CN110642857B - 一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针及其制备与应用，双功能荧光探针结构式如式I所示：

该双功能荧光探针用于溶液或细胞内粘度和pH检测。本发明制备并提供了能检测粘度和pH的双功能探针；能对溶液粘度进行定量检测；可用于细胞中的粘度和pH值变化检测，为研究细胞中粘度和pH的生理作用提供了新的检测技术手段。

Description

一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针及其制备与应用

技术领域

本发明涉及荧光探针领域，具体地，涉及到一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

细胞内液体的稳定性是活细胞正常活动的基础，细胞内液体的异常变化与许多功能障碍和疾病有关。特别是，细胞内液体黏度在控制许多扩散介导的细胞过程中起着至关重要的作用，包括信号和运输。此外，细胞内黏度已被证明是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、阿尔茨海默病以及细胞恶性肿瘤的明确诱因。

细胞内pH在酶活性、凋亡、吞噬和肿瘤生长等许多生物学生理过程中起着重要作用。哺乳动物细胞的细胞内pH值范围从酸性pH值(4.5-5.5)线粒体到线粒体中略碱性的pH值(8.0)。哺乳动物的细胞pH值的异常会导致细胞功能紊乱，导致多种疾病(包括癌症和阿尔茨海默病等)的发生。

近年来，荧光探针技术由于其高灵敏度、操作简单、生物样本损伤性小的优点被广泛应用于细胞/组织中活性物质或者内环境的检测。然而，目前能够具有检测粘度和pH的双功能探针还是稀缺的。

发明内容

本发明设计制备了检测粘度和pH的双功能荧光探针，为研究细胞甚至组织内粘度和pH的关系提供了新型的有力分析工具，具有十分重要的意义。

本发明提供一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针,结构式如式I所示：

本发明还提供一种所述的双功能荧光探针的制备方法，包括：

惰性气体保护下，将式II所示化合物、式III所示化合物、甲醇钠加入溶剂中反应，反应液分离纯化即得；

反应式如下：

可选的，式II所示化合物、式III所示化合物和甲醇钠的物质的量之比为1:1-1.2：0.2-0.4。

可选的，式II所示化合物、式III所示化合物和甲醇钠的物质的量之比为1:1.2：0.2。

可选的，所述分离纯化方法可如下：将反应液减压浓缩去除溶剂，粗产品以乙酸乙酯/石油醚(v/v，1:5)混合液为展开剂，利用柱层析进行纯化，得到目标荧光探针(I)。

本发明化合物(III)为公开的化合物，其制备方法可参考文献(Wu Y Y,Yu W T,Hou T C,et al.A selective and sensitive fluorescent albumin probe for thedetermination of urinary albumin[J].Chemical Communications,2014,50(78):11507-11480.)。

化合物(II)市购获得。

可选的，所述溶剂为乙腈。

可选的，反应条件为：30℃～40℃搅拌反应12h～14h。

本发明还提供一种如所述的双功能荧光探针在溶液或细胞内粘度检测中的应用。

应用于溶液粘度检测时，可对溶液中的粘度进行定量检测，检测方法包括：

将所述双功能荧光探针加入待测溶液中，反应结束后在激发波长为480nm，发射波长为535nm下采集反应液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的粘度。

可选的，荧光探针在待测溶液中的加入量以荧光探针的摩尔量与溶液中粘度比计为：0.005mM荧光探针：粘度100～950CP溶液。

可选的，标准曲线的制备如下：

将0.005mM荧光探针分别与粘度在100～950CP内的溶液反应，激发波长为480nm，发射波长为535nm下采集反应液的荧光强度，以ln(荧光强度)为纵坐标、log(溶液粘度)为横坐标，绘制即得线性标准曲线。

