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CN110621782A - 监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法及使用其的细胞分类方法 - Google Patents

监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法及使用其的细胞分类方法 Download PDF

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CN110621782A CN201880029179.XA CN201880029179A CN110621782A CN 110621782 A CN110621782 A CN 110621782A CN 201880029179 A CN201880029179 A CN 201880029179A CN 110621782 A CN110621782 A CN 110621782A
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Abstract

本发明提供简便且高效地监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法。更具体而言，本发明提供监测细胞的动态变化的方法，所述方法包括下述工序：准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞或来源于其的物质和至少一个微珠；通过经时性地反复一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息、和微珠的成像信息，从而监测多个隔室中的各细胞或来源于其的物质的动态变化，其中，各隔室中的微珠的成像信息可彼此区分，且成为确定各隔室中所含的细胞或来源于其的物质的指标。

Description

监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法及使用其的细 胞分类方法
相关申请的参考
本专利申请主张基于2017年5月2日提出申请的日本专利申请2017-91964号的优先权，该在先专利申请的全部公开内容通过引用而成为本说明书的一部分。
技术领域
本发明涉及监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法及使用其的细胞分类方法。
背景技术
细胞是构成生物的最小单位。以往，仅针对细胞群尝试阐明生物的功能、结构、形态等。然而，最近的研究中发现，在癌组织等的类似的细胞类型中，基因表达也因细胞各异，是多样的，产生了对细胞逐个进行分析的需要。
另一方面，作为对一个细胞(单细胞，single cell)进行分析的方法，一直以来使用以流式细胞术为代表的细胞状态测量技术。例如，通过使用使一个个细胞分散于流体中并使该流体细细地流动而对一个个细胞进行光学分析的流式细胞术、显微镜或成像细胞术(imaging cytometry)等成像技术，可基于细胞的空间信息而得到一个个细胞的形态学信息。特别是利用成像流式细胞术，能够以非常高的通量(例如，每1秒分析数万个细胞)进行单细胞分析，能够实现统计学数量的单细胞测量(例如，非专利文献1等)。
然而，以成像流式细胞术为代表的流式细胞术技术虽然从测定效率、准确性的观点考虑具有优点，但另一方面，由于观察对象在一次测量后会丧失顺序，因此，针对一个观察对象仅能够实施一次测量，难以追踪细胞发生的时间序列的动态变化。在这样的技术背景下，可以说仍然需求简便且高效地监测大量的细胞的动态变化的方法。
现有技术文献
非专利文献
专利文献1：《生物工程》，第90卷，2012年，第12期，785-789页
发明内容
本发明的目的在于提供简便且高效地监测细胞的动态变化的方法。
本申请的发明人此次发现：若将至少一个细胞和至少一个微珠封入至隔室(compartment)中，并将该微珠的成像信息用作确定细胞的指标、反复经时性地获得隔室中的细胞的状态测量信息，则能够简便且高效地监测细胞的动态变化。本发明是基于上述见解完成的。
根据本发明，可提供以下的(1)～(21)。
(1)监测细胞的动态变化的方法，所述方法包括下述工序：
准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞和至少一个微珠；
通过经时性地反复一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，从而监测多个隔室中的各细胞或来源于其的物质的动态变化，
其中，各隔室中的微珠的成像信息可彼此区分，且成为确定各隔室中所含的细胞或来源于其的物质的指标。
(2)如(1)所述的方法，其中，每1个隔室的微珠的数量为多个。
(3)如(1)或(2)所述的方法，其中，所述细胞的动态变化为选自由细胞形态的变化、细胞活动状态的变化、及细胞间相互作用的变化中的至少一种变化。
(4)如(1)～(3)中任一者所述的方法，其中，利用流式细胞仪或显微镜来测定所述细胞或来源于其的物质的状态测量信息或微珠的成像信息。
