CN110628664B

CN110628664B - 防治根结线虫的远东假单胞菌及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110628664B
Application number: CN201910752350.6A
Authority: CN
Inventors: 李林; 张润; 丁美娟; 孙孝文; 刘永轩
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-08-15
Also published as: CN110628664A

Abstract

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种防治根结线虫的远东假单胞菌及制备方法与应用。本发明所述的菌株为远东假单胞菌（Pseudomonas extremorientalis）MB751，于2019年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019495，该菌株从植物根际土壤中分离获得，对南方根结线虫具有显著的防治效果，且对植物有促生效果，耐盐范围较广，通过常规的液体发酵培养制备，生产过程简单，且不污染环境。

Description

防治根结线虫的远东假单胞菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物杀虫农药技术领域，具体涉及防治根结线虫的远东假单胞菌及其制备方法与应用。

背景技术

粮食对人类的生存必不可少。但是每年由寄生线虫造成粮食以及蔬菜等经济作物的损失在整个农业生产中非常巨大。因此，对根结线虫的防治工作迫在眉睫。目前，对根结线虫的防治应用比较普遍的是化学防治。然而，化学杀线虫剂对环境污染严重，使用过程中对人和动物也有危害，虽然可以对线虫起到毒杀作用，但是其具有残留率高，破坏生态平衡等缺点，不利于农业生产的发展。因此，致力于安全高效的防治方法的研究工作才符合农业可持续发展的理念，比如生物防治技术。

目前生物防治根结线虫的细菌包括根际细菌、内生细菌以及专性寄生细菌，根际细菌研究较为热门，内生细菌研究相对较少，寄生细菌限制较大，根际细菌能促进植物对矿物质营养快速吸收和利用，从而促进植物的生长，而且培养方便、定殖容易，对植物寄生线虫有很强的致死作用，具有很好的研究应用优势和市场开发潜力。现今研究比较广泛的是芽孢杆菌属和假单胞菌属。假单胞菌属是构成土壤的重要组成部分，其微生物群落在可耕地中起着主导作用，它可溶解矿物质，提供其他重要的营养物质供植物根系吸收。假单胞菌一方面能促进植物的种子萌发以及根的生长，从而提高根对矿物营养、水分等的吸收作用，另一方面假单胞菌的次生代谢产物能抑制土壤中植物寄生线虫的繁殖，间接促进植物生长。因此假单胞菌属成为一种极具应用潜力的生物防治资源。

发明内容

本发明的目的是分离得到一株新的具有防治根结线虫的远东假单胞菌，并由该菌发酵生产制备防治根结线虫的远东假单胞菌菌制剂，防治效果可达80.43％，且可促进植物生长。

本发明的技术方案如下所述：

申请人于2017年6月在新疆库尔勒果园分离筛选得到一株对根结线虫具有高效防治效果的远东假单胞菌，该菌株被命名为远东假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)MB751，于2019年6月25日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址是武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2019495。

远东假单胞菌MB751菌株具有下列明显特征：

(1)该菌株属于假单胞菌属，革兰氏阴性，呈杆状，无芽孢；在LB固体培养基上，菌落突起，呈淡黄色，边缘整齐；LB液体培养基摇瓶震荡培养8h后可形成明显生物膜。

(2)该菌株发酵培养物及其发酵上清对南方根结线虫具有高效防治效果，且促进植物生长。

(3)该菌株的盐度耐受范围广，在盐度为1％—7％之间具有较高的生物量。

本发明提供了远东假单胞菌MB751的工业发酵培养基，其配方为葡萄糖12.46g/L、玉米粉15.13g/L、黄豆饼粉4.00g/L、MgSO₄ 0.30g/L、MnSO₄ 0.04g/L、NaH₂PO₄ 0.30g/L、Na₂HPO₄ 1.50g/L，pH＝8.42。28℃下振荡培养24h后，最大活菌数可达1.57×10¹¹CFU/mL，比初始的发酵培养基活性提高了3.5倍。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明的远东假单胞菌MB751来源于植物根际土壤，不仅可以杀根结线虫，还可以有效地促进植物生长，对于环境及植物、人、动物等所有生物无不良影响，该菌株耐盐范围较广，且菌株长势都很好，生产成本低，生产过程简单，不会对环境造成污染，适于推广使用。

