CN110755426B

CN110755426B - 雷帕霉素及其结构类似物在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN110755426B
Application number: CN201810837686.8A
Authority: CN
Inventors: 于政权; 宋永利
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2018-07-26
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2038-07-26
Also published as: CN110755426A

Abstract

本发明公开了雷帕霉素在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用。本发明首次使用m‑TOR通路的抑制剂雷帕霉素治疗Msi1基因异位过表达引起的皮肤异常Paget样病。将雷帕霉素药物用于小鼠模型上，能很好地减缓疾病表型，达到缓解疾病的效果。并且研发的药物在EMPD病人上应用，已取得了较好的临床效果。本发明为治疗小鼠及人的乳腺外Paget病提供了新的药物。

Description

雷帕霉素及其结构类似物在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及雷帕霉素及其结构类似物在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用。

背景技术

雷帕霉素(Rapamycin)的靶蛋白是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，1975年从吸水性链霉菌发酵液中提取出来。最初被用作抗真菌药物。先前研究报道，人类的很多遗传疾病，如肿瘤，糖尿病等疾病的发生与m-TOR通路的异常激活有关,m-TOR蛋白的分子量为289KD，是哺乳动物生长发育所必不可少的(Inoki K,2005,Nat Genet,37(1):19-24)。研究发现，m-TOR和Rictor能够相互结合，形成蛋白复合物，该复合物能使AKT蛋白质的氨基酸磷酸化，能够激活AKT，若能够找到阻止m-TOR和Rictor结合的分子，就能够阻止AKT激活，AKT的激活往往与肿瘤的发生发展密切相关，阻止了AKT的激活，就能减弱肿瘤发生的几率(Sarbassov D D,2005,Science,307(5712):1098-1101)。

Rapamycin是一种大环内酯类抗生素，具有抗氧化，抗衰老作用，通过阻断m-TOR,影响细胞周期，细胞生长，在细胞中使用Rapamycin，其能与FKBP12形成复合体，进一步与m-TOR结合为复合体，可以阻断PI3K-AKT-mTOR信号通路。除此之外，还可以抑制IL-2介导的T细胞分化，能够有效防止免疫排斥反应的发生(Andoh T F,1996,Kidney int,50(4):1110-1117)。另外，Rapamycin可能对Th1和Th2介导的结肠炎症具有很好的改善作用(Heller F,2002,Immunity,17(5):629-638)。

Rapamycin从1976年被发现，虽然报道了其很多的生理作用，但直到1999年才被批准为免疫排斥反应的治疗药物，m-TOR的很多生理作用至今还没有被发现，有待于进一步研究在机体内的生理作用(Knoop,C,2006,Semin Respir Crit Care Med)。大量研究表明，在恶性肿瘤中，PI3K/Akt/mTOR通路中的分子表达或活性异常，导致细胞逃避正常衰老，可以无限制地快速增值，使得正常细胞恶性化，导致肿瘤发生(Bjornsti,M.A.2004,The mTORpathway:a target for cancer therapy,Nat Rev Cancer and)。在神经胶质瘤细胞中，PI3K/Akt/mTOR信号通路处于过度激活状态(Nature,2008,455(7216:1061-8))。因此，抑制m-TOR通路，即可阻断PI3K通路的激活，可抑制部分肿瘤及部分胶质瘤的发生。

Musashi1属于RNA结合蛋白家族的成员，在进化上高度保守(Gunter,K.M,2011,IUBMB LIFE63,678-685)，该基因是20世纪90年代著名的神经生物学家Montell首先在试验中发现的，在研究果蝇感觉器官发育过程时，发现了重大的结果，野生型感觉器官前体细胞(SOP)不对称分裂时形成一个非神经祖细胞IIa和一个非神经祖细胞IIb,当Musashi1突变后，SOP细胞的分裂方式将发生很大的变化，分裂后形成两个相同的IIa细胞，结果是果蝇的表型出现双刚毛。由于其表型的特点，如同一名武士拿着双剑，联想到日本著名武士Miyamato Musashi,为了纪念该武士，将这个基因命名为Musashi(Fox,RG,2015,Annu RevCell Dev Biol 31,249-267)。

