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CN110669107A - 抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

抗菌肽及其制备方法 Download PDF

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CN110669107A
CN110669107A CN201910583081.5A CN201910583081A CN110669107A CN 110669107 A CN110669107 A CN 110669107A CN 201910583081 A CN201910583081 A CN 201910583081A CN 110669107 A CN110669107 A CN 110669107A
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张喜全
冯军
东圆珍
赵文杰
王岩
徐宏江
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Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
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Shanghai Faith Biotechnology Co Ltd
Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd
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Abstract

本发明发明属于医药领域，具体涉及一种抗菌肽及其制备方法与应用。体外活性测定表明，本发明提供的抗菌肽具有很高的抗菌活性，与多粘菌素B相比，本发明的抗菌肽的抗菌活性显著提高。

Description

抗菌肽及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及抗菌肽及其制备方法与应用，具体而言涉及一组具有较高抗菌活性的多黏菌素类似物及其合成制备与应用。
背景技术
当今世界正在面临耐药菌的威胁，某些耐药菌甚至可以抵抗所有市售抗生素，严重威胁人类健康。与之相比，由于几乎99％的土壤微生物无法在实验室条件中进行培养，近年来人类几乎无法再从自然界发现新型抗生素(Ling L L，et al.A new antibiotickills pathogens without detectable resistance[J].Nature,2015,517:455-459)。对于多种革兰氏阴性多重耐药致病菌的感染，例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等，多黏菌素E甲磺酸钠是最常用、也是目前仅剩的唯一的治疗方案。
多黏菌素是1947年发现的一类由多黏芽孢杆菌产生的环肽类抗生素，有多种组分组成，包括多黏菌素A、多黏菌素B、多黏菌素C、多黏菌素D、多黏菌素E，通常它们的抗菌谱窄且仅能对抗革兰氏阴性菌。天然多黏菌素一般由脂肪酰基链和环状七肽通过线性三肽链接构成，其中4位氨基酸L-Dab(2，4-二氨基丁酸)与10位氨基酸L-Thr缩合形成七肽环。多黏菌素B和多黏菌素E的结构十分相似，仅在6位氨基酸上存在差异。其中，多黏菌素B的6位氨基酸是D-Phe，多黏菌素E的6位氨基酸是D-Leu(Cui,et.al.Research Development ofPolymyxins[J].World Notes on Antibiotics,2015,36(5):205-210)。临床上常用于治疗由革兰氏阴性菌引起的感染，但肾毒性和神经毒性限制了其临床应用，目前全球上市的药物有注射用多黏菌素B和colistin。colistin是多黏菌素E的甲磺酸衍生物，耐受性较好，毒性有所降低。
WO2017/054047用不同化合物替代多黏菌素的N端脂肪链，得到了一系列抗菌活性与多黏菌素相近、毒性较低的衍生物。NAB739的七肽环序列(Martti Vaara,Novelderivatives of polymyxins.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2013)与多黏菌素B相同，直链肽部分为辛酰基-苏氨酰基-D-丝氨酸，与多黏菌素相比，少了2个正电荷氨基酸(Dab)。NAB739的活性略低于多黏菌素B，但一系列细胞毒性的研究证明，NAB739的毒性远低于多黏菌素B。
本发明以多黏菌素的结构为基础，用固相多肽合成的方法进行氨基酸替换，合成了多黏菌素的结构类似物，并通过最小抑菌浓度实验测定了它们的抑菌活性。
发明内容
本发明专利申请涉及化合物或多肽及其制备合成方法与应用，具体而言涉及到一组具有较高抗菌活性的多肽类似物及其合成制备与应用。
在一个方面，本申请涉及化合物或多肽及其药用盐，所述多肽与式I所示的序列具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些方案中，所述多肽具有如下序列通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12(式I)，其中，R1为：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，或3FPhe，或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，或AEEAc，或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，或Orn，或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，或Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，或Ala，或缺失；Xaa6为：Lys，Glu，或Dab；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，或Orn，或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，或D-Ala；Xaa9为：Leu，或Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa12为：Glu，Lys，或Asp。
在一些方案中，所述多肽为环肽。在某些方案中，所述多肽由Xaa6与Xaa12的侧链基团脱水缩合成酰胺键而成环，可选地，所述侧链基团包含氨基和/或羧基。可选地，所述多肽由氨基与羧基脱水缩合成酰胺键而成环。
在一些方案中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基。
在一些方案中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基。
