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CN110643542B - 一株可缓解变应性哮喘Th2反应的罗伊氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株可缓解变应性哮喘Th2反应的罗伊氏乳杆菌及其应用 Download PDF

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CN110643542B
CN110643542B CN201911023858.9A CN201911023858A CN110643542B CN 110643542 B CN110643542 B CN 110643542B CN 201911023858 A CN201911023858 A CN 201911023858A CN 110643542 B CN110643542 B CN 110643542B
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Abstract

本发明公开了一株可缓解变应性哮喘Th2反应的罗伊氏乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)具有缓解变应性哮喘的作用，具体体现在：(1)显著降低变应性哮喘小鼠肺部炎症反应；(2)显著抑制变应性哮喘小鼠血清中总免疫球蛋白IgE的产生；(3)显著降低变应性哮喘小鼠肺中IL‑5的含量；(4)显著降低变应性哮喘小鼠肺中IL‑13的含量；(5)显著升高变应性哮喘小鼠肠道中丙酸的含量，因此，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)在制备预防和/或治疗变应性哮喘的产品中，具有巨大的应用前景。

Description

一株可缓解变应性哮喘Th2反应的罗伊氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株可缓解变应性哮喘Th2反应的罗伊氏乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
变应性哮喘是临床常见病、难治病，病程迁延难愈，主要特征是气道中各型炎症细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞以及T淋巴细胞等)浸润，这些细胞分泌的一些炎性介质放大炎症级联反应，增加气道高反应性(AHR)以及刺激黏液分泌，导致气道阻塞和气道重塑。在易感者中，此种炎症可引起反复发作的喘息、气促、胸闷和/或咳嗽等症状，进而引发呼吸骤停和呼吸衰竭等并发症，危及患者生命。
哮喘的在发展中国家，哮喘患病率逐年增加。其发病受多方面因素影响，如暴露途径、遗传易感性、变应原剂量等。有研究证实，85％的哮喘患者通常对屋尘螨(House dustmite，HDM)过敏。变应原进入机体致敏，机体Th1/Th2细胞比例失衡，Th0细胞趋于分化为Th2细胞，导致IL-5、IL-13等Th2因子分泌增加，致机体处于致敏状态。当机体再次接触该类变应原时，B细胞诱导分泌的IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面结合，引起组胺、白三烯等一系列物质释放，进而产生过敏症状。Th2型细胞因子IL-5和IL-13在启动和维持哮喘病理生理反应过程中发挥重要作用。
随着肠道菌群的深入研究，许多研究证实变应性哮喘与肠道菌群的紊乱相关，对比健康人群和变应性哮喘患者的肠道菌群发现，肠道中有益菌的减少和有害菌的增多，肠道中代谢产物的改变如短链脂肪酸的减少等有关，有研究检测了变应性哮喘患者粪便中短链脂肪酸的浓度，发现变应性哮喘患者肠道内丙酸，丁酸和异丁酸的浓度较健康人群明显下降，同时Th2型变态反应水平的细胞因子白细胞介素5和13与肠道中丙酸的含量呈负相关。标志由肠道菌群代谢产生的丙酸有利于降低变应性哮喘的Th2反应。
目前，治疗变应性哮喘的手段通常是通过药物控制，这些药物包括支气管舒张药物、抗炎药物以及益生菌制剂。其中，支气管舒张药物和抗炎药物由于多数需要以静脉注射或吸入的方式给药，因此，患者对这些药物的依从性较差，这就导致了患者的疾病会反复发作，久而久之还会引发患者肺气肿、肺心病等严重并发症。
而益生菌制剂虽然较为安全健康，但是，由于目前发现的具有缓解变应性哮喘症状的加式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌等益生菌或效果较差或作用效果不明确，因此，市面上多数的益生菌制剂也或具有见效慢的缺陷，或具有作用关系不明确的缺陷。
因此，急需找到一种降低变应性哮喘Th2反应强且缓解变应性哮喘能力强的益生菌以解决现有针对变应性哮喘的益生菌制剂均见效慢、作用关系不明确的问题
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CCFM1072，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60735，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072是从来源于山东莱州地区的人体粪便中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072。
本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的微生物形态学特征为：细胞呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌，非运动性、不产芽孢。
本发明的第二个目的是提供所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072在制备预防、缓解、改善和/或治疗变应性哮喘的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述产品中，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的活菌数为不低于1×106CFU/mL。
