CN110713936B - 茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法，所述茶白星病菌经鉴定为痂囊腔菌，于2019年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019555。本发明提供了一株来自病叶新的痂囊腔菌(Elsinoe camellia sinesis)菌株Cs52，并被鉴定为茶白星病的致病菌。为该病的发生规律及生物防治的研发奠定了基础。

Description

茶白星病菌及其单孢分离方法和鉴定方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种茶白星病菌及其 单孢分离方法和鉴定方法。

背景技术

茶白星病(Tea white scab disease)是高海拔茶园最严重的真菌病 害之一，随着山区茶园的进一步发展，茶白星病的发生与为害更加严 重。当茶树受到茶白星病菌侵染后，在叶片、茎秆、花苞均可出现密 集的褐色小点或灰白色圆形斑，减产10％-50％以上，甚至片叶无收。 感病芽叶制成的干茶叶底布满小斑、汤色浑暗，尤其味苦异常。生产 上通常采用多菌灵等化学农药对该病进行防控，因发病期常为多雨季 节，防效不佳，已日益发展成茶产业发展的技术瓶颈。加速茶白星病 病原的致病机理、病害流行规律的研究，研发抗病品种等生态防控措 施的需求十分迫切。然而，有关该病的研究却面临着一个十分基础性的问题——病原菌的分离鉴定尚有存疑。因此需要加速茶白星病病原 的分离鉴定、再开展进一步病害流行规律的研究，明确茶白星病的致 病菌的基本前提，并为抗茶白星病品种选育等生态防控措施提供科技 支撑。

发明内容

基于此，针对上述背景技术中技术问题，提供一种茶白星病菌及 其单孢分离方法和鉴定方法。

一种茶白星病菌，经鉴定为Elsinoe camellia sinesis Cs52，于2019 年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉 市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉 大学保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019555。

在一些实施方式中，包括4段核苷酸序列，4段所述核苷酸序列如 SEQID NO:1、SEQID NO:2、SEQID NO:3和SEQID NO:4所示。

本发明提供了一种所述的茶白星病菌单孢的分离方法，包括如下 步骤：

S1、切取病叶上病健交界处的病组织；

S2、将病组织进行灭菌、清洗和晾干处理；

S3、将S2步骤处理的组织浸渍在无菌载玻片上，并滴加1滴灭菌 水，为使其保持湿润，将其保存在保湿室中，20～24℃下保存5小时， 将小片提起，镜检，用毛细管吸引分生孢子的水滴，水滴在PDA上流 动，分布在直径为9cm的表面皿全面上。待菌落生长形成孢子，通过 琼胶平板表面单孢子挑取法进行单孢分离获得茶白星病菌单孢。

在一些实施方式中，在S2步骤中，灭菌处理采用3％次氯酸钠。

在一些实施方式中，所述PDA配方包括如下成分：200g马铃薯、 20g葡萄糖、20g琼脂粉和蒸馏水定容至1L。

本发明还提供了一种所述的茶白星病菌的鉴定方法，包括如下步 骤：

1)提取待测样品的总DNA；

2)对所述总DNA进行PCR扩增；

3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

4)回收目的片段，并将其克隆至载体上，通过菌液PCR筛选阳 性克隆体；

5)对所述阳性克隆体进行测序。

在一些实施方式中，所述PCR扩增体系为:rTaq酶0.25μL，dNTPs 0.4μL，DNA模板1μL，上下游引物各2μL，ddH₂O定容至50μL。

在一些实施方式中，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，最 后72℃延伸10min，4℃保存。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一株来自病叶新的痂囊腔 菌(Elsinoecamellia sinesis)菌株Cs52，并被鉴定为茶白星病的致病 菌。为该病的发生规律及生物防治的研发奠定了基础。

附图说明

图1为茶白星病菌的田间症状表型的示意图；

图2为茶白星病菌的菌落生长示意图；

图3为T1和T2接种菌的形态学示意图；

图4为T1的系统发育树图；

图5为T2的系统发育树图；

图6为T1和T2病菌的致病性测定的示意图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但 是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术 人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受 下面公开的具体实施的限制。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、 “左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关 系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简 化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、 以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外， 术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示 或暗示相对重要性。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发 明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说 明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于 限制本发明。

一种茶白星病菌，经鉴定为Elsinoe camellia sinesis，于2019年7 月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2019555。

在一些实施方式中，包括4段核苷酸序列，4段所述核苷酸序列如 SEQID NO:1、SEQID NO:2、SEQID NO:3和SEQID NO:4所示。

为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技 术方案进行详细的说明。

实施例1：茶白星病菌的单孢分离

1、一种茶白星病菌的单孢分离方法，包括如下步骤：

S1、取采集的病叶，无菌水洗净，从病健交界处切取病组织2mm× 2mm小块；

S2、将病组织小块浸渍在无菌载玻片上，并滴加1滴灭菌水，为使其 保持湿润，将其保存在保湿室中，20～24℃下保存5小时，将小片提 起，镜检，用毛细管吸引分生孢子的水滴。；

