CN110656136B - 一种利用淀粉生产甲萘醌-7的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用淀粉生产甲萘醌‑7的方法，属于生物催化技术领域。本发明通过温度诱导适应性进化，诱导最适温度为50℃的芽孢杆菌，以50g/L可溶性淀粉为唯一碳源时，50℃下摇瓶培养6d后MK‑7产量达到37.1±2.1mg/L，MK‑7合成效率大大提高，将有利于提高淀粉的利用率和降低MK‑7生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用淀粉生产甲萘醌-7的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
自然界中的维生素K主要有两种类型，第一种是维生素K1，也称为叶绿醌，主要来自于植物；第二种是维生素K2，也称为甲萘醌，主要由微生物代谢产生，最初是从纳豆中分离得到。纯品维生素K2为黄色粉末，其结构是由一个甲基萘醌母环和一条位于母环C-3位置上的异戊二烯侧链组成，根据侧链上异戊二烯单元个数差异，维生素K2共分为14种，以MK-n表示，甲萘醌-7(MK-7)即表示侧链上含有7个异戊二烯单元的维生素K2。MK-7具有多种生理功能，例如作为哺乳动物中凝血因子II、VII、IX和X的一个重要的辅因子，参与血液凝固；抑制成骨细胞的生长并刺激成骨细胞的分化，形成骨头；提高骨头中的矿物质密度，降低髋骨骨折风险；提高骨钙蛋白的羧化作用；降低血压；促进以神经生长因子为媒介的PC 12D细胞的轴突生长；通过调控Ca2+的利用和促进Gla蛋白质的活性，防止钙质在血管中沉淀而造成的动脉硬化等。因此MK-7作为新一代的保健食品，其功能正在受到越来越多的关注。
前人研究发现，采用微生物发酵法将是未来工业化生产MK-7的唯一方法。虽然多种微生物可以用于合成MK-7，但是芽孢杆菌属的微生物更具有生产MK-7的潜力。目前，研究人员已从多个方面来试图提高利用微生物发酵生产MK-7，具体包括：(1)优化培养方式；(2)优化培养基组成和培养条件；(3)改善发酵反应器；(4)将合成菌株固定在纳米材料上；(5)采用传统诱变方法解除合成途径中反馈作用；(6)采用基因工程手段强化合成途径中碳通量。虽然上述方法取得利率一定的成果，但是目前用于发酵生产MK-7的碳源全都是甘油。以甘油为唯一碳源生产MK-7存在许多问题，如抑制多聚物的合成和增加了发酵液的渗透压，从而影响菌体对底物的利用和产物的胞外运输。
众所周知，芽孢杆菌属的微生物可以利用单糖、双糖和多糖作为碳源用于菌体生长和合成某些代谢产物。目前，有报道采用葡萄糖、蔗糖、甘露醇甚至是可再生的农业原料如淀粉、玉米粉水解液和豆腐渣来生产MK-7。淀粉是高分子碳水化合物，是由葡萄糖分子经α-1,4糖苷键连接而成。需要指出的是，虽然淀粉可以用于发酵生产MK-7，但是其产量比较低，无法实现工业化应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种高效利用淀粉生产甲萘醌-7的方法，通过温度诱导适应性进化，诱导最适温度为50℃的芽孢杆菌，以50g/L可溶性淀粉为唯一碳源时，50℃下摇瓶培养6d后MK-7产量达到37.1±2.1mg/L，MK-7合成效率大大提高，将有利于提高淀粉的利用率和降低MK-7生产成本。
本发明的第一个目的是提供一种利用淀粉生产甲萘醌-7的方法，包括如下步骤：
(1)将出发芽孢杆菌接种于种子培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发芽孢杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ0，即μ＝χ0；
(2)将步骤(1)中生长至对数生长中后期的出发芽孢杆菌接种至新鲜种子培养基中，并在40-42℃进行培养，测定菌株在40-42℃下的比生长速率μ＝χ1；进一步将上述生长至对数生长中后期的菌株接种至新鲜种子培养基中，并在40-42℃进行培养，测定菌株在40-42℃下的比生长速率μ＝χ2；重复上述步骤，直至菌株在40-42℃下比生长速率μ≈χ0，得到在40-42℃下正常生长的突变菌株；
(3)采用步骤(2)相同方法，以步骤(2)得到的在40-42℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在44-46℃下正常生长的突变菌株；
(4)采用步骤(2)相同方法，以步骤(3)得到的在44-46℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在48-52℃下正常生长的突变菌株；
(5)利用步骤(4)得到的在48-52℃下正常生长的突变菌株，以淀粉作为唯一碳源，发酵生产甲萘醌-7。
进一步地，所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。
进一步地，在步骤(1)或步骤(2)中，所述的培养是在100-150r/min转速下培养。
进一步地，在步骤(2)中，接种的接种量为1-2％。
进一步地，在步骤(5)中，所述的发酵的具体步骤为：将在48-52℃下正常生长的突变菌株单菌落接种至种子培养基中培养至对数期，将种子培养液转接至SYS培养基进行发酵生产甲萘醌-7。