在一种实施方式中，所述药品含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒以及脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂以及附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含抗黏合剂、渗透促进剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、吸收剂、保湿剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、pH值调节剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、整合剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、发泡剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素以及精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包含颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
在一种实施方式中，所述产品包含食品、药品或保健食品。
在一种实施方式中，所述食品包含使用含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)CCFM1072的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品。
在一种实施方式中，所述食品是含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的固体饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为：将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的发酵剂。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述脱脂奶粉:麦芽糊精:L-谷氨酸钠＝8～10:8～10:1。
有益效果：
本发明筛选出了一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072，此罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072具有缓解变应性哮喘的作用，具体体现在：
(1)变应性哮喘小鼠肺部炎症得分由3.25降低到1.5；
(2)变应性哮喘小鼠血清中总免疫球蛋白IgE的产生由403.19降低到354.38μg/mL；
(3)变应性哮喘小鼠肺中IL-5的含量由213.19降低到61.40pg/mL；
(4)变应性哮喘小鼠肺中IL-13的含量由1044.90降低到442.50pg/mL；
(5)变应性哮喘小鼠肠道中丙酸的含量由5.01升高到7.77μmol/g，
因此，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072在制备预防和/或治疗变应性哮喘的产品(如食品、药品或保健食品等)中，具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072，分类学命名为Lactobacillus reuteri，已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60735，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为不同组别实验小鼠肺组织病理评分。
图2为不同组别实验小鼠血清中免疫球蛋白IgE含量。
图3为不同组别实验小鼠肺泡灌洗液中IL-5含量。
图4为不同组别实验小鼠泡灌洗液中IL-13含量。
图5为不同组别实验小鼠肠道中丙酸的含量。
具体实施方式
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
酸度检测方法：采用国标GB 431334-2010。
实施例中的菌株记载于公开号CN109628359A的专利申请文件中；罗伊氏乳杆菌L.reuteri1和L.reuteri2为采用相同方法分离获得的菌株。
实施例1：罗伊氏乳杆菌的筛选及鉴定
具体步骤如下：
1、筛选：
以来源于山东莱州地区的人体粪便为样本，将样本经预处理后，在30％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1072。
2、鉴定：
将CCFM1072的16S rDNA进行扩增和测序，将该序列在NCBI中进行核苷酸序列比对，结果显示菌株为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072。
实施例2：罗伊氏乳杆菌的培养
具体步骤如下：
将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072接入MRS固体培养基中于37℃培养48h后，观察其菌落并在显微镜下对其菌体进行观察，发现其菌落乳白色、不规则型、圆形凸起、光滑，其菌体形状呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌，通常单个、成对和小簇存在。
将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072接入MRS液体培养基中于37℃培养18h后，转入新鲜的MRS液体培养基中，同样条件培养18h，6000g离心菌体15min，0.9％生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心10min，得到菌体，用30％蔗糖溶液重悬，冻存于-80℃待用。