Musashi1主要表达在干细胞和祖细胞，而在分化细胞中表达相对减少(Sakakibara,S,2001,J.Neurosci.21,8091-8107)，当在线虫中敲除Musashi1,会引起雄性交配行为出现障碍，预示着Msi1可能调控分化的神经细胞的活性(Yoda,A.2000,Genescells5,885-895)。Musashi1能结合到(G/A)U_nAGU(n＝1-3)基序，这个基序定位到靶基因的mRNA的3’UTR区(Ohyama,T,2012,Nucleic Acids Res.40,3218-3231)。在体内，鉴定的Msi1靶基因并不多，例如m-numb(Imai,T,2001,Mol,cell.Biol),CDKN1A(Battelli,S,2006,Nature395,124-125)。除此之外，通过RIP-ChIP方法在293T细胞中鉴定出64个Msi1的靶基因(de Sousa Abreuet al.,2009).与对照组相比，这64个靶基因的mRNA被富集到Msi1相关的亚群，根据这些基因对于肿瘤形成的功能，主要包括两类，其一，细胞周期，细胞增殖，细胞分化和细胞凋亡；其二，蛋白修饰，包括泛素化，泛素循环(Raquel de Sousa Abreu,2009,The journal of biological chemistry,284,18,12125-12135)。

目前对于乳腺外Paget病的治疗，国内外都没有很好的治疗方法，一旦确诊，就需要采用外科手术切除的方法治疗。

发明内容

本发明的目的是提供Rapamycin及其结构类似物在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供Rapamycin及其结构类似物在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用。其中Rapamycin的结构类似物是指依维莫司(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、替西罗莫司(Temsirolimus)、INK128、地磷莫司(Ridaforolimus)或其组合。

优选地，所述异位过表达是指Msi1基因在皮肤基底层中过表达。

更优选地，所述疾病是指因Msi1基因异位过表达所致的Paget病。

最优选地，所述疾病是指因Msi1基因异位过表达所致的乳腺外Paget病。

第二方面，本发明提供一种用于治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物或组合物，有效成分为Rapamycin和/或其结构类似物。

第三方面，本发明提供一种用于治疗因Msi1基因过表达所致Paget病，特别是乳腺外Paget病的外用乳膏，乳膏配方如下：每100g蒸馏水中，Rapamycin 0.5g,白凡士林6g,羟苯乙酯0.17g,单硬酯酸甘油酯2g,硬脂酸2g,吐温-80 2.8g,十八醇13g,甘油33g，十二烷基硫酸钠0.04g。

使用时，将Rapamycin乳膏涂抹于EMPD病人患处皮肤表面，有效剂量为12.5mg乳膏/m²皮肤。

第四方面，本发明提供一种抑制Msi1基因表达的药物，其活性成分为Rapamycin和/或其结构类似物，该药物能够治疗Msi1基因高表达所引起的Paget病，特别是乳腺外Paget病。

本发明中，人类和小鼠Msi1基因在GenBank中登录号分别为NM_002442.3和NM_008629.1。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次使用m-TOR通路抑制剂Rapamycin及其结构类似物治疗由Msi1基因异位过表达引起的皮肤异常Paget样病。将Rapamycin药物用于小鼠模型上，能很好地减缓疾病表型，达到缓解疾病的效果。并且研发的药物在EMPD(乳腺外Paget病)病人上应用，已经取得了较好的临床效果。本发明为治疗小鼠及人的乳腺外Paget病提供了新方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中乳腺外paget病小鼠模型的构建过程示意图。A鼠(K14rtta转基因小鼠)与B鼠(TRE-Msi1转基因小鼠)进行杂交。