附图说明

图1为远东假单胞菌MB751的显微形态图。

图2显示远东假单胞菌MB751的菌落形态。

图3显示远东假单胞菌MB751的系统发生树。

图4显示远东假单胞菌MB751和E.coli OP50处理后的南方根结线虫。

图5显示远东假单胞菌MB751对南方根结线虫半致死浓度测定。

图6显示使用假单胞菌MB751灌根后的番茄根。

图7显示不同盐度对远东单胞菌MB751生长的影响。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。

实施例1远东假单胞菌MB751的分离及鉴定

1、2017年6月在新疆库尔勒果园集距地表面0-15cm的土壤，去掉其中的枯枝、石子等杂物后，室温下晾干，研磨破碎并过40目筛后，利用梯度稀释法分离植物根际土壤细菌。取10g土壤，溶于90mL无菌水中，振荡均匀。取100μL土壤混浊液，加入到含有900μL无菌水的离心管中，用快速涡旋振荡器振荡均匀(20sec)；依次稀释10²，10³，10⁴，10⁵，10⁶，10⁷倍。将稀释管中的稀释液分别取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨(NA)培养平板上，在28℃下恒温培养48h。将分离到的单菌落用划线分离法进行纯化。

2、将分离纯化的远东假单胞菌MB751划线转接到LB固体培养基上培养24h，观察菌落形态；然后，挑一单菌落，进行革兰氏染色观察。如图1所示，革兰氏染色后显微镜观察远东假单胞菌MB751革兰氏阴性，杆状。图2是假单胞菌MB751在LB固体培养基上培养24h后的菌落形态图，表现为圆形，淡黄色，表面光滑，边缘整齐，中间凸起，易挑取。

3、MB751菌株的16S rRNA基因进行了PCR扩增并测序，使用T载体试剂盒将得到的DNA片段与T载相连，筛选阳性克隆子，送擎科生物公司进行序列测序，序列见SEQ ID NO:1。根据引物截选出目的片段，在EzbioCloud中进行序列相似性比对得到结果，菌株MB751与远东假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)有99.79％的相似性。根据形态观测、部分生理生化测定结果并结合16S rRNA基因测序和序列比对分析结果，将分离菌株MB751鉴定为远东假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)。申请人已于2019年6月25日交由中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名为远东假单胞菌(Pseudomonas extremorientalis)MB751，保藏编号为CCTCC NO:M 2019495。

实施例2远东假单胞菌MB751的制备

1、远东假单胞菌MB751菌种的活化：氯化钠10.00g，蛋白胨10.00g，酵母粉5.00g，蒸馏水定容至1.00L，pH为7.0，在无菌操作下，从培养MB751的固体平板上挑一单菌落到装有5.0mL上述液体培养基的PA瓶中，28℃，160r·min^-1培养8h左右。

2、液体扩大培养：按1％的接种量转接于装有200mL LB液体培养基的三角瓶中28℃，160r·min^-1扩大培养24h。

3、工业发酵培养基优化试验：

1)单因素实验：将MB751菌株接种到基础培养基中，以培养基初始pH 7.0，接种量1％，培养温度28℃，转速150rpm为初始条件。分别以葡萄糖、酵母粉、可溶性淀粉、蔗糖、玉米粉、乳糖作为基础培养基中的碳源，研究不同碳源对MB751产量的影响，并选择最适碳源。

以MB751菌株的产量为检测指标，当氮源分别为黄豆饼粉、豆粕粉、大豆蛋白胨、花生饼粉、胰蛋白胨、(NH4)₂SO₄时，研究不同氮源对MB751产量的影响，并选择最适氮源。

以MB751菌株的产量为检测指标，选择最适的培养基发酵工艺参数。当初始pH分别为5、6、7、8、9时，考察活菌数变化情况，选择最适pH；当初始接种量分别为1％、2％、3％、4％、5％时，考察活菌数变化情况，选择最适活菌数。当温度分别为16℃、20℃、28℃、30℃、37℃时，考察活菌数变化情况，选择最适温度。