实施例3：罗伊氏乳杆菌对变应性哮喘小鼠肺部炎症的影响
具体步骤如下：
将6周大的SPF级BALB/c雌性小鼠分成5组，分别为正常组、模型组和实验组，其中，实验组包括灌胃罗伊氏乳杆菌CCFM1072的CCFM1072预防组、灌胃罗伊氏乳杆菌1的L.reuteri1预防组和灌胃罗伊氏乳杆菌2的L.reuteri2预防组，每组6只，饲养在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX(所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共6周(每周5天)，第2-6周进行造模，每天对模型组和实验组小鼠均麻醉滴鼻25μg/10μL的HDM(屋尘螨提取物)，正常组仅滴10μL无菌生理盐水作为对照。
第1-6周，实验组每天灌胃0.25mL(活菌数为1×109CFU)的CCFM1072，L.reuteri1和L.reuteri2菌悬液，正常组和模型组仅灌胃0.25mL无菌生理盐水作为对照，所有分组均为自由饮水和摄食。
实验结束后，麻醉处死小鼠，解剖胸腔，将琼脂糖溶液注入小鼠左肺后，取下左肺置于4％的多聚甲醛溶液中固定，进行石蜡包埋，HE染色，送病理科进行肺部炎症程度评估，炎症程度评估结果见图1。
如图1所示，小鼠在喂食本发明中的菌株CCFM1072后，炎症细胞浸润明显减少，肺组织切片病理学评分减少了54％，显著低于模型组(p＜0.05)，与罗伊氏乳杆菌L.reuteri1和L.reuteri2组降低的46％，相比更接近于空白组，说明罗伊氏乳杆菌CCFM1072降低了哮喘小鼠肺部的炎症反应。
以上实验结果表明，相比于罗伊氏乳杆菌L.reuteri1和L.reuteri2，罗伊氏乳杆菌CCFM1072更能够显著改善哮喘小鼠肺部炎症，缓解哮喘症状。
实施例4：罗伊氏乳杆菌对变应性哮喘小鼠血清中Total-IgE的影响
具体步骤如下：
将6周大的SPF级BALB/c雌性小鼠分成6组，分别为正常组、模型组和实验组，其中，实验组包括灌胃罗伊氏乳杆菌CCFM1072的CCFM1072预防组、灌胃罗伊氏乳杆菌CCFM1040的L.reuteri CCFM1040预防组、罗伊氏乳杆菌1的L.reuteri1预防组和灌胃罗伊氏乳杆菌2的L.reuteri2预防组，每组6只，饲养在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX(所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共6周(每周5天)，第2-6周进行造模，每天对模型组和实验组小鼠均麻醉滴鼻25μg/10μL的HDM(屋尘螨提取物)，正常组仅滴10μL无菌生理盐水作为对照。
第1-6周，实验组每天灌胃0.25mL(活菌数为1×109CFU)的CCFM1072，L.reuteri1和L.reuteri2菌悬液，正常组和模型组仅灌胃0.25mL无菌生理盐水作为对照，所有分组均为自由饮水和摄食。
实验结束后，麻醉小鼠，眼球采血，静止2h后，于离心机3000rpm离心10分钟，收集血清于干净的离心管中，冻存于-20℃。
通过总IgE ELISA试剂盒检测血清中Total IgE的含量，检测结果见图2。
如图2所示，喂食本发明的菌株CCFM1072后，小鼠血清中总IgE的含量降到354μg/ml显著低于模型组含量403μg/ml(p＜0.05)，与空白组含量344μg/ml相当，优于罗伊氏乳杆菌L.reuteri1含量365μg/ml，L.reuteri2含量394μg/ml和L.reuteri CCFM1040含量410μg/ml与模型组没有显著差异。
以上实验结果说明，罗伊氏乳杆菌CCFM1072能够显著降低哮喘小鼠血清中总IgE，改善过敏反应，而罗伊氏乳杆菌L.reuteri2和L.reuteri CCFM1040并未有这种效果。
实施例5：罗伊氏乳杆菌对变应性哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-5的影响
具体步骤如下：
将6周大的SPF级BALB/c雌性小鼠分成6组，分别为正常组、模型组和实验组，其中，实验组包括灌胃罗伊氏乳杆菌CCFM1040的L.reuteri CCFM1040预防组、罗伊氏乳杆菌CCFM1072的CCFM1072预防组、灌胃罗伊氏乳杆菌1的L.reuteri1预防组和灌胃罗伊氏乳杆菌2的L.reuteri2预防组，每组6只，饲养在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX(所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共6周(每周5天)，第2-6周进行造模，每天对模型组和实验组小鼠均麻醉滴鼻25μg/10μL的HDM(屋尘螨提取物)，正常组仅滴10μL无菌生理盐水作为对照。
第1-6周，实验组每天灌胃0.25mL(活菌数为1×109CFU)的CCFM1072，L.reuteri1和L.reuteri2菌悬液，正常组和模型组仅灌胃0.25mL无菌生理盐水作为对照，所有分组均为自由饮水和摄食。
实验结束后，麻醉处死小鼠，放于解剖盘上，固定头部和四只，解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，结扎右肺，用留置针进行气管插管，以1mL注射器吸取0.3mL预冷的PBS，灌洗小鼠左肺，进行3次，回收量≥80％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。于离心机上，4℃，1000rpm，5min，收集上清液，分装于Eppendorf管中，冻存-20℃，通过ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的IL-5的含量，肺泡灌洗液中的IL-5的含量检测结果见图3，
如图3所示，小鼠在喂食本发明中的菌株CCFM1072后，肺泡灌洗液中IL-5的含量较模型组显著降低了71％(p＜0.05)，且与正常组无显著性差异，优于CCFM1040和L.reuteri2，分别降低了60％和40％，说明本发明中的菌株，能够抑制Th2反应；而罗伊氏乳杆菌L.reuteri1组肺泡灌洗液中IL-5的含量与模型组并无显著差异，仅降低了13％。