图2为本发明实施例1中乳腺外paget病小鼠模型鉴定结果。A:K14rttA，500bp；B:Tre-msi1，300bp、500bp。

图3为本发明实施例1中基因Musashi1过表达小鼠的基因型鉴定结果。A：对照；B：Msi1过表达小鼠(DTG小鼠)。

图4为本发明实施例1中DTG小鼠PAS染色结果。箭头所指是阳性细胞。

图5为本发明实施例1中paget样病标志物的免疫组化染色结果。

图6为本发明实施例1中DTG小鼠使用Rapamycin后HE染色结果。

图7为本发明实施例1中DTG小鼠pS6高表达，m-TOR通路过度激活。

图8为本发明实施例1中人EMPD样品pS6高表达，m-TOR通路过度激活。

图9为本发明实施例1中小鼠使用Rapamycin后，pS6表达下降，m-TOR通路被抑制。

图10为本发明实施例2中EMPD病人使用Rapamycin后，pS6表达下降，m-TOR通路被抑制。

图11为本发明实施例1中小鼠使用Rapamycin后，PAS阳性细胞减少。

图12为本发明实施例2中EMPD病人涂Rapamycin后，PAS阳性细胞减少。

图13为本发明实施例1中DTG小鼠使用Rapamycin后，CAM5.2表达下降。

图14为本发明实施例2中EMPD病人使用Rapamycin后，CAM5.2表达下降。

图15为本发明实施例2中EMPD病人使用Rapamycin乳膏后，症状减轻。

图16为本发明实施例2中EMPD病人使用Rapamycin乳膏后，CT检查结果，基本恢复为正常表型。

图17为本发明实施例2中制备的Rapamycin乳膏成品。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明的技术流程如下：

1、乳腺paget病转基因小鼠模型的构建

由Doxycyline(Dox)控制Musashi1表达的转基因小鼠模型。饮水中添加Dox，诱导外源基因Musashi1过表达。

2、检测到Paget样转基因小鼠模型m-TOR通路异常激活

Musashi1在小鼠皮肤特异性过表达后，出现乳腺外paget病的典型症状，出现paget样细胞，通过检测发现在Musashi1过表达小鼠中m-TOR通路异常激活。通过人的样品，检测发现Musashi1高表达，且m-TOR通路也是异常激活。

3、特异性药物的使用

在DTG小鼠中，按照4mg/kg的剂量给小鼠注射Rapamycin，注射药物后，小鼠皮肤paget样病症减轻。由于在DTG小鼠中检测到m-TOR通路异常的激活，因此使用了m-TOR通路抑制剂Rapamycin，验证其是否具有减轻病症的作用。

4、使用药物后，分析药效结果

通过HE染色，观察表型变化、恢复的效果。通过免疫染色，从分子机制进一步检测药效及表型恢复的机制。

实施例1 Rapamycin在治疗因Msi1基因过表达所致的乳腺外Paget病中的应用

(一)乳腺外小鼠paget病模型(可诱导的小鼠模型)的制备

本实施例制备了由Doxycyline(Dox)控制Musashi1表达的转基因小鼠模型(DTG小鼠)。通过给小鼠饲喂Dox，诱导外源基因Musashi1过表达。在Musashi1过表达48h(即Dox给药48h)后，即可出现初期乳腺外paget病的症状。

DTG小鼠的具体制备方法如下：

将K14rtta转基因小鼠与TRE-Msi1转基因小鼠进行交配(两种转基因小鼠的构建方法参见Wang S,Li N,Yousefi M,Nakauka-Ddamba A,Li F,Parada K,et al.(2015)Transformation of the intestinal epithelium by the MSI2 RNA-bindingprotein.Nat Commun 6:6517)，产生子代小鼠，待子代小鼠长到6周时，向小鼠的饮水中添加终浓度为0.2g/L的四环素，让小鼠自由饮水，保证饮水充足，诱导基因Musashi1过表达。饲喂四环素48h后，即可出现乳腺外paget病样症状的小鼠，即乳腺外小鼠paget病模型(DTG小鼠)。