2)Plackett—Burman实验：采用八因子二水平的设计对MB751生物量进行优化，得到三个最具显著性因素分别为葡萄糖、玉米粉和pH。

3)最陡爬坡实验设计：通过SAS 9.2分析软件对Plackett-Burman设计分析，选取3个影响最大因素(葡萄糖、玉米粉和pH)作为最陡爬坡路径法的最大增长的方向。采用通过三因素试验次数N＝7的最陡爬坡路径试验，对MB751的生物量进行优化。

4)响应面Box-Behnken实验：通过最陡爬坡路径试验的结果选取3个影响最大因子(葡萄糖、玉米粉和pH)的最优组合作为BOX-Behnken试验的3个因素，每个因子分别设置低(-1)、中(0)和高(1)3个水平，采用三因素3水平的BOX-Behnken试验设计对MB751的生物量进行优化。最终得到最优的工业发酵培养基配方：葡萄糖12.46g/L、玉米粉15.13g/L、黄豆饼粉4.00g/L、MgSO₄ 0.30g/L、MnSO₄ 0.04g/L、NaH₂PO₄ 0.30g/L、Na₂HPO₄ 1.50g/L。发酵工艺参数：pH＝8.42、接种量2％、摇床温度28℃。最佳发酵培养基活性为1.57×10¹¹CFU/mL，比初始的发酵培养基活性3.52×10¹⁰CFU/mL提高了3.5倍。

4、远东假单胞菌MB751菌体悬液的制备：扩大培养24h后，12000r·min^-1离心2min，离心所得沉淀即为菌体。用PBS洗涤菌体四遍，并用之悬浮菌体，菌悬液即为实验生测所需的菌体样品。

5、远东假单胞菌MB751发酵上清液的制备：扩大培养72h后的培养液，经8000r·min^-1离心10min，上清即为生测时所用的发酵上清液样品。

6、待测样品的浓度测定：假单胞菌MB751菌体和E.coli OP50测OD值；发酵上清使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

实施例3远东假单胞菌MB751杀南方根结线虫的活性试验

1、南方根结线虫虫卵的制备：取被根结线虫感染的番茄根，用清水把表面泥沙冲洗干净后，用细针把根上的卵块取下，1％的次氯酸钠晃动处理卵块5min，离心(8000r·min^-1，1min)，弃上清，重复洗涤三次以上，可得大量虫卵。

2、南方根结线虫二龄幼虫的制备：将所得虫卵用无菌水悬浮，置于96孔板中，每孔200μL卵悬液，25℃孵化4d，即得大量二龄幼虫，用作毒力测定。

3、MB751对根结线虫二龄幼虫的活性测定：在96孔板中进行测定，每孔中加50条二龄幼虫，150μL样品，10mg/ml氯霉素0.6μL，每个样品3个重复，对照组使用OP50代替样品。鉴定线虫死亡的方法为：作用24h后，用2％的氯化钠溶液处理2min左右，死虫僵直不动，活虫卷曲或扭动。

表1远东假单胞菌MB751对南方根结线虫的毒杀效果

样品	浓度	南方根结线虫相对致死率
			E.coli OP50菌体对照	OD<sub>600nm</sub>＝0.60	2.37±1.38％
MB751菌体	OD<sub>600nm</sub>＝0.60	77.98±1.73％
			MB751发酵上清液	1800μg·mL<sup>-1</sup>	79.94±7.69％

结果表明，远东假单胞菌MB751菌体和发酵上清液对南方根结线虫具有较好的毒杀效果。利用菌体杀南方根结线虫24h后，致死率达77.98％。图4所示，远东假单胞菌MB751菌体处理后，南方根结线虫均僵直死亡，而对照E.coli OP50菌体处理后，南方根结线虫几乎未有死亡。图5所示，测得MB751菌体半致死浓度(LC₅₀)为0.29mg/mL(0.228～0.349)(菌体干重)，线性回归方程：Y＝3.141X-7.741。发酵上清液致死率达79.94％，表明远东假单胞菌MB751的代谢产物对南方根结线虫也具有较好的毒杀效果。

