CN110616258A - 用于检测rs4077515多态性位点的物质在评价或辅助评价ABPA中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测rs4077515多态性位点的物质在评价或辅助评价ABPA中的应用。通过对ABPA患者的CARD9^S12N位点进行检测，分析其等位基因位点上A所占的百分比，进而评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性。本发明对于APBA的防控及其发病机制进行研究具有重大意义。

Description

用于检测rs4077515多态性位点的物质在评价或辅助评价 ABPA中的应用

技术领域

本发明涉及分子遗传技术领域，特别涉及用于检测rs4077515多态性位点的物质在评价或辅助评价ABPA中的应用。

背景技术

变态反应性支气管肺曲霉菌病(Allergic Bronchopulmonary Aspergillosis,ABPA)是肺曲霉菌病的一种，其致病菌为曲霉菌(Aspergillas，Asp)，尤以烟曲霉菌(Aspergillas fumigatus，Af)最为常见。

ABPA的主要免疫应答为Th2介导的细胞免疫应答，Th2细胞能分泌白细胞IL-4、IL-5和IL-13,有助于IgE产生,促进嗜酸粒细胞分化成熟。ABPA典型的病理学特征包括①富含嗜酸性粒细胞的肉芽肿，主要累及支气管和细支气管；②支气管腔内黏液及纤维蛋白分泌增多，黏液栓形成，可见由嗜酸性粒细胞降解产生形成的夏科-雷登晶体，并导致中心性支气管扩张；③支气管及肺组织中有嗜酸性粒细胞、单核细胞的侵润，而周围血管炎较轻。从临床和免疫检查的角度，ABPA的主要特点嗜酸粒细胞增多，肺部大量浸润，血清总IgE水平显著升高以及烟曲霉菌特异的IgE和IgG阳性。本病最常见的临床症状为喘息，急性发作时可由发热、咳嗽、头痛、全身不适、咳白色或粘液泡沫痰，可由金棕色或墨绿色胶冻样痰栓，部分患者出现咳血。慢性期除有肺纤维化导致的呼吸困难、全身乏力和紫绀等症状，还可出现支气管扩张并感染等症状。

然而，目前对于ABPA精确诊断还相当匮乏。同时，对于如何利用分子遗传手段对遗传风险因子进行预测，进而评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性还未曾报道。

发明内容

基于此，有必要提供一种用于检测rs4077515多态性位点的物质在评价或辅助评价ABPA中的应用，以利于APBA的早期防控。

用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质在制备评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病危险性的产品或检测系统中的应用。

在其中一实施例中，所述CARD9基因rs4077515多态性位点的基因型表现为AA、AG或GG，当CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比大于65％时，待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性相对升高。

在其中一实施例中，所述rs4077515多态性位点为：以RNA反转录得到的cDNA为模板，采用引物扩增得到的扩增产物的编码CARD9蛋白第12位氨基酸的核苷酸，所述引物由序列表1所示的正向引物和序列表2所示的反向引物组成。

在其中一实施例中，用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质为：用于直接测序法的物质、用于焦磷酸测序的物质、用于基因芯片测序的物质、用于二代测序的物质、用于SNaPShot技术测序的物质、用于TaqMan技术测序的物质、用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的物质、用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的物质、用于聚合酶链式反应与焦磷酸测序法相结合的物质、用于杂交的方法的物质、用于引物延伸的方法的物质、用于构象方法的物质、或用于高分辨溶解曲线分析的物质。

在其中一实施例中，所述用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质为用于焦磷酸测序的物质，包括：引物、反应底物、待测单链和酶；

所述反应底物主要由5′-磷酰硫酸和荧光素组成，所述酶主要由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶组成。

在其中一实施例中，所述待测个体为哮喘病患者或肺囊性纤维化患者。

在其中一实施例中，待测样品来自所述待测个体的血液、尿、唾液、胃液、头发或离体组织。

一种用于评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性的试剂盒，包括用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质。