综合上述实验结果，罗伊氏乳杆菌CCFM1072能显著下调哮喘小鼠肺泡灌洗液中典型上调Th2相关的细胞因子至正常水平，显著优于另外三株罗伊氏乳杆菌CCFM1040、L.reuteri1和L.reuteri2。
实施例6：罗伊氏乳杆菌对变应性哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-13的影响
具体步骤如下：
将6周大的SPF级BALB/c雌性小鼠分成5组，分别为正常组、模型组和实验组，其中，实验组包括灌胃罗伊氏乳杆菌CCFM1072的CCFM1072预防组、灌胃罗伊氏乳杆菌1的L.reuteri1预防组和灌胃罗伊氏乳杆菌2的L.reuteri2预防组，每组6只，饲养在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX(所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共6周(每周5天)，第2-6周进行造模，每天对模型组和实验组小鼠均麻醉滴鼻25μg/10μL的HDM(屋尘螨提取物)，正常组仅滴10μL无菌生理盐水作为对照。
第1-6周，实验组每天灌胃0.25mL(活菌数为1×109CFU)的CCFM1072，L.reuteri1和L.reuteri2菌悬液，正常组和模型组仅灌胃0.25mL无菌生理盐水作为对照，所有分组均为自由饮水和摄食。
实验结束后，麻醉处死小鼠，放于解剖盘上，固定头部和四只，解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，结扎右肺，用留置针进行气管插管，以1mL注射器吸取0.3mL预冷的PBS，灌洗小鼠左肺，进行3次，回收量≥80％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。于离心机上，4℃，1000rpm，5min，收集上清液，分装于Eppendorf管中，冻存-20℃，通过ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的IL-13的含量，肺泡灌洗液中的IL-13的含量检测结果见图4。
如图4所示，小鼠在喂食本发明中的菌株CCFM1072后，肺泡灌洗液中IL-13的含量降低了58％，较模型组显著降低(p＜0.05)，且与正常组无显著性差异，说明本发明中的菌株，能够抑制Th2反应；而罗伊氏乳杆菌L.reuteri1和L.reuteri2组肺泡灌洗液中IL-13的含量仅降低15％和37％与模型组并无显著差异。
综合上述实验结果，罗伊氏乳杆菌CCFM1072能显著下调哮喘小鼠肺泡灌洗液中典型上调Th2相关的细胞因子至正常水平，尤其是降低能刺激气道上皮细胞产生大量粘液的IL-13水平，显著优于另外两株罗伊氏乳杆菌L.reuteri1和L.reuteri2。
实施例7：罗伊氏乳杆菌对变应性哮喘小鼠肠道中丙酸的影响
具体步骤如下：
将6周大的SPF级BALB/c雌性小鼠分成6组，分别为正常组、模型组和实验组，其中，实验组包括灌胃罗伊氏乳杆菌CCFM1072的CCFM1072预防组、灌胃罗伊氏乳杆菌CCFM1040的L.reuteri CCFM1040预防组、灌胃罗伊氏乳杆菌1的L.reuteri1预防组和灌胃罗伊氏乳杆菌2的L.reuteri2预防组，每组6只，饲养在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX(所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共6周(每周5天)，第2-6周进行造模，每天对模型组和实验组小鼠均麻醉滴鼻25μg/10μL的HDM(屋尘螨提取物)，正常组仅滴10μL无菌生理盐水作为对照。
第1-6周，实验组每天灌胃0.25mL(活菌数为1×109CFU)的CCFM1072，L.reuteri1和L.reuteri2菌悬液，正常组和模型组仅灌胃0.25mL无菌生理盐水作为对照，所有分组均为自由饮水和摄食。
实验结束后，麻醉小鼠，解剖腹腔，取盲肠内容物于干净的离心管中，冻存于-20℃
通过GC-MS检测盲肠内容物中丙酸的含量，检测结果见图5，丙酸各组平均含量(μM/g)：空白4.05，模型5.01，CCFM1072 7.77，CCFM 1040 3.87，L.reuteri1 5.35，L.reuteri2 3.12。
如图5所示，小鼠在喂食本发明中的菌株CCFM1072后，盲肠内容物中丙酸的含量较模型组显著升高了55％(p＜0.05)，显著高于空白和模型组，而罗伊氏乳杆菌L.reuteri2组未见显著升高，CCFM1040和L.reuteri1两组反而分别降低了50％和42％。说明本发明中的菌株CCFM1072，能够促进肠道中丙酸的产生。
综合上述实验结果，罗伊氏乳杆菌CCFM1072显著上调了短链脂肪酸中的丙酸的含量。在促进肠道产生丙酸的方面，罗伊氏乳杆菌CCFM1072显著优于L.reuteri1和L.reuteri2。
实施例8：含有罗伊氏乳杆菌CCFM1072固体饮料的制备
将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072菌粉。
将含有109CFU的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072菌粉同麦芽糊精进行混合，CCFM1072菌粉和麦芽糊精总质量为1克，得到富含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的固体饮料。
取10克(相当于共灌1010CFU)上述含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的固体饮料，用生理盐水复溶，定容到20毫升，每只小鼠每天灌胃200微升，连续两周，可有效降低变应性哮喘小鼠血清中总IgE的含量、肺组织中炎症细胞浸润、炎性细胞因子的产生，提高肠道中丙酸的含量，在缓解变应性哮喘有极好的效果。
