CN110656117A

CN110656117A - 一种编码人nadh脱氢酶亚单位6蛋白的核酸及其应用

Info

Publication number: CN110656117A
Application number: CN201810702492.7A
Authority: CN
Inventors: 李斌
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co Ltd; Wuhan Neurophth Biotechnology Ltd Co
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-01-07

Abstract

本发明公开了一种编码人NADH脱氢酶亚单位6(ND6)蛋白的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种融合核酸，所述融合核酸包含所述的ND6蛋白的核酸。本发明还公开了一种人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的制备方法，其包括以下步骤：(1)获得所述转化体；(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述人NADH脱氢酶亚单位6蛋白。本发明将ND6的线粒体编码序列改变为核编码序列，在细胞核里编码出正常的ND6蛋白质，并且该核编码序列末端连接有线粒体定位序列，可将核里编码好的ND6蛋白引导到线粒体中，发挥正常的线粒体ND6蛋白的生理功能，达到治疗LHON的目的。

Description

一种编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白(ND6)的核酸及其应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。

Leber遗传性视神经病变(LHON)与线粒体DNA的突变有关，至今人们已经发现了很多与疾病相关的线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)突变。mtDNA突变影响氧化磷酸化的功能，导致ATP产生缺乏，供能不足，导致细胞无法正常地进行代谢，细胞发生退变、坏死或调亡，组织和器官的功能衰退，出现相应的临床症状。其中14484位点是中国人群能够引起LHON的三个高发位点之一。主要是人NADH脱氢酶亚单位6(ND6)基因的第14484位核苷酸由T突变成C，突变后使ND6亚基第64位编码的起始氨基酸甲硫氨酸替换成缬氨酸，该位点低度保守，该突变使呼吸链复合物I的活性降低，从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。

LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中蛋白异常所致。现在国内外均出现的诊断LHON三个原发位点的诊断试剂盒，例如同昕生物技术(北京)有限公司专利申请号：201410234184.8、重庆医科大学附属儿童医院专利申请号：201410128241.4以及中山大学眼科中心的专利申请号：201611076186.4中所述内容。但是目前国内外均没有治疗ND6(14484位点突变)导致的LHON的有效治疗方法。ND4是现在的国内外研究的重点，ND6的相关治疗研究由于病例过少，现在并无单独的研究专利和文献。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中NADH脱氢酶亚单位6(ND6)序列无法转染至线粒体内、治疗效果不佳的技术问题，提供一种编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸及其应用。本发明将ND6的线粒体编码序列改变为核编码序列，在细胞核里编码出正常的ND6蛋白质，其与在线粒体中编码的蛋白质完全相同，并且该融合核酸末端有线粒体定位序列，可将核里编码好的ND6蛋白引导到线粒体中，发挥正常的线粒体ND6蛋白的生理功能，达到治疗LHON的目的。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种融合核酸，所述融合核酸包含所述的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸；较佳地，所述融合核酸在编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸上连接了线粒体靶向序列和/或UTR序列。在本发明中，所述编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸又称作ND6基因或ND6核酸。

较佳地，当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸连接了线粒体靶向序列时，所述线粒体靶向序列为如SEQ ID NO:2所示的COX10序列，或如SEQ ID NO:3所示的OPA1(optic atrophy 1，视神经萎缩相关蛋白1抗体)序列；当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸连接了UTR(Untranslated Region)序列时，所述UTR序列如SEQ ID NO:4所示。

线粒体靶向序列(Mitochondrial targeting sequence，MTS)的作用是将细胞核内编码好的ND6蛋白引导至线粒体中，发挥正常的线粒体ND6蛋白的生理功能，达到治疗LHON的目的。

较佳地，在所述融合核酸中，所述COX10序列、所述编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸序列、所述UTR序列由5’端至3’端依次排列；较佳地，所述融合核酸的序列如SEQ IDNO:5所示。具体的，ND6融合蛋白的核酸其核苷酸序列全长为2034bp，自1bp至84bp为COX10基因的线粒体靶向序列(共84bp)；85bp至609bp为ND6基因(共525bp)，610bp至2034bp为3’UTR(共1425bp)。COX10基因为线粒体靶向序列，引导ND6蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能，3’UTR是非编码序列，设计在ND6蛋白的后面，其作用是稳定COX10基因线粒体靶向序列和ND6序列的表达。

