CN110702647A - 一种基于磁性金属有机骨架（mof） 的新型荧光印迹传感器的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明报道了一种基于磁性金属有机骨架(MOF)的新型荧光印迹聚合物传感器的制备，并成功将其用于甲型肝炎病毒(HAV)的检测。在本发明中，我们引入发光MOF(MIL‑101‑NH2)代替量子点和有机染料作为输出信号。发光MOF材料不仅可以用作输出信号，还可以用作载体。同时，金属有机骨架具有较大的比表面积，可提供更多的印迹位点，从而提高传感器的响应灵敏度；四氧化三铁颗粒与MIL‑101‑NH2材料的组合，使得制备印迹聚合物的过程更简单，更快速；荧光分析法具有高灵敏度、选择性较强、操作方便等优点。因此，综合以上几点优势，相较于其它的分析方法或传感器而言，本发明构建的分子印迹荧光化学传感器对模板分子的选择性好，检测灵敏度高。结果表明，该方法简便，快速，可用于定性、定量地检测HAV，在生物传感及病毒的检测与预防方面有着重要的实际应用潜能及意义。
Description
技术领域
本发明属于分析化学检测技术领域，具体涉及一种基于磁性金属有机骨架的新型荧光印迹传感器的构建及应用。
背景技术
在传统的荧光病毒分子印迹材料的制备中，研究人员往往会在印迹层中引入荧光材料，如量子点[Zhou J.,Yang Y.,Zhang C.,Chemical reviews,2015,115,11669-11717.]、有机荧光染料等作为输出信号，或直接利用病毒本身的荧光作为输出信号，这些工作都取得了一定的成果。然而，在我们的后续研究中，发现带有量子点的印迹聚合物会表现出荧光不稳定性；含有机荧光染料的印迹聚合物具有光漂白的隐患，且大多数有机染料具有轻微毒性，不适合进一步应用于体内研究。利用病毒本身的荧光进行检测避免了上述问题，但由于其荧光强度较弱，获得的检测范围和检测限往往都不太理想。
金属有机骨架(MOF)是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料。这些材料具有高孔容，高度有序的孔结构，高活性部位密度和高比表面积等性质[Reed D.A.,Keitz B.K.,Oktawiec J.,Nature,2017,550,96.]。越来越多的人使用功能性MOFs材料来感应无机离子和小有机分子。在这些材料中，由于其自身具有发色团而发出荧光的一类MOFs材料(如MIL-101-NH2，UIO-66等)引起了人们的注意。这些发光MOFs材料的固有光物理性质和孔隙率可以满足物体的封装能力，并且有望应用于荧光传感。
因此，在本研究中，我们用发光MOFs(MIL-101-NH2)代替上述荧光信号源作为输出信号。值得一提的是，MIL-101-NH2不仅可以用作荧光输出信号，还可以作为印迹载体，并且利用到了MOFs材料大比表面积、优越的稳定性能等优点。在本发明中，通过简单的一步法合成了HAV磁性分子印迹聚合物(MMIPs)。具体程序为：首先合成了磁性MIL-101-NH2，之后，将模板病毒HAV在其表面固定，然后加入TEOS交联聚合得到印迹聚合物。该方法具有制备工艺快速，简单，成本低的优点，并在应用中取得了预期的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于磁性金属有机框架的分子印迹荧光传感器用于检测甲型肝炎病毒的新方法，并将所述传感器应用于病毒分子的特异性识别与检测。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种新型的基于氨基功能化金属有机框架的分子印迹荧光传感器的构建及应用，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