在一些实施方式中，Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu或缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
在一些方案中，所述多肽具有如下序列通式：
R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Xaa6-Xaa7-D-Phe-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12)，其中，R1为：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，或3FPhe，或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，或AEEAc，或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，或Orn，或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，或Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，或Ala，或缺失；Xaa6为：Lys，Glu，或Dab；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，或Orn，或缺失；Xaa9为：Leu，或Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa12为：Glu，Lys，或Asp。在一些具体实施方式中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。在一些具体实施方式中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。在一些具体实施方式中，Xaa1缺失，Xaa2缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
在一些方案中，所述多肽具有如下序列通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Xaa6-Xaa7-D-Leu-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12)，其中，R1为：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，或3FPhe，或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，或AEEAc，或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，或Orn，或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，或Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，或Ala，或缺失；Xaa6为：Lys，Glu，或Dab；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，或Orn，或缺失；Xaa9为：Leu，或Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，或D-Leu，或缺失；Xaa12为：Glu，Lys，或Asp。在一些具体实施方式中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。在一些具体实施方式中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。在一些具体实施方式中，Xaa1缺失，Xaa2缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：
R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Glu)，其中，R1为：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa6为：Lys，Dab；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；Xaa9为：Leu，Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。在一些具体实施方式中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。在一些具体实施方式中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。在一些具体实施方式中，Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu或缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，和/或Xaa11优选Dab。在另一些具体实施方式中，Xaa1缺失，Xaa2缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，和/或Xaa11优选Dab。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：
R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12)，其中，R1为：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa6为：Lys，Dab；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；Xaa9为：Leu，Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。在一些具体实施方式中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。在一些具体实施方式中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。在一些具体实施方式中，Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu或缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。在另一些具体实施方式中，Xaa1缺失，Xaa2缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Glu)，其中，R1为：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；Xaa9为：Leu，Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。