进一步地，所述的种子培养基为：：3-7g/L蛋白胨，2-3g/L酵母膏，3-7g/L葡萄糖，pH 6-8。
进一步地，所述的SYS培养基为：45-55g/L可溶性淀粉，8-12g/L酵母膏，35-45g/L豆粕水解液，0.3-0.7g/L MgSO4，0.3-0.7g/L KH2PO4，0.4-0.5g/L异戊烯醇，pH 6-8。
进一步地，种子培养阶段的培养条件为：培养温度为48-52℃，转速为100-150r/min，培养时间为20-25h。
进一步地，将种子培养液转接至SYS培养基的接种量为5-15％。
进一步地，发酵阶段的培养条件为：培养温度为48-52℃，转速为100-150r/min，培养时间为5-8d。
本发明的作用原理：在利用淀粉作为唯一碳源，发酵生产甲萘醌-7的过程中，淀粉需要分解成可发酵性糖如单糖或双糖，才能被有效利用。α-淀粉酶在采用酶法水解淀粉中发挥重要作用。根据最适作用温度不同，α-淀粉酶可以分为中温淀粉酶和高温淀粉酶，其中前者最适作用温度是50～70℃，后者最适作用温度是>90℃。然而，对于大多数芽孢杆菌属的微生物来说，它们的最适生长温度为28～37℃，由于酶的最适作用温度与菌体生长的最适温度不一致导致不能有效利用淀粉合成MK-7。本发明利用温度诱导适应性进化的方法，得到生长最适温度与酶的最适温度比较接近的菌株，并利用其以淀粉作为唯一碳源，发酵生产甲萘醌-7。
本发明的有益效果是：
本发明通过温度诱导适应性进化，诱导最适温度为50℃的芽孢杆菌，以50g/L可溶性淀粉为唯一碳源时，50℃下摇瓶培养6d后MK-7产量达到37.1±2.1mg/L，MK-7合成效率大大提高，将有利于提高淀粉的利用率和降低MK-7生产成本。
附图说明
图1为出发菌株H.β.D.R.-5和突变菌株MK50-36在不同温度下的生长速度和MK-7产量；
图2为温度诱导的适应性进化操作流程以及每个循环温度下比生长速率的变化；
图3为40℃、45℃和50℃下最佳产MK-7菌株的筛选；
图4为出发菌株H.β.D.R.-5和突变菌株MK50-36在37℃和50℃下菌体生长和菌株活力。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：MK-7实时监测采用高效液相色谱仪(HLPC)测定。菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD600nm。
HLPC参数为：以甲醇:二氯甲烷(9:1，v/v)为流动相，流速为1.0mL/min,柱温为40℃，进样量为10μL，紫外检测波长为270nm。
种子培养基为：5g/L蛋白胨，2.5g/L酵母膏，5g/L葡萄糖，pH 7.2±0.2并于121℃灭菌20min。
SYS培养基为：50g/L可溶性淀粉，10g/L酵母膏，40g/L豆粕水解液，0.5g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4，0.43g/L异戊烯醇，pH 7.2±0.2并于121℃灭菌20min。
本申请以最适生长温度为37℃的解淀粉芽孢杆菌为例，说明本技术方案的可行性。
实施例1：出发菌株H.β.D.R.-5在不同温度下的生长速度和MK-7产量
将出发菌株H.β.D.R.-5接种于以可溶性淀粉为唯一碳源的SYS培养基中，并分别在37℃、40℃、45℃、50℃和55℃下120r/min摇瓶培养6d，并定时取样测定不同培养温度下OD600和MK-7的产量。结果分别如图1中(a)、(b)中的左图所示。
实施例2：适应性进化逐级驯化出发菌株H.β.D.R.-5的温度耐受性
驯化操作流程以及每个循环温度下比生长速率的变化如图2所示，具体包括：首先，将出发菌株H.β.D.R.-5接种于种子培养基中并于37℃下120r/min摇瓶培养，测定出发菌株H.β.D.R.-5在37℃下比生长速率μ＝χ0。其次，吸取1％的在37℃下摇瓶培养至对数生长中后期的出发菌株H.β.D.R.-5培养液于一装有新鲜种子培养基的三角瓶中，并于40℃下120r/min摇瓶培养，测定菌株H.β.D.R.-5在40℃下比生长速率μ＝χ1。随后，吸取1％的在40℃下摇瓶培养至对数生长中后期的出发菌株H.β.D.R.-5培养液于一装有新鲜种子培养基的三角瓶中于40℃下120r/min摇瓶培养并测定菌株H.β.D.R.-5在40℃下比生长速率μ＝χ2，重复上述步骤，直至菌株在40℃下比生长速率μ≈χ0。最后，采用相同的步骤分别选育耐受45℃、50℃和55℃的突变菌株。
实施例3：不同温度下最佳目的菌株的筛选
以筛选40℃下最佳目的菌株为例。
当菌株在40℃下比生长速率μ≈χ0时，吸取适量的处于对数生长中期的菌液倍比稀释后涂布于种子培养基固体平板上并于40℃下恒温培养至长出单菌落。随机挑选出在种子培养基固体平板上菌落较大的单菌落，接种于SYS液体培养基中，并于40℃下120r/min摇瓶培养6d，测定不同突变株以淀粉为唯一碳源时MK-7的产量。通过两次筛选，最终获得在40℃下能高效利用淀粉合成MK-7的突变株MK40-92。随后，以突变株MK40-92为出发菌株，继续筛选在45℃和50℃下能高效利用淀粉合成MK-7的突变株MK45-67和MK50-36。40℃、45℃和50℃下最佳产MK-7菌株的筛选的过程如图3所示。由于在55℃培养条件下，突变株的比生长速率都无法达到菌株H.β.D.R.-5在37℃下比生长速率，故没有筛选在55℃下能高效利用淀粉合成MK-7的突变株。
