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CN110628823B - 一种cd30 car慢病毒表达载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种cd30 car慢病毒表达载体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110628823B CN201910999876.4A CN201910999876A CN110628823B CN 110628823 B CN110628823 B CN 110628823B CN 201910999876 A CN201910999876 A CN 201910999876A CN 110628823 B CN110628823 B CN 110628823B
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Abstract

本发明公开了一种CD30 CAR慢病毒表达载体及其制备方法和应用，所述CD30 CAR慢病毒表达载体包括CD30抗体的重链和轻链，所述CD30 scFv基因片段，其基因序列包括SEQ ID NO：1。本发明成功制备了CD30 CAR慢病毒表达载体，并证明CD30 CAR慢病毒表达载体能够用于制备抑制T细胞淋巴瘤的CAR‑T细胞药物。

Description

一种CD30 CAR慢病毒表达载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于慢病毒表达载体技术领域，具体涉及一种CD30 CAR慢病毒表达载体及其制备方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)，是一种治疗肿瘤的新型精准靶向细胞疗法，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤细胞免疫治疗方法。T淋巴细胞，是人体白细胞的一种，来源于骨髓造血干细胞，在胸腺中成熟，然后分布到人体血液、淋巴和周围组织器官，发挥免疫功能。
2017年美国FDA批准了第一例用于癌症的CAR-T治疗方法，即Tisagenlecleucel用于儿童及年轻成人复发及耐药的ALL患者的治疗。Axicabtagene ciloleucel是美国FDA批准的用于成人特定种类的非霍奇金淋巴瘤，包括弥漫大B细胞淋巴瘤，原发纵隔的B细胞淋巴瘤，转化的滤泡淋巴瘤的CAR T细胞疗法。
CAR-T细胞的嵌合抗原受体(CAR)的是由细胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区组成。其中嵌合抗原受体针对肿瘤相关抗原，因此具有高度特异性，且不受主要组织相容性复合物(MHC)的限制，因此肿瘤抗原亦不受种类的限制，除可选择蛋白多肽外，还包括神经节苷脂、有机糖类抗原等。
目前的CAR-T药物主要针对B细胞淋巴瘤，而针对T细胞淋巴瘤的CAR-T药物鲜有研究。复发难治的外周T细胞淋巴瘤的治疗仍然是需要攻克的难题，因此开发一种针对复发难治的外周T细胞淋巴瘤的治疗药物是有待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明提供一种CD30 CAR慢病毒表达载体，其中：所述CD30 CAR慢病毒表达载体包括CD30抗体的重链和轻链所组成的CD30 scFv基因片段，所述CD30 scFv基因片段，其基因序列包括SEQ ID NO：1。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：所述慢病毒表达载体，包括CD30 scFv基因片段和pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP载体。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：所述CD30CAR慢病毒表达载体基因序列如SEQ ID NO：2所示。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：包括，
将CD30抗体的重链和轻链与单链可变区片段scFv连接，构成CD30 scFv基因片段；
将所述CD30 scFv基因片段与CD8aSP、4-1BB胞内信号区及CD3ζ基因序列相串联，得到CD30 CAR基因序列；
将所述CD30 CAR基因序列与pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP载体连接,得到所述CD30CAR慢病毒表达载体，所述CD30 CAR慢病毒表达载体基因序列如SEQ ID NO：2所示。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：所述将CD30抗体的重链和轻链与单链可变区片段scFv连接，包括将CD30抗体的重链与轻链分别与克隆载体pMD18-T Vector连接并分别进行PCR扩增。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：所述将CD30抗体的重链与轻链分别与克隆载体pMD18-T Vector连接并分别进行PCR扩增，其中，所述PCR扩增的反应体系为：MVH Mix或MVL Mix 45μL、DNA Polymerase 0.3μL、CD30抗体的重链或轻链引物1μL，ddH2O 3.7μL。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：所述将CD30 CAR基因序列与pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP载体连接，包括用XbaI和BamHI分别对所述CD30 CAR基因序列和pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP进行双酶切，37℃酶切过夜，加入10×Loading Buffer 5μL，1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，并凝胶回收目的条带，连接过夜。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：所述CD30抗体，来源于CD30单克隆抗体杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCC NO：C201861。
作为本发明所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的一种优选方案：还包括，所述CD30单克隆抗体杂交瘤细胞的RNA提取及cDNA合成。
作为本发明的另一个方面，本发明提供所述的CD30 CAR慢病毒表达载体在制备抗淋巴瘤CAR-T细胞药物中的应用，其中：所述淋巴瘤，包括外周T细胞淋巴瘤。
本发明的有益效果：本发明成功筛选出特异性良好的CD30 scFv,并制备了CD30CAR慢病毒表达载体，证明CD30 CAR慢病毒表达载体能够用于制备抑制淋巴瘤CAR-T细胞药物，具有显著的治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为CD30 CAR慢病毒表达载体结构示意图。