DTG小鼠基因型的鉴定：

1、提取小鼠基因组DNA作为模板，以F1和R1为引物，进行PCR扩增(PCR靶为K14rtta基因)，检测扩增产物，出现500bp的特征条带。PCR反应体系：mix 6μL(康维世纪，货号：01037/30252)，F1 0.6μL，R1 0.6μL，基因组DNA模板1μL，ddH₂O 3.8μL。反应程序：95℃5min；95℃30s，61℃30s，72℃30s，35个循环；72℃2min。

2、提取小鼠基因组DNA作为模板，以F2和R2为引物，进行PCR扩增(PCR靶为TRE-Msi1基因)，检测扩增产物，出现300bp和500bp两条特征条带。PCR反应体系：mix 6μL(康维世纪，货号：01037/30252)，F2 0.6μL，R2 0.6μL，G 0.6μL，基因组DNA模板1μL，ddH₂O 3.2μL。反应程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃2min。

同时满足上述1和2的鉴定为乳腺paget病小鼠。若出现其他的基因型，均为同窝对照小鼠。

所用引物序列如下(SEQ ID NO:1-5)：

F1:5′-CACGATACACCTGACTAGCTGGGTG-3′

R1:5′-CACGATACACCTGACTAGCTGGGTG-3′

F2:5′-CCCTCCATGTGTGACCAAGG-3′

R2:5′-GCACAGCATTGCGGACATGC-3′

G:5′-GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG-3′

(二)DTG小鼠药物处理

待DTG小鼠长到6周时，注射给药，部分小鼠注射Rapamycin液作为实验组，另一部分小鼠注射生理盐水作为对照组(Rapamycin液的配制方法如下：用无水乙醇配制Rapamycin母液，母液中Rapamycin浓度为10mg/mL，吐温80 5％，PEG-400 5％；然后用生理盐水将母液稀释到Rapamycin终浓度为1mg/mL，即得Rapamycin液)，每只小鼠每天给药量为0.8mg Rapamycin/kg体重，连续注射5天。每只小鼠给药量总计为4mg Rapamycin/kg体重。第5天注射完，开始取样，进行后续实验。

(三)取样

以同窝出生，注射生理盐水的DTG小鼠作为对照组。注射Rapamycin液的DTG小鼠作为实验组。颈部脱臼处死小鼠，用电推剪将背部毛发剔除干净，用剪刀取一小长方形背部皮肤，用4％的多聚甲醛固定24h后，PBS清洗3次，每次20min，使用刀片修剪成约1cm×0.75cm大小的组织快。剪角(顺着毛发方向)，切掉一小块，准备脱水。

(四)脱水

脱水程序及步骤如下

后3步温度设定为60℃，用来溶解蜡，其余都是常温。

(五)包埋

石蜡包埋，竖立包埋，然后切成5μm大小，在39℃水浴锅中展片，实体显微镜下观察是否完全展开，将展平的片子用粘附性载玻片捞取，晾干。

(六)小鼠表型分析(HE染色)

苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining),简称HE染色法,该方法是细胞学，组织学，胚胎学以及病理学中使用最常见的方法，能够直观的观察组织细胞的异常变化。