可选的，检测时溶液的pH在7.4左右。

应用于细胞内粘度检测时，可对细胞内粘度进行定性检测，检测方法包括：

将荧光探针与待测细胞共培育后进行荧光检测，通过荧光亮度变化定性检测细胞内粘度变化。

本发明还提供一种如所述的双功能荧光探针在溶液或细胞内pH检测中的应用。

可选的，所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。

双功能荧光检测原理为：

粘度检测原理：式(I)所示的荧光探针，在具有一定粘度的溶液中，会限制结构碳碳单键的旋转，从而减少探针的非辐射能量，实现荧光由关到开的变化。

pH检测原理：苯并咪唑上的氮原子质子的得失影响探针(I)的荧光强度。

相比于现有技术，本发明的有益效果至少体现在：

(1)本发明制备并提供了能检测粘度和pH的双功能探针；

(2)本发明的荧光探针能对溶液粘度进行精准的定量检测；

(2)本发明的荧光探针可用于细胞中的粘度和pH值变化检测，为研究细胞中粘度和pH的生理作用提供了新的技术手段。

附图说明

图1为实施例1制备的探针(I)的核磁氢谱。

图2为实施例1制备的探针(I)的核磁碳谱。

图3为实施例1制备的探针(I)加入到PBS缓冲液和Gly/PBS缓冲液(v/v＝9:1)中的紫外-可见光吸收光谱图。

图4为实施例1制备的探针(I)在Gly/PBS缓冲液(v/v＝1:9至9:1)中的荧光发射光谱图(pH＝7.4)。

图5为实施例1制备的探针(I)在Gly/PBS缓冲液(v/v＝1:9至9:1)中的线性关系图(pH＝7.4)。

图6为实施例1制备的探针(I)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下，相关生物活性物质的荧光干扰测试的荧光强度。

图7为实施例1制备的探针(I)在DMSO/不同pH缓冲液(v/v＝1/99)条件下的紫外-可见光吸收光谱图。

图8为实施例1制备的探针(I)在DMSO/不同pH缓冲液(v/v＝1/99)条件下的荧光发射光谱图。

图9为实施例1制备的探针(I)在DMSO/不同pH缓冲液(v/v＝1/99)条件下在540nm处荧光强度的拟合曲线。

图10为实施例1制备的探针(I)的细胞粘度成像图。

图11为实施例1制备的探针(I)的细胞pH成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：探针(I)的制备

化合物II购自于安耐吉公司。

化合物III为公开的化合物，本实施例中直接参考文献(Wu Y Y,Yu W T,Hou T C,et al.A selective and sensitive fluorescent albumin probe for thedetermination of urinary albumin[J].Chemical Communications,2014,50(78):11507-11480.)中的方法制备。

在惰性气体(氮气)保护下，将化合物II、化合物III和甲醇钠加入到乙腈溶剂中，化合物II、化合物III和甲醇钠物质的量之比为1:1.2:0.2，其中化合物II为1mmol，乙腈的用量10mL，在35℃搅拌反应12h，将反应物减压浓缩，通过使用乙酸乙酯/石油醚(v/v，1：5)的二氧化硅柱层析进行纯化，即得探针(I)(收率60％)，其核磁氢谱参见图1，核磁碳谱参见图2。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.78(d,J＝13.0Hz,2H),7.63–7.43(d,J＝12.0Hz,,2H),7.06(m,2H),6.84(m,1H),3.39–3.31(m,4H),2.96(t,J＝6.4Hz,2H),2.82(t,J＝6.2Hz,2H),2.06–1.99(m,4H).¹³C NMR(500MHz,CDCl₃)δ168.78,163.08,133.13,130.59,130.17,129.30,128.99,128.87,128.80,126.83,124.36,123.11,112.34,98.31,77.29,77.23,77.03,76.78,49.77,29.07,20.92。

实施例2：探针(I)(5μM)在PBS和体积分数为90％的甘油中的紫外-可见光吸收光谱测试。

准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL甘油/PBS缓冲液(甘油/PBS，v:v，1:9)中，再加入到96孔板中，然后测定探针(I)的紫外-可见光吸收光谱。

荧光图谱见图3。实验结果表明，当缓冲液粘度提高时，探针(I)在480nm处的吸收不断增强，说明探针(I)对粘度具有识别作用。

实施例3：探针(I)在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)，pH＝7.4的条件下，探针的荧光强度随粘度的变化的荧光性能测试。