图2为CD30 CAR慢病毒表达载体的酶切鉴定图。
图3为慢病毒感染后CD30 CAR-T/T细胞增值及细胞表面分子表达情况图。
图4为流式细胞术检测慢病毒感染后T细胞表面CD30表达情况图。
图5为LDH释放实验检测三种CD30 CAR-T细胞杀伤率图。
图6为RTCA法检测CD30 CAR-T细胞的体外杀伤能力图。
图7为CD30 CAR-T体内对外周T细胞淋巴瘤的抑制效果和CD30 CAR-T体内对TNF-α、INF-γ和GM-CSF水平的影响。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
抗CD30单链抗体scFv序列的获取与CD30 CAR慢病毒表达载体构建与表达：
实验材料：
实验细胞株：杂交瘤细胞(保藏编号为CCTCC NO：C201861，为已公开细胞株)。
工具细胞293T细胞(本实验室保存)
大肠杆菌：E.coli DH5α(本实验室保存)
载体：pMD18-T Vector(南京PPL公司购买)
溶液配制：
慢病毒转染试剂的准备：
配制0.25M的CaCl2溶液：1.47g CaCl2粉末溶于去离子水中，定容至40mL，灭菌；
配制5M的NaCl溶液：14.61g的NaCl粉末溶于去离子水中，定容至50mL；
配制1M的BES溶液；
配制1M的Na2HPO4溶液；
2×BBS溶液的配制：将5.6mL的5M的NaCl溶液、5.0mL的1M BES溶液、150μL的1MNa2HPO4溶液加入到80mL水中，用NaOH调节PH为6.95±0.02，去离子水定容到100mL，过滤除菌。
实验方法：
1、杂交瘤细胞RNA的提取：
使用QIAGEN公司RNeasy Mini Kit试剂盒：
杂交瘤细胞(CCTCC NO：C201861)加入到PBS溶液中，300g离心10min；
弃上清，加入700μL RLT，得到细胞裂解液；
从细胞裂解液中吸取350μL悬液，震荡；
加入350μL的70％的乙醇，混匀；
上柱300g离心15s，弃废液；
向柱子中加入700μL的Buffer RW1，300g离心15s；
向柱子中加入500μL的Buffer RPE，300g离心15s；
再向柱子中加入500μL的Buffer RPE，300g离心2min；
300g空转1min；加入50μL的DEPC水溶解RNA。
2、cDNA合成：
使用Roche公司Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit提取cDNA。
(1)反应体系：
65℃变性10min
反应体系：
组分 体积
细胞总RNA 5μL
oligodT 1μL
dNTPs Mix 1μL
DEPC水 补足至10μL
(2)准备混合液：
混合液成分体系：
组分 体积
10×RT buffer 2μL
0.1M DTT 2μL
RNaseOUT(40U/μL) 1μL
25mM MgCl<sub>2</sub> 4μL
SuperScriptⅢ 1μL
50℃水浴锅加热50min；
85℃水浴锅加热5min；
冰浴，-20℃保存。
3、PCR扩增单克隆抗体CD30的重链(VH)和轻链(VL)：
(1)将10μg上述制备的cDNA作为模板，扩增单克隆抗体CD30的重链(VH)和轻链(VL)：
PCR扩增体系：
PCR扩增体系：
组分 体积
cDNA模板 0.2μL
10×EX Buffer 5μL
dNTP 4μL
primer-F(10pM) 2μL
primer-R(10pM) 2μL
EX Taq 0.5μL
DEPC水 36.3μL
重链扩增引物：
MVH-F:GGCCAGTGGATAGTCAGATG
MVH-R:GAGGTGCAGCTGAAGGAGTC
轻链扩增引物：
MVK-F:GGATACAGTTGGTGCAGCATC
MVK-R:GATGTTTTGATGACCCAAACT
PCR反应条件：
Figure BDA0002240958430000061
将PCR的产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，进行割胶回收(QIAGEN胶回收试剂盒)。
(2)克隆抗体CD30的重链(VH)和轻链(VL)的克隆及测序：
将切胶回收的克隆抗体CD30的重链(VH)和轻链(VL)DNA分别与克隆载体pMD18-TVector连接，室温下反应5min；反应体系如下：
连接反应体系：
Figure BDA0002240958430000062
Figure BDA0002240958430000071
将连接产物分别转化感受态细胞DH5α，次日挑选单克隆菌落送测序；
测序结果正确后，进行克隆，提取质粒。
(3)克隆抗体CD30的重链(VH)和轻链(VL)基因片段的连接与扩增(使用PPL公司的小鼠抗体ScFv基因扩增试剂盒)：
反应体系如下：
反应体系：
Figure BDA0002240958430000072
PCR反应条件如下：
Figure BDA0002240958430000073
琼脂凝胶电泳，割胶回收大小为330bp左右的条带。
(4)将CD30的重链(VH)和轻链(VL)进行连接构成CD30 scFv段：
按下列组分配制反应体系(50μL体系)
连接反应体系：
组分 体积
scFv Mix(scFv连接扩增体系) 45μL
DNA Polymerase 0.3μL
V<sub>H</sub> 1μL
V<sub>L</sub> 1μL
ddH<sub>2</sub>O 2.7μL
PCR反应条件如下：
Figure BDA0002240958430000081
PCR产物过2％琼脂后，回收大小为700bp左右的条带，割胶回收后，进行克隆；目的条带经回收后克隆到pMD18-TVector载体；
按下表配置反应体系：
目的条带与载体连接体系：
组分 体积
V<sub>L</sub>或V<sub>H</sub>基因片段 4μL
pMD18-T Vector 1μL
SolutionⅠ 5μL
将每个PCR的回收片段按照上述体积，进行连接体系的配置，室温下反应5min；转化DH5α细胞；涂氨苄抗性的平皿，次日挑菌送单克隆送测序。
Lenti-2G.CAR-CD30的设计与构建：
CD30 CAR基因序列的结构设计与构建：
将CD30 scFv与Genebank(NCBI)中CD8a铰链区-跨膜区，即CD8aSP(Signalpeptide)，4-1BB胞内信号区及CD3ζ基因序列相串联。
CD30 CAR基因序列与载体pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP的连接：
通过XbaI和BamHI内切酶，将构建好的CD30 CAR基因序列克隆入pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP慢病毒表达载体，得到本发明CD30 CAR慢病毒表达载体；CD30 CAR慢病毒表达载体图谱如图1所示；
将3μg pMD2G、6μg psPAX及7.5μg的所述CD30 CAR慢病毒表达载体加入到150μL的OPTI-MEM中混匀，之后加入到500μL含有25μL Lipo 2000的OPTI-MEM中，室温静置15min后，加入到培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱内培养12h，之后转染293T细胞扩增并收集慢病毒，得到的慢病毒命名为Lenti-2G.CAR-CD30。