本发明中，“融合核酸”指由两个或两个以上不同来源的核苷酸序列连接而成的核酸，或者由同一来源但其天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。本发明的融合核酸所编码的蛋白称作融合蛋白，在本发明中即ND6蛋白。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体中含所述的融合核酸；较佳地，所述重组表达载体的骨架载体为腺相关病毒(AAV)载体质粒pSNaV；更佳地，所述重组表达载体为重组腺相关病毒表达载体pSNaV/rAAV2/2-ND6。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种转化体，即在宿主中导入上述融合核酸。

较佳地，所述宿主为哺乳动物细胞；更佳地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

较佳地，在所述宿主中导入所述的重组表达载体或者所述的融合核酸整合在所述宿主的基因组上。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种由所述的融合核酸编码的融合蛋白。本发明提供的编码ND6的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产ND6蛋白或ND6融合蛋白。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

(1)获得所述的转化体；

(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述人NADH脱氢酶亚单位6蛋白。

为解决上述问题，本发明的技术方案之一，是提供一种上述融合核酸或重组表达载体或转化体在制备治疗Leber遗传学视神经病变的药物中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明首先对人ND6的核苷酸进行改进，将ND6的线粒体编码序列改变为核编码序列，使其在细胞核里编码出正常的ND6蛋白质，并与在线粒体编码的蛋白质完全相同。此外，该核编码序列末端连接有线粒体定位序列，可将核里编码好的ND6蛋白引导到线粒体中，发挥正常的线粒体ND6蛋白的生理功能，达到治疗LHON的目的。将含有本发明所述融合核酸的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞，从而有效地治疗Leber遗传性视神经病变。

附图说明

图1为重组质粒结构图，其中MTS指线粒体定位序列。

图2为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为Marker，泳道1为ND6。

图3为兔子的眼底照相，其中A为rAAV-ND6注射组，B为rAAV-GFP注射组，C为PBS注射组。

图4为兔子的视网膜荧光照相，其中A为rAAV-GFP注射组，B为PBS注射组。

具体实施方式

以下是主要试剂和设备的信息：

PCR反应扩增仪：加拿大BBI公司

移液器：加拿大BBI公司

SW-CJ-1D洁净工作台：江苏苏洁净化设备厂

DK-8D型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司

YXJ-2离心机：湘仪离心机仪器有限公司

凝胶成像系统：Gene Genius公司

TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)有限公司

Marker：生工生物工程(上海)有限公司

6×DNA Loading Dye：生工生物工程(上海)有限公司

PCR产物纯化回收试剂盒：生工生物工程(上海)有限公司

KpnI/SalI酶：生工生物工程(上海)有限公司

PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒：美国Invitrogen公司

以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改和变化，在本发明权利要求及其等同物范围内的修改和变化均属于本发明保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1质粒的构建和重组腺相关病毒的制备

1.1质粒的构建

获取人NADH脱氢酶亚单位6(ND6)的核苷酸序列(NCBI参考序列：NC_011137.1)，本发明改变了ND6的线粒体编码序列为核编码序列(如SEQ ID NO：1所示)，并在ND6基因的5’端连接COX10的线粒体编码序列(如SEQ ID NO：2所示)，ND6基因的3’端连接UTR序列(如SEQID NO：4所示)，所得融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQ ID NO:5所示，所有基因序列均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

将重组人NADH脱氢酶亚单位6基因用加了Kpn I和Sal I两个酶切位点的引物进行PCR扩增全长基因，通过Kpn I/Sal I的酶切，在融合基因上形成粘性末端，并将融合基因嵌入有Kpn I/SalI酶切位点的质粒载体pSNaV(BioVector)得到重组腺相关病毒表达载体，命名为pSNaV/rAAV2/2-ND6(如图1所示)。

1.2重组子的筛选和鉴定

将上述得到的pSNaV/rAAV2/2-ND6涂布于平板上，取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有100mg/L Amp的LB液体培养基中，在37℃200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒pSNaV/rAAV2/2-ND6，质粒提取步骤参照Biomiga说明书，使用ND6全长引物进行PCR鉴定。

ND6全长引物设计如下：

ND6全长-正向引物：5’-ATGATGTATGCTTTGTTTCTG-3’(序列如SEQ ID NO:6所示)

ND6全长-反向引物：5’-CTAATTCCCCCGAGCAATCTC-3’(序列如SEQ ID NO:7所示)