实施例4：测定突变株MK50-36在不同温度下的生长速度和MK-7产量
将突变株MK50-36接种于以可溶性淀粉为唯一碳源的SYS培养基中，并分别在37℃、40℃、45℃、50℃和55℃下120r/min摇瓶培养6d，并定时取样测定不同培养温度下OD600和MK-7的产量。结果分别如图1中(a)、(b)中的右图所示。
实施例5：比较出发菌株H.β.D.R.-5和突变菌株MK50-36在37℃和50℃下菌体生长和菌株活力
将出发菌株H.β.D.R.-5和突变菌株MK50-36分别接种于种子培养基中，并分别在37℃和50℃下120r/min摇瓶培养48h，并每隔4h取样测定不同培养温度下OD600以及每隔12h测定不同培养温度下菌株活力。菌株活力具体测定方法是：将菌液做适当的倍比稀释后涂布于种子培养基平板上并于相应温度下培养至长出单菌落。最后，数出单菌落并计算每mL菌液所能长出的单菌落数。出发菌株H.β.D.R.-5和突变菌株MK50-36在37℃和50℃下菌体生长和菌株活力结果如图4所示。
实施例6：突变菌株MK50-36遗传稳定性的测定
将出发菌株H.β.D.R.-5和突变菌株MK50-36分别接种于SYS液体培养基中，并连续传代20次，分别测定第5代、第10代和第20代出发菌株H.β.D.R.-5和突变菌株MK50-36的比生长速率和MK-7产量。其中出发菌株H.β.D.R.-5培养温度为37℃，而突变菌株MK50-36培养温度为50℃。
表1突变菌株和出发菌株比生长速率和MK-7产量
从表1中可以看出，突变菌株与出发菌株类似，都具有良好的遗传稳定性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (8)
1.一种利用淀粉生产甲萘醌-7的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将出发芽孢杆菌接种于种子培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发芽孢杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ0，即μ=χ0；
（2）将步骤（1）中生长至对数生长中后期的出发芽孢杆菌接种至新鲜种子培养基中，并在40-42℃ 进行培养，测定菌株在40-42℃ 下的比生长速率μ=χ1；进一步将上述生长至对数生长中后期的菌株接种至新鲜种子培养基中，并在40-42℃ 进行培养，测定菌株在40-42℃ 下的比生长速率μ=χ2；重复上述步骤，直至菌株在40-42℃ 下比生长速率μ≈χ0，得到在40-42℃ 下正常生长的突变菌株；
（3）采用步骤（2）相同方法，以步骤（2）得到的在40-42℃ 下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在44-46℃ 下正常生长的突变菌株；
（4）采用步骤（2）相同方法，以步骤（3）得到的在44-46℃ 下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在48-52℃ 下正常生长的突变菌株；
（5）利用步骤（4）得到的在48-52℃ 下正常生长的突变菌株，以淀粉作为唯一碳源，发酵生产甲萘醌-7；
所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）或步骤（2）中，所述的培养是在100-150r/min转速下培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，接种的接种量为1-2%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述的发酵的具体步骤为：将在48-52℃ 下正常生长的突变菌株单菌落接种至种子培养基中培养至对数期，将种子培养液转接至SYS培养基进行发酵生产甲萘醌-7；
所述的SYS培养基为：45-55 g/L 可溶性淀粉，8-12 g/L 酵母膏，35-45 g/L 豆粕水解液，0.3-0.7 g/L MgSO4，0.3-0.7 g/L KH2PO4，0.4-0.5 g/L 异戊烯醇，pH 6-8。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基为：3-7 g/L 蛋白胨，2-3 g/L 酵母膏，3-7 g/L 葡萄糖，pH 6-8。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，种子培养阶段的培养条件为：培养温度为48-52℃，转速为100-150r/min，培养时间为20-25 h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将种子培养液转接至SYS培养基的接种量为5-15%。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵阶段的培养条件为：培养温度为48-52℃，转速为100-150r/min，培养时间为5-8d。
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