在一些具体实施方式中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。在一些具体实施方式中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。在一些具体实施方式中，Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu或缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。在另一些具体实施方式中，Xaa1缺失，Xaa2缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，和/或Xaa11优选Dab。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Lys-Xaa7-D-Phe-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Glu)，其中，R1选自：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa9为：Leu，Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。在一些具体实施方式中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。在一些具体实施方式中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。在一些具体实施方式中，Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu或缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。在另一些具体实施方式中，Xaa1缺失，Xaa2缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，和/或Xaa11优选Dab。
在一些方案中，所述多肽具有如下通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Lys-Xaa7-D-Leu-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Glu)，其中，R1选自：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；Xaa9为：Leu，Ala；Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。在一些具体实施方式中，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。在一些具体实施方式中，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。在一些具体实施方式中，Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu或缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。在另一些具体实施方式中，Xaa1缺失，Xaa2缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，和/或Xaa11优选Dab。
在一个方面，本申请涉及多肽及其药用盐，所述多肽与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些方案中，所述多肽具有如SEQ ID NO:1所示的通式：R1--Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-Xaa8-Leu-Dab-Dab-Glu)。
其中R1为：(A)2-吲哚甲酰基，(B)4-甲基辛酰基，(C)2-乙基己酰基，(D)2,6-二氯苯甲酰基，(E)2-甲氧基-5-溴烟酰基，(F)2-氯-5-氟烟酰基，(G)对甲苯甲酰基，(H)4-三氟甲基烟酰基，(I)2,6-二溴-4-烟酰基，(J)1-甲基-3-吲唑甲酰基，(K)4-氯-2-吡啶甲酰基，(L)5-氯吲哚-2-甲酰基，(M)4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，(N)3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，(O)苯并[b]噻吩-2-甲酰基，(P)4-乙基辛酰基，(Q)1-甲基吲哚-2-甲酰基，或(R)4,5-二溴噻吩-2-甲酰基；
Xaa8为：Leu，DLeu，Phe或DPhe。
在一些方案中，R1为(J)1-甲基-3-吲唑甲酰基，或(K)4-氯-2-吡啶甲酰基。
在一些方案中，Xaa8为DLeu或DPhe，更优选DPhe。
作为本发明的优选方案，R1优选(J)1-甲基-3-吲唑甲酰基，或(K)4-氯-2-吡啶甲酰基，Xaa优选DLeu或DPhe，更优选DPhe。
在一些方案中，所述多肽具有如下式II或式III所示的通式，其中，R1选自1-烷基-3-吲唑甲酰基或4-卤素-2-吡啶甲酰基，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基；所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基：
Figure BDA0002113512850000081
在一些实施方式中，本发明的化合物包含与上述化合物的多肽部分具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％序列同一性的氨基酸序列。在另一些实施方式中，本发明的化合物与上述化合物相比，具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个氨基酸的添加、替换和/或缺失的氨基酸序列。在另一些实施方式中，本发明的多肽与上述多肽相比，具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个氨基酸的替换，其中所述取代可以是保守的替换，和/或近似的替换。在另一些实施方式中，本发明的多肽是上述多肽的6个、7个、8个、9个、10个、11个氨基酸长度的连续的氨基酸的截短体。
本发明所涉及的氨基酸残基包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本发明所涉及的氨基酸或化合物所对应的三字母代码表如表1所示，所涉及的所有氨基酸若不特别限定其结构，代表L型氨基酸。
表1：氨基酸及化合物三字母代码表
Figure BDA0002113512850000082
Figure BDA0002113512850000091
Figure BDA0002113512850000101