(1)用XbaI和BamHI对质粒pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP进行双酶切，37℃，酶切过夜，反应体系如下：
质粒酶切体系：
名称 体积
10×Buffer M 2μL
XbaI 1μL
BamHI 1μL
pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP 1μL
ddH<sub>2</sub>O 补足至20μL
(2)加入10×Loading Buffer 5μL，1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，并回收凝胶中的目的条带；
(3)用XbaI和BamHI对合成的包含CD30 CAR基因序列的pMD18-T Vector进行双酶切；
(4)将酶切回收后的pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP片段和CD30 CAR基因序列酶切产物进行连接，具体连接反应体系如下：
连接反应体系：
组分 体积
10×Buffer 1μL
pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP的酶切片段 1μL
CD30 CAR基因序列 6.4μL
T4连接酶 6.4μL
PEG<sub>4000</sub> 1μL
反应条件：轻轻混匀后，16℃，过夜。
鉴定：
(5)连接产物的转化
将过夜连接的混合液直接转化Stbl3感受态细胞。将转化好的Stbl3感受态细胞加入LB液体培养基摇菌后，涂LB平板，37℃培养箱倒置培养过夜。
(6)重组质粒的扩增与提取
转化16h后，选取3个单菌菌落，分别接种至5mL LB氨苄抗性培养基中，培养液中氨苄终浓度为100μg/mL，37℃振荡培养过夜，次日提取质粒。
(7)DNA测序鉴定
将提取的质粒委托南京质粒与蛋白共享库(PPL)公司进行DNA测序鉴定。经鉴定符合要求，即获得含有CD30 CAR的基因片段的慢病毒表达载体。
实验结果：
CD30 CAR慢病毒表达载体的扩增与鉴定：
通过XbaI和BamHI双酶切位点对本发明慢病毒表达载体进行双酶切验证，结果显示：包括scFv段在内的CD30 CAR序列的片段大小与预期相一致，约为1000bp(图2)。
CD30重链(VH)、轻链(VL)条带的测序结果：
本发明研究发现，从杂交瘤细胞株CCTCC NO：C201861分泌的CD30抗体中，鉴定出多条不同的CD30抗体的重链(VH)和轻链(VL)：
CD30抗体的VH序列分析结果如下：
VH(重链)具体序列
CDR1 CDR2 CDR3
V<sub>H</sub>-1 GFSLTSHG IWSDGSTA AREPPTTYVCL
V<sub>H</sub>-2 GFSLTSYG IWSDGSTA AREPPTTYVCL
V<sub>H</sub>-3 GYTFTNYD IYPGDGTA ARGDGFDY
V<sub>H</sub>-4 GFSLSRYS IWGGGIT ARKYGLDYDGAMDY
CD30抗体的VL序列分析：
VL(轻链)具体序列
CDR1 CDR2 CDR3
V<sub>L</sub>-1 KSVSTSGYSY LVS QHIRELTR
V<sub>L</sub>-2 KSVSTSGYSY LVS QHIRELTL
V<sub>L</sub>-3 DNVHTY GAS GQSYRYPPT
V<sub>L</sub>-4 DNVHTY GAS GQSYRYPLT
CD30 CAR基因序列：
按照CD30抗体的不同重链与轻链的组合构建Lenti-2G.CAR-CD30：
将重链为VH-4、轻链为VL-3组合的CD30抗体命名为9C11-1，将重链为VH-4、轻链为VL-4组合的CD30抗体命名为9C11-2，将重链为VH-4、轻链为VL-1组合的CD30抗体命名为9C11-3。其余CD30抗体的重链与轻链组合由于经实验证明抗体效价较低而被排除。
本发明涉及的慢病毒表达载体中的序列如下：
(1)Signal peptide(SP)：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg
(2)CD8αTM
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(3)41BB
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
(4)CD3ζ
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
(5)CD30 scFv(9C11-1)
gaggtgaaactgcagcagtctggacctggcctggtggcaccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctctgggttctcattatccagatatagtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtggtggaatcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaacaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatactactgtgccagaaagtatgggttggattacgacggtgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccgacatccagatgacccagtctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcaccttgagctgcaaggccactgacaatgtgcatacttatgtatcctggtatcaacaaaaaccagagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtacactggggtccccgatcgcttcacaggcagtggatctgaaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggctgaagaccttgcagattatcactgtggacagagttacaggtatccgcccacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
(6)CD30 scFv(9C11-2)(即SEQ ID NO：1)