一种用于评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性的检测系统，包括检测单元和数据分析单元；

所述检测单元用于检测待测个体的CARD9基因rs4077515多态性位点，并获得检测结果；

所述分析单元用于对检测单元的检测结果进行分析处理，评估待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性。

在其中一实施例中，所述检测结果为CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比。

在其中一实施例中，所述分析单元进行评估时，按以下操作进行：

判断检测单元的CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比是否大于或等于65％；

对于CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比大于或等于65％的待测个体，评估其患变态反应性支气管肺曲霉菌病的概率。

本发明有益效果如下：

rs4077515是人类基因组上CARD9基因的一个单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)位点，该SNP导致Card9基因编码的蛋白质第12位氨基酸由丝氨酸(Serine)变异为天冬酰胺(Asparagine)，即p.Ser12Asn(S12N)。生物信息学分析发现S12N变异位于CARD9分子的CARD结构域，该结构域被认为介导其与Bcl-10和MALT1相互作用形成CBM复合体，该复合体对于激活经典NF-κB(p65)至关重要。

本发明的申请人将基础试验与临床试验相结合，首次报道CARD9^S12N变异在人群中高频存在，且其是烟曲霉菌引起的过敏性支气管肺曲霉病的易感因素。机制上，申请人通过大量的研究首次发现CARD9^S12N变异通过影响CARD9与RelB的结合，进而抑制CARD9依赖的MALT1对RelB的切割，促进其核转位，激活非经典NF-κB(RelB)通路及下游靶基因IL-5的转录，促进嗜酸性粒细胞的活化和Th2型免疫反应，促进ABPA的发生。在此过程中，S12N作为一个功能获得性(gain-of-function)变异，激活非经典NF-κB(RelB)，而经典的NF-κB(p65)激活不受影响。另外，申请人还发现，烟曲霉菌感染巨噬细胞可刺激CARD9 S12N蛋白通过蛋白酶体途径降解，而野生型CARD9蛋白不受影响。这些结果提示一些致病菌在致病过程中，可能通过调节CARD9蛋白的稳定性，下调机体保护性的经典NF-κB(p65)信号强度，来抵抗宿主的免疫清除。

另外，通过对临床病人进一步研究发现，在ABPA患者中有超过50％的病人均为S12N的杂合突变；且对其PBMC研究发现与S12N纯合突变存在类似的表型。进一步研究发现，S12N杂合变异的病人存在等位基因不平衡表达——即ABPA患者优先表达携带S12N突变的等位基因。因此，基于CARD9^S12N的不平衡表达只存在于ABPA患者中，可通过建立分子遗传的方法，对ABPA患者的CARD9^S12N位点进行检测，通过分析其等位基因位点上A所占的百分比，进而对患者的遗传背景以及其发病机制进行精准的预测和治疗，进而可达到最优化的治疗效果，因此可以用检测rs4077515多态性位点的物质评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性。

附图说明

图1为实施例1的CARD9的cDNA焦磷酸测序的结果实例；

图2实施例1的CARD9基因型为G/A杂合子的病人与健康对照中，通过焦磷酸测序检测到的CARD9:g.136372044G>A等位基因在RNA中所占比例。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

需要说明的是，本发明并非以疾病的诊断治疗为目的，以获取中间结果并辅助变态反应性支气管肺曲霉菌病的防控为目的。

本发明提供了一种用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质在制备评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性的产品或检测系统中的应用。

其中，rs4077515多态性位点为：以RNA反转录得到的cDNA为模板，采用引物扩增得到的扩增产物的编码CARD9蛋白第12位氨基酸的核苷酸，引物由序列表1所示的正向引物和序列表2所示的反向引物组成。