本发明的一个优选实施方式中公开了一种环肽(TZ40-J)，其氨基酸序列为：1-甲基-3-吲唑甲酰基-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Glu)(SEQ ID NO:2)。
本发明的一个优选实施方式中公开了一种环肽(TZ40-K)，其氨基酸序列为：4-氯-2-吡啶甲酰基-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Glu)(SEQ ID NO:3)。
本发明另一个优选的实施方式中公开了一组环肽：TZ40-A，TZ40-B，TZ40-C，TZ40-D，TZ40-E，TZ40-F，TZ40-G，TZ40-H，TZ40-I，TZ40-L，TZ40-M，TZ40-N，TZ40-O，TZ40-P，TZ40-Q，TZ40-R，TZ41-A，TZ41-B，TZ41-C，TZ41-D，TZ41-E，TZ41-F，TZ41-G，TZ41-H，TZ41-I，TZ41-J，TZ41-K，TZ41-L，TZ41-M，TZ41-N，TZ41-O，TZ41-P，TZ41-Q，TZ41-R其氨基酸序列如表2所示。
表2：化合物序列
Figure BDA0002113512850000111
Figure BDA0002113512850000121
Figure BDA0002113512850000131
本发明还提供了上述多肽的制备方法，可以采用本领域技术人员熟悉的固相化学合成技术制备线性肽以及利用上述部分多肽在碱性水相中自身环化的特性制备环肽。
固相化学合成技术的制备方法如下：
(1)在树脂上固相合成多肽；
(2)将步骤(1)的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，优选三氟乙酸；并加入侧链保护基清除剂，然后用5-20倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃去上清，在用冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽。
步骤(1)是在液相环境中进行，所述步骤(1)包括如下步骤：
(a)浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤树脂—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸或修饰基团(A～R)；
(b)树脂肽进一步环化。
其中，氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲基羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲基羰基(Fmoc)。
固相多肽合成中，对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护，例如Lys氨基侧链可以采用叔丁氧羰基(Boc)保护；Glu羧基侧链可以采用烯丙氧羰基(OAll)保护；Thr羟基侧链可以采用叔丁基(tBu)保护。所述保护基不限于此，可以根据本领域常规方案进行合理选择。
所述保护基包括但不限于此，可根据具体情况进行合理选择。
所述步骤(a)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或上述试剂不同比例的混合溶液，优选DMF。
所述步骤(a)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min；优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。
所述步骤(a)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。
所述碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。
所述偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
所述步骤(a)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
所述步骤(a)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。
所述步骤(b)环化氨基酸为Lys与Glu，合成过程中采用正交保护策略，Lys侧链上的氨基保护基为烯丙氧羰基(Alloc)，Glu侧链羧基保护基为烯丙基(OAll)。脱去Alloc与OAll需要加入脱除剂和清除剂，使用的脱除剂为四(三苯基膦)钯((Pd(PPh3)4)，清除剂可选用H3N·BH3，Me2NH·BH3或PhSiH3，优选PhSiH3。
步骤(b)中环化反应需要加入偶联试剂，偶联试剂由碳二亚胺型试剂或叔胺型和苯并三氮唑鎓盐型试剂或吡啶三唑翁盐型组成，通过其侧链氨基与羧基形成酰胺键而成环。
其中，所述碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。
所述叔胺型试剂包括但不限于N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。
所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。
所述吡啶三唑翁盐型包括但不局限于(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(二甲胺基)膦六氟磷酸盐(AOP)。
所述偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。进一步优选N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。
步骤(2)所述的侧链保护基清除剂包括但不限于三异丙基硅烷、茴香硫醚、苯酚、水、1,2-乙二硫醇、间甲酚或上述任意两种或者两种以上的组合，并与三氟乙酸(TFA)或氢氟酸(HF)按5-20％(体积比)进行配制得到。优选三氟乙酸(TFA):茴香硫醚:苯酚:水＝85:5:3.75:6.25。本发明所涉及的多肽C末端若为羧酸形式，则步骤(1)采用Wang树脂进行合成；本发明所涉及的多肽C末端若为酰胺形式，则步骤(1)采用Rink Amide MBHA树脂进行合成。
特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的多肽制备方法还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。
本发明所涉及多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基。以硫酸多黏菌素E及盐酸万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的抗菌肽具有更高的抗菌活性，特别抗革兰氏阴性菌(如铜绿假单胞菌)或抗耐药菌(如耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌)的活性得到显著改善。