(1)基于氨基功能化的磁性金属有机框架荧光分子印迹聚合物的制备：首先，将四氧化三铁羧基化，然后在其表面上制备MIL-101-NH2；通过使用上述颗粒作为载体，HAV作为模板以及TEOS作为交联剂制备HAV印迹聚合物，其分子印迹聚合物固定在MOFs材料(MIL-101-NH2)的表面上；
(2)四氧化三铁颗粒与MIL-101-NH2材料的组合作用：利用MOFs材料的高孔容，高比表面积等性质更好地固定和印迹目标病毒，并且在磁体作用下使得制备印迹聚合物的过程更简单，更快速；
(3)病毒荧光分子印迹传感器的构建及应用：将模板分子与印迹聚合物在优化的实验条件下吸附一段时间，取其混合物于比色皿中，在波长为290nm，狭缝为5.0nm-5.0nm的条件下激发，采用RF-5301PC荧光分光光度计测其荧光强度，发射波长为420nm，构建一种基于氨基功能化的金属有机框架荧光分子印迹传感器。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)引入发光MOFs(MIL-101-NH2)代替量子点和有机染料作为输出信号，其具有稳定荧光信号，没有光漂白性，也不具有毒性等特性。发光MOFs材料不仅可以用作输出信号，还可以用作载体，并兼具MOFs材料的优势。
(2)以磁性纳米粒子为基底，接枝一层金属有机骨架材料在磁性纳米粒子的表面，作为病毒分子印迹的载体材料。利用其磁性进行洗脱和纯化，使得印迹聚合物的制备过程更简单，更快速；金属有机骨架材料表面易于修饰，比表面积大，可提供更多的结合位点；且其热稳定性能良好，有利于长期保存使用。
(3)实验结果表明，所述病毒分子印迹荧光传感器对目标分子具有高的选择性和灵敏度，印迹效果令人满意；
(4)所述传感器具有应用于其它分子检测的潜在可能性，且检测过程对操作人员的专业要求不高，具有重要的实际应用价值。
附图说明
[图1]所述病毒分子印迹荧光传感器的制备流程图
[图2]Fe3O4(a)、Fe3O4@SiO2(b)、Fe3O4@MOFs(c)及Fe3O4@MOFs@MIPs(d)粒子的红外光谱图。
[图3]Fe3O4@SiO2-COOH(a)和Fe3O4@MOFs(b)粒子的X-射线衍射图。
[图4]Fe3O4@SiO2(a)，Fe3O4@MOFs@MIPs(b)粒子的SEM图。
[图5]病毒分子印迹荧光传感器对不同浓度HAV的响应图：
[图6]病毒分子印迹荧光传感器对不同病毒的检测图。
[图7]病毒分子印迹荧光传感器用于加标回收HAV。
具体实施方案
在此，将结合附图及实施例，对本发明的具体实施方案作进一步的详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的应用范围及扩展。
实施例1：一种新型的病毒荧光分子印迹传感器的制备方法
(1)Fe3O4@MIL-101-NH2的合成：首先，制备羧基官能化的四氧化三铁颗粒，1gFe3O4，100mL异丙醇，4mL超纯水，超声处理20min后均匀分散。在机械搅拌下，加入20mL氨水，逐滴加入6mL TEOS，并在45℃的油浴中进行反应6h。最后用蒸馏水，乙醇洗涤，并在60℃下真空干燥，得到Fe3O4@SiO2产物备用。将0.5g丁二酸酐(SA)和1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在30mL乙酸中，超声5min后，在30℃下搅拌3h。再加入40mg Fe3O4@SiO2粒子、20mL乙酸和3mL超纯水，并将该混合物超声分散后被广泛在30℃的油浴中反应12h。用水洗涤后，将其真空干燥使用。