准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同粘度值的PBS缓冲液(最终粘度的值分别100，200，300，400，500，600，700，800，950)，在37℃下加入到96孔板中，然后测定探针(I)的荧光强度的变化，并做相关线性曲线。

荧光图谱见图4、5。数据表明，随着缓冲液粘度的增加，在激发波长为480nm，发射波长为535nm处荧光强度提升接近100倍。同时将ln(荧光强度)为纵坐标，log(粘度)为横坐标做线性关系图可以发现，两者具有很好的线性关系(R²＝0.98)，证明了探针具有良好的检测效果。

实施例4：本发明中的探针(I)(5μM)在DMSO/PBS缓冲液(pH＝7.4，v/v＝1/199)条件下荧光专一性测试

准确称取一定量化合物(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.394mL，随后分别加入4μL生物相关干扰物水溶液(1-12分别为PBS、铜离子、钙离子、锌离子、铁离子、葡萄糖、谷胱甘肽、同型半胱氨酸、半胱氨酸、硫酸氢钠、双氧水、叔丁基过氧化氢、甘油，最终浓度均为1mM)，37℃下测定其荧光值。荧光激发波长为480nm，发射波长为530nm。

荧光图谱见图6。实验结果表明，除了甘油，化合物(I)在其它相关生物活性分子存在下荧光强度基本没有显著的变化，表明其检测专一性好。

实施例5：本发明中探针(I)(5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)条件下，在不同pH值情况下，紫外-可见光吸收光谱的测试

准确称取一定量实施例1制备的化合物(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(使最终pH在缓冲液的值分别从2到10.5)，加入到96孔板中，测试其紫外-可见光吸收强度的变化。

荧光图谱见图7。数据表明，化合物(I)对pH具有较强的敏感性。在酸性条件下，其最佳吸收峰值在360nm处，随着pH的逐渐增加，其吸收强度在处逐渐升高。说明探针(I)对pH具有识别作用。

实施例6：本发明中的探针(I)(5μM)，在DMSO/PBS缓冲液(v/v＝1/199)条件下，在不同pH值情况下，进行荧光性能的测试

准确称取一定量探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取2μL加入到0.398mL不同pH值的PBS缓冲液(使最终pH在缓冲液的值分别从2到10.5)，加入到96孔板中，测试其荧光强度。激发波长为430nm。

荧光图谱见图8、9。数据表明，探针(I)对pH具有识别作用，随着pH的逐渐增加，其发射波长逐渐在540nm处升高并做pH和探针(I)在540nm处的荧光强度拟合曲线，经计算，pKa＝8.13，说明探针(I)对pH具有响应能力。

实施例7:本发明中的探针(I)在细胞中粘度检测的应用。

准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mL DMEM培养基中。空白组：取1mL含有探针(I)的培养液加入到Hela细胞中，37℃下孵化0.5h，用PBS洗涤两次，实验组：用商品化的制霉菌素(Nystatin)，37℃下孵化20min，PBS洗涤两次，然后取1mL含有探针(I)的培养液加入到Hela细胞中，用PBS洗涤两次，最终用奥林巴斯Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行细胞成像。共聚焦显微镜的激发波长为488nm，发射接收波长范围为520～600nm。

荧光图谱见图10。实验结果表明，未处理的细胞的平均荧光强度为14.069，在加入制霉菌素改变细胞内粘度之后，平均荧光强度为37.646，表明探针(I)可以检测Hela细胞内粘度的变化。

实施例8:本发明中的探针(I)在细胞中pH检测的应用。

准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液。利用尼日利亚菌素(0.5μmol)DMEM(pH分别为6、9)将细胞在37℃孵化20min。随后加入2μL探针母液进行孵化，孵化半小时后用1mL PBS缓冲液洗涤两次，最终用奥林巴斯Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。图10为细胞共聚焦荧光成像效果图：激发波长为405nm，发射接收波长范围为530–600nm。

荧光图谱见图11。实验结果表明，pH为9时的细胞荧光强度高于pH为6的细胞荧光强度，说明探针(I)可以检测细胞内pH的变化。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.如式I所示的双功能荧光探针在制备溶液或细胞内pH值检测试剂中的应用；

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