(5)如(1)～(4)中任一者所述的方法，其中，所述微珠的成像信息为基于电磁波、荧光、相位、散射、反射、相干拉曼、拉曼或吸收光谱的空间信息。
(6)如(1)～(5)中任一者所述的方法，其中，所述微珠的成像信息为选自由微珠的空间信息、各隔室中的微珠的空间配置信息、及各隔室中的微珠和细胞的空间配置信息组成的组中的至少一种信息。
(7)如(1)～(6)中任一者所述的方法，其中，所述隔室为孔、液滴或凝胶粒子的形态。
(8)如(1)～(7)中任一者所述的方法，其中，所述隔室是包含水凝胶而成的。
(9)如(1)～(8)中任一者所述的方法，其中，隔室为担载有微珠或包含微珠的子隔室(subcompartment)的细胞。
(10)如(1)～(9)中任一者所述的方法，其中，每1个隔室的细胞的数量为1个。
(11)如(1)～(10)中任一者所述的方法，其包括下述工序：一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息、和微珠的成像信息后，对各隔室进行分选。
(12)如(1)～(11)中任一者所述的方法，其中，所述多个隔室还包含药剂。
(13)筛选药剂的方法，所述方法基于在(12)所述的方法中经时性地获得的细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息来筛选药剂。
(14)细胞或来源于其的物质的分类方法，其包括下述工序：基于在(1)～(12)中任一者所述的方法中经时性地获得的细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息，获得细胞或来源于其的物质的分类模型。
(15)如(14)所述的细胞或来源于其的物质的分类方法，其包括下述工序：与所述集成状态测量信息独立地，获得任意时间点时的细胞或来源于其的物质的1时间点状态测量信息，基于该1时间点状态测量信息和所述集成状态测量信息，获得所述细胞或来源于其的物质的分类模型。
(16)如(14)或(15)所述的细胞或来源于其的物质的方法，其中，利用相同或不同的方法获得所述集成状态测量信息及1时间点状态测量信息。
(17)如(13)～(16)中任一者中记载的细胞或来源于其的物质的分类方法，其包括下述工序：基于上述细胞分类模型、和被测细胞或来源于其的物质的预先获得的状态测量信息，预测被测细胞或来源于其的物质的动态变化或特征。
(18)如(17)所述的细胞或来源于其的物质的分类方法，其中，所述预测包括任意时间点时的被测细胞或来源于其的物质的状态预测。
(19)监测细胞或来源于其的物质的动态变化的系统，其包含：
隔室准备部，其准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞和至少一个微珠；及
监测部，其通过经时性地反复一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，从而监测细胞或来源于其的物质的动态变化，
其中，各隔室中的微珠相关成像信息可彼此区分，且成为确定各隔室中所含的细胞的指标。
(20)如(19)所述的系统，其中，所述监测部具备能经时性地收集及分选隔室的隔室收集部。
(21)隔室组合物，其用于(1)～(18)中任一者所述的方法，所述隔室组合物具备至少一个细胞和至少一个微珠。
根据本发明，可使用隔室中的微珠的成像信息作为确定细胞或来源于其的物质的指标，简便且高效地监测细胞或来源于其的物质的动态变化。本发明中，细胞和微珠被保持于隔室中，细胞或来源于其的物质的状态测量信息与微珠的成像信息被相关联，因此，即使使用细胞等在测定后被收集而丧失顺序的流式细胞术等，仍然能够高效地测定大量的细胞各自的时间序列变化。上述本发明的方法可特别有利地应用于迅速且高效地分析单细胞的动态变化。
附图说明
[图1]为示出监测本发明的细胞的动态变化的方法的示意图。
[图2]为示出以控制大小、RGB、荧光亮度、其他光学特性而制作的n种微珠的成像信息(光学ID)作为指标的实施方式的示意图。
[图3]为使用微珠的成像信息(光学ID)确定细胞、且根据细胞的成像信息分析各细胞的状态等的实施方式的示意图。
[图4]为示出隔室的制造工序的一实施方式的示意图。
[图5]为利用流式细胞仪装置对多个隔室进行测定的一实施方式的示意图。
[图6]为基于由本发明得到的细胞的集成测量信息制作细胞分类模型的方法的示意图。需要说明的是，图4的中段下方的图为以二维方式表现将细胞的动态变化数据在多维空间上进行分类处理而得到的多维分类模型的示意图。
[图7A]为使用任意时间点时的细胞的1时间点状态测量信息、和基于细胞的集成状态测量信息得到的分类结果进行机器学习而得到分类模型、利用所述分类模型对新获得的被测细胞进行分析、判别或分类的方法的第一示意图。
[图7B]为使用任意时间点时的细胞的1时间点状态测量信息、和基于细胞的集成状态测量信息得到的分类结果进行机器学习而得到分类模型、利用所述分类模型对新获得的被测细胞进行分析、判别或分类的方法的第二示意图。
[图7C]为使用任意时间点时的细胞的1时间点状态测量信息、和基于细胞的集成状态测量信息得到的分类结果进行机器学习而得到分类模型、利用所述分类模型对新获得的被测细胞进行分析、判别或分类的方法的第三示意图。
[图8]为本发明的监测系统的流程图。
[图9]为包含荧光微珠及NIH3T3细胞的油包水型隔室的照片。