(2)Fe3O4@MOF的制备：取0.8g Cr(NO3)3·9H2O，0.36g H2BDC-NH2，0.16g NaOH，溶解在15mL超纯水中，并在室温下搅拌1.5h。混合后，加入30mg Fe3O4@SiO2-COOH，搅拌30min后，将其转移到50mL反应容器中。反应在150℃下进行12h，得到Fe3O4@MOF，干燥后使用。
(3)磁性分子印迹聚合物/非印迹聚合物(MMIPs/MNIPs)粒子的制备：将2mL HAV溶液，0.06g Fe3O4@MOF，超声分散在15％四氢呋喃中，30min后，加入50μL TEOS，并将反应在30℃保持12h。通过磁铁将产物与反应液分离，然后用超纯水洗去反应液中的未反应单体，未印迹模板，低聚物等杂质。用甲醇：乙酸(9：1，v：v)洗脱模板，用超纯水洗去残余的洗脱液，真空干燥使用。在相同条件下，在没有模板病毒的情况下合成非印迹颗粒(NIPs)，并在相同的洗脱步骤中处理。
(4)所述分子印迹荧光传感器(MMIPs传感器)的构建：将MMIPs粒子分散在PBS稀释液中至终浓度为19μg/mL。再加入HAV混合，并用PBS缓冲液将溶液体积调节至1000μL，并在恒温下振荡一段时间。然后取一定量反应液于比色皿中，采用RF-5301PC荧光分光光度计测其荧光，构建一种检测病毒的分子印迹荧光传感器。检测条件为：激发波长：290nm，发射波长：420nm，激发狭缝：5.0nm，发射狭缝：5.0nm。
实施例2：所述MMIPs荧光传感器及中间产物的性能、形貌和结构表征。
利用傅里叶变换红外光谱仪、X-射线衍射仪、扫描电镜对制备的所有材料进行了结构和形貌的表征。图2为Fe3O4(a)，Fe3O4@SiO2(b)，Fe3O4@MOFs(c)及Fe3O4@MOFs@MIPs(d)粒子的红外光谱图。约570cm-1处的吸收峰归因于Fe3O4的Fe-O特征峰。1096cm-1处的吸收峰是Si-O-Si的拉伸振动峰，793cm-1处的吸收峰是Si-O的振动峰。这为Fe3O4@SiO2的合成提供了证据。得到的线都包含这些特征峰。合成MOF后，红外光谱再次发生变化。1384cm-1,1500cm-1和1628cm-1的三个吸收峰代表在Fe3O4中形成MIL-101-NH2。
图3为Fe3O4@SiO2(a)，MMIPs(b)粒子的SEM图。从图3a中可以看出，涂覆有SiO2的Fe3O4的表面相对光滑并且具有约300nm的均匀球形。图3b显示具有粗糙表面的MMIPs颗粒和具有约500nm粒径的聚集颗粒的图像。
通过X-射线衍射(图4)进一步分析Fe3O4@SiO2-COOH和Fe3O4@MOFs。图4是Fe3O4@SiO2-COOH和Fe3O4@MOF的XRD光谱。如图4a所示，在两个样品中观察到氧化铁(30.1°，43.1°，53.4°，57°，62.6°)在20°～80°(2θ)范围内的几个特征峰，这些较弱的特征峰可能是由硅层涂层引起的。图4b是Fe3O4@MOF的XRD光谱，与图4a相比，Fe3O4的几个特征峰几乎消失，证明MOFs层已成功制备。
实施例3：所述荧光分子印迹传感器的应用
本实施例的实验条件为：MMIPs的用量为22.44mg/mL，pH为7.5，吸附时间为15min,温度为37℃。具体实施方案为：取特定浓度的HAV和MMIP于19μg/mL的PB缓冲液，将整个体系的pH调节为7.5，在37℃下振荡吸附15min后，测其荧光强度。
(1)MMIPs荧光传感器对不同浓度HAV的检测分析
在最佳实验环境下，研究了荧光强度与模板病毒浓度的线性关系。如图5所示，当模板病毒浓度在20pM-2500pM范围内时，荧光强度与模板病毒浓度具有良好的线性关系。线性回归方程为y＝251.53x+175.92，R2＝0.997，y为荧光强度，x为模板病毒浓度(nM)。随着模板病毒浓度的增加，由于印迹颗粒对模板病毒的特异性吸附，荧光强度也增加。然后基于3倍信噪比(S/N＝3)计算检测限，检测限为3pM。