定义
除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，酮取代不会发生在芳香基上。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH2CH3)、单取代的(如CH2CH2F)、多取代的(如CHFCH2F、CH2CHF2等)或完全被取代的(CF2CF3)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被2个R所取代，则每个R都有独立的选项。
术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
术语“酰基”指-CO-基团。
术语“羧基”指-COOH基团。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“氰基”指-CN基团。
术语“巯基”指-SH基团。
术语“氨基”指-NH2基团。
术语“硝基”指-NO2基团。
术语“烷基”是指通式为CnH2n+1的烃基。该烷基可以是直链或支链的。例如，术语“烃1-6烷基”指含有1至6个碳原子的单价直链或支链脂肪族基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、3,3-二甲基丙基、己基、2-甲基戊基等)。类似地，烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺酰基和烷硫基的烷基部分(即烷基)具有上述相同定义。
术语“烷氧基”指-O-烷基。
术语“烷硫基”指-S-烷基。
术语“烷基氨基”指-NH(烷基)。
术语“二烷基氨基”指-N(烷基)2。
术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基。烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基等。
术语“炔基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个三键的不饱和脂肪族烃基。炔基的非限制性实例包括但不限于乙炔基(-C由碳原)、1-丙炔基(-C基(原子和3)、2-丙炔基(-CH2-CH(原)、1,3-丁二炔基(-C炔基(子和氢原)等。
术语“环烷基”指完全饱和的并且可以以呈单环、稠环或螺环存在的碳环。除非另有指示，该碳环通常为3至10元环，优选为3至8元环。环烷基非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基(双环[2.2.1]庚基)、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基等。
术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。例如，芳基可以具有6-20个碳原子，6-14个碳原子或6-12个碳原子。芳基的非限制性实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基等。
术语“杂芳基”是指单环或稠合多环体系，其中含有至少一个选自N、O、S的环原子，其余环原子为C，并且具有至少一个芳香环。优选的杂芳基具有单个4至8元环，尤其是5至8元环，或包含6至14个，尤其是6至10个环原子的多个稠合环。杂芳基的非限制性实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、三唑基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基等。
术语“治疗”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以预防、改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：
(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时；
(ii)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；
(iii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。
术语“治疗有效量”意指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本申请化合物的用量。构成“治疗有效量”的本申请化合物的量取决于该化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
作为药学上可接受的盐，例如，可以提及金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。金属盐的非限制性实例包括但不限于碱金属的盐，例如钠盐、钾盐等；碱土金属的盐，例如钙盐、镁盐、钡盐等；铝盐等。与有机碱形成的盐的非限制性实例包括但不限于与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺等形成的盐。与无机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。与有机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等形成的盐。与碱性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。与酸性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。
术语“药物组合物”是指一种或多种本申请的化合物或其盐与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的赋形剂、稀释剂、或载体的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。
术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、或载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些赋形剂、稀释剂、或载体。合适的载体、稀释剂及赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等原料。
本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I和36Cl等。
某些同位素标记的本申请化合物(例如用3H及14C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。此外，用较重同位素(诸如氘(即2H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。
本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。