在一实施例中，CARD9基因rs4077515多态性位点的基因型表现为AA、AG或GG，当CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比大于或等于65％时，待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性相对升高。其中，CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比可以通过直接测序方法、焦磷酸测序(Pyprosequencing)、焦磷酸测序法、基因芯片、二代测序技术、微测序(SNaPShot)或TaqMan探针技术等来进行测定。也可以采用基于引物延伸的方法、基于构象分析的方法，例如：限制性片段长度多态性(RFLP)分析、单链构象多态性(SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析、变性高效液相色谱技术(dHPLC)分析等来进行检测。

用于检测rs4077515多态性位点的物质可为上述方法中用到的物质，例如为：用于直接测序法的物质；或用于焦磷酸测序的物质；或用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的物质；或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的物质；或用于聚合酶链式反应与焦磷酸测序法相结合的物质；或用于以下任一种SNP分型方法的物质：基于杂交的方法、基于引物延伸的方法、基于构象分析的方法或高分辨溶解曲线分析方法。

在一实施例中，用于检测rs4077515多态性位点的物质为用于焦磷酸测序的物质。具体地，该物质主要由引物、反应底物、酶和待测单链组成。其中，引物由序列表1所示的正向引物和序列表2所示的反向引物组成；反应底物主要由5’-磷酰硫酸和荧光素组成；酶主要由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶组成。

焦磷酸测序的原理是引物与模板退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到测定DNA欲裂的目的。焦磷酸测序技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。

此外，含有本发明的基因的待测样品可以从待测个体的细胞获得，如来自待测个体的血液、尿、唾液、胃液、头发或离体组织。在一实施例中，待测样品来自待测个体的血液。可以先从待测个体的细胞获得含本发明的基因的待测样品，然后按照常规方法提取目标基因的DNA。

本发明中，待测个体无特别限定，可以为各国籍、各民族的人，也可以为健康人或有疾病史的人。在一实施例中，待测个体为中国汉人。在另一实施例中，待测个体为哮喘病患者或肺囊性纤维化患者。

在慢性持续性支气管哮喘患者中，ABPA的患病率约为12.9％，在入住ICU的重症支气管哮喘患者中ABPA的患病率可高达38.6％，在肺囊性纤维化的患者中约为7～9％，以儿童和青少年多见，发病率无差异，56％患者10岁前有哮喘病史，提示患者ABPA的发生可能与其先天性免疫缺陷有关。英国一份报告称46例门诊哮喘病人中11％符合ABPA诊断标准，美国报道42例激素依赖性哮喘中有7％具备ABPA的诊断标准。国内学者马艳良等选取200例门诊就诊的支气管哮喘患者中，发现烟曲霉皮肤点刺试验阳性者11例(5.5％)，其中5例诊断为ABPA，占总人数的2.5％；本校附属肺科医院于2002年1月至2008年7月诊治22例ABPA患者，其中男13例，女9例，有气喘症状者16例，无气喘症状者6例。Marc A等报道ABPA占肺嗜酸性细胞增多症80％，15～40％的哮喘患者对烟曲霉菌致敏，而对烟曲霉菌致敏的哮喘患者中，有25～30％会发展为ABPA。上述流行病学研究说明ABPA可能是哮喘患者死亡的一个特殊危险因素。因此，通过检测哮喘患者或肺囊性纤维化患者的rs4077515多态性位点的g.136372044G>A中A/G碱基比率，判断其患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性，可以有助于患者提前采取相应的治疗方案，防止演变为ABPA，也可以有助于预防向ABPA发展的相关药物、仪器、系统的研发。

另外，可以将用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质制备成试剂盒，以方便使用。在此不对试剂盒中物质进行特别限定，为任选能够检测rs4077515多态性位点的物质。

在一实施例中，试剂盒主要由引物、反应底物、酶和待测单链组成。其中，引物由序列表1所示的正向引物和序列表2所示的反向引物组成；反应底物主要由5’-磷酰硫酸和荧光素组成；酶主要由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶组成。