[图10]A为通过用荧光显微镜及明视野显微镜对担载有绿色荧光微珠的NIH3T3细胞进行拍摄而得到的复合照片。B为通过用荧光显微镜及明视野显微镜对担载有红色荧光微珠的K562细胞进行拍摄而得到的复合照片。C为通过用荧光显微镜及明视野显微镜对担载有绿色荧光微珠和红色荧光微珠的MIA-PaCa2细胞进行拍摄而得到的复合照片。
具体实施方式
监测细胞的动态变化的方法
本发明的监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法的特征在于，所述方法包括下述工序：
准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞或来源于其的物质和至少一个微珠，
通过经时性地反复一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，从而监测多个隔室中的各细胞或来源于其的物质的动态变化，其中，各隔室中的微珠的成像信息可彼此区分，且成为确定各隔室中的细胞的指标。
以下，基于图1及表1、2对本发明的监测方法的一个优选方式进行说明，但对本发明不构成特别限定。
本发明的监测方法中，如图1～3所示，通过对细胞群1、和微珠群2进行分配处理，从而准备包含细胞1’、和多个微珠2’的多个隔室3。其中，微珠2’的成像信息可彼此区分。
将多个不同的微珠2’组合进行分配时，可以使各隔室分别生成与微珠的组合对应的各种成像信息。例如，如表1所示，基于颜色(3种)、颜色的强度(浓度；3种)、大小(6种)的变化(variation)准备微珠2’的情况下，微珠的种类为合计645种。进而，对645种的多个微珠进行分配处理、每1个隔室随机地封入3个微珠的情况下，如表2所示，概率上产生大于107个模式(pattern)的不同的微珠组合。这样的微珠的组合可通过以微珠的成像信息作为指标而有利地用于确定隔室中的各种细胞。
[表1]
表1
内容 数量
微珠大小(NBS) 3、7、11μm 3
微珠颜色(NBC) 蓝、绿、红 3
微珠颜色强度(NIL) 染料的浓度为0、1、2、3、4、5 6
微珠种类(NBV) (NIL<sup>NBC</sup>-1)*NBS＝(6<sup>3</sup>-1)*3＝645 645
[表2]
表2
微珠的种类 组合的数量
每个隔室为3个微珠的组合 645 <sub>645</sub>C<sup>3</sup>＞10<sup>7</sup>
然后，本发明的监测方法中，在监测开始时(t＝0分钟(min))，一同测定各隔室3中的细胞1’或来源于其的物质的状态测量信息和微珠2’的成像信息。微珠2’或其组合在统计学上按各个隔室而言是唯一(unique)的，因此，能够将各隔室3中的细胞1’或来源于其的物质的状态测量信息与微珠2’的成像信息以一对一的对应关系进行关联。这样的关联是通过隔室化实现的，因此，即使在获得细胞的状态测量信息和微珠的成像信息后多个隔室混合而丧失顺序，本发明中仍然能够以各隔室中的微珠的成像信息作为指标而再次确定细胞或来源于其的物质。
图2及图3中，更具体地说明成像信息的分析路线。
图2为以控制大小、RGB、荧光亮度、其他光学特性而制作的n种(ID)微珠的成像信息作为指标的情况下的示意图。图2中，测量微珠的成像信息，将得到的微珠的成像信息与光学微珠ID联系起来。然后，图3中，实施包含细胞及微珠的各隔室的成像，将细胞的成像信息与微珠的成像信息进行关联。若采用这样的分析方法，则能够使用与微珠的成像信息联系起来的光学微珠ID信息确定细胞，另一方面，能够根据细胞的成像信息对各细胞的状态等进行分析。
然后，本发明的监测方法中，经过规定的时间(例如，t＝10分钟)后，再次一同获得隔室3中的细胞1’或来源于其的物质的状态测量信息和微珠2’的成像信息。通过如此经时性地反复获得细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，能够将各细胞(1’a、1’b、1’c…1’n)的各测定时间的状态测量信息进行集成，作为各细胞(1’a、1’b、1’c…1’n)的动态变化的数据。
各细胞或来源于其的物质的动态变化的种类只要能经时性地测定·集成相关的状态测量信息即可，没有特别限定。作为该细胞的动态变化的优选例，可举出细胞形态的变化、细胞内分子结构的变化、细胞活动的变化、及细胞间相互作用的变化等。如上所述，根据本发明，能够经时性、高效且准确地确定细胞或来源于其的物质的广泛的动态变化，因此，也能有利地用于后述的细胞的分类、药剂的筛选中。
以下，按各工序对本发明的方法进行具体说明。
隔室准备工序
本发明的监测方法中，如上所述，准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞或来源于其的物质和至少一个微珠。
细胞或来源于其的物质
从用于区分相似细胞间的表达信息的单细胞分析的观点考虑，本发明的隔室中的细胞优选为来源于细胞群或组织的细胞。
另外，从单细胞分析的观点考虑，细胞的数量优选每1个隔室为1个。然而，例如，测定细胞间的相互作用等多个细胞的动态变化时，每1个隔室的细胞的数量也可以为多个，本发明中也包括该方式。
对于作为测量对象的细胞的种类、形态而言，只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，可根据目的而选择细胞。因此，本发明的细胞可以是悬浮细胞，也可以是粘附细胞。
