CN110628717B

CN110628717B - 一种浸润性t细胞的培养方法

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Publication number: CN110628717B
Application number: CN201911029541.6A
Authority: CN
Inventors: 柴勋; 李晓飞
Original assignee: SHANGHAI BIOMED-UNION CO LTD
Current assignee: Shanghai Biomed-union Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN110628717A

Abstract

一种浸润性T细胞的培养方法，包括以下步骤：1)制备形成效应T细胞，2)使用退分化培养基，使效应T细胞退分化为TIL‑TCM，3)使用扩增培养基扩增TCM。本发明所培养的TIL‑TCM有更强的瘤体趋向性，能归巢到肿瘤位置；能特异性识别肿瘤细胞，特异性杀瘤；能适应肿瘤微环境；能长时间在体内存活，起到长期抗肿瘤作用；少量的细胞，就能发挥强效的抗肿瘤作用，培养时间短，副反应几率低，操作简单，细胞增殖速度快。

Description

一种浸润性T细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及一种浸润性T细胞的培养方法，尤其涉及一种肿瘤浸润性中央记忆T细胞的培养方法。

背景技术

《2012中国肿瘤登记年报》曾报道：我国癌症发病率为285.91/10万，城市和农村发病率分别为303.91/10万和249.98/10万。据估计，至2049年，我国癌症发病率可能达到400/10万的水平。癌症发病率升高的最主要原因为人口老龄化。现今我国老龄人口所占比例为13.6％，20—30年后可能达到16％。与之相对应的，我们可以了解到近年来癌症发病率确实一直处于直线上升趋势，并且尽管目前的对于癌症的治疗措施在不断发展，但晚期恶性肿瘤患者愈后的身体状况仍然很差，5年生存率不到15％。

传统的手术、化疗、放疗三种肿瘤治疗手段靶向性差，副作用大，容易产生比较强的耐药现象，同时还有转移复发的危险，难以根除肿瘤细胞。随着肿瘤生物学、分子生物学和免疫学的发展，大量研究表明免疫治疗对晚期恶性肿瘤患者具有其他治疗方式无法比拟的优越性，因此，免疫治疗已成为继传统肿瘤治疗方法，手术、化疗、放疗，后的第四种肿瘤治疗方法，具有广阔的临床应用前景。

肿瘤免疫治疗通常指的是过继性细胞免疫治疗，是指通过输注自体或同种异体特异性或非特异性“抗肿瘤免疫效应细胞”，直接杀伤肿瘤细胞或改善提高机体免疫功能来达到治疗肿瘤的目的治疗方法。本发明主要对于肿瘤浸润性中央记忆T细胞进行研究。

肿瘤浸润性中央记忆T细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)，指浸润在肿瘤中的淋巴细胞，用于分离和鉴定出不同肿瘤相关抗原特异性T细胞。TIL可以识别肿瘤相关抗原的特性被用于肿瘤过继性免疫细胞治疗。Rosenberg实验室从黑色素瘤中分离得到TIL，并在体外经筛选和扩增等方法处理后，应用于晚期转移性黑色素瘤患者，其中近50％患者获得客观治疗反应。另外在不同肿瘤类型中，TIL在肿瘤中的数量，分布和种类都有着相当大的差异，这种差异与机体免疫系统对肿瘤的反应性密切相关。近些年来，关于TIL在肿瘤中的特征已经被用于患者愈后的判断标准。比如，在结肠癌中，肿瘤中浸润CD3+、CD3+CD8+细胞密度更高者，愈后更好，而且这个标准比传统的TNM分级更为准确。恶性程度更高的肿瘤，颗粒酶和伽玛干扰素基因表达水平明显比恶性程度稍逊者低，而这两种成份，均与免疫细胞抗肿瘤相关。

肿瘤特异性中央记忆T细胞(Central Memory T cell，TCM)，是免疫应答中的上游细胞，被认为在体内有着更长的寿命和瘤体趋向性，能起到纽带作用。免疫系统识别肿瘤抗原之后，TCM负责长久记忆肿瘤抗原，并在肿瘤抗原刺激下源源不断地产生针对肿瘤的大量效应型记忆T细胞(Effector Memory T cells，TEM)，进而分化成为大量的效应T细胞。