本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。
附图说明
图1显示化学通式II，R1选自1-烷基-3-吲唑甲酰基或4-卤素-2-吡啶甲酰基，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。
图2显示化学通式III，R1选自1-烷基-3-吲唑甲酰基或4-卤素-2-吡啶甲酰基，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。
具体实施方案
实施例1：TZ40-J的制备与纯化
多肽序列：1-甲基-3-吲唑甲酰基-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Glu)(SEQ ID NO:2)
(1)材料及试剂
Rink Amide MBHA树脂，取代值0.65mmol/g。
氨基酸为：Fmoc-Glu(OAll)-OH,Fmoc-Dab(Boc)-OH,Fmoc-D-Phe-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Alloc)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,1-甲基引唑-3-羧酸(J)。
合成试剂：HOBt，DIC，HATU，DIEA，DMF，DCM，哌啶，四(三苯基膦)钯，苯硅烷，二乙基二硫代氨基甲酸钠。
(2)仪器：CSBIO型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、冷冻干燥机。
(3)操作步骤(以0.15mmol为例)
a.固相化学合成多肽
称取Rink Amide MBHA树脂0.24g，置于多肽合成仪反应器中，DMF洗涤树脂6次，加入15mL DCM，搅拌浸泡2h，完成树脂溶胀。
向反应器中加入20％PIP/DMF溶液10mL，混合30min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂6次。称取三倍量(0.45mmol)的Fmoc-Glu(OAll)-OH和HOBT，加入10ml DMF溶解后再加入3倍量DIC，混匀后加入反应器中与树脂进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，若树脂监测无色则缩合反应完全。重复洗涤-脱保护-洗涤过程，将序列其他氨基酸和修饰基团偶联到树脂上即可完成直链肽的合成。当序列合成至第8个氨基酸时，使用10mL DMF溶解的3当量HATU和3当量DIEA作为缩合试剂完成后续合成。
b.直链肽的环化
称取四(三苯基膦)钯与苯硅烷，摩尔量比例为：树脂摩尔量：四(三苯基膦)钯：苯硅烷＝1：0.1：10，用10ml DCM溶解。在避光、氮气保护、室温的条件下与树脂反应25min，茚三酮反应进行检测树脂为紫黑色。用DCM洗涤树脂5次，DMF洗涤5次，0.03mmol/L二乙基二氨基甲酸钠/DMF溶液洗涤树脂3次，DMF洗涤5次。反应器中加入以10ml DMF溶解的3倍量的HATU和3倍量DIEA的混合溶液室温反应，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则视为反应完成，用DMF洗涤树脂5次。最后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除最后一个氨基酸末端Fmoc保护基。
c.裂解及沉淀
肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1ml裂解试剂/100mg树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA:茴香硫醚:苯酚:水＝85:5:3.75:6.25(V:V:V:V)，室温搅拌反应3小时，抽滤。向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。
d.反相色谱纯化
(1)纯化
仪器方法如下：
色谱柱：纳微C18(250mm×10mm，10μm)
流速：5mL/min
检测波长：215nm
流动相：A：1％乙酸/水
B：1％乙酸/乙腈
梯度洗脱程序见表3：
表3纯化梯度洗脱表
(2)分析方法
色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)
流速：1ml/min
检测波长：215nm
流动相：A：0.05％TFA/水
B：0.05％TFA/乙腈
梯度洗脱程序如表4:
表4梯度洗脱表
Figure BDA0002113512850000212
收集纯度大于95％的目标组分，低压旋蒸，冷冻干燥。TZ40-J的理论分子量为1276.2，ESI-MS分子量确证[M+2H]2+＝639.16，与理论分子量一致，证明序列合成正确。
实施例2：抗菌肽的制备与纯化
利用实施例1类似的方法合成本申请表5中的化合物。
表5：本发明申请的化合物特征数据
Figure BDA0002113512850000213
Figure BDA0002113512850000221
Figure BDA0002113512850000231
实施例3：体外抗菌活性测定
根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法测定系列抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，细菌培养基采用MH肉汤培养基(Mueller-Hinton broth)，上文所述多肽为测试样品，多黏菌素B作为阳性对照。
具体步骤为：
(1)抗菌药物贮备液制备
精确配制浓度为128μg/mL抗菌肽和128μg/mL阳性对照品多黏菌素B。配置好的各贮备液至于-20℃环境中保存备用。
(2)培养基配制
细菌MIC测试用MH Broth培养基：称取MH肉汤培养基固体粉末24.00g，溶于蒸馏水中，加热至完全溶解，定容至1L，121℃高温灭菌30min。
(3)接种物的制备：
用接种环挑取形态相似待检菌落3～5个，接种于4～5ml的MH肉汤培养基中，35℃孵育12～16h。处于对数生长期得到菌液用MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×108CFU/ml。用MH肉汤将上述菌悬液进行1：1000稀释后备用。
(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种
取一块96孔板，在第1孔中加入160μL MH肉汤培养基，第2-12孔中各加入100μL相对应培的养基，然后向第1孔加入抗菌药物原液(128μg/mL)40μL，混匀，接着吸取100μL至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μL弃去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制备好的接种物各100μL，使每孔最终菌液浓度约为0.5×105CFU/mL。第1-10孔药物浓度分别为12.8μg/mL、6.4μg/mL、3.2μg/mL、1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.025μg/mL，第11孔为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第12孔为不含抗菌药物的阴性对照。