另外，测量对象也可以是来源于细胞的物质。作为所述来源于细胞的物质，可举出细胞的破碎物、细胞的内容物、细胞的溶解物、细胞块、细胞球、类器官等，更具体而言，可举出DNA、RNA、蛋白质、病毒、其他来源于细胞的小分子等。对于将该来源于细胞的物质作为测量对象而言，在通过特定蛋白质的液态ELISA、特定DNA位点的读取、RNA的rtPCR等获得分子化学评价信息并用于细胞评价的方面是特别有利的。需要说明的是，也可在将细胞与细胞溶解缓冲液一同封入至隔室并生成隔室后，使隔室中生成细胞的内容物、破碎物，本发明中也包括该方式。
另外，对于细胞或来源于其的物质在隔室中的配置而言，只要不妨碍获得细胞或来源于其的物质的状态测量信息及微珠的成像信息即可，没有特别限定，可根据细胞或来源于其的物质的种类、大小、性质而以所期望的方式在隔室内配置细胞或来源于其的物质。根据一个方式，细胞或来源于其的物质的全部或一部分优选存在于隔室内。另外，根据本发明的其他方式，细胞或来源于其的物质优选存在于隔室表面上。该方式在细胞为粘附细胞时尤其可有利地应用。
另外，从用于流式细胞术等的观点考虑，可利用荧光色素对细胞或来源于其的物质进行标记。另外，如后文所述，将本发明的方法用于筛选药剂时，可预先将所期望的药剂添加至细胞中，也可将药剂添加至隔室中。
微珠
本发明的微珠可作为用于基于其成像信息确定各隔室中的细胞或来源于其的物质的指标使用。因此，本发明的微珠是能与细胞或来源于其的物质一同分配至隔室、且能测定成像信息的粒子。另外，被分配至各隔室的微珠作为确定隔室内的细胞或来源于其的物质的指标发挥功能，因此优选具有可彼此区分的成像信息。
微珠的成像信息可以是各微珠自身的固有的成像信息，也可以是多个微珠的组合的成像信息。
微珠的优选的成像信息没有特别限定，可举出大小、颜色、形状等。所谓“成像”，是指能基于空间信息而对在时间上重叠的微珠等被测对象的测量信息进行分离测定的方法，将通过该成像获得的被测对象的测量信息称为成像信息。
微珠的大小没有特别限定，优选参考可封入所期望的隔室中的大小进行选择。
另外，微珠的颜色没有特别限定，如表1中也已示出的那样，可通过增减染料的浓度、种类而适当调节。
微珠的形状可以是球状、大致球状、卵形、圆盘形、立方体及其他三维形状等各种形状中的任何。
作为微珠的优选的成像信息，可以是选自颜色(色彩)、荧光、大小、形状、物理波(例如声音、超声波)、电磁波(例如光、太赫兹)、透过、相位、散射、反射、相干拉曼、红外分光、拉曼分光、及吸收光谱中的至少一种测定信息。更具体而言，可举出荧光编码信息(例如，利用有机系荧光分子、来源于生物体的荧光分子、无机物质(量子点、重金属)、或它们的组合而赋予的信息)、吸收、拉曼散射编码信息[例如，利用吸收波长带(分子印迹)不同的有机分子、尤其是波长带不与细胞信号重叠的炔系化合物、无机物质或它们的组合而赋予的信息]、相位、散射、反射编码信息(例如，利用折射率根据浓度而异的有机分子、无机物质或它们的组合而赋予的信息)等。
需要说明的是，作为微珠的成像信息，也可适宜地利用隔室内的微珠单独或组合的空间配置信息。该空间配置也包括各隔室中的微珠与细胞的关系信息(例如，细胞与微珠的距离等)。
另外，微珠的材质只要能作为确定细胞的指标发挥功能即可，没有特别限定，可使用包括树脂及聚合物的各种材料制造。作为该材质，可举出例如水凝胶、无机物(量子点、重金属)等，更具体而言，可举出由硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、氧化锌(ZnO)等半导体材料制成的量子点(半导体纳米粒子)等半导体、金等重金属等无机物质、丙烯酰胺、琼脂糖、胶原蛋白、海藻酸等的水凝胶、聚苯乙烯、聚丙烯等树脂，优选为水凝胶，更优选为丙烯酰胺。
本发明的微珠的制造方法只要不妨碍本发明的效果即可，没有特别限定，例如，可按照已知的流式细胞术测定用微珠的制造方法进行制造。另外，在上述制造方法中，根据期望，可基于向各微珠赋予所期望的成像信息的目的而对用于制造微珠的模具、所添加的染料的种类或量等进行调节。
隔室
本发明的隔室具备至少一个细胞或来源于其的物质、和至少一个微珠，是能以隔室中的微珠的成像信息作为指标来与其他隔室区别开来的区室的单位。
对于本发明的隔室中的细胞与微珠的位置关系而言，只要不妨碍获得细胞的状态测量信息和微珠的成像信息即可，没有特别限定，可根据细胞、微珠的种类、大小、性质而适当设定。本发明中，例如，微珠与细胞可以在接触或不接触的情况下共同存在于同一隔室内，也可将微珠导入至细胞的内部。作为微珠与细胞接触的方式的优选例，可举出例如将细胞表面与微珠直接粘接、或通过使用市售的细胞膜修饰剂而使细胞担载微珠的方式等。另外，作为微珠与细胞不接触的方式的优选例，可举出在同一隔室内微珠与细胞不接合地存在的方式、通过使不包含细胞但包含微珠的子隔室与细胞接合而使细胞担载子隔室的方式等。另外，作为将微珠导入至细胞内部的方式的优选例，可举出微珠被细胞吞食的方式等。
另外，本发明的隔室或子隔室(不包含细胞但包含微珠的区室)的形态没有特别限定，可以是例如孔、液滴或凝胶粒子的形态。作为更具体的例子，可举出水性液滴、油滴、水凝胶的凝胶粒子、乳液等多种非混合界面重叠的水·油的结构体、多孔板的孔等。