北华大学第二附属医院化疗科主任冯燕在2013年至2016年期间用TCM细胞治疗的365位癌症患者，证实了TCM在延长患者生存周期、提升癌症患者生存质量、减轻化疗副作用等方面有一定的效果。中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科副主任赵宏指出，肝切除术是治疗肝细胞癌最主要的治疗方式，但超过50％的肝癌患者在术后两年内复发，TCM治疗或可改善这一现状。TCM作为最新一代抗肿瘤免疫细胞，已被纳入美国国立卫生研究院(NIH)癌症中心招标项目，被美国NIH评价为最佳抗肿瘤细胞。

目前，传统的免疫细胞治疗是单独使用TCM或TIL进行治疗，但都没有取得良好的临床效果及市场应用，其原因主要有：

1、外周血中的TCM“记忆”了不同抗原，针对不同的疾病、感染进行免疫应答，只有极少一部分TCM可以针对肿瘤进行识别，故通过外周血分离的TCM其肿瘤杀伤能力有限，基本上扩增的都是一些不相干的细胞；

2、TIL实际上是一群免疫细胞的集合，里面有着各种淋巴细胞，甚至还有很多肿瘤抑制性细胞，随着科技的发展，近年来人们发现TIL中只有极少的一部分才具有肿瘤杀伤能力，所以如何扩增肿瘤特异性TIL细胞一直是该细胞的研究重点，现有的方法如neoantigen、单克隆挑选等等都是非常耗时耗力的，其成本非常巨大，很难推广；

3、根据美国国立卫生研究院(NIH)，TIL要到达有效浓度需要1000亿的细胞量且需要配合高剂量的IL2的输注维持TIL在内体的活性，其原因是传统的TIL是效应T细胞,其在体内很快衰竭，无法长期扩增，从而无法实现长期的抗瘤效果，而扩增1000亿的细胞量光培养基都需要上百升的体系，成本可想而知；

4、大剂量的IL2对患者会有极大的副作用；

5、传统的外周血扩增的TCM，就算记忆了肿瘤抗原，由于肿瘤微环境等原因，依然无法浸润到肿瘤当中。

综上所述，TIL和TCM的优缺点是互补的，如果有一种细胞能结合2者的优点并克服彼此的缺点，那这种细胞就具有良好的治疗效果和巨大的市场潜力，但因为TIL中TCM含量极低，几乎没有，无法直接从TIL中分离TCM，目前尚无完整的解决方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种TIL-TCM培养方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种浸润性T细胞的培养方法，包括以下步骤：1)制备形成效应T细胞，2)使用退分化培养基，使效应T细胞退分化为TIL-TCM，3)使用扩增培养基扩增TCM。

为了获得效应T细胞，所述步骤1)中的效应T细胞为使用激活培养基激活外周血中的淋巴细胞。

为了激活效应T细胞的活性，解除效应T细胞的抑制状态，所述激活培养基包括1640和AIM-V 1:1混合的基础培养基，55-100ng/ml CD28，20-60ug/ml PD1抗体，70-300ng/ml CD137L，10-40ng/ml IL2，2-20％自体血清。

优选地，所述激活培养基包括1640和AIM-V 1:1混合的基础培养基，80ng/mlCD28，40ug/ml PD1抗体，200ng/ml CD137L，20ng/ml IL2，10％自体血清。

为了使效应T细胞退分化，所述步骤2)中的退分化培养基包括AIM-V，3-21mg/ml三羟甲基乙烷，0.4-2mg/ml的BaCL2，30-80ug/ml依维莫司，1-7mg/ml KCL。

优选地，所述退分化培养基包括AIM-V，10mg/ml三羟甲基乙烷，1mg/ml的BaCL₂，50ug/ml依维莫司，3mg/ml KCL。

为了降低成本同时能够提高培养效果，所述步骤2)中加入经辐照灭活的工程化细胞，用作滋养层细胞。

优选地，所述经辐照灭活的工程化细胞比例为1/100。

为了提高扩增效率，所述步骤3)中的扩增培养基包括AIM-V，9-32ng/ml的IL2，2-9％自体血清。

优选地，所述扩增培养基包括AIM-V，20ng/ml的IL2，5％自体血清。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、所培养的TIL-TCM有更强的瘤体趋向性，能归巢到肿瘤位置；能特异性识别肿瘤细胞，特异性杀瘤；能适应肿瘤微环境；能长时间在体内存活，起到长期抗肿瘤作用；少量的细胞，就能发挥强效的抗肿瘤作用，培养时间短，副反应几率低。