PCR后进行琼脂糖凝胶电泳(如图2所示)发现在525bp左右有ND6目的条带，说明筛选出的质粒为目的质粒。

1.3细胞转染

转染前一天，将HEK293细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞，培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜；转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：

(a)每个转染瓶取pAd Helper(购于BioVector)、pAAV-r2c2(购于BioVector)、pSNaV/rAAV2/2-ND6质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTransII(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号为B试剂；

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养；

(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10％牛血清)。

转染48h后，收取细胞，将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。

1.4重组腺相关病毒rAAV2/2-ND6的分离、浓缩和纯化

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三个步骤进行分离、浓缩和纯化得到重组腺相关病毒rAAV2/2-ND6，具体步骤如下：

1.4.1病毒的收集：1)准备干冰乙醇浴(或液氮)和37℃水浴；2)将上述1.3中收取的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中；3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬；4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次，冻和融各10分钟，每次融解后稍加震荡。

1.4.2病毒的浓缩：1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心得到的上清转移到一个新离心管中；2)用0.45μm滤器过滤除杂质；3)加入1/2体积的1M NaCl，10％PEG8000溶液，混合均匀，4℃过夜；4)12,000rpm离心2h，弃上清，病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解，待完全溶解后用0.22μm滤器过滤除菌；5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合。在37℃孵育30分钟；6)用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的rAAV2/2-ND6病毒液。

1.4.3病毒的纯化：1)向浓缩的rAAV2/2-ND6病毒液中添加固体CsCl直到密度为1.41g/ml(折射率为1.372)；2)将样品加入到超速离心管中，用预先配好的1.41g/ml CsCl溶液将离心管剩余空间填满；3)在175,000g下离心24小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有rAAV2颗粒的组分；4)重复上述过程一次。将病毒装入100kDa的透析袋，4℃透析脱盐过夜。至此，获得浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2/2-ND6。

如本领域技术人员所知，除COX10以外，OPA1(序列如SEQ ID NO:3所示)也可与本发明的ND6基因融合，线粒体靶向序列OPA1可将ND6基因表达的蛋白带入到线粒体内膜上，从而实现蛋白的线粒体靶向表达。

实施例2rAAV2/2-ND6的滴度测定

用地高辛标记的H1探针点杂交方法检测病毒液中AAV2/2-ND6的物理滴度。将质粒pSNAV-ND6准确定量，用稀释缓冲液以一系列稀释度稀释后点到尼龙膜上；待测的病毒液rAAV2/2-ND6样品用DNase I和RNase于37℃消化1h。提取rAAV2/2-ND6病毒基因组，沸水浴5min变性之后置于冰浴中。用试剂盒提供的稀释缓冲液以一定比列做系列稀释后点膜。预杂交、杂交、洗膜、显色按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书进行。通过计算pSNAV-ND6的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAV2/2-ND6的基因组滴度为2.0×10¹¹vg/mL。

实施例3兔眼玻璃体腔注射rAAV2/2-ND6试验

取24只兔子分为3组：实验组1、实验组2和对照组。分别用rAAV-ND6、rAAV-GFP和PBS在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。

2、眼压、眼底照相检查

3组兔子分别于术后1、7、30天眼压的检查,所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后30天的眼底照相如图3所示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

3、视网膜的荧光照相

玻璃体腔注射30天后，GFP组视网膜的荧光照相如图4所示，GFP成功地被表达在视网膜上，表明以rAAV为载体，携带GFP基因转染兔眼玻璃体内可以正常表达，间接证明rAAV-ND6重组基因可以在视网膜上表达。

4Real-time PCR检测ND6的表达

分别利用TRIZOL试剂盒提取rAAV-ND6组和PBS组视兔神经细胞总RNA并反转录合成cDNA模板。然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物(β-actin作为内参)：

β-actin-正向引物：CGAGATCGTGCGGGACAT(序列如SEQ ID NO:8所示)

β-actin-反向引物：CAGGAAGGAGGGCTGGAAC(序列如SEQ ID NO:9所示)

ND6-正向引物：AGTGTGGGTTTAGTAATG(序列如SEQ ID NO:10所示)

ND6-反向引物：TGCCTCAGGATACTCCTC(序列如SEQ ID NO:11所示)

在Real-time PCR Detection System仪器上进行Real-time PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH2O 8μL、引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔β-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行Real-time PCR。

按照95℃预变性1s，然后94℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸25s共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。采用相对定量方法研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔β-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值，rAAV-ND6组和PBS组分别为0.59±0.06和0.41±0.03，表明实验组视网膜上ND6的表达明显比对照组高(P＜0.01)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 一种编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸及其应用