gaggtgaaactgcagcagtctggacctggcctggtggcaccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctctgggttctcattatccagatatagtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtggtggaatcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaacaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatactactgtgccagaaagtatgggttggattacgacggtgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccgacatccagatgacccagtctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcaccttgagctgcaaggccactgacaatgtgcatacttatgtatcctggtatcaacaaaaaccagagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtacactggggtccccgatcgcttcacaggcagtggatctgaaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggctgaagaccttgcagattatcactgtggacagagttacaggtatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
(7)CD30 scFv(9C11-3)
gaggtgaaactgcagcagtctggacctggcctggtggcaccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctctgggttctcattatccagatatagtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtggtggaatcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaacaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatactactgtgccagaaagtatgggttggattacgacggtgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccgaaattgtgttgacgcagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaa
(8)本发明慢病毒表达载体(9C11-2)基因序列(即SEQ ID NO：2)：
acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatactagtattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagattctagagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgaaactgcagcagtctggacctggcctggtggcaccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctctgggttctcattatccagatatagtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatggggtggtggaatcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcaacaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatatactactgtgccagaaagtatgggttggattacgacggtgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggcggcggcggctccgacatccagatgacccagtctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcaccttgagctgcaaggccactgacaatgtgcatacttatgtatcctggtatcaacaaaaaccagagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtacactggggtccccgatcgcttcacaggcagtggatctgaaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcaggctgaagaccttgcagattatcactgtggacagagttacaggtatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaactcgagaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaaggatccgcggccgcgaaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctacgctagacgccaccatggagagcgacgagagcggcctgcccgccatggagatcgagtgccgcatcaccggcaccctgaacggcgtggagttcgagctggtgggcggcggagagggcacccccaagcagggccgcatgaccaacaagatgaagagcaccaaaggcgccctgaccttcagcccctacctgctgagccacgtgatgggctacggcttctaccacttcggcacctaccccagcggctacgagaaccccttcctgcacgccatcaacaacggcggctacaccaacacccgcatcgagaagtacgaggacggcggcgtgctgcacgtgagcttcagctaccgctacgaggccggccgcgtgatcggcgacttcaaggtggtgggcaccggcttccccgaggacagcgtgatcttcaccgacaagatcatccgcagcaacgccaccgtggagcacctgcaccccatgggcgataacgtgctggtgggcagcttcgcccgcaccttcagcctgcgcgacggcggctactacagcttcgtggtggacagccacatgcacttcaagagcgccatccaccccagcatcctgcagaacgggggccccatgttcgccttccgccgcgtggaggagctgcacagcaacaccgagctgggcatcgtggagtaccagcacgccttcaagaccccc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CD30 CAR-T细胞制备：
T淋巴细胞的激活及CD30 CAR T细胞获取；
人T淋巴细胞的培养与激活：调整人外周血单核细胞密度至5×106个细胞/mL，按50μg/mL浓度加入人血白蛋白，以及1000U/mL的细胞因子IL-2、100U/mL的Anti-CD3(OKT3)和CD28抗体，于37℃、5％CO2的培养箱内培养48小时；
慢病毒Lenti-2G.CAR-CD30感染T淋巴细胞：将T细胞分为CD30 CAR组和T细胞空白对照组；按照MOI为5计算感染所需要的病毒量；
计算公式：MOI＝(病毒滴度×病毒液体积)/T细胞数量