(5)孵育
接种细菌的96孔板置于37℃空气培养箱孵育16～20h。
(6)结果
以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。各抗菌肽的MIC测定结果如表6所示，N.D.表示未检测到。
表6：各抗菌肽的MIC测定结果
Figure BDA0002113512850000251
结果显示，本发明的化合物对铜绿假单胞菌，耐药铜绿假单胞菌，大肠杆菌，鲍曼不动杆菌具有抑菌作用。其中，TZ40-J和TZ40-K对铜绿假单胞菌的MIC达到0.1μg/ml，抑菌作用明显。
根据本发明所公开的内容，在此所公开并要求保护的所有组合物和/或方法均无需进行过多实验即可进行制备和实施。虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。
本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。

Claims (33)

1.一种化合物或其药用盐，所述多肽与式I所示的序列具有至少70％的序列同一性：
R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12(式I)，
其中，R1选自：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa6为：Lys，Glu，Dab；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；
Xaa9为：Leu，Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa12为：Glu，Lys，Asp。
2.如权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中所述化合物为环肽。
3.如权利要求1-2任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物由Xaa6与Xaa12的侧链基团脱水缩合成酰胺键而成环，可选地，所述侧链基团含有氨基和/或羧基。
4.如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药用盐，所述R1选自2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
5.如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物具有如下通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Glu)，
其中，R1选自：2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa6为：Lys，Dab；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；
Xaa9为：Leu，Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。
6.如权利要求5所述的化合物或其要药用盐，所述R1选自2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa6优选Lys或Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。
7.如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药用盐，所述多肽具有如下通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12)，
其中，R1选自2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；
Xaa9为：Leu，Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa12为：Glu，Asp。
8.如权利要求7所述的化合物或其药用盐，所述R1选自2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab，和/或Xaa12优选Glu。
9.如权利要求1-3任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物具有如下通式：R1-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-cy(Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Glu)，
其中，R1选自2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；
Xaa1为：Leu，Ala，AEEAc，Phe，IPhe，BrPhe，3FPhe或缺失；
Xaa2为：Leu，Ala，Arg，AEEAc或缺失；
Xaa3为：Dab，Ala，Leu，Orn或缺失；
Xaa4为：Thr，Ala，Dab，Lys；
Xaa5为：Dab，Lys，Orn，Ala或缺失；
Xaa7为：Dab，Ala，Lys，Orn或缺失；
Xaa8为：D-Leu，D-Phe，Lys，D-Ala；
Xaa9为：Leu，Ala；
Xaa10为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失；
Xaa11为：Dab，Leu，Orn，Ala，D-Leu或缺失。
10.如权利要求9所述的化合物或其药用盐，所述R1选自2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失；Xaa1优选Leu或缺失，Xaa2优选Leu或缺失，Xaa3优选Dab，Xaa4优选Thr，Xaa5优选Dab，Xaa7优选Dab，Xaa8优选D-Phe或D-Leu，Xaa9优选Leu，Xaa10优选Dab，Xaa11优选Dab。
11.如权利要求1-4任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物具有R1-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-Xaa8-Leu-Dab-Dab-Glu)的通式，其中R1选自2-吲哚甲酰基，4-甲基辛酰基，2-乙基己酰基，2,6-二氯苯甲酰基，2-甲氧基-5-溴烟酰基，2-氯-5-氟烟酰基，对甲苯甲酰基，4-三氟甲基烟酰基，2,6-二溴-4-烟酰基，1-烷基-3-吲唑甲酰基，4-卤素-2-吡啶甲酰基，5-氯吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，3-氯苯并噻吩-2-甲酰基，苯并[b]噻吩-2-甲酰基，4-乙基辛酰基，1-甲基吲哚-2-甲酰基，4,5-二溴噻吩-2-甲酰基，或缺失，更优选为1-甲基-3-吲唑甲酰基或4-氯-2-吡啶甲酰基；Xaa8优选D-Phe或D-Leu。