<130> P180114153C

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 525

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND6核编码序列

<400> 1

atgatgtatg ctttgtttct gttgagtgtg ggtttagtaa tggggtttgt ggggttttct 60

tctaagcctt ctcctattta tgggggttta gtattgattg ttagcggtgt ggtcgggtgt 120

gttattattc tgaattttgg gggaggttat atgggtttaa tggttttttt aatttattta 180

gggggaatga tggttgtctt tggatatact acagcgatgg ctattgagga gtatcctgag 240

gcatgggggt caggggttga ggtcttggtg agtgttttag tggggttagc gatggaggta 300

ggattggtgc tgtgggtgaa agagtatgat ggggtggtgg ttgtggtaaa ctttaatagt 360

gtaggaagct ggatgattta tgaaggagag gggtcagggt tgattcggga ggatcctatt 420

ggtgcggggg ctttgtatga ttatgggcgt tggttagtag tagttactgg ttggacattg 480

tttgttggtg tatatattgt aattgagatt gctcggggga attag 525

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX10序列

<400> 2

atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60

gtctggtatc ttgaaagaag aact 84

<210> 3

<211> 266

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OPA1序列

<400> 3

gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60

tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120

cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180

acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240

cgactacgtc gggccgctgt ggcctg 266

<210> 4

<211> 1425

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UTR序列

<400> 4

gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60

tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120

tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180

agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240

ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300

tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360

acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420

gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480

ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540

aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600

ttgggagtct caagctggac tgccagcccc tgtcctccct tcacccccat tgcgtatgag 660

catttcagaa ctccaaggag tcacaggcat ctttatagtt cacgttaaca tatagacact 720

gttggaagca gttccttcta aaagggtagc cctggactta ataccagccg gatacctctg 780

gcccccaccc cattactgta cctctggagt cactactgtg ggtcgccact cctctgctac 840

acagcacggc tttttcaagg ctgtattgag aagggaagtt aggaagaagg gtgtgctggg 900

ctaaccagcc cacagagctc acattcctgt cccttgggtg aaaaatacat gtccatcctg 960

atatctcctg aattcagaaa ttagcctcca catgtgcaat ggctttaaga gccagaagca 1020

gggttctggg aattttgcaa gttacctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080

ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct acagagtccc atctgcccaa 1140

aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcga ttactcagtc tcccagggca ctactggtcc 1200