另外，作为隔室或子隔室的基材，从测定细胞的活动状态的观点考虑，优选使用以水凝胶(例如，琼脂糖、胶原蛋白、海藻酸等)为代表的水性基材。
对于本发明的隔室或子隔室而言，从与其他隔室或子隔室区分的观点考虑，优选在其周缘部具有物理性的阻隔功能。作为该具有阻隔功能的隔室或子隔室的优选制造方法，可举出相分离法等。相分离法中，例如，将细胞及微珠与水性基材混合而得到水性液滴，使该水性液滴悬浮于疏水性溶剂中，由此可生成隔室。以下，更具体地说明本发明的隔室的制造工序。
图2为示出优选的隔室的制造工序的示意图。图2中，在流体聚焦装置(flowfocusing device)4的流路5中，细胞1’与水溶性基材一同作为试样液存在。另外，流路6中，存在作为微珠2’与水溶性基材的混合物的含有微珠2’的液体。并且，将含有细胞1’的试样液与含有微珠2’的液体在流体聚焦装置4中的流路中混合，然后释放至填充有油8的流路7中，通过相分离而生成含有细胞及微珠的隔室3。分配至1个隔室中的细胞及微珠的数量可通过调节流体聚焦装置4中的送液速度而简便地进行调节。上述方法也可在将细胞置换为来源于其的物质(破碎物、分泌物等)、或将细胞与来源于其的物质合用的情况下利用。
获得细胞或来源于其的物质的状态测量信息及微珠的成像信息
本发明的监测方法中，使用微珠的成像信息作为确定细胞的指标，经时性地反复一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息及微珠的成像信息，由此能够高效地监测多个隔室中的各细胞的动态变化。
对于本发明的细胞或来源于其的物质的状态测量信息而言，只要能够识别细胞的特征、状态即可，没有特别限定，可举出细胞或来源于其的物质的成像信息、从细胞或来源于其的物质得到的形态信息等。更具体而言，作为本发明的细胞或来源于其的物质的状态测量信息，可举出基于颜色、荧光、大小、形状、物理波(例如声音、超声波)、电磁波(例如光、太赫兹)、透过、相位、散射、反射、相干拉曼、红外分光、拉曼、或吸收光谱等的测定信息的成像信息，或者，核、细胞质的大小、细胞骨架的疏密度、内部结构的特征量、膜的均匀度、各结构的荧光强度、分子局部存在、分子或观察对象的位置关系等细胞的形态信息，可优选举出从细胞得到的形态信息。细胞或来源于其的物质的状态测量信息可利用已知方法获得，为成像信息时，也可利用与后述的微珠的成像信息同样的方法获得。
本发明中，微珠的成像信息的测定方法没有特别限定，可根据作为测定对象的细胞或来源于其的物质及微珠的性质而适当选择。作为本发明的成像信息的测定方法的优选例，可举出荧光成像、吸收成像、吸收光谱成像、相干拉曼成像(CARS法、SRS法)、相位成像、明视野成像等。
作为更具体的成像信息的测定方法，可举出流式细胞术(例如，对在流路中流动的隔室进行观察的成像流式细胞术法等)、显微镜测定(使用了常见的光学显微镜的微孔内的隔室观察法等)，从迅速测定单细胞的动态变化的观点考虑，优选流式细胞术。
以下，基于图3对本发明的监测方法中使用流式细胞术的具体方式进行说明。图3为利用流式细胞仪装置对多个隔室进行测定的一实施方式的示意图。图3的流式细胞仪装置9中，隔室3被保存于试样液容纳部10中，在流路中与鞘液11混合。对于混合液中的隔室3中的细胞及微珠而言，在流路中的信息测定位置12处测定及获得细胞的状态测量信息及微珠的成像信息，将隔室3分选至容器13中。容器13中，多个隔室3失去测定顺序而被随机地混合。然而，由于可利用微珠的成像信息来确定隔室3，因此，可在经过规定的时间后注入至试样液容纳部10，再次获得细胞的状态测量信息及微珠的成像信息。
细胞或来源于其的物质的分类方法
本发明的监测方法中，可基于细胞或来源于其的物质的经时性地获得的集成状态测量信息，进一步对各细胞或来源于其的物质进行分类。例如，如图4所示，可以将1个时间点或集成的细胞动态变化数据输入计算机，介由机器学习及在多维空间上的聚类处理，将各细胞标注为数个类型(I型、II型、III型…IV型)，进行分类。因此，根据其他方式，可提供细胞或来源于其的物质的分类方法，所述方法包括基于由本发明的监测方法得到的方法中经时性地获得的细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息，获得细胞或来源于其的物质的分类模型。另外，通过使用上述分类模型、参考新获得的被测细胞的状态测量信息，可对被测细胞进行分析、判别或分类。
另外，本发明的方法中，被测细胞的分析、判别或分类中，可以与上述集成状态测量信息独立地，进一步获得任意时间点时的细胞或来源于其的物质的1时间点状态测量信息并加以利用。该方式可由图5A～C所示的示意图表示。图5A～C中，首先，准备在t＝t0～t1(例如10分钟)期间获得的各细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息[X1…Xn]、和任意时间点(t＝tx)时的各细胞或来源于其的物质的1时间点状态测量信息[Z1…Zn](图5A)。然后，基于集成状态测量信息[X1…Xn]，生成评价标签[Y1…Yn](图5B)。该评价标签[Y1…Yn]包含被测细胞的动态变化或与其关联的细胞的特征(细胞的种类、细胞的活性、分化能力、分子产生能力等)。然后，针对任意时间点tx时的细胞或来源于其的物质的状态测量信息[Z1…Zn]，标注上述评价标签[Y1…Yn]，介由将其作为训练数据(training data)的机器学习，可制作分类模型(图5C)。通过使用如上述那样得到的细胞或来源于其的物质的分类模型，参考新获得的被测细胞的状态测量信息，可准确且高效地预测、鉴定被测细胞的动态变化或与其关联的细胞的特征(细胞的种类、细胞的活性、分化能力、分子产生能力等)。因此，根据优选方式，本发明的方法包括下述工序：使用基于细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息的分类模型，参考被测细胞或来源于其的物质的预先获得的状态测量信息，预测被测细胞或来源于其的物质的动态变化或与其关联的细胞的特征。
