CN110656106A - 一种体态类生物检材中游离dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体态类生物检材中游离DNA的提取方法，包括生物检材前处理、核酸吸附和洗涤步骤，能够实现对已发生DNA降解的陈旧生物检材而导致采用Chelex‑100 法检验失败的DNA模板进行游离DNA的提取，不仅可以有效提高DNA检验成功率，而且可以减少从头开始复检的繁琐；特别是对生物检材量少，无法复检的案件检材，可以作为有效的补救措施，对于充分发挥游离DNA在案件侦破、打击犯罪、固定证据中强有力的技术支撑作用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及法医物证检测技术领域，具体涉及一种体态类生物检材中游离DNA的提取方法。
背景技术
游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)，又称为细胞外DNA，主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA-蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。法医物证中的血液、唾液、尿液、汗液等体态类生物检材中均含有一定量的游离DNA，对生物检材中游离DNA分离后，分别对游离DNA和细胞内DNA进行检验，可以弥补细胞内DNA、PCR扩增失败或扩增不平衡产生等位基因缺失等问题，从而保证分型的完整性和准确性。在DNA纯化过程中，常规的纯化方法需要繁琐的步骤，且通常用到有害的试剂。为了缩短提取时间，技术人员开发了Chelex-100法，该法仅需要较少的步骤，且有害试剂使用量较少。Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，其含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力，能结合多种外源性物质。然而在日常检案中发明人发现，面对含有腐殖酸、血红素、尿素、染料、色素、蛋白、胶原质、胆盐等物质的体态类生物检材，这些物质通过抑制DNA聚合酶活性、阻碍DNA分子与引物结合或者形成引物二聚体等方式，从而影响Chelex-100法的提取纯化效果。尤其是面对陈旧生物检材的游离DNA提取，Chelex-100法常常出现纯度不够或浓度不够而导致检验失败。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种体态类生物检材中游离DNA的提取方法，该方法能够对含有腐殖酸、血红素、尿素、染料、色素、蛋白、胶原质、胆盐等物质或已发生降解的常规生物检材(唾液斑擦拭物、血迹擦拭物、深色染料衣物上的血迹/血斑、深色烟头、陈旧烟头等)而导致采用Chelex-100法检验失败的DNA模板进行纯化及浓缩，从而有效提高DNA检验成功率。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比，所述浓度为质量百分比浓度。
本发明的目的是这样实现的：
本发明体态类生物检材中游离DNA的提取方法，包括生物检材前处理、核酸吸附和洗涤步骤，其特征在于：所述生物检材前处理为首先用去离子水洗涤生物样本，再加入螯合树脂50～200μl的悬浮液和0.2-4mg/ml的蛋白酶K，56℃孵育0.5-1.5h,100℃孵育8min，然后通过离心去除杂质，获得DNA模板；所述螯合树脂悬浮液的溶剂为水，溶质是30-80mg/ml的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂。
在一个实施方案中，本发明所述核酸吸附为生物检材前处理获得的DNA模板与吸附液以及磁珠悬浮液混合，DNA将与磁珠结合，形成了含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，在磁力的作用下收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；所述吸附液包含终浓度为60-100mM的Tris-HCl，3-6M的异硫氰酸胍盐，10-100mM的EDTA，体积百分含量为15-30％的乙醇；所述磁珠悬浮液由直径50-1200nm的纳米级硅包被磁性微球和水组成。
在一个实施方案中，本发明所述吸附液的pH＝6.0-7.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：60-100mM的Tris-HCl，3-6M的异硫氰酸胍盐，10-100mM的EDTA，体积百分含量为15-30％的乙醇。
在一个实施方案中，本发明所述磁珠悬浮液中每ml磁珠悬浮液的组分如下：直径为50-1200nm的纳米级硅包被磁性微球40-80mg，其余为水。优选的，本发明所述磁珠悬浮液中每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球是50mg。
在一个实施方案中，本发明所述核酸吸附中，先将DNA模板与吸附液混合，再加入磁珠悬浮液混合，加入磁珠悬浮液混合的条件是室温(20-30℃)翻转混合10-15min。
在一个实施方案中，本发明所述磁珠悬浮液与DNA模板、吸附液的体积比为10-30∶10-300∶100-900，如(10-30)μl∶(10-300)μl∶(100-900)μl。
在一个实施方案中，本发明所述洗涤为将得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用80-90％的乙醇水溶液、无水乙醇洗涤，然后用去离子水溶出DNA，得到纯化的DNA。
在一个实施方案中，本发明还包括洗脱步骤，所述洗脱为洗涤后用枪头吸干残留液体，65℃温浴6-10min，然后往离心管中加入去离子水，震荡后65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃保存。