gtaggattcg attggtcggg gtaggagagt taaacaacat ttaaacagag ttctctcaaa 1260

aatgtctaaa gggattgtag gtagataaca tccaatcact gtttgcactt atctgaaatc 1320

ttccctcttg gctgccccca ggtatttact gtggagaaca ttgcatagga atgtctggaa 1380

aaagcttcta caacttgtta cagccttcac atttgtagaa gcttt 1425

<210> 5

<211> 2034

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND6融合序列

<400> 5

atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60

gtctggtatc ttgaaagaag aactatgatg tatgctttgt ttctgttgag tgtgggttta 120

gtaatggggt ttgtggggtt ttcttctaag ccttctccta tttatggggg tttagtattg 180

attgttagcg gtgtggtcgg gtgtgttatt attctgaatt ttgggggagg ttatatgggt 240

ttaatggttt ttttaattta tttaggggga atgatggttg tctttggata tactacagcg 300

atggctattg aggagtatcc tgaggcatgg gggtcagggg ttgaggtctt ggtgagtgtt 360

ttagtggggt tagcgatgga ggtaggattg gtgctgtggg tgaaagagta tgatggggtg 420

gtggttgtgg taaactttaa tagtgtagga agctggatga tttatgaagg agaggggtca 480

gggttgattc gggaggatcc tattggtgcg ggggctttgt atgattatgg gcgttggtta 540

gtagtagtta ctggttggac attgtttgtt ggtgtatata ttgtaattga gattgctcgg 600

gggaattagg agcactggga cgcccaccgc ccctttccct ccgctgccag gcgagcatgt 660

tgtggtaatt ctggaacaca agaagagaaa ttgctgggtt tagaacaaga ttataaacga 720

attcggtgct cagtgatcac ttgacagttt tttttttttt taaatattac ccaaaatgct 780

ccccaaataa gaaatgcatc agctcagtca gtgaatacaa aaaaggaatt atttttccct 840

ttgagggtct tttatacatc tctcctccaa ccccaccctc tattctgttt cttcctcctc 900

acatgggggt acacatacac agcttcctct tttggttcca tccttaccac cacaccacac 960

gcacactcca catgcccagc agagtggcac ttggtggcca gaaagtgtga gcctcatgat 1020

ctgctgtctg tagttctgtg agctcaggtc cctcaaaggc ctcggagcac ccccttcctt 1080

gtgactgagc cagggcctgc atttttggtt ttccccaccc cacacattct caaccatagt 1140

ccttctaaca ataccaatag ctaggacccg gctgctgtgc actgggactg gggattccac 1200

atgtttgcct tgggagtctc aagctggact gccagcccct gtcctccctt cacccccatt 1260

gcgtatgagc atttcagaac tccaaggagt cacaggcatc tttatagttc acgttaacat 1320

atagacactg ttggaagcag ttccttctaa aagggtagcc ctggacttaa taccagccgg 1380

atacctctgg cccccacccc attactgtac ctctggagtc actactgtgg gtcgccactc 1440

ctctgctaca cagcacggct ttttcaaggc tgtattgaga agggaagtta ggaagaaggg 1500

tgtgctgggc taaccagccc acagagctca cattcctgtc ccttgggtga aaaatacatg 1560

tccatcctga tatctcctga attcagaaat tagcctccac atgtgcaatg gctttaagag 1620

ccagaagcag ggttctggga attttgcaag ttacctgtgg ccaggtgtgg tctcggttac 1680

caaatacggt tacctgcagc tttttagtcc tttgtgctcc cacgggtcta cagagtccca 1740

tctgcccaaa ggtcttgaag cttgacagga tgttttcgat tactcagtct cccagggcac 1800

tactggtccg taggattcga ttggtcgggg taggagagtt aaacaacatt taaacagagt 1860

tctctcaaaa atgtctaaag ggattgtagg tagataacat ccaatcactg tttgcactta 1920

tctgaaatct tccctcttgg ctgcccccag gtatttactg tggagaacat tgcataggaa 1980

tgtctggaaa aagcttctac aacttgttac agccttcaca tttgtagaag cttt 2034

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND6全长-正向引物

<400> 6

atgatgtatg ctttgtttct g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND6全长-反向引物

<400> 7

ctaattcccc cgagcaatct c 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-actin-正向引物

<400> 8

cgagatcgtg cgggacat 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-actin-反向引物

<400> 9

caggaaggag ggctggaac 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND6-正向引物

<400> 10

agtgtgggtt tagtaatg 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ND6-反向引物

<400> 11

tgcctcagga tactcctc 18

Claims

1.一种编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸；较佳地，所述融合核酸在编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸序列上连接了线粒体靶向序列和/或UTR序列。

3.如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸连接了线粒体靶向序列时，所述线粒体靶向序列为如SEQ ID NO:2所示的COX10序列，或如SEQ ID NO:3所示的OPA1序列；当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸连接了UTR序列时，所述UTR序列如SEQ ID NO:4所示。

4.如权利要求3所述的融合核酸，其特征在于，在所述融合核酸中，所述COX10序列、所述编码人NADH脱氢酶亚单位6蛋白的核酸序列、所述UTR序列由5’端至3’端依次排列；较佳地，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO:5所示。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含如权利要求2～4任一项所述的融合核酸；较佳地，所述重组表达载体的骨架载体为腺相关病毒载体质粒pSNaV，更佳地，所述重组表达载体为重组腺相关病毒表达载体pSNaV/rAAV2/2-ND6。

6.一种转化体，其特征在于，在宿主中导入如权利要求2～4任一项所述的融合核酸；较佳地，所述宿主为哺乳动物细胞；更佳地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

7.如权利要求6所述的转化体，其特征在于，在所述宿主中导入如权利要求5所述的重组表达载体或者所述的融合核酸整合在所述宿主的基因组上。

8.一种由如权利要求2～4任一项所述的融合核酸编码的融合蛋白。

9.一种人NADH脱氢酶亚单位6融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

(1)获得如权利要求6或7所述的转化体；

(2)筛选所述转化体，表达并纯化所述人NADH脱氢酶亚单位6融合蛋白。

10.一种如权利要求2～4任一项所述的融合核酸或如权利要求5所述的重组表达载体或如权利要求6或7所述的转化体在制备治疗Leber遗传学视神经病变的药物中的应用。