将病毒液加入到500μL的含有一定数量T细胞的GT-T551 H3培养基中，随后加入8μg/mL的polybrene，混合均匀后加入到24孔板中，37℃，5％CO2的培养箱内孵育1小时；将上述培养基加到9mL的含有50μg/mL人血白蛋白，1000U/mL的IL-2，100U/mL OKT3和CD28的GT-T551 H3培养基，于37℃，5％CO2培养培养14天。细胞计数仪和流式细胞术检测CD30 CAR T细胞的增值和CD30表达量。
CD30 CAR-T细胞对外周T细胞淋巴瘤细胞株(Karpas299)的杀伤作用是通过LDH乳酸脱氢酶试剂盒检测。
计算杀伤率：
杀伤率＝(实验孔OD值-靶细胞自然释放孔OD值)/(靶细胞最大释放管OD值-靶细胞自然释放管OD值)×100％。
采用实时无标记细胞分析法(RTCA)检测CD30 CAR-T细胞的体外杀伤能力；
采用Luminex液相芯片技术检测上清中细胞因子表达情况；
细胞膜染液PKH26和7-AAD联合检测CD30 CAR-T细胞的杀伤作用。
实验结果：
流式细胞仪检测慢病毒感染后T细胞表面的CD3，CD4，CD8，CD30表达情况：
通过检测慢病毒转染T细胞后，CAR表达的F a’b段和T细胞GFP，CD3，CD4，CD8分子的表达率来确定CD30 CAR T细胞的比例，实验结果如图4，在细胞提取后的第1天，第3天，第5天，第7天，第9天，第11天，第13天随着时间的延长，CD3，CD4，CD8分子的表达呈增加趋势，在第13天时，CD3+T细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞占总细胞的比例分别为88.9％，52.9％，38.4％，CD30的阳性表达率达到53.3％。
CD30 CAR-T细胞的体外增殖情况：
在提取人外周血T淋巴细胞进行体外培养后，分别在第0天，第13天，对无关序列NCCAR-T细胞与CD30 CAR-T细胞进行计数，记录慢病毒转染前后细胞的增殖情况，结果如图4，在第13天时，CD30 CAR-T细胞较第0天相比，扩增约10倍。
LDH乳酸脱氢酶试剂盒检测CD30 CAR-T细胞的杀伤作用：
结果如图5所示，3种不同的CD30 CAR-T细胞对CD30阳性外周T细胞Karpas299具有杀伤作用，当效靶比为40：1时，9C11-2细胞杀伤作用最强，是9C11-3的1.8倍，9C11-1的1.98倍。以下选择9C11-2 CD30 CAR-T(以下简称CD30 CAR-T)细胞进行后续研究。
随着效靶比的不断提升，可以发现在40：1的条件下，对比T细胞，感染慢病毒的CD30 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果明显提高，CD30 CAR-T细胞杀伤率为88.04±1.41，差异有统计学意义(P<0.01)。LDH乳酸脱氢酶释放实验表明，CD30 CAR-T细胞对靶细胞Karpas299具有明显杀伤效果，且在一定的效靶比范围内，该杀伤效果随着效靶比而提高。
RTCA细胞增值实验检测CD30 CAR-T细胞的体外杀伤能力：
将T细胞在体外扩增14天以后，分别按照效靶比20：1和10：1，将靶细胞Karpas299和CD30 CAR-T细胞共培养，观察在两种效靶比下，T细胞和CD30CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果有无变化。结果如图6所示，在效靶比20：1和10：1时，CD30 CAR-T细胞的杀伤效果都要明显高于NC CAR-T细胞(P<0.01)，且在一定范围内，杀伤效果随着效靶比的提高而上升。
Luminex液相芯片技术检测上清中细胞因子TNF-α、IL-2和INF-r的表达情况：
通过检测细胞因子TNF-α、IL-2和INF-r在T上清中的含量来显示CD30CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果，设定效靶比分别为40：1，20：1，10：1，在效靶比40：1和20：1时，细胞因子TNF-α、IL-2和INF-r在上清中的含量大致相同，较效靶比10：1时上升明显，且细胞因子的释放量随着效靶比的升高，在一定范围内也逐步升高。
PKH26染料和7-AAD联合检测CD30 CAR-T细胞的杀伤作用：
将靶细胞Karpas299用PKH26染料进行染色，在与CD30 CAR-T细胞共培养24小时后，在通过7-AAD流式抗体对凋亡的靶细胞进行标记，观察CD30CAR-T细胞的杀伤效果，在40：1，20：1，10：1的效靶比下，CD30 CAR-T细胞的杀伤效果都要高于NC CAR-T细胞，杀伤率分别为78.3％，43.7％和22.6％差异有统计学意义(P<0.01)。其中，40：1的实验组效果最为显著，同时，与之前的实验结果相一致，在一定的范围内，效靶比越高，杀伤效果越明显。
综上，通过LDH乳酸脱氢酶释放实验，RTCA增殖曲线，Luminex液相芯片技术检测TNF-α，IL-2和INF-r在上清中表达量，以及PKH26与7-AAD联合法这四种实验方法，均显示CD30 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果比T细胞有明显提高。
CD30 CAR-T体内对外周T细胞淋巴瘤的抑制：
为研究CD30 CAR-T细胞对于CD30阳性的淋巴瘤的体内抑制作用，取2×106karpas299细胞于100μL PBS中，并与100μL基质凝胶(Life sciences,USA)混合，注射于NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju小鼠(NCG,GemPharmatech)的右后背部，构建小鼠异种肿瘤移植模型，当肿瘤大小达到50mm3时，小鼠静脉注射1×107CD30 CAR-T细胞、或1×107NC CAR-T细胞或生理盐水。用卡尺监测肿瘤大小，计算肿瘤体积为：肿瘤长径×肿瘤宽径2/2。30天后，处死小鼠进行肿瘤组织分析。采用免疫组化方法测定肿瘤组织中TNF-α、INFγ和G-CSF的水平。
CD30 CAR-T细胞能有效抑制肿瘤生长，并具有较高的肿瘤抑制作用(图7)。CD30CAR-T组的TNF-α、INF-γ和G-CSF水平明显高于NC CAR T组和生理盐水组，我们还分析了CD30 CAR T、NC CAR T、生理盐水组小鼠的存活率，结果显示，CD30 CAR-T组小鼠显著延长了存活率。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江苏省肿瘤医院
<120> 一种CD30 CAR慢病毒表达载体及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggtgaaac tgcagcagtc tggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaatcac agactataat 180
tcagctctca aatccagact gagcatcaac aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatact actgtgccag aaagtatggg 300
ttggattacg acggtgctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccgacat ccagatgacc 420
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tatcactgtg gacagagtta caggtatccg ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag 720