2、操作简单，细胞增殖速度快。

附图说明

图1为实施例1中实验组TIL-TCM的流式细胞分析图。

图2为实施例1中对照组TIL-TCM的流式细胞分析图。

图3为实施例2中TIL-TCM细胞和TCM细胞的乳腺癌体外杀伤率曲线图。

图4为实施例3中裸鼠注射2小时后的静脉血检测情况。

图5为实施例3中裸鼠注射后6天的静脉血检测情况。

图6为实施例4中各小鼠的乳腺癌荷瘤体积变化图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明的一种浸润性T细胞的培养方法，其步骤包括：先通过激活TIL中的效应细胞，并将其退分化为TCM；然后通过工程化细胞，来大量扩增纯化TIL-TCM，并在体外使其保持TCM的表型。

本发明直接从肿瘤组织中TIL进行分离扩增，肿瘤组织中的TIL通过诱导激活分化为TCM，其记忆了患者肿瘤抗原信息，且在肿瘤微环境中长期“训练”。所以，TIL-TCM具有极强的肿瘤特异性和趋向性，能适应肿瘤微环境特异性高效杀伤肿瘤，并能浸润到肿瘤中。

据研究表明，TIL中的其他细胞如Treg、γδT等免疫抑制性淋巴细胞，不会退分化为TCM，因此，通过体外诱导，TIL中的效应T细胞退分化所得到的TCM都具有抗肿瘤作用，并且TIL-TCM能在体外长期扩增，且在体内无需IL2的协助下可以长期存活，并维持其功能，活性良好。

TIL能被体内的肿瘤细胞激活，从而在体内大量增殖分化成效应T细胞，无需巨大的细胞量就可以起到长期的抗瘤效果。

实施例1

肿瘤组织样本来自一位34岁乳腺癌患者，手术取下肿瘤组织约为3cm³，放入组织保存液中；构建稳定表达IL7、IL21、IL15、CD137L等膜蛋白的工程化K562细胞。

1、用镊子将肿瘤组织取出置于10cm培养皿中，快速的用75％乙醇消毒30s，再用PBS清洗2遍，后转移至另一10cm培养皿中。

2、用手术剪将肿瘤组织剪成适当大小的组织块后，再用眼科镊固定组织块，用手术刀片延同一方向将组织块切成1mm³大小。

3、将切割后的组织块均匀分散到10cm培养皿中，干燥贴壁1小时。

4、沿着培养皿内壁，缓慢加入激活培养基，隔天补液，用于解除效应T细胞的抑制状态。

激活培养基包括1640和AIM-V 1:1混合的基础培养基，55-100ng/ml CD28，20-60ug/ml PD1抗体，70-300ng/ml CD137L，10-40ng/ml IL2，2-20％自体血清。AIM-V能使肿瘤释放抗原，通过TCR-MHC途径特异性激活效应T细胞；CD28及CD137L作为共刺激因子能更好的激活效应T细胞；PD1抗体能封闭免疫检查点从而解除肿瘤对效应T细胞的免疫抑制；IL2为免疫细胞扩增必须的添加剂；血清提供营养。优选地，激活培养基包括1640和AIM-V1:1混合的基础培养基，80ng/ml CD28，40ug/ml PD1抗体，200ng/ml CD137L，20ng/ml IL2，10％自体血清。

5、第五天，收集未贴壁的细胞及肿瘤组织块，过45um过滤网，过滤后的细胞悬液与淋巴细胞分离液1:1离心，2200rpm，15min。

6、收集中间的白膜层于15ml离心管中，补加生理盐水至12ml，离心1500rpm，5min。

7、弃上清，将细胞团弹散，加入12ml生理盐水，离心1500rpm，5min。

8、弃上清，用扩增培养基重悬计数。调整细胞1X10^6cells/100ml接种至T175培养瓶中。将培养瓶平均分为两组，分别为实验组和对照组。实验组中加入退分化培养基24h后换成扩增培养基。对照组则一直使用扩增培养基。