本发明所述的陈旧生物检材是指暴露于自然环境中7d以上，DNA分子发生某种程度的降解，导致常规方法不能成功检验出基因分型的生物检材，如陈旧烟头、陈旧唾液斑、陈旧血迹/血斑等。
有益效果：
不意图为任何理论所束缚，尽管Chelex-100法针对游离DNA具有步骤少、有害试剂使用量较少、提取时间短的优势，但是面对含有腐殖酸、血红素、尿素、染料、色素、蛋白、胶原质、胆盐等物质的体态类生物检材，由于这些物质通过抑制DNA聚合酶活性、阻碍DNA分子与引物结合或者形成引物二聚体等方式，从而导致Chelex-100法检验失败。本发明人进行了大量实验，并且出人意料地发现，使用本发明的体态类生物检材中游离DNA的提取方法，去掉了高温消化裂解过程，避免在较高温度下裂解过程中可能造成的DNA损耗，可以高效、快捷提取体态类生物检材中的游离DNA，实现生物检材中游离DNA与细胞内DNA的分离检验。
面对陈旧生物检材的游离DNA提取，由于在自然环境中发生降解，导致所获得的DNA模板浓度过低而不能达到成功检测要求，故Chelex-100法不适合该类体态类生物检材游离DNA的提取。更出人意料地发现，使用本发明的体态类生物检材中游离DNA的提取方法，能够实现对已发生DNA降解的陈旧生物检材(唾液斑擦拭物、血迹擦拭物、深色染料衣物上的血迹/血斑，深色烟头、饮料瓶等)而导致采用Chelex-100法检验失败的DNA模板进行游离DNA的提取，不仅可以有效提高DNA检验成功率，而且可以减少从头开始复检的繁琐；特别是对生物检材量少，无法复检的案件检材，可以作为有效的补救措施。本发明采用灵活的试剂体系，通过调节操作体系，可实现DNA样本的最大富集，对于充分发挥游离DNA在案件侦破、打击犯罪、固定证据中强有力的技术支撑作用具有重要意义，在法医DNA检验中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为采用实施例1的试剂和方法提取纯化Chelex-100法检验失败的室外地面血迹擦拭物检材中游离DNA后获得的STR分型图谱；
图2为采用实施例2的试剂和方法提取纯化Chelex-100法检验失败的深色衣物上血迹检材中游离DNA后获得的STR分型图谱；
图3为采用实施例3的试剂和方法提取纯化Chelex-100法检验失败的深色烟头检材中游离DNA后获得的STR分型图谱；
图4为采用实施例7的试剂和方法提取纯化Chelex-100法检验失败的陈旧烟头检材中游离DNA后获得的STR分型图谱；
图5为采用实施例8的试剂和方法提取纯化Chelex-100法检验失败的陈旧饮料瓶瓶口擦拭物检材中游离DNA后获得的STR分型图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。本发明的PCR扩增，毛细管电泳检测检测方法为：PCR扩增：采Identifiler-Plus试剂盒(ABI，美国)按表1的PCR扩增体系，表2的PCR扩增程序进行PCR扩增反应；毛细管电泳检测：取1μl PCR扩增产物加入到96孔板中，每孔中再加入9μl配制好的甲酰胺和Liz600(体积比160:2.5)的混合液，混匀后将96孔板放入ABI 3500型遗传分析仪(ABI，美国)进行毛细管电泳检测，用GeneMapper ID-X v1.5基因软件进行数据分析。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
表1 PCR扩增反应体系
| 反应成分 | 反应体积 |
| Master Mix | 4μl |
| Primer Set | 2μl |
| DNA模板 | 4μl |
表2 PCR扩增反应程序
实施例1
对Chelex-100法检验失败的室外地面血迹擦拭物生物检材中游离DNA的提取纯化
试剂
吸附液：pH为6.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：100mM的Tris-HCl，6M的异硫氰酸胍，100mM的EDTA以及30％(体积百分含量)的乙醇。磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是600nm)(QIAGEN公司，德国)为40mg，其余为水。
DNA的提取纯化
(1)前处理：将生物样品装入离心管中，加入200μl去离子水，震荡洗涤离心后吸弃液体，再加入100μl 30mg/ml的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂悬浮液和5μl 0.2mg/ml的蛋白酶K，56℃水浴锅中孵育0.5h，100℃恒温仪上孵育8min，离心后去除杂质，DNA模板4℃保存。将上述提取的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果未能成功检测出STR基因座基因分型。这里检测失败可能是生物检材中含有腐植酸、血红素等因子对PCR扩增反应的抑制所造成。
(2)核酸吸附：向步骤(1)得到的DNA模板中分别加入磁珠悬浮液(加入量为10μl浓度为50mg/ml的溶液)和300μl的吸附液，室温(30℃)翻转混合15min，即形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在吸附液溶液体系中。
(3)复合体分离：将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤(2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从吸附液溶液体系中分离出来。
(4)洗涤：往离心管中加入200μl 85％乙醇水溶液，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；往离心管中加入200μl无水乙醇，漩涡振荡洗涤后吸弃液体。