ctgaaa 726
<210> 2
<211> 8996
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt 1800
taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc 1860
aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttatcga 1920
tactagtatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1980
gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 2040
tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 2100
ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 2160
caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 2220
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag attctagagc 2280
caccatggcc ttaccagtga ccgccttgct cctgccgctg gccttgctgc tccacgccgc 2340
caggccggag gtgaaactgc agcagtctgg acctggcctg gtggcaccct cacagagcct 2400
gtccatcaca tgcactgtct ctgggttctc attatccaga tatagtgtac actgggttcg 2460
ccagcctcca ggaaagggtc tggagtggct gggaatgata tggggtggtg gaatcacaga 2520
ctataattca gctctcaaat ccagactgag catcaacaag gacaactcca agagccaagt 2580
tttcttaaaa atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc atatactact gtgccagaaa 2640
gtatgggttg gattacgacg gtgctatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt 2700
ctcctcaggt ggtggtggtt ctggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccgacatcca 2760
gatgacccag tctcccaaat ccatgtccat gtcagtagga gagagggtca ccttgagctg 2820
caaggccact gacaatgtgc atacttatgt atcctggtat caacaaaaac cagagcagtc 2880
tcctaaactg ctgatatacg gggcatccaa ccggtacact ggggtccccg atcgcttcac 2940
aggcagtgga tctgaaacag atttcactct gaccatcagc agtgtgcagg ctgaagacct 3000
tgcagattat cactgtggac agagttacag gtatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa 3060
gctggagctg aaactcgaga ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac 3120
catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc 3180
agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg 3240
gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa 3300
gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga 3360
agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa 3420
gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga 3480
gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc 3540
tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca 3600
gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg 3660
caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc 3720
ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta aggatccgcg gccgcgaagg atctgcgatc 3780
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 3840
gaggggtcgg caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 3900
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 3960
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc 4020
gaggggctcg catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc 4080
ggttgagtcg cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct 4140
aggtaagttt aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac 4200
ctagactcag ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg 4260
tttcgttttc tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct acgctagacg 4320
ccaccatgga gagcgacgag agcggcctgc ccgccatgga gatcgagtgc cgcatcaccg 4380
gcaccctgaa cggcgtggag ttcgagctgg tgggcggcgg agagggcacc cccaagcagg 4440