退分化培养基包括AIM-V，3-21mg/ml三羟甲基乙烷，0.4-2mg/ml的BaCL₂，30-80ug/ml依维莫司，1-7mg/ml KCL，其中AIM-V是基础培养基，三羟甲基乙烷用于效应细胞往中央记忆T细胞退分化的诱导因子，BaCl₂用于效应细胞往中央记忆T细胞退分化的诱导因子，依维莫司用于维持中央记忆T细胞，防止其再分化为别的细胞，KCL用于效应细胞往中央记忆T细胞退分化的诱导因子。优选地，退分化培养基包括AIM-V，10mg/ml三羟甲基乙烷，1mg/ml的BaCL₂，50ug/ml依维莫司，3mg/ml KCL。

扩增培养基包括AIM-V，9-32ng/ml的IL2，2-9％自体血清。其中AIM-V为基础培养基，IL2用于淋巴细胞的扩增，自体血清用于提供细胞培养的必须营养成分，CD28用于更好的激活T淋巴细胞。优选地，扩增培养基包括AIM-V，20ng/ml的IL2，5％自体血清。

9、实验组中往每瓶中加入1/100经辐照灭活的工程化细胞，将T175培养瓶放至37℃，5％CO2培养箱中，隔天补液。

对照组中往每瓶中加入1/100经辐照灭活的3份不同健康人PBMC，将T175培养瓶放至37℃，5％CO2培养箱中，隔天补液；

10、第21天，实验组和对照组收获细胞。通过流式细胞仪分析收获细胞表明TCM的标志物CD45RO、CD62L、CCR7三阳性从而获得TIL-TCM纯度，结果如图1和图2。

结果分析

如图1所示，图1A中显示实验组中表达趋化因子受体CCR7的纯度高达89.8％％，图1B中显示CD45RO+、CD62L+双阳性(第二象限)的细胞高达86.4％。可见实验组中的细胞为高纯度的TIL-TCM细胞，并且细胞归巢能力和瘤体趋向性强。

如图2所示，图2A中显示对照组中表达趋化因子受体CCR7的纯度为29.9％，图2B中显示对照组中获得的细胞大多是CD45RO-(第一、第四象限)的效应T细胞45.1％和不显性细胞40.8％，CD45RO+、CD62L+双阳性的细胞(第二象限)只有14％。由此可见，对照组中的TIL-TCM含量很低，缺失细胞归巢能力和瘤体趋向性。

实施例2

肿瘤组织样品来自一位57岁乳腺癌患者，手术取下肿瘤组织约为12cm3，放入组织保存液中

1、制备靶细胞：

1.1用镊子取一部分肿瘤组织，置于10cm培养皿中，快速的用75％乙醇消毒30s，再用PBS清洗2遍。转移至另一10cm培养皿中。

1.2将肿瘤组织中的脂肪、结缔组织和坏死组织去除后，将肿瘤组织充分剪碎，移入50ml离心管中，加入0.2％的胶原蛋白酶NB4G进行消化12小时。

1.3用200目的滤网滤除未消化的组织，滤液按1X10^6的细胞量接种到T75的培养瓶中，补完全培养基。

1.4当细胞长到80％后，消化后移入24孔板，进行靶细胞培养。

1.5取生长状态良好的靶细胞，1000rpm/min离心5min，用完全培养基重悬，台酚蓝计数检测细胞活率，调整细胞数为2x10^5/ml，2ml(50ul/孔，共21孔)。

2、将另外一部分肿瘤组织按实施例1中实验组的方法培养获得TIL-TCM细胞。

3、制备效应细胞：

取TIL-TCM细胞，重悬，1500rpm/min离心5min×2次，台酚蓝计数活率，完全培养基重悬，调整细胞数为4x106/ml(按最大效靶比20:1,50ul/孔，6孔)，得到效应细胞备用。按靶细胞10⁴/孔处理效应细胞，效靶比E:T＝20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0.5:1：