另外，根据本发明的方法，上述细胞或来源于其的物质的分类方法可以有利地用于筛选具有所期望的活性的细胞。本发明的方法优选用于抗体医药、细胞制剂的制造等中。例如，抗体医药的制造中，通过预先制作使用本发明的方法制作并与细胞的形态信息等相关联的分类模型，能够从被测细胞中高效地获得高水平产生抗体的细胞株。另外，以多能干细胞为代表的细胞医药的制造中，基于使用本发明的方法制作的与细胞的形态信息等相关的分类模型，能够高效地获得增殖能力、分化能力高的细胞。如上所述，通过将本发明的方法用于抗体医药、细胞制剂的制造，能够大幅度提高它们的制造成本、开发效率。
另外，本发明的分类方法中，可将已用药剂预先处理的细胞作为测定对象使用。对于通过这样的筛选获得的显示所期望的活性的细胞而言，可进行培养并使其增殖，有利地用作用于筛选具有所期望的活性的药剂的受试体。
药剂的筛选方法
另外，本发明的分类方法可用于：使药剂与细胞或来源于其的物质一同共存于隔室内，经时性地测定药剂对细胞或来源于其的物质的影响，选择针对特定的细胞显示所期望的活性的药剂。因此，根据优选方式，可提供：基于在本发明的方法中经时性地获得的细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息、对药剂进行筛选的方法。该方法中，各隔室优选含有药剂。各隔室中的药剂的种类、量可由本领域技术人员根据筛选的参数的对象(药剂的种类、量)等而适当设定变更。
系统/隔室组合物
另外，根据本发明的其他方式，可提供用于实施本发明的监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法的系统。该监测系统包含：隔室准备部，其准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞或来源于其的物质和至少一个微珠；及监测部，其通过经时性地反复一同测定各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，从而监测细胞或来源于其的物质的动态变化，其中，各隔室中的微珠的成像信息可彼此区分，且成为确定各隔室中所含的细胞或来源于其的物质的指标。本发明的监测系统中，可一体化地构成隔室准备部和监测部，因此，在高效且简便地实施本发明的监测方法的方面是有利的。
以下，基于图6的流程图对由隔室准备部、和监测部一体化构成的本发明的监测系统进行具体说明。
本发明的系统中，首先，在隔室准备部中，制造具备细胞或来源于其的物质和微珠的多个隔室。作为隔室准备部，可使用例如E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wideExpression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法、Microfuid Nanofluid(2008)5:585-594,Appled PhysicsLetters,Vol.85,No.13,27,2004年9月,p2649-2651、日本特表2013-508156号等中记载的流体聚焦装置、例如上述的图2的示意图所示的流体聚焦装置等。
另外，本发明的监测系统中，反复一同获得由隔室准备部制造的隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，从而进行测定。本发明的监测部反复获得细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，因此，其优选具备测定两种信息的信息获得部、和对从信息获得部得到的隔室进行收集的隔室收集部(容器等)。可以将由隔室收集部收集的隔室再次基于测定成像信息的目的输送至信息获得部。
作为构成监测部的装置，可由本领域技术人员根据所期望的信息而适当选择已知测定装置或其组合，作为优选例，可举出图3所示的流式细胞仪装置等。图3中，流式细胞仪装置9可作为监测部发挥功能，试样液容纳部13可作为隔室收集部发挥功能。
隔室组合物
另外，本发明的隔室可适当选择基材、界面结构而成为独立的组合物的形态。因此，根据本发明的其他方式，可提供用于本发明的方法的隔室组合物，其具备至少一个细胞和至少一个微珠。
本发明的系统及隔室组合物的制造及使用可按照本发明的监测系统的记载实施。
实施例
以下，基于实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。另外，只要没有特别提及，则本发明的测定方法及单位遵循日本工业标准(JIS)的规定。