实施例9：含有罗伊氏乳杆菌CCFM1072的牛乳的制备
具体步骤如下：
将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬至菌浓度达到1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将悬浮液于37℃下放置60min进行预培养后采用冻干法冻干，得到罗伊氏乳杆菌CCFM1072发酵剂；其中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解；所述培养基的pH为6.8；
将脱脂乳在95℃热杀菌20min，然后冷却至4℃，加入罗伊氏乳杆菌CCFM1072发酵剂，使乳脱脂奶中罗伊氏乳杆菌CCFM1072活菌浓度达到1×109CFU/mL，在4℃下冷藏保存，得到含有罗伊氏乳杆菌CCFM1072活菌的牛乳。
取200微升含有罗伊氏乳杆菌CCFM1072活菌的牛乳，对小鼠进行灌胃连续3周，可有效降低变应性哮喘小鼠血清中总IgE的含量、肺组织中炎症细胞浸润、炎性细胞因子的产生，提高肠道中丙酸的含量，在缓解变应性哮喘有极好的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<120> 一株可缓解变应性哮喘Th2反应的罗伊氏乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1065
<212> DNA
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 1
gcaaatttgt tccgccttag gcggctccct ccataaaggt taggccaccg actttgggcg 60
ttacaaactc ccatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120
gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc gacttcgtgt aggcgagttg cagcctacag 180
tccgaactga gaacggcttt aagagattag cttactctcg cgagtttgcg actcgttgta 240
ccgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatc tgacgtcgtc 300
cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt ctcactagag tgcccaactt aatgctggca 360
actagtaaca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacgacca tgcaccacct gtcattgcgt ccccgaaggg aacgccttat ctctaaggtt 480
agcgcaagat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgtagc ttcgaattaa accacatgct 540
ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc 600
caggcggagt gcttaatgcg ttagctccgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta 660
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tcgagcctca gcgtcagttg cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata 780
tatctacgca ttccaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtcgc 840
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ggctgctggc acgtagtagc cgtgactttc tggttggata ccgtcactgc gtgaacagtt 1020
actctcacgc acgtcttctc aacaacagag ctttacgagc cgaaa 1065

Claims (7)

1.一株罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60735，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072在制备预防、缓解、改善和/或治疗变应性哮喘的产品中的应用；所述产品为食品和/或药品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品中，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的活菌数为不低于1×106CFU/mL。
4.含有权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的组合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物组合物，含有药物载体和/或药用辅料。
6.含有权利要求1所述罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1072的食品。
7.一种发酵剂，其特征在于，制备方法为：将权利要求1所述罗伊氏乳杆菌按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，35～37℃下培养12～24h，收集菌体，用冻干保护剂重悬，再采用真空冷冻法进行冻干，得到罗伊氏乳杆菌的发酵剂。
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