gccgcatgac caacaagatg aagagcacca aaggcgccct gaccttcagc ccctacctgc 4500
tgagccacgt gatgggctac ggcttctacc acttcggcac ctaccccagc ggctacgaga 4560
accccttcct gcacgccatc aacaacggcg gctacaccaa cacccgcatc gagaagtacg 4620
aggacggcgg cgtgctgcac gtgagcttca gctaccgcta cgaggccggc cgcgtgatcg 4680
gcgacttcaa ggtggtgggc accggcttcc ccgaggacag cgtgatcttc accgacaaga 4740
tcatccgcag caacgccacc gtggagcacc tgcaccccat gggcgataac gtgctggtgg 4800
gcagcttcgc ccgcaccttc agcctgcgcg acggcggcta ctacagcttc gtggtggaca 4860
gccacatgca cttcaagagc gccatccacc ccagcatcct gcagaacggg ggccccatgt 4920
tcgccttccg ccgcgtggag gagctgcaca gcaacaccga gctgggcatc gtggagtacc 4980
agcacgcctt caagaccccc atcgccttcg ccagatcccg cgctcagtcg tccaattctg 5040
ccgtggacgg caccgccgga cccggctcca ccggatctcg ctaagtcgac aatcaacctc 5100
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 5160
tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca 5220
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 5280
tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca 5340
ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg 5400
cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg 5460
acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg 5520
ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg 5580
accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc 5640
ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggtaccttt aagaccaatg 5700
acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg 5760
ctaattcact cccaacgaaa ataagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta 5820
gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa 5880
taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac 5940
tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt 6000
catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac 6060
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 6120
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 6180
catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 6240
atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat 6300
tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctagactt ttgcagagac ggcccaaatt 6360
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 6420
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 6480
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 6540
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 6600
cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 6660
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 6720
caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6780
ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6840
cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6900
ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 6960
tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 7020
gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 7080
ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 7140
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 7200
gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 7260
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 7320
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 7380
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 7440