本发明一实施方式的用于评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性的检测系统，包括检测单元和数据分析单元。其中，检测单元用于检测待测个体的CARD9基因rs4077515多态性位点，并获得检测结果；分析单元用于对检测单元的检测结果进行分析处理，评估待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性。其中，检测结果为CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比。当分析单元进行评估时，按以下操作进行：判断检测单元的CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比是否大于或等于65％；对于CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比大于或等于65％的待测个体，评估其患变态反应性支气管肺曲霉菌病的概率。

上述试剂盒和检测系统可以更方便进行rs4077515多态性位点的检测，进而判断待测个体患ABPA的危险性，指导治疗，同时对于ABPA相关的药物和仪器的研究具有重大意义。

下面列举基体实施方式对本发明进行说明。

实施例1 rs4077515多态性位点与变态反应性支气管肺曲霉菌病(ABPA)的关联分析

一、研究人群

选取61例ABPA患者(经同济大学附属医院确诊)和167例健康被试者，均对以下实验知情同意，均为中国汉族人。

二、试验方法

1、全血标本采集

采集全血前，使被采取者知情且获得被采取者同意。采集被试者外周静脉血5mL，与抗凝剂肝素混合。

2.提取全血标本中的DNA

使用Gentra Puregene Blood kit(Qiagen,158389)试剂盒提取全血标本中的基因组。

a.将900μL的RBC裂解液加入1.5mL离心管中。

b.向离心管中加入300μL全血，颠倒混匀10次。室温放置1min。

c.13000*g离心20s。小心弃上清，至残留约10μl溶液于管中。

d.在残留溶液中重悬沉淀。

e.加入300μL细胞裂解液，反复吹打10s。

f.加入100μL蛋白沉淀液，震荡混匀。13000*g离心1min。

g.取上清到新的离心管中，加入300μL异丙醇，反复吹打混匀。

h.13000*g离心1min，弃上清。

i.使用300μL 70％乙醇洗涤沉淀，13000*g离心1min，弃上清，室温晾干10min。

j.加入100μL DNA溶解液，65℃水浴5min溶解DNA。

3.PCR扩增目的片段

使用PrimeSTAR Max(Takara)对CARD9的cDNA进行PCR扩增。反应体系如下：

试剂	使用量
		2X PrimeSTAR Max	25μL
EXON2-3-F	1.5μL
		EXON2-3-R	1.5μL
DNA样品	2μL
		H<sub>2</sub>O	21μL

反应条件：变性温度：98℃，退火温度55℃，延伸温度72℃，延伸时间1min，循环数35。EXON2-3-F引物序列为：GTCTG AGAAG GAGTG GGAGC(如序列表3)。EXON2-3-R引物序列为：GCTGT GGCAG GAGCT CAGG(如序列表4)。

取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶检测，确认产物无可见其他杂带。样品保存于-20℃。

4.基因序列测序

将DNA样品委托上海生工生物股份有限公司进行测序，测序引物为EXON2-3-F。

测试结果如表1。

表1:CARD9:g.136372044G>A SNP分布以及ABPA和健康人中的基因频率

^*OR,风险比(odds ratio)；CI,置信区间(confidence interval)；HWE哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium).

从表1可以看出，在健康人中，GG、GA和AA的表达频率分别为62.3％、31.7％和6％；而在ABPA患者中，GG、GA和AA的表达频率分别为34.4％、55.8％和9.8％，可见，杂合人群在健康人中的比例低于ABPA患者。此外，从表1还可以看出A碱基健康人中出现的频率为21.9％，而在ABPA患者中出现频率为37.7％，远高于健康人群中A碱基出现频率。故，推测GA基因型中的A等位基因可能导致ABPA病的易感性。

实施例2 杂合型CARD9:g.136372044G>A SNP对ABPA患者CARD9的功能影响分析

一、研究人群

选取10例ABPA杂合被试者(经同济大学附属医院确诊)和22例健康杂合被试者，均对以下实验知情同意，均为中国汉族人。

二、试验方法

1、全血标本采集

采集全血前，使被采取者知情且获得被采取者同意。采集被试者外周静脉血5mL，与抗凝剂肝素混合。

2.提取全血标本中的外周血单核细胞(PBMC)