例1：隔室制备预试验
基于以下的方法制造表1所示的多个微珠。
首先，使用微流体芯片制造凝胶生成用溶液的液滴。溶液组合物的分散相由含有10mM Tris-HCl[pH 7.6]、1mM EDTA、15mM NaCl的6.2％(v/v)丙烯酰胺、0.18％(v/v)双丙烯酰胺、0.3％(w/v)过硫酸铵、及所期望的浓度的荧光染料(蓝色：Alexa Fluor 405、绿色：钙黄绿素(calcein)、红色：罗丹明)构成。作为连续相，使用了含有0.4％(v/v)TEMED及0.5％(w/w)EA-表面活性剂的氟化物溶液。将上述液滴与200μL矿物油一同收集至1.5mL管中，于65℃孵育12小时，通过聚合而生成微珠。将生成并已固化的微珠用1mL的HFE-7500油中20％(v/v)的1H,1H,2H,2H全氟辛醇(B20156，Alfa Aesar)洗涤2次，用1mL的己烷(BDH1129-4LP，VWR)中1％(v/v)Span 80(S6760，Sigma)洗涤2次，在各步骤之间孵育0.5～1分钟，最终以5000rcf离心分离30秒。离心分离后，抽吸己烷相，将生成的BHM粒料溶解于1mL的TEBST缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 8.0]、137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM EDTA及0.1％(v/v)Triton X-100)中。然后，使用1mL TEBST缓冲液将微珠以5000rcf洗涤30秒，最终在1mLTEBST缓冲液中再次悬浮，除去微量的己烷。得到的微珠于4℃保存。
可以按照Microfuid Nanofluid(2008)5:585-594,Appled Physics Letters、Vol.85,No.13或E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide Expression Profilingof Individual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)的记载，制作封入有该微珠的隔室。另外，通过使用图3所示的流式细胞仪装置，可以将上述微珠作为指标区分各隔室。关于以上情况，使用封入有微珠的隔室、利用成像流式细胞仪装置进行了确认。关于成像流式细胞仪装置，按照本说明书的记载，由本申请的发明人对已知的装置进行适当设定变更。具体而言，可将已知的流式细胞仪装置(ImageStream(商标)X Mark IIImaging Flow Cytometer等)遵循与本说明书的图5等相关的记载进行设计变更而使用。
例2：隔室的制备
荧光微珠的制备
首先，制备荧光标记海藻酸溶液。具体而言，向2质量％海藻酸钠溶液中以所期望的浓度添加荧光色素，制备绿色、红色或蓝色的荧光海藻酸钠溶液。需要说明的是，作为绿色的荧光色素，使用了5FTSC(荧光素-5-氨基硫脲)；作为红色的荧光色素，使用了AF555酰肼；作为蓝色的荧光色素，使用了Cascade Blue酰肼。
将荧光海藻酸钠溶液与Ca-EDTA溶液(50mM-EDTA/50mM氯化钠pH7.2)等量混合而得到分散相溶液。然后，将分散相溶液添加至连续相溶液(含有表面活性剂的氟油)中，在得到的混合液中形成液滴。接着，向该混合液中以成为0.05％的方式添加乙酸，使Ca自Ca-EDTA游离，使液滴凝胶化从而生成荧光海藻酸微珠。混合液中的荧光微珠使用1H,1H,2H,2H全氟辛醇洗涤并进行分离。
按照上述步骤，获得绿色、红色或蓝色的荧光微珠。需要说明的是，本领域技术人员可根据需要而通过调节试剂的量来针对各荧光微珠设置多种大小、荧光强度(亮度)的种类，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。
荧光稳定性的确认
向5mL的TEBST缓冲液(10mM Tris-HCl[pH8.0]，137mM NaCl，2.7mM KCl，及0.1％(v/v)Triton X-100)中添加约10,000,000个微珠(绿色、红色及蓝色荧光微珠)并使其悬浮。于自添加至缓冲液起0小时及72小时的时间点，利用流式细胞仪确认微珠的亮度。结果，于0小时及72小时的时间点未确认到荧光光谱的变化。
按照E.Z.Macosko等，Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling ofIndividual Cells Using Nanoliter Droplets.Cell.161,1202-1214(2015)中记载的方法，利用使用了微流体技术的液滴制造方法制备包含上述荧光微珠和细胞的隔室。得到的隔室的照片示于图9。
例3
包含担载有荧光微珠的细胞的隔室的制备
(a)担载有绿色荧光微珠的NIH3T3细胞
将含有自培养板剥离的NIH3T3和BAM试剂(细胞膜修饰剂)的溶液进行离心分离处理，以隔室的形式得到担载有绿色荧光微珠的NIH3T3细胞。使用荧光显微镜及明视野显微镜对所得的担载有绿色荧光微珠的NIH3T3细胞进行拍摄而得到的复合照片示于图10A。
(b)担载有红色荧光微珠的K562细胞