(5)洗脱：洗涤后，用20μl枪头吸干残留液体，65℃温浴6-10min(至乙醇挥发)。然后往离心管中加入20μl的去离子水，震荡后65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃保存。
STR复合扩增分析
将洗脱得到的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果如图1所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好。
实施例2
对Chelex-100法检验失败的深色衣物上血迹生物检材中游离DNA的提取纯化
试剂
吸附液：pH为7.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：80mM的Tris-HCl，5M的异硫氰酸胍，20mM的EDTA以及15％(体积百分含量)的乙醇。磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是1000nm)(QIAGEN公司，德国)为50mg，其余为水。
DNA的提取纯化
(1)前处理：将生物样品装入离心管中，加入150μl去离子水，震荡洗涤离心后吸弃液体，再加入200μl 50mg/ml的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂悬浮液和3μl 2mg/ml的蛋白酶K，56℃水浴锅中孵育1h，100℃恒温仪上孵育8min，离心后去除杂质，DNA模板4℃保存。将上述提取的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果未能成功检测出STR基因座基因分型。这里检测失败可能是生物检材中含有染料、血红素等因子对PCR扩增反应的抑制所造成。
(2)核酸吸附：向步骤(1)得到的DNA模板中分别加入磁珠悬浮液(加入量为15μl浓度为50mg/ml的溶液)和400μl的吸附液，室温(26℃)翻转混合15min，即形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在吸附液溶液体系中。
(3)复合体分离：将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤(2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从吸附液溶液体系中分离出来。
(4)洗涤：往离心管中加入400μl 80％乙醇水溶液，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；往离心管中加入300μl无水乙醇，漩涡振荡洗涤后吸弃液体。
(5)洗脱：洗涤后，用20μl枪头吸干残留液体，65℃温浴6-10min(至乙醇挥发)。然后往离心管中加入20μl的去离子水，震荡后65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃保存。
STR复合扩增分析
将洗脱得到的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果如图2所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好。
实施例3
对Chelex-100法检验失败的深色烟头生物检材中游离DNA的提取纯化
试剂
吸附液：pH为6.8，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：90mM的Tris-HCl，6M的异硫氰酸胍，30mM的EDTA以及15％(体积百分含量)的乙醇。磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是1200nm)(QIAGEN公司，德国)为50mg，其余为水。
DNA的提取纯化
(1)前处理：将生物样品装入离心管中，加入100μl去离子水，震荡洗涤离心后吸弃液体，再加入90μl 80mg/ml的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂悬浮液和1μl 4mg/ml的蛋白酶K，56℃水浴锅中孵育1.5h，100℃恒温仪上孵育8min，离心后去除杂质，DNA模板4℃保存。将上述提取的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果未能成功检测出STR基因座基因分型。这里检测失败即可能是生物检材中含有染料等因子对PCR扩增反应的抑制所造成。
(2)核酸吸附：向步骤(1)得到的DNA模板中分别加入磁珠悬浮液(加入量为30μl浓度为50mg/ml的溶液)和900μl的吸附液，室温(26℃)翻转混合15min，即形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在吸附液溶液体系中。
(3)复合体分离：将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤(2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从吸附液溶液体系中分离出来。
(4)洗涤：往离心管中加入500μl 80％乙醇水溶液，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；往离心管中加入500μl无水乙醇，漩涡振荡洗涤后吸弃液体。
(5)洗脱：洗涤后，用20μl枪头吸干残留液体，65℃温浴6-10min(至乙醇挥发)。然后往离心管中加入20μl的去离子水，震荡后65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃保存。
STR复合扩增分析
