERKL敲除鱼视网膜的感光细胞层和视网膜色素上皮细胞中“LC3 punctae”的数量相对于野生型存在明显的减少。

3.2 western blot检测视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型中LC3-II与LC3-I的比例变化。

(1)斑马鱼蛋白样品的制备方法为：采用冰冻法将斑马鱼处死后，立即摘取两侧眼球，用预冷的PBS清洗之后放入1.5mL空的EP管中，每10mg组织加入100-200μL体积的蛋白裂解液RIPA(含蛋白酶抑制剂)，使用匀浆仪于冰上研磨直至没有大的组织块残留，之后于4℃以12000rpm转速离心5-10min，将上清液转移至一个新的EP管中，加入1/5体积的5×SDS-PAGE loading buffer，充分混匀后于沸水中煮10min，立即置于冰中冷却2min，然后可将所得蛋白样品进行分装并于-80℃保存。

(2)SDS-PAGE电泳：本文中使用的SDS-PAGE分离胶的浓度主要为12％，根据目的蛋白的表达丰度调整蛋白样品的上样体积。蛋白电泳过程中先使用70V电压使蛋白在浓缩胶中富集，待蛋白进入分离胶时(此时会看到蛋白marker开始分离)，将电压调到110V继续电泳分离，参考旁边的蛋白marker，直到目的蛋白所在的区域可以分离时停止电泳。

(3)转膜：采用“三明治夹心法”即“海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵”进行蛋白转印，转印过程保持电流稳定在200mA，转膜时间依据目的蛋白的分子量大小。

(4)封闭：待转膜完毕后，将NC膜的蛋白面保持向上，并用含5％脱脂奶粉的蛋白封闭液(用TBST配制)，于水平摇床上室温封闭2h。

(5)一抗孵育：倒掉封闭液，用TBST缓冲液清洗NC膜上的封闭液(注意不能对着膜上蛋白冲洗)，加入一抗(用含5％BSA的TBST缓冲液稀释)，于水平摇床上4℃孵育过夜。

(6)二抗孵育：将一抗稀释液回收，用TBST缓冲液清洗NC膜三次，每次5-10min,加入二抗(用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释)，于水平摇床上室温孵育2h。

(7)显影：倒掉二抗稀释液，同样用TBST缓冲液清洗NC膜三次，每次5-10min,将配好的显影液均匀地加到目的蛋白所在的位置，开始显影。显影结果通过Quantify One软件进行分析。

结果如图5所示，1mpf时CERKL敲除鱼中LC3-II/LC3-I相对于野生型斑马鱼有明显的降低，说明在视网膜色素变性疾病RP斑马鱼模型中自噬功能受损。

实施例4

4.本实施例在视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)中通过RNA干扰的方法，建立视网膜色素变性致病基因CERKL缺陷的细胞模型。具体实施如下：

使用Invitrogen公司的LipofectamineTM 3000试剂将所述基因的siRNA转入细胞。转染前一天铺需要的细胞平板，待APRE-19细胞汇合度达到30％-50％时，用Opti-MEM培养基分别配置siRNA悬液和LipofectamineTM 3000悬液，将两种悬液混合均匀后静置10min，之后加入待转染的细胞中，培养72小时。

实施例5

5.本实施例通过检测实施例4中视网膜色素变性致病基因CERKL缺陷细胞模型的自噬情况，确定由于CERKL基因缺陷破坏细胞的自噬能力。具体实施如下：

Western blot检测ARPE-19细胞中敲低CERKL基因的干扰组和对照组中LC3-II与LC3-I比例的变化。具体操作如3.2Western blot操作步骤所述。结果如图6所示，在ARPE-19细胞中干扰CERKL基因后LC3-II/LC3-I明显下降。

免疫荧光检测ARPE-19细胞中敲低CERKL基因的干扰组和对照组中“LC3 punctae”的数量。具体操作如3.1免疫荧光操作步骤所述。结果如图7所示，在ARPE-19细胞中干扰CERKL基因后，每个细胞中“LC3 punctae”的数量明显减少。

上述实验表明实施例4中视网膜色素变性致病基因CERKL缺陷的细胞模型自噬能力受损。

实施例6

6.本实施例在实施例4中视网膜色素变性致病基因CERKL缺陷的细胞模型中，通过含有0-200nm雷帕霉素的完全培养基替换原有培养基，培养细胞2小时，确定雷帕霉素可以提高视网膜色素上皮细胞自噬水平。具体实施如下：

对ARPE-19细胞中进行雷帕霉素处理，具体如下：

在干扰72小时的ARPE-19细胞中，将培养基替换为溶有0.1％DMSO、50nM、100nM、150Nm和200Nm雷帕霉素的培养基，培养2小时。

Western blot检测经雷帕霉素处理的ARPE-19敲低CERKL基因的干扰组和对照组中LC3-II与LC3-I比例的变化。具体实施如3.2中Western blot操作步骤所述。结果如图8所示，经含有0-200nm雷帕霉素的完全培养基替换原有培养基，培养细胞2小时后，CERKL干扰组的LC3-II/LC3-I相对于未加雷帕霉素原有培养基的干扰组和对照组均有明显升高。

表明雷帕霉素可以提高实施例4中视网膜色素变性致病基因CERKL缺陷的细胞模型的自噬水平。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。