1.烤片：63℃，1h。

2.脱蜡，水化。

3.二甲苯I:15min。

4.二甲苯II:15min

5.梯度乙醇处理：

100％乙醇I,II：各5min

95％乙醇I,II：各5min

80％乙醇:5min

70％乙醇:5min

蒸馏水：5min

苏木精：10min

自来水：5min

95％乙醇I,II：各3min

伊红：10s

95％乙醇I,II：各3min

100％乙醇I,II：各3min

二甲苯I:10min

二甲苯II:10min

封片，拍照。

(七)免疫组化

1.烤片：63℃，1h。

2.脱蜡，水化。

3.二甲苯I:15min。

4.二甲苯II:15min。

5.梯度乙醇处理：

100％乙醇I,II：各5min

95％乙醇I,II：各5min

80％乙醇:5min

70％乙醇:5min

蒸馏水：5min。

6.抗原修复：PH＝6.0的柠檬酸钠煮沸20min。

7.自然冷却：1h左右。

8.PBS:处理3次，5min/次。

9.H₂O₂:避光20min。

10.PBS:处理3次，5min/次。

11.封闭：封闭液作用至少1h。

12.一抗：按照适当比例与量加入现配制好的一抗，4℃过夜。

13.复温：室温放置半小时。

14.PBS:处理3次，5min/次。

15.B液：室温30min。

16.PBS:处理3次，5min/次。

17.C液：室温30min。

18.PBS:处理3次，5min/次。

19.蒸馏水：处理5min。

20.DAB:根据抗体的特点，在显色合适的时间下，终止显色，放入蒸馏水中。

21.苏木精：复染5min。

22.自来水：处理5min。

23.梯度乙醇处理：

70％乙醇:3min

80％乙醇:3min

90％乙醇:3min

100％乙醇:3min

二甲苯I:5min

二甲苯II:5min

封片，拍照。

其中，B液、C液来自于中杉金桥试剂盒，目录号：sp9001，sp9002。

(八)Western blot

1.提取蛋白质

(1)剪适当大小的皮肤，用剪刀剪碎。

(2)向上述样品中加入400μL蛋白裂解液(PMSF:IP体积比1:100)，匀浆机分散均匀组织在冰上裂解30min。

(3)4℃，12000rpm离心10min

(4)吸取上清，取一部分样品检测浓度，用于Western blot实验，其余样品放在-80℃保存。

2.检测蛋白质浓度

用碧云天试剂盒BCA检测蛋白质浓度，每个泳道上样50μg。

3.电泳

浓缩胶：60V，分离胶：80V。

4.转膜

湿转，330mA转膜1h。

5.封闭

用5％脱脂奶粉封闭1h。

6.一抗

按照蛋白分子量大小，剪取适当大小膜，封膜，加入适量一抗。4℃过夜。

7.复温

摇床上摇30min。回收一抗。

8.洗膜

TBST:3X10min/次

9.二抗

用购自碧云天的二抗，室温孵育1h。

10.洗膜

TBST:处理3次，10min/次。

11.显色

免疫组化所用一抗：pS6(cell signaling technology,1；400,#4858)。CAM5.2(1:50；ZSGB-BIO，ZM-0316组化二抗和DAB显色试剂盒(中杉金桥试剂盒)。

Western blot所用一抗：pS6(cell signaling technology,稀释比例1；1000)。β-tubulin(上海翊圣生物科技有限公司,稀释比例1；4000,30101ES50)，Western blot所用二抗(碧云天，稀释比例1：10000，货号：A0208(兔源)，A0216(小鼠源)。

PAS染色试剂盒：购自北京雷根生物技术有限公司(货号：DG0005)。

通过HE染色，观察到DTG转基因小鼠出现了paget样细胞。通过免疫组化和westernblot检测，发现pS6表达升高，PAS染色结果表明DTG转基因小鼠出现了大量PAS阳性细胞，说明在小鼠上诱导出paget样疾病，并且mTOR通路激活。施用Rapamycin后，pS6表达下降，Cam5.2表达下降，PAS阳性细胞减少，表明给药后，mTOR通路受到抑制，疾病受到抑制。