20:1配比：调整TIL-TCM细胞数为4x10⁶/ml，1ml，混匀，50ul/孔，6孔。

10:1配比：取上述20:1的TIL-TCMT细胞500ul，加500ul完全培养基混匀，50ul/孔，6孔。

5:1配比：取上述10:1的TIL-TCM细胞500ul，加500ul完全培养基混匀，50ul/孔，6孔。

2:1配比：取上述5:1的TIL-TCM细胞400ul，加600ul完全培养基混匀，50ul/孔，6孔。

1:1配比：取上述2:1的TIL-TCM细胞500ul，加500ul完全培养基混匀，50ul/孔，6孔。

0.5:1配比：取上述1:1的TIL-TCMT细胞500ul，加500ul完全培养基混匀，50ul/孔，6孔。

4、TIL-TCM细胞毒性检测：

将处理好的TIL-TCM与靶细胞，按不同效靶比E:T＝0.5:1，1:1，2:1，5:1，10:1，20:1分别加入96孔板中，不足100ul体积孔加入完全培养基补足100ul。取相应细胞数的靶细胞和TIL-TCM作对照，取相同体积培养基作空白对照，实验孔周围孔加入等体积PBS过夜培养(16～24h)。

5、第二天每孔加入10％体积的CCK-8，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育2—4h后，在450nm波长下测定OD值，同时设定630nm为参比波长，计算杀伤率并绘制标准曲线，结果如图3。

杀伤率(％)＝(对照靶细胞OD值+相应对照CTL组OD值-实验组OD值-空白培养基OD值)/(对照靶细胞OD值-空白培养基OD值)x100％

对照组

1、取健康人外周血50ml，按传统方法制作TCM：

2.1将采集的血样轻轻转移至4支装有20ml的淋巴细胞分离液的50ml离心管中，2200rpm，离心20min；

2.2用巴氏吸管吸取中间白膜层于新的50ml离心管，并用生理盐水1800rpm，离心5min洗涤2次；

2.3用CD3磁珠富集T细胞，去除其他天然免疫细胞，并用生理盐水1800rpm，离心5min洗涤2次；

2.4用AIM-V培养基重悬细胞沉淀并计数，并按2～3×10^6/ml的密度接种于T75培养瓶；添加30mlAIM-V，1000ng/ml的白细胞介素-2、5ng/mL的白细胞介素-7、5ng/mL的白细胞介素-15、3μg/ml的Anti-CD3抗体、5％的自体血浆置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养；

2.5第七天收获TCM细胞，并按上述方法进行杀伤实验，并画标准曲线，结果如图3。

结果分析

如图3所示，TCM曲线为对照组细胞的肿瘤细胞杀伤率，由于健康人外周血中的TCM没有记忆相应的肿瘤抗原所以没有对靶细胞有杀伤作用，无论效靶比多少，外周血扩增的TCM对肿瘤没有任何杀伤作用。图3中TIL-TCM曲线为实验组细胞的肿瘤细胞杀伤率，显示出TIL-TCM对乳腺癌效靶比0.5:1时，杀伤效率为18％，1:1时杀伤效率为57％，5:1时杀伤效率为97.73％接近了100％，杀伤能力强。

实施例3

将实例1中制备的TIL-TCM及TIL分别打入两只重量相同、同一谱系的重度免疫缺陷的裸鼠体内，观察不同细胞的体内存活情况。分别于第2小时、第6天抽取裸鼠尾静脉血，通过流式检测测CD45(人白细胞)的含量，结果如图4和图5。

结果分析

图4为裸鼠注射2小时后的静脉血检测情况。如图4所示，裸鼠输注2小时后TIL-TCM和TIL这两种细胞均已经在裸鼠外周血中循环，其中TIL细胞含量为45.1％，TIL-TCM细胞含量为47.4％，两者在小鼠外周血细胞中的占比没有明显区别。

图5为裸鼠注射后6天的静脉血检测情况。如图5所示，裸鼠体内TIL-TCM细胞含量为51.0％，对比注射2小时所得到的数据，细胞占比有略微上升，说明TIL-TCM大部分在小鼠体内存活，且略有增殖。而TIL细胞的含量为9.4％，细胞占比明显降低，说明TIL细胞在裸鼠体内6天后代谢明显，只有小部分细胞存活。