实施例4远东假单胞菌MB751防治南方根结线虫侵染番茄的盆栽应用

盆栽试验：在25℃±3℃温度条件下进行。在育苗盘中将番茄培养至四叶期，移至13cm×12cm盛有无菌土的黑色塑料盆中培养定植，7d后向番茄根系浇灌MB751发酵液10m L(10⁸CFU·m L^-1)，对照处理浇灌相同体积工业发酵培养基，3d后向番茄根系中接种南方根结线虫二龄幼虫(RKN-J2)约1000条。施菌后40天测定植株性状：株高、茎粗、根长、地上部分鲜重、根系鲜重和地上部分干重、根系干重。统计根结数计算防治效果。每个处理5次重复，每个重复1株番茄，试验重复3次。

表2远东假单胞菌MB751对南方根结线虫的防治效果

处理	病情指数	防治效果
			培养基对照	61.33％	-
MB751菌剂	12.12％	80.43％

结果表明，远东假单胞MB751发酵液浇灌后番茄根系上的根结数量显著减少，计算得到MB751的防治效果达80.43％。

表3远东假单胞菌MB751促生盆栽实验结果

通过盆栽试验，施菌后40天测定植物株高、茎粗、根长、地上鲜重、根系鲜重以及地上干重和根系干重。结果表明，远东假单胞菌MB751浇灌的番茄在各种性状上与对照组相比都有显著性增加(p<0.05)，株高增加了37.51％，茎粗增加了46.45％，根长增加了13.88％，地上鲜重增加了66.67％，地下鲜重增加了27.42％，地上干重增加了1.375倍，地下干重增加了2.21倍。图6显示了对照与远东假单胞菌MB751浇灌后植物根的情况，对照浇灌的根根结较多，受线虫侵染的损害比较严重，虫卵数量也很多；而相比之下，远东假单胞菌MB751浇灌后的番茄根根结很少，受线虫的损害较小，说明远东假单胞菌MB751对南方根结线虫有明显的防治效果。

实施例5远东假单胞菌MB751耐盐实验

在LB培养基中，盐度(以NaCl为计)分别设计为0、1％、3％、5％、7％、8％、10％，以MB03(丁香假单胞菌)和OP50(大肠杆菌)为对照，培养48h，测定吸光度。每个实验做3次重复。

如图7所示，通过48h的摇床培养并测量吸光度可知，与对照相比，远东假单胞菌MB751在不同盐度范围下菌株长势最强，且对盐度耐受范围较大，可在盐度为1％—7％之间具有较高的生物量。远东假单胞菌MB751培养48h，最适生长盐度(NaCl为3％)的OD_600nm为1.9925。说明MB751做成的菌剂耐盐范围较大，可在实际生产中推广应用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 防治根结线虫的远东假单胞菌及其制备方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat catggctcag agcgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac 60

ggacccttcg gggttagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggaacgtgc ctttaggttc 120

ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatgc cgaatgtgcc cttcggggga aagatttatc 180

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Claims

1.一株防治南方根结线虫的远东假单胞菌（ Pseudomonas extremorientalis ），其特征在于，该菌株为远东假单胞菌（Pseudomonas extremorientalis）MB751，保藏编号为CCTCC NO: M 2019495。

2.权利要求1所述的远东假单胞菌在防治南方根结线虫中的应用。

3.权利要求1所述的远东假单胞菌制备的防治南方根结线虫的菌剂。

4.根据权利要求3所述的远东假单胞菌制备的防治南方根结线虫的菌剂，其特征在于，所述的菌剂的活性成分为远东假单胞菌MB751的发酵液或发酵上清液。

5.权利要求1所述远东假单胞菌（Pseudomonas extremorientalis）MB751的发酵培养方法，其特征在于，发酵培养基的配方为葡萄糖12.46 g/L，玉米粉15.13 g/L，黄豆饼粉4.00 g/L，MgSO₄0.30 g/L，MnSO₄ 0.04 g/L，NaH₂PO₄ 0.30 g/L，Na₂HPO₄1.50 g/L，发酵工艺参数为pH8.42，接种量2%，温度28℃。