使用PBS对样品按照1：1的比例进行稀释。将15mL的淋巴细胞分离液(MPBiomedicals)加入50mL离心管中，并将全血样品缓缓加入离心管中。室温下400*g离心15-30分钟。离心后，吸出上层5-10mL血浆。吸取淋巴细胞层和一半的下层淋巴细胞分离液层到另一离心管中。加入等体积的平衡盐缓冲液至离心管中，室温160*g离心10min。使用平衡盐缓冲液清洗细胞后，使用RPMI1640(Gibco)+10％FBS培养PBMC。

3、抽提PBMC的RNA

将2*10⁶个PBMC溶于1mL的TRIZOL(Life technologies)中，于4℃12000*g离心5min，弃细胞碎片沉淀。

向溶液中加入200μL的三氯甲烷，震荡混匀，室温静置3min后，于4℃12000*g离心20min。小心吸取上层水相于新的RNase free的EP管中，加入等体积的异丙醇(约500μL)，混匀并室温静置30min。

静置后的样品于4℃12000*g离心20min，弃净上清。

加入70％乙醇清洗沉淀，4℃12000*g离心15min，弃上清。在重复洗涤一次。

室温晾干沉淀10min左右，加入DEPC水(Sangon biotech)溶解沉淀。

使用NanoDrop 2000(ThermoFisher)对RNA浓度进行检测，要求A260/A280比值于1.5-2.0之间，A260/A230于1.5-2.3。RNA样品于-80℃保存。

4、cDNA的合成

使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)对RNA样品进行反转录：

a.配制反应混合液：

试剂	使用量
		Oligo dT引物(50uM)	1μL
dNTP混合物(各10mM)	1μL
		RNA样品	1ug
RNase free H<sub>2</sub>O	直到10μL

b.65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

c.配置下列反转录反应液：

试剂	使用量
		上述反应液	10μL
5X PrimScript II缓冲液	4μL
		RNase抑制剂	0.5μL
PrimeScript II RTase	1μL
		RNase free H<sub>2</sub>O	4.5μL

d,缓慢混匀。于42℃孵育30-60min，再置于95℃中15min终止反应。冰上冷却。

5、克隆CARD9 cDNA片段

使用PrimeSTAR Max(Takara)对CARD9的cDNA进行PCR扩增。反应体系如下：

试剂	使用量
		2X PrimeSTAR Max	25μL
hCARD9-F	1.5μL
		hCARD9-R	1.5μL
cDNA样品	2μL
		H<sub>2</sub>O	21μL

反应条件：变性温度：98℃，退火温度55℃，延伸温度72℃，延伸时间1min，循环数35。hCARD9-F引物序列为：ccatcaggaagtgcacaggc(如序列表1)。hCARD9-R已进行5‘端生物素标记(Sangon biotech)，序列为：ccggacgcgtcgatgatcat(如序列表2)。

取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶检测，确认产物无可见其他杂带。样品保存于-20℃，用于后续焦磷酸测序。

6、焦磷酸测序

焦磷酸测序主要包括以下步骤：将生物素标记的PCR产物与链霉亲和素包被的磁珠连接；通过变性将与磁珠吸附的PCR产物非模板链与磁珠解离，作为焦磷酸测序模板；测序引物与模板链退火配对后进行焦磷酸测序。

a.PCR产物连接磁珠

涡旋使磁珠在溶液中均匀分布。将PCR产物进行离心确保其中没有气泡。取出25μL的PCR产物，与22μL的binding buffer和3μL的磁珠进行混合。混合样品置于振动器上1300rpm震荡5min。

b.解离PCR产物中的非模板链

准备以下缓冲液：

Annealing buffer：pH 7.6:20mM Tris–HAcetate,2mM Mg-Acetate.

Denaturing buffer:0.2M NaOH.

Washing buffer:10mM Tris–HAcetate,pH 7.6.