图1为乳腺paget病小鼠模型的构建过程示意图。A鼠(K14rtta转基因小鼠)与B鼠(TRE-Msi1转基因小鼠)进行杂交。

图2为乳腺paget病小鼠模型鉴定结果。A:K14rttA，500bp；B:Tre-msi1，300bp、500bp。

图3为基因Musashi1过表达小鼠的基因型鉴定结果。A：对照；B：Msi1过表达小鼠(DTG小鼠)。

图4为DTG小鼠PAS染色结果。箭头所指是阳性细胞。

图5为paget样病标志物的免疫组化染色结果。

图6为DTG小鼠使用Rapamycin后HE染色结果。

图7显示DTG小鼠pS6高表达，m-TOR通路过度激活。

图8显示人EMPD样品pS6高表达，m-TOR通路过度激活。

图9显示小鼠使用Rapamycin后，pS6表达下降，m-TOR通路被抑制。

图11显示小鼠使用Rapamycin后，PAS阳性细胞减少。

图13显示DTG小鼠使用Rapamycin后，CAM5.2表达下降。

实施例2 Rapamycin乳膏的制备及其在治疗因Msi1基因过表达所致的乳腺外Paget病中的应用

(一)Rapamycin乳膏的制备方法

1、Rapamycin乳膏的配方：

每100g蒸馏水中，Rapamycin 0.5g,白凡士林6g,羟苯乙酯0.17g,单硬酯酸甘油酯2g,硬脂酸2g,吐温-80 2.8g,十八醇13g,甘油33g，十二烷基硫酸钠0.04g。

2、制备方法：

Rapamycin乳膏属于O/W型(水包油型)。

(1)油相：各物质(白凡士林:6g,羟苯乙酯:0.17g,单硬酯酸甘油酯2g,硬脂酸2g,吐温-80 2.8g,)加入油锅，开启加热装置加热熔化，调节温度在80℃，保温。

(2)水相：各物质(十八醇13g,甘油33g,加蒸馏水，加热装置加热熔化，调节温度在80℃，保温。

(3)乳化成型：打开真空装置，依次将水相，Rapamycin，油相缓慢抽入匀质锅中，开启匀质装置，匀质半小时后停止匀质。持续搅拌至冷凝即得。

图17为制备的Rapamycin乳膏成品。

(二)Rapamycin乳膏的治疗实例

经诊断为EMPD的病人，通过招募确定为志愿者，在阴囊附近发病部位(有红斑)涂抹软膏，延伸到健康组织处也涂抹，早晚各一次，每cm²皮肤约涂抹12.5mg乳膏，(具体根据实际患处的红斑面积调整用药量，以覆盖住红斑为宜)延伸到健康组织部位为宜。连续涂抹2周，涂药前和涂药后作比较，发现涂药后EMPD病人症状减轻，甚至达到恢复。

在人EMPD病例上涂抹Rapamycin乳膏后，可以观察到疾病明显减缓。

图10显示EMPD病人使用Rapamycin后，pS6表达下降，m-TOR通路被抑制。

图12显示EMPD病人涂Rapamycin后，PAS阳性细胞减少。

图14显示EMPD病人使用Rapamycin后，CAM5.2表达下降。

图15显示EMPD病人使用Rapamycin乳膏后，症状减轻。

图16显示EMPD病人使用Rapamycin乳膏后，CT检查结果，基本恢复为正常表型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 雷帕霉素及其结构类似物在制备治疗由Msi1基因异位过表达引起疾病的药物中的应用

<130> KHP181113671.9

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacgatacac ctgactagct gggtg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacgatacac ctgactagct gggtg 25

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctccatgt gtgaccaagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcacagcatt gcggacatgc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagaagcgc ggccgtctgg 20

Claims

1.雷帕霉素及其结构类似物在制备治疗乳腺外Paget病的药物中的应用，其中雷帕霉素的结构类似物是指依维莫司、KU-0063794、AZD8055、替西罗莫司、INK128、地磷莫司或其组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为外用乳膏，乳膏配方如下：每100g蒸馏水中，雷帕霉素0.5g,白凡士林6g,羟苯乙酯0.17g,单硬酯酸甘油酯2g,硬脂酸2g,吐温-80 2.8g,十八醇13g,甘油33g，十二烷基硫酸钠0.04g。