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 7500
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 7560
tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 7620
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 7680
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 7740
gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 7800
taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 7860
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 7920
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 7980
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 8040
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 8100
tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 8160
ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 8220
aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 8280
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 8340
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 8400
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 8460
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 8520
ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 8580
ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 8640
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 8700
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 8760
tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 8820
gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 8880
cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg 8940
taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc aagctg 8996

Claims (10)

1.一种CD30 CAR慢病毒表达载体，其特征在于：所述CD30 CAR慢病毒表达载体包括CD30抗体的重链和轻链所组成的CD30 scFv基因片段，所述CD30 scFv基因片段，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的CD30 CAR慢病毒表达载体，其特征在于：所述慢病毒表达载体，包括CD30 scFv基因片段和pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP载体。
3.如权利要求1或2所述的CD30 CAR慢病毒表达载体，其特征在于：所述CD30 CAR慢病毒表达载体基因序列如SEQ ID NO：2所示。
4.制备权利要求1所述的CD30 CAR慢病毒表达载体的方法，其特征在于：包括，
将CD30抗体的重链和轻链与单链可变区片段scFv连接，构成CD30 scFv基因片段；
将所述CD30 scFv基因片段与CD8aSP、4-1BB胞内信号区及CD3ζ基因序列相串联，得到CD30 CAR基因序列；
将所述CD30 CAR基因序列与pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP载体连接,得到所述CD30 CAR慢病毒表达载体，所述CD30 CAR慢病毒表达载体基因序列如SEQ ID NO：2所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述将CD30抗体的重链和轻链与单链可变区片段scFv连接，包括将CD30抗体的重链与轻链分别与克隆载体pMD18-T Vector连接并分别进行PCR扩增。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述将CD30抗体的重链与轻链分别与克隆载体pMD18-T Vector连接并分别进行PCR扩增，其中，所述PCR扩增的反应体系为：MVH Mix或MVL Mix 45μL、DNA Polymerase 0.3 μL、CD30抗体的重链或轻链引物1μL，ddH2O 3.7 μL。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述将CD30 CAR基因序列与pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP载体连接，包括用XbaI和BamHI分别对所述CD30 CAR基因序列和pCDH-CMV-SMC-EF1a-GFP进行双酶切，37 ˚C 酶切过夜，加入10 × Loading Buffer 5μL，1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，并凝胶回收目的条带，连接过夜。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述CD30抗体，来源于CD30单克隆抗体杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCC NO：C201861。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：还包括，所述CD30单克隆抗体杂交瘤细胞的RNA提取及cDNA合成。
10.权利要求1所述的CD30 CAR慢病毒表达载体在制备抗淋巴瘤CAR-T细胞药物中的应用，其特征在于：所述淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤。
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