使用磁力架使磁珠后贴在管壁上，弃净溶液。使用70％乙醇洗涤一次磁珠，弃乙醇。使用Denaturing buffer重悬磁珠，浸泡5s后，弃溶液。重复使用Denaturing buffer重悬一次磁珠，弃净溶液。再使用Washing buffer洗一次磁珠，弃净溶液。最后使用Annealingbuffer重悬磁珠，并迅速加入终浓度为0.4uM焦磷酸测序引物，使用振动器1300rpm震荡5min混匀。

c.测序引物与模板链退火

将混匀样品于95℃加热2min，缓慢冷却至室温。

d.焦磷酸测序

使用 Q96 ID(QIAGEN)焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序。

e.数据分析

使用PyroMark ID software version 1.0的allelic quantification(AQ)模式进行数据分析。SNP位点被突出显示。不同的测试质量被不同的颜色标记：蓝色代表质量合格，黄色代表需要进一步检查，红色代表测试失败，具体试验结果如图1和图2。

另外，分别针对22例健康的杂合被试者和10例患有ABPA的杂合被试者外周血样品中CARD9基因的mRNA上g.136372044G>A SNP位点进行分析，具体结果如图1。

从图1可以看出，当被试者的基因型为纯合的G/G或A/A时，显示GG或AA所占的百分比均大于95％。而当被试者的基因型为杂合G/A时，显示的A所占的百分比在50％到90％之间。

从图2可以看出，健康的杂合被试者A所占的比例在60％左右，而被试的杂合ABPA患者A所占的比例均高于65％。

说明CRAD9基因mRNA上的g.136372044G>A SNP位点上A所占的百分比能够作为评估ABPA发生的风险指标，为未来的针对杂合人群是否患有ABPA的诊断和ABPA的治疗提供参考依据。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市第十人民医院

<120> 用于检测rs4077515多态性位点的物质在评价或辅助评价ABPA中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccatcaggaa gtgcacaggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ccggacgcgt cgatgatcat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtctgagaag gagtgggagc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gctgtggcag gagctcagg 19

Claims (10)

1.用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质在制备评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病危险性的产品或检测系统中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CARD9基因rs4077515多态性位点的基因型表现为AA、AG或GG，当CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比大于或等于65％时，待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性相对升高。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述rs4077515多态性位点为：以RNA反转录得到的cDNA为模板，采用引物扩增得到的扩增产物的编码CARD9蛋白第12位氨基酸的核苷酸；所述引物由序列表1所示的正向引物和序列表2所示的反向引物组成。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质为：用于直接测序的物质、用于焦磷酸测序的物质、用于基因芯片测序的物质、用于二代测序的物质、用于SNaPShot技术测序的物质、用于TaqMan技术测序的物质、用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的物质、用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的物质、用于聚合酶链式反应与焦磷酸测序法相结合的物质、用于杂交的方法的物质、用于引物延伸的方法的物质、用于构象分析方法的物质、或用于高分辨溶解曲线分析的物质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质为用于焦磷酸测序的物质，包括：引物、反应底物、酶和待测单链；

所述引物由序列表1所示的正向引物和序列表2所示的反向引物组成；

所述反应底物主要由5′-磷酰硫酸和荧光素组成；

所述酶主要由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶组成。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述待测个体为哮喘病患者或肺囊性纤维化患者。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，待测样品来自所述待测个体的血液、尿、唾液、胃液、头发或离体组织。

8.一种用于评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CARD9基因rs4077515多态性位点的物质。

9.一种用于评价或辅助评价待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性的检测系统，其特征在于，包括检测单元和数据分析单元；

所述检测单元用于检测待测个体的CARD9基因rs4077515多态性位点，并获得检测结果；

所述分析单元用于对检测单元的检测结果进行分析处理，评估待测个体患变态反应性支气管肺曲霉菌病的危险性。

10.根据权利要求9所述的检测系统，其特征在于，所述检测结果为CARD9:g.136372044G>A等位基因位点上A所占的百分比。