除了使细胞为K562细胞、采用红色荧光微珠代替绿色荧光微珠以外，利用与(a)同样的方法，得到担载有红色荧光微珠的K562细胞。使用荧光显微镜及明视野显微镜对所得的担载有红色荧光微珠的K562细胞进行拍摄而得到的复合照片示于图10B。
(c)担载有绿色荧光微珠及红色荧光微珠的MIA-PaCa2细胞
除了使细胞为MIA-PaCa2细胞、作为微珠采用绿色荧光微珠及红色荧光微珠以外，利用与(a)同样的方法，得到担载有绿色荧光微珠和红色荧光微珠的MIA-PaCa2细胞。使用荧光显微镜及明视野显微镜对所得的担载有绿色荧光微珠和红色荧光微珠的MIA-PaCa2细胞进行拍摄而得到的复合照片示于图10C。
例4
针对例3(a)、(b)、(c)中得到的包含担载有荧光微珠的细胞的各隔室，经时性地反复一同获得细胞的状态(形态)测量信息和微珠的成像信息。流式细胞仪装置使用了按照Scientific Reports volume 4,Article number:7253(2014)的记载对已知的流式细胞仪装置进行设计变更而成的装置。由得到的隔室的图像信息分别获得细胞图像信息和微珠图像信息。并且，根据细胞图像信息监测细胞的动态变化后，确认了能根据微珠图像信息确定细胞。
附图标记说明
1 细胞群
1’ 细胞
2 微珠群
2’ 多个微珠
3 隔室
4 流体聚焦装置
5、6、7 流路
8 油
9 流式细胞仪装置
10 试样液容纳部10
11 鞘液
12 信息测定位置
13 容器

Claims (15)

1.监测细胞或来源于其的物质的动态变化的方法，所述方法包括下述工序：
准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞或来源于其的物质和至少一个微珠；
通过经时性地反复一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，从而监测多个隔室中的各细胞或来源于其的物质的动态变化，
其中，各隔室中的微珠的成像信息可彼此区分，且成为确定各隔室中的细胞或来源于其的物质的指标。
2.如权利要求1所述的方法，其中，每1个隔室的微珠的数量为多个。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞或来源于其的物质的动态变化为选自由细胞或来源于其的物质的形态变化、细胞内分子结构的变化、细胞活动的变化、及细胞间相互作用的变化组成的组中的至少一种变化。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，利用流式细胞仪或显微镜来获得所述细胞或来源于其的物质的状态测量信息或微珠的成像信息。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述微珠的成像信息为基于电磁波、荧光、相位、透过、分光、多色、散射、反射、相干拉曼、拉曼或吸收光谱的信息。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述微珠的成像信息为选自由微珠的空间信息、各隔室中的微珠的空间配置信息、及各隔室中的微珠和细胞的空间配置信息组成的组中的至少一种信息。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述隔室为孔、液滴或凝胶粒子的形态。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述隔室是包含水凝胶而成的。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述隔室为担载有微珠或包含微珠的子隔室的细胞。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，每1个隔室的细胞的数量为1个。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其包括下述工序：一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息、和微珠的成像信息后，对各隔室进行分选。
12.如权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述多个隔室还包含药剂。
13.筛选药剂的方法，所述方法基于在权利要求12所述的方法中经时性地获得的细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息来筛选药剂。
14.细胞或来源于其的物质的分类方法，其包括下述工序：基于在权利要求1～12中任一项所述的方法中经时性地获得的细胞或来源于其的物质的集成状态测量信息，获得细胞或来源于其的物质的分类模型。
15.监测细胞或来源于其的物质的动态变化的系统，其包含：
隔室准备部，其准备多个隔室，所述隔室具备至少一个细胞或来源于其的物质和至少一个微珠；及
监测部，其通过经时性地反复一同获得各隔室中的细胞或来源于其的物质的状态测量信息和微珠的成像信息，从而监测细胞的动态变化，
其中，各隔室中的微珠的成像信息可彼此区分，且成为确定各隔室中所含的细胞或来源于其的物质的指标。
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