12.如权利要求1-11任一项所述的化合物或其药用盐，其中，R1为1-烷基-3-吲唑甲酰基，所述1-烷基-3-吲唑甲酰基选自1-甲基-3-吲唑甲酰基，1-乙基-3-吲唑甲酰基，1-丙基-3-吲唑甲酰基，1-异丙基-3-吲唑甲酰基，1-丁基-3-吲唑甲酰基，优选1-甲基-3-吲唑甲酰基。
13.如权利要求1-11任一项所述的化合物或其药用盐，其中，R1为4-卤素-2-吡啶甲酰基，所述4-卤素-2-吡啶甲酰基选自4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，4-碘-2-吡啶甲酰基，优选4-氟-2-吡啶甲酰基，4-氯-2-吡啶甲酰基，4-溴-2-吡啶甲酰基，更优选4-氯-2-吡啶甲酰基。
14.如权利要求1-11任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物是1-甲基-3-吲唑甲酰基-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Glu)。
15.如权利要求1-11任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物是4-氯-2-吡啶甲酰基-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Glu)。
16.如权利要求1-11任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物是1-甲基-3-吲唑甲酰基-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Glu)。
17.如权利要求1-11任一项所述的化合物或其药用盐，所述化合物是4-氯-2-吡啶甲酰基-Dab-Thr-Dab-cy(Lys-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Glu)。
18.权利要求1-17任一项所述多肽或其药用盐的制备方法，包括：合成所述多肽。
19.如权利要求18所述的方法，包括：
(1)在树脂上固相合成多肽；
(2)将步骤(1)的产物用强酸进行裂解；加入侧链保护基清除剂，过滤，用5-20倍体积的有机溶剂沉淀多肽，离心，有机溶剂洗涤沉淀，干燥，得到粗肽。
20.如权利要求19所述的方法，所述步骤(1)是在液相环境中进行的，具体包括：
(a)浸泡树脂—脱除氨基保护基—洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸；
(b)树脂肽进一步环化。
21.如权利要求20所述的方法，所述步骤(a)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，优选DMF；所述氨基保护基选自叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)。
22.如权利要求20-21任一项所述的方法，所述步骤(a)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，所述偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成；优选为二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
23.如权利要求20-22任一项所述的方法，所述步骤(b)环化氨基酸为Xaa6与Xaa12，通过其侧链氨基与羧基形成酰胺键而成环。
24.如权利要求20-23任一项所述的方法，所述步骤(b)中成环采用的是正交保护策略，成环氨基酸侧链上的氨基保护基为烯丙氧羰基(Alloc)，羧基保护基为烯丙基(OAll)。
25.如权利要求24所述的方法，所述步骤(b)包括脱氨基保护，脱去Alloc与OAll需要加入脱除剂，所述脱除剂为四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)。
26.如权利要求25所述的方法，所述步骤(b)中还需要加入清除剂，清除剂选自H3N·BH3，Me2NH·BH3或PhSiH3，优选PhSiH3。
27.如权利要求20-26任一项所述的方法，所述步骤(b)中环化反应需要加入偶联试剂，所述偶联试剂由碳二亚胺型试剂或叔胺型和苯并三氮唑鎓盐型试剂或吡啶三唑翁盐型组成；优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)；进一步优选N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。
28.如权利要求20-27任一项所述的方法，所述步骤(1)还包括：(c)将步骤(b)得到的树脂肽连接脂肪酸链或多元脂肪酸链。
29.如权利要求28所述的方法，所述步骤(c)在DMF溶剂中偶联剂作用下发生连接反应，所述偶联剂为二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
30.前述任一项权利要求所述的多肽或其药用盐的用途，其特征在于，用于抑菌、抗菌或制备抗菌物质。
31.如权利要求30所述的用途，所述抗菌物质为抗菌药物或抗菌剂。
32.如权利要求31所述的用途，所述菌为细菌或真菌。
33.如权利要求32所述的用途，所述细菌或真菌是鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)，耐药鲍曼不动杆菌(drug resistant Acinetobacter baumanii)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，耐药铜绿假单胞菌(drug resistant Pseudomonasaeruginosa)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，大肠杆菌(E.coli)，和/或白色念珠菌(candida Albicans)中的一种或几种。
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WO2012051663A1 (en) * 2010-10-21 2012-04-26 Monash University Antimicrobial compounds
CN111247162A (zh) * 2017-10-31 2020-06-05 正大天晴药业集团股份有限公司 多黏菌素类似物及其制备方法

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