(2)MMIPs荧光传感器对HAV的选择性吸附
本实施例选择了浓度均为1.0nM的HAV，JEV，HBV和RV作为目标物来考察MMIPs荧光传感器对HAV的吸附与检测能力。实验按上述步骤进行，重复三次，取平均值。后三种竞争剂具有与模板病毒甲型肝炎相似的性质，但颗粒大小不同等。结果显示在图6中。在相同的最佳实验条件下，印迹颗粒对HAV的反应最强烈。JEV对印迹颗粒的响应显著低于HAV，可能是因为JEV的颗粒尺寸远大于HAV的颗粒尺寸，因此印迹部位不匹配。HBV的荧光响应也低于HAV，因为两者属于同一属，但表面组成和粒径不同。这证明了印迹聚合物对模板病毒的吸附具有特异性。
(3)MMIPs荧光传感器对HAV的加标回收
为了评价印迹聚合物在实际样品中的识别能力，实验参考文献，将血清稀释并在最佳实验条件下进行加标回收实验。每个样品平行测量三次，并使用线性回归方程计算回收率。结果显示在图7中。回收率在90％和106％之间，表明该方法可用于测定人稀释血清中的HAV剂量。
Claims (4)
1.一种基于磁性金属有机骨架(MOF)的新型荧光印迹传感器的构建及应用，其特征在于：分子印迹聚合物固定在发光MOF材料(MIL-101-NH2)的表面上。首先，将四氧化三铁羧基化，然后在其表面上制备MIL-101-NH2；用上述颗粒作为载体，甲肝病毒(HAV)作为模板和TEOS作为交联剂制备HAV印迹聚合物。并将其构建为一种基于氨基功能化的金属有机框架分子印迹荧光传感器用于目标病毒的检测。具体包括以下几点：
1)以磁性纳米粒子为载体、然后在其表面上制备MIL-101-NH2；通过使用上述颗粒作为载体，TEOS作为交联剂的病毒印迹聚合物的制备。在磁体作用下进行洗脱，缩短洗脱时间，洗脱过程更简单，更快速。
2)所述病毒分子印迹荧光传感器的构建。
3)所述病毒分子印迹荧光传感器的应用。
2.根据权利要求1第1)点所述的印迹聚合物的制备，其特征在于，包括以下步骤：
1)首先合成羧基官能化磁性纳米粒子，在其表面制备MIL-101-NH2，并将其作为印迹时的载体材料；
2)在1)的基础上，加入功能单体、交联剂及模板病毒HAV，聚合完成后洗脱模板，得到HAV印迹的聚合物。
3)根据权利要求1所述的病毒分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于利用磁性纳米粒子作为载体，通过磁性洗脱分离以达到更简单、更快速的目的。并且在磁体表面生长一层MOF材料，增大其比表面积。
3.根据权利要求1第2)点所述的分子印迹荧光传感器的构建，其特征在于：取适量印迹聚合物于缓冲溶液中，加入适量的病毒，在优化的吸附条件下震荡吸附。然后，取一定量上述混合物于比色皿中，采用RF-5301PC荧光分光光度计测其荧光强度，构建成一种新型的病毒分子印迹荧光传感器。检测条件为：激发波长为290nm,发射波长为420nm,激发和发射的狭缝宽分别为5.0nm和5.0nm。
4.根据权利要求1第3)点所述的病毒分子印迹荧光传感器的应用，其特征在于：将上述病毒分子印迹荧光传感器对不同浓度的HAV进行分析，用以评估其对模板病毒的检测范围与检测限；用上述病毒分子印迹荧光传感器检测相同浓度的不同病毒分子，用以评估所制备的分子印迹传感器对模板分子的选择性识别与检测能力；将上述智能型病毒分子印迹荧光传感器应用于人血清中HAV的加标回收，用以评估所述的分子印迹传感器对模板分子的实际分析能力。
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