实施例4

1、取具有B-NDG重度免疫缺陷(具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等，非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长)，5周龄，体重近似的雌性小鼠8只，平均分为A、B、C、D共4组；

将均8只小鼠皮下接种原代乳腺癌细胞，1x10E6/只，细胞活率93％，并分别在第7天、第14天、第21次测量瘤体大小；

2、第21天，往小鼠尾静脉注射免疫细胞，具体如下：

A组为空白组，注射生理盐水；

B组注射高浓度TIL细胞，注射1X10⁹的TIL细胞；

C组注射低浓度TIL细胞，注射1X10⁷的TIL细胞；

D组注射低浓度TCM-TIL细胞，注射1X10⁷的TIL-TCM细胞；

3、观察输注后反应：B组2只小鼠均出现低温、不活动等反应，其中1只小鼠20小时后死亡，B1剔除实验；另一只B248小时后恢复，其他6只小鼠没有明显反应；

5、每7天测量瘤体大小，绘制瘤体曲线，结果如图6所示；

6、42天后，观察到7只小鼠全部存活，其中B组及D组瘤体消失，C组1只小鼠瘤体先缩小后再长大，另一只瘤体跟对照组没有明显差异。

结果分析

如图6所示，A1、A2小鼠的肿瘤一直处于增长状态，35天之后，2只小鼠的瘤块体积超过了800mm³(出于伦理，此时将2只小鼠处死)。B1在注射了高浓度的TIL细胞后出现了强烈的副反应，20小时后死亡，剔除实验；B2在注射了高浓度TIL细胞的7天后瘤体消失，并且在本实验观察期42天内瘤体没有复发。C1在注射了低浓度TIL细胞后，后瘤体没有出现明显的变化，依然成较快的趋势生长，到第42天其瘤体体积接近于600mm³；C2在注射了低浓度TIL细胞的7天后，瘤体由164mm³缩减到80mm³，第35天瘤体又增长到110mm³，到第42天瘤体快速增长至320mm³。D1注射低浓度TIL-TCM后，瘤体持续减少，最终消失；D2在注射低浓度TIL-TCM细胞后的第7天，瘤体消失，并且在本实验观察期42天内瘤体没有复发。

综上所述，TIL细胞治疗肿瘤细胞需要大量的细胞数量，并存在较大的副反应；而TIL-TCM只需要较少的细胞数量，便可以持续抗瘤。

Claims

1.一种浸润性T细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：1)利用肿瘤组织制备形成效应T细胞，2)加入退分化培养基和经辐照灭活的工程化细胞，使效应T细胞退分化为TIL-TCM，所述经辐照灭活的工程化细胞比例为1/100，3)使用扩增培养基扩增TCM；

所述退分化培养基为AIM-V，3-21mg/ml三羟甲基乙烷，0.4-2mg/ml的BaCL₂，30-80 μ g/ml依维莫司，1-7mg/ml KCl ；

所述扩增培养基为AIM-V，9-32ng/ml的IL2，2-9％自体血清。

2.如权利要求1所述的浸润性T细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤1)中的效应T细胞为使用激活培养基激活外周血中的淋巴细胞。

3.如权利要求2所述的浸润性T细胞的培养方法，其特征在于：所述激活培养基为1640和AIM-V 1:1混合的基础培养基，55-100ng/mlCD28，20-60μ g/ml PD1抗体，70-300ng/mlCD137L，10-40ng/mlIL2，2-20％自体血清。

4.如权利要求3所述的浸润性T细胞的培养方法，其特征在于：所述激活培养基为1640和AIM-V 1:1混合的基础培养基，80ng/mlCD28，40μ g/mlPD1抗体，200ng/ml CD137L，20ng/mlIL2，10％自体血清。

5.如权利要求1所述的浸润性T细胞的培养方法，其特征在于：所述退分化培养基为AIM-V，10mg/ml三羟甲基乙烷，1mg/ml的BaCl₂ ，50μ g/ml依维莫司，3mg/ml KCl 。

6.如权利要求1所述的浸润性T细胞的培养方法，其特征在于：所述扩增培养基为AIM-V，20ng/ml的IL2，5％自体血清。