S3、将水滴在PDA上流动，分布在直径为9cm的表面皿全面上，置 于培养箱中24℃黑暗培养6d，待菌落长出形成孢子，应用琼胶平板表 面单孢子挑取法进行单孢分离。

2、茶白星病菌的形态学观察

染色观察：单孢分离的菌株，以PDA平板培养基在25℃恒温箱中 培养至稳定期，记录菌落形态特点，并在光学或电子显微镜下观察分 生孢子的形态特点。将发病斑块浸泡在98％无水乙醇中煮沸至叶色透 明，置于玻片上，滴加一滴染液(石碳酸20ml，乳酸20ml，甘油40ml， 蒸馏水20ml，棉兰50mg)，覆上盖玻片，轻压使标本平铺5min后镜检。

电镜观察：单孢分离菌株，蘸取少许孢子，采用固定、脱水、置 换、干燥、制样、喷金镀膜后在Philips XL-30型扫描电子显微镜下观察 病菌孢子形态。

3、茶白星病菌的形态特征

茶白星病发生在海拔400m以上茶园的嫩芽、嫩叶、叶柄、嫩茎及花 苞上，并以嫩叶上发生最多。茶白星病初期呈针头状褐色点，光照可 见其边缘有黄色晕圈，病斑中央凹陷而其周围隆起，环绕初期斑点向 外扩展，病叶斑点数达数十个，病斑直径不超过2mm，并相互融合形 成大的不规则斑点，致使叶片扭曲变形或畸形，参见图1中a和b。嫩 茎和花苞上也有病斑，但病斑数目较少，常为散生，参见图1中c和d。

对来自不同茶园的358份茶白星病叶片病原菌进行分离、纯化培 养，其中大部分为茶树炭疽病及轮斑病等常见茶树病害病原及内生真 菌如拟茎点霉菌等，分别占比为35.9％-64.71％。而依据菌落形态特征 将分离获得的150个菌株分为T1型和T2型两个类型。其中T1-HNGZ 菌落生长速度为0.09cm/d，初期为黄褐色，后期为红褐色，呈近圆形 毡状，边缘有褶皱，分界光滑清晰，质地致密坚硬，中心位置丘状凸 起，具粉红色粘稠状分生孢子堆，后期菌落边缘较薄，表面有时产生 白色菌丝，并分泌黄色素等物质使培养基呈黄色，参见图2中a和b。 T2-HNBJ菌落生长速率为0.67cm/d，初期为灰褐色，后期为黑褐色， 呈蓬松圆形绒毛状，边缘有放射状，菌落中心有小粒点，参见图2中c 和d。调查发现如表1所示，不同地理位置和海拔高度的4个茶区中都 可分离获得T1型和T2型菌。其中，T1型比例为5.24％-12.82％，T2 型比例为23.53％-51.28％，T2型比例显著大于T1型，且海拔越高T2型分离比例越高。

表1不同产区茶白星病原菌的分离、纯化统计表

4、分离菌株的形态观察

将T1型代表菌接种至供试茶树叶片培养，10d后进行棉兰染色观 察，结果如图3中a和b所示，在病斑中间有散生状菌丝。其中子囊 为(6.0-18.5)μm×(12.0-28.5)μm此外，如图2中c所示，在PDA培养 基上培养7d后的T1菌落同样出现散生状菌丝。T1菌的成熟期显微观 察表明，菌落表面有大量分生孢子，呈椭圆状，半透明状，大小为(1.5-5.0) μm×(1.0-2.5)μm，参见图3中d、e和f，与已有研究报道相比发现， T1菌株的形态与痂囊腔菌(Elsinoesp)的性状一致。将T2型代表菌 培养10d后显微观察表面有直径90～180um的黑褐色球形，有1～3个 直径为17～33um的孔口，其分生孢子呈不规则圆形无色单胞，大小为 (3.4～5.0)μm×(2.2～3.1)μm，参见图3中g、h和i。T2型菌株的形 态与茶叶点霉菌和茎点霉菌的性状一致。鉴于此，在T1-HNGZ和 T2-HNBJ的多基因分子鉴定基础上，T1型代表菌(T1-HNGZ-1)鉴定 为痂囊腔菌Elsinoe camellia sinesis，T2型代表菌(T2-HNBJ-1)则鉴 定为茎点霉菌phoma sp.CPT。

实施例2：茶白星病菌的鉴定方法

1、一种茶白星病菌的鉴定方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品的总DNA，具体包括如下步骤：取培养7d的菌 株菌丝0.4g，用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取真菌总DNA，以提 取的DNA为模板，分别扩增至真菌基因间隔序列ITS、18SrRNA、RPB2 及LSU，其引物的序列如表2所示。