将洗脱得到的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果如图3所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好。
实施例4-6
对Chelex-100法检验失败生物检材DNA模板提取纯化后检验成功率试剂：实施例4-6中的所有试剂与实施例2完全相同。
DNA的提取纯化
(1)前处理：实施例4-6的生物检材按照实施例2中前处理的步骤进行操作，结果实施例4-6采用Chelex-100法均未能成功检测出全部STR基因座基因分型。实施例4-6的检测失败可能是上述实施例的生物检材中含有腐植酸、染料、血红素等抑制物对PCR扩增反应的抑制所造成。
(2)核酸吸附：按照实施例2步骤进行操作。其余步骤参照实施例2。
STR复合扩增分析
将实施例4-6提取纯化后的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，以STR位点完整，分型准确，且无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，视为检验成功，统计检验成功率。表3表明采用本发明方法对Chelex-100法检验失败的含抑制物生物检材DNA模板提取纯化后，DNA检验成功率得到了显著的提高。
表3实施例4-6对Chelex-100法检验失败的DNA模板提取纯化后检验成功率
从实施例4-6的检测结果来看，本发明检测方法用于地面血迹擦拭物以及深色衣服上血迹生物检材中游离DNA的提取纯化，成功率为100％，用于深色烟头中游离DNA的提取纯化，成功率为96％，可见本发明对于充分发挥游离DNA在案件侦破、打击犯罪、固定证据中强有力的技术支撑作用具有重要意义，在法医DNA检验中具有重要的应用价值。
实施例7
对Chelex-100法检验失败的陈旧烟头生物检材中游离DNA的提取纯化
试剂
吸附液：pH为7.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：50mM的Tris-HCl，5M的异硫氰酸胍，10mM的EDTA以及20％(体积百分含量)的乙醇。磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是200nm)(QIAGEN公司，德国)为50mg，其余为水。
DNA的提取纯化
(1)前处理：将生物样品装入离心管中，加入100μl去离子水，震荡洗涤离心后吸弃液体，再加入50μl 50mg/ml的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂悬浮液和2μl 1mg/ml的蛋白酶K，56℃水浴锅中孵育1h，100℃恒温仪上孵育8min，离心后去除杂质，DNA模板4℃保存。
将上述提取的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果未能成功检测出全部STR基因座基因分型。这里检测失败可能是生物检材在自然环境中发生降解，导致所获得的DNA模板浓度过低，不能达到成功检测要求所造成。
(2)核酸吸附：向步骤(1)得到的DNA模板中分别加入磁珠悬浮液(加入量为10μl浓度为50mg/ml的溶液)和700μl的吸附液，室温(27℃)翻转混合15min，即形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在吸附液溶液体系中。
(3)复合体分离：将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤(2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从吸附液溶液体系中分离出来。
(4)洗涤：往离心管中加入500μl 80％乙醇水溶液，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；往离心管中加入500μl无水乙醇，漩涡振荡洗涤后吸弃液体。
(5)洗脱：洗涤后，用20μl枪头吸干残留液体，65℃温浴6-10min(至乙醇挥发)。然后往离心管中加入20μl的去离子水，震荡后65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃保存。
STR复合扩增分析
将洗脱得到的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果如图4所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好。
实施例8
对Chelex-100法检验失败的陈旧饮料瓶瓶口擦拭物生物检材中游离DNA的提取纯化
试剂
吸附液：pH为7.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：50mM的Tris-HCL，5M的异硫氰酸胍，10mM的EDTA以及20％(体积百分含量)的乙醇。磁珠悬浮液：每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球(直径是200nm)(QIAGEN公司，德国)为50mg，其余为水。
DNA的提取纯化
(1)前处理
将生物样品装入离心管中，加入100μl去离子水，震荡洗涤离心后吸弃液体，再加入50μl 50mg/ml的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂悬浮液和2μl1mg/ml的蛋白酶K，56℃水浴锅中孵育1h，100℃恒温仪上孵育8min，离心后去除杂质，DNA模板4℃保存。将上述提取的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果未能成功检测出全部STR基因座基因分型。这里检测失败可能是生物检材在自然环境中发生降解，导致所获得的DNA模板浓度过低，不能达到成功检测要求所造成。