表2 PCR病原检测引物

2)对所述总DNA进行PCR扩增，具体包括如下步骤：PCR扩增 体系：rTaq酶0.25μL，dNTPs 0.4μL，DNA模板1μL，上下游引物 (10umol/L)各2μL，ddH₂O补足至50μL。反应条件为，94℃预变性 4min；94℃变性30_S，55℃退火30_S，72℃延伸90_S，共35个循环，最 后72℃延伸10min，4℃保存。

3)扩增产物采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

4)回收目的片段，并将其克隆至载体上，通过菌液PCR筛选阳 性克隆体，具体步骤包括：参照凝胶回收试剂盒说明书将其目的片段 回收，并将其克隆至pMD19-T载体，采用菌液PCR方法筛选阳性克 隆体。

5)对所述阳性克隆体进行测序，具体步骤如下：，委托生工生物工 程(上海)股份有限公司完成测序。测序结果去除载体信息，并通过 NCBI的BLAST进行比对搜索，下载同源比对数据，并利用最大似然 (ML)和贝叶斯推理(BI)对每一个序列进行了系统树估计。在CIPRES 门户网站中，使用了ML的默认参数。贝叶斯推理分析在Beast V2.4.3 中实现。

2、分离菌株的分子鉴定

提取T1型菌T1-HNGZ、T2型菌T2-HNBJ基因组DNA，并将rDNA 的ITS、18S rRNA、RBP2与LSU区进行克隆测序，通过NCBI核酸 数据库同源比对下载ITS、18S rRNA、RBP2与LSU区序列，与测序 获得的相应序列构建系统发育树。测序结果提交至NCBI数据库， T1-HNGZ的登录号分别为MK312256、MK312257、MK814964与 MK793793。系统进化树结果显示，T1-HNGZ与Elsinoe hederae、Elsinoe leucopogonis及Elsinoe theae的亲缘关系最近，参见图4，T2-HNBJ扩 增的ITS、RBP2、18S rRNA与LSU区序列的登录号依次为 MK814959-MK814963，系统进化树的结果显示与phoma sp.、Phoma herbarum以及Didymellia bellidis的亲缘关系最近，参见图5。从而初 步鉴定T1-HNGZ菌为Elsinoe sp.，鉴定T2-HNBJ菌为Phoma sp.。

实施例3：病原菌分离致病性测定

用茶树品种茗丰进行致病性测定。

有伤接种方法：剪取温室盆栽2年生供试茶树新生枝条，经无菌水清 洗后晾干，用接种针在上部第2平展叶的叶片左右两边对称各制造5 个深浅大小一致的接种伤口，分别将直径5mm培养14d的供试菌株菌 碟和无菌PDA培养基对照碟片置于刺伤部位，以无菌水浸润后脱脂棉 覆盖保湿，有伤接种重复10次。

无伤接种方法：培养14d的供试菌株配置成2.0×10⁵mL分生孢子悬 浮液，将采集的枝条浸泡于悬浮液中5h后取出，枝条浸泡于无菌水中 5h设为对照。分别将有伤无伤接种的茶树及枝条置于光照培养箱中培 养(26℃恒温，95％湿度，12/12小时光暗交替)，48h后清除接种体， 继续培养，每天观察发病情况，待接种部位发病后，再次进行病原菌 分离，观察菌落、分生孢子的形态并与供试菌株进行比较。无伤接种 重复10次。

将T1型和T2型中选取3个代表性菌株，接种到供试茶树幼叶的 叶片上进行培养观测。研究发现，接种T1-HNGZ菌株培养4d后，叶 片出现针头状淡褐色小点，边缘有黄色晕圈，当培养6d后病健分界明 显，病斑呈红褐色，中心略凹，四周有褐色隆起，直径约0.2-1.5mm，如图6中a和b所示。尤其在无伤接种的第4d即出现与田间观察报道 的茶白星病发病初期一致的症状。接种T2-HNBJ菌株培养2d后，叶 片呈4-8mm褐色斑块，6d后生长成不规则的黑褐色斑块，直径约 1.0-1.5cm，边缘颜色较深，如图6中c和d所示。该性状与田间观察 报道的茶白星病的症状存在差异，而且无伤接种后一直不显症。因此 鉴定T1-HNGZ为茶白星病的病原菌。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简 洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述， 然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书 记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具 体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出 的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提 下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种茶白星病菌，经鉴定为痂囊腔菌(Elsinoe camellia sinesis)，于2019年7月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019555。

2.如权利要求1所述的茶白星病菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待测样品的总DNA；

2)对所述总DNA进行PCR扩增；

3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

4)回收目的片段，并将其克隆至载体上，通过菌液PCR筛选阳性克隆体；

5)对所述阳性克隆体进行测序。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为:rTaq酶0.25μL，dNTPs 0.4μL，DNA模板1μL，上下游引物各2μL，ddH₂O定容至50μL。

4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

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