(2)核酸吸附：向步骤(1)得到的DNA模板中分别加入磁珠悬浮液(加入量为10μl浓度为50mg/ml的溶液)和700μl的吸附液，室温(27℃)翻转混合15min，即形成了磁性纳米微球-DNA的复合体，该复合体在吸附液溶液体系中。
(3)复合体分离：将离心管漩涡振荡后，放于磁架上，吸弃液体，这一步是在外界磁场力的作用下，将步骤(2)中的磁性纳米微球-DNA的复合体从吸附液溶液体系中分离出来。
(4)洗涤：往离心管中加入500μl 80％乙醇水溶液，漩涡振荡洗涤后吸弃液体；往离心管中加入500μl无水乙醇，漩涡振荡洗涤后吸弃液体。
(5)洗脱：洗涤后，用20μl枪头吸干残留液体，65℃温浴6-10min(至乙醇挥发)。然后往离心管中加入20μl的去离子水，震荡后65℃温浴5-8min，磁分离，吸取DNA，4℃保存。
STR复合扩增分析
将洗脱得到的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，结果如图5所示，STR位点完整，分型准确，无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好。
实施例9-10
对Chelex-100法检验失败陈旧生物检材DNA模板浓缩后检验成功率试剂：实施例9-10中的所有试剂与实施例7完全相同。
DNA的提取纯化
(1)前处理：实施例9-10的生物检材按照实施例7中前处理的步骤进行操作，结果实施例9-10采用Chelex-100法均未能成功检测出全部STR基因座基因分型。实施例9-10检测的失败即可能是上述实施例的生物检材在自然环境中发生降解，导致所获得的DNA模板浓度过低，不能达到成功检测要求所造成。为了实现对实施例9-10中获得的DNA模板进一步浓缩，进行以下操作。
(2)核酸吸附：按照实施例7步骤进行操作。其余步骤参照实施例7。
STR复合扩增分析
将实施例9-10浓缩后的DNA分别按照表1扩增体系、表2扩增程序进行STR复合扩增。然后用3500型遗传分析仪检测，以STR位点完整，分型准确，且无等位基因丢失、不平衡扩增、Pullup峰、stutter带、split峰等现象出现，视为检验成功，统计成功率。表4表明采用本发明方法对Chelex-100法检验失败的降解生物检材DNA模板进一步浓缩后，DNA检验成功率得到了有效提高。
表4实施例9-10对Chelex-100法检验失败的DNA模板浓缩后的检验成功率
从实施例9-10的检测结果来看，本发明检测方法用于陈旧烟头中游离DNA的提取纯化，成功率为67％，用于陈旧矿泉水瓶瓶口擦拭物中游离DNA的提取纯化，成功率为80％。可见本发明对于充分发挥游离DNA在案件侦破、打击犯罪、固定证据中强有力的技术支撑作用具有重要意义，在法医DNA检验中具有重要的应用价值。
Claims (9)
1.一种体态类生物检材中游离DNA的提取方法，包括生物检材前处理、核酸吸附和洗涤步骤，其特征在于：所述生物检材前处理为首先用去离子水洗涤生物样本，再加入螯合树脂50~200μl 的悬浮液和0.2-4 mg/ml的蛋白酶K，56℃孵育0.5-1.5 h，100℃孵育8 min，然后通过离心去除杂质，获得DNA模板；所述螯合树脂悬浮液的溶剂为水，溶质是30-80mg/ml的聚苯乙烯二乙烯基苯树脂。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述核酸吸附为生物检材前处理获得的DNA模板与吸附液以及磁珠悬浮液混合，DNA将与磁珠结合，形成了含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，在磁力的作用下收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA 的复合体；所述吸附液包含终浓度为60-100mM的Tris-HCl，3-6M的异硫氰酸胍盐，10-100mM的EDTA，体积百分含量为15-30％的乙醇；所述磁珠悬浮液由直径50-1200nm的纳米级硅包被磁性微球和水组成。
3.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述吸附液的pH = 6.0-7.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：60-100mM的Tris-HCl，3-6M的异硫氰酸胍盐，10-100mM 的EDTA，体积百分含量为15-30％的乙醇。
4.如权利要求2所述的提取方法，其特征在于：所述磁珠悬浮液中每ml磁珠悬浮液的组分如下：直径为50-1200nm 的纳米级硅包被磁性微球40-80 mg，其余为水。
5.如权利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述磁珠悬浮液中每ml磁珠悬浮液中的纳米级硅包被磁性微球是50 mg。
6.如权利要求1-5任一项所述的提取方法，其特征在于：所述核酸吸附中，先将DNA模板与吸附液混合，再加入磁珠悬浮液混合，加入磁珠悬浮液混合的条件是室温翻转混合10-15min 。
7.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于：所述磁珠悬浮液与DNA模板、吸附液的体积比是10-30∶10-300∶100-900。
8.如权利要求1-5任一项所述的提取方法，其特征在于：所述洗涤为将得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用80-90%的乙醇水溶液、无水乙醇洗涤，然后用去离子水溶出DNA，得到纯化的DNA。
9.如权利要求8所述的提取方法，其特征在于：还包括洗脱步骤，所述洗脱为洗涤后用枪头吸干残留液体，65℃温浴6-10 min ，然后往离心管中加入去离子水，震荡后65℃温浴5-8 min，磁分离，吸取DNA，4℃保存。
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