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CN110612352A - 具有改变的膜脂组成的重组宿主细胞 - Google Patents

具有改变的膜脂组成的重组宿主细胞 Download PDF

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CN110612352A CN201880028304.5A CN201880028304A CN110612352A CN 110612352 A CN110612352 A CN 110612352A CN 201880028304 A CN201880028304 A CN 201880028304A CN 110612352 A CN110612352 A CN 110612352A
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Abstract

本发明属于重组生物技术领域，特别属于蛋白质表达领域。本发明一般涉及一种从宿主细胞中表达目标蛋白(POI)的方法。本发明特别涉及改善宿主细胞表达和/或分泌目标蛋白的能力，和宿主细胞用于蛋白表达的用途。本发明还涉及细胞培养技术，更具体地涉及培养细胞以生产用于医学目的或食品的所需分子。

Description

具有改变的膜脂组成的重组宿主细胞
技术领域
本发明属于重组生物技术领域，特别属于蛋白质表达领域。本发明一般涉及一种通过过表达或低表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸以从宿主细胞中表达目标蛋白(POI)的方法。本发明特别涉及改善宿主细胞表达和/或分泌目标蛋白的能力，和宿主细胞用于蛋白表达的用途。本发明还涉及细胞培养技术，更具体地涉及培养细胞以生产用于医学目的或食品或饲料产品的所需分子。
背景技术
已经采用原核和真核宿主完成了目标蛋白(POI)的成功生产。最突出的实例是如大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)的酵母菌，如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或里氏木霉(Trichoderma reesei)的丝状真菌，或如CHO细胞的哺乳动物细胞。虽然某些蛋白质产量容易以高效率实现，但是很多其它蛋白质仅以相对低的水平生产。
一般而言，异源蛋白质合成可受到不同水平的限制。可能的限制是靶蛋白的转录和翻译、蛋白质折叠和(若适用)分泌、二硫键形成和糖基化以及聚集和降解。通过利用强启动子或增加异源基因的拷贝数可以增强转录。然而，这些措施明显达到了平台期，表明转录下游的其它瓶颈限制了表达。
在宿主细胞中高水平的蛋白产量可在一个或多个不同步骤，如折叠、二硫键的形成、糖基化、在细胞内转运或从细胞中释放时限制。基于目前本领域最先进的知识，甚至当宿主生物体的全部基因组的DNA序列可获得时，许多涉及的机制仍然不能被完全理解且不能预测。此外，以高产量产生重组蛋白的细胞的表型可以是降低的生长速率、降低的生物质形成和整体降低的细胞适应性。
在本领域中进行了各种尝试以期改善目标蛋白的产量，比如使应促进蛋白质折叠、氨基酸的外部补充等的分子伴侣过表达。
然而，仍然需要改善宿主细胞生产和/或分泌目标蛋白的能力的方法。本发明要解决的技术问题是满足这种需要。
上述技术问题的方案是提供手段(比如工程化的宿主细胞)、应用所述手段的方法和用途以通过在真核宿主细胞中过表达或低表达至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸从而增加所述宿主细胞中目标非膜蛋白(non-membrane protein of interest)的产量。这些手段、方法和用途将在本文中详述、在权利要求中列出、在实施例中示例性阐述并在附图中说明。
因此，本发明提供增加重组蛋白在宿主细胞中的产量的新方法和用途，所述方法和用途是简单且有效的并适用于在工业方法中使用。本发明还提供实现上述目的的宿主细胞。
***
必须指出的是，除非上下文另有明确指示，本文所用单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括所提及的复数且反之亦然。因此，例如，提及的“一种宿主细胞”或“一种方法”分别包括一种或多种此类宿主细胞或方法，并且提及的“所述方法”包括本领域普通技术人员已知的可被修饰或置换的等效步骤和方法。类似地，例如，提及的“方法(methods)”或“宿主细胞(host cells)”分别包括“一种宿主细胞”或“一种方法”。
除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一元素。本领域技术人员将承认或采用常规实验能够确定，本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。本发明旨在涵盖这种等价方案。
术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任意其它组合”的含义。例如，A、B和/或C的含义是A、B、C、A+B、A+C、B+C和A+B+C。
本文所用术语“约(about)”或“大约(approximately)”的含义是在给定值或范围的20％内，优选地10％内，和更优选地5％内。其还包括具体数目，如，约20包括20。
术语“少于”、“多于”或“大于”包括具体数目。例如，少于20的含义是≤20，多于20的含义是≥20。
本说明书及权利要求或项目全文中，除非上下文有其它要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数(或步骤)、或整数(或步骤)的集合。其并不排除任何其它的整数(或步骤)、或整数(或步骤)的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够以术语“含有(containing)”、“由…组成(composed of)”、“包含(including)”、“具有(having)”或“携带(carrying)”替代，且反之亦然，比如术语“具有(having)”能够以术语“包括/包含(comprising)”替代。当本文使用时，“由…组成”排除了未在权利要求/项目中规定的任何整数或步骤。当本文使用时，“本质上由…组成”并不排除实质上不影响权利要求/项目的基本特征和新特征的整数或步骤。本文的每一个实例中，术语“包括/包含”、“本质上由…组成”和“由…组成”中任意一个可被其它两个术语中的任意一个替代。
另外，在描述本发明的代表性实施方案时，本说明书可能将本发明的方法和/或过程体现为特定的步骤顺序。然而，就方法或过程并不依赖于本文所陈述的特定步骤顺序来说，该方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。本领域的普通技术人员能够理解，其他步骤的顺序也是可能的。因此，在本说明书中所描述的步骤的具体顺序，不应被解释为对权利要求的限制。此外，涉及本发明的方法和/或过程的权利要求也不应被限制于以所记载次序的其步骤的操作，而且本领域的技术人员能够容易地理解，这些顺序可以是变化的并且仍然被包含在本发明的精神和范围之内。
应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等。本文所使用的名词只用于描述特定实施方案的目的，其并不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求/项目限定。
本说明书全文所引用的所有的出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导书等)，无论在前还是在后，均以其全文通过引入并入本文。本文无任何内容能被解释为承认由于在先发明，本发明不早于这样的公开内容。就通过引入并入的材料与本说明书矛盾或不一致来说，本说明书将取代任何这样的材料。
发明概述
本发明基于这样一个对编码参与脂质代谢的蛋白(“本发明的辅助蛋白”)的多核苷酸序列(“本发明的多核苷酸”)的惊人发现：所述蛋白的表达、优选地过表达导致目标蛋白(POI)的产量增加。本文通过工程化宿主细胞以使得这些细胞能够过表达至少一种、即一种或多种参与脂质代谢的蛋白，从而提供了用于改善POI的产量的方法和材料。优选的多核苷酸编码(参与脂质代谢的)辅助蛋白，所述辅助蛋白包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
本发明还基于这样一个对编码参与脂质代谢的蛋白(“本发明的辅助蛋白”)的多核苷酸序列(“本发明的多核苷酸”)的惊人发现：所述蛋白的低表达导致目标蛋白(POI)的产量增加。在本文中，有时将此类辅助蛋白称为“KO蛋白”或“KO辅助蛋白”。因此，即使在本申请的文本中使用的术语仅是“辅助蛋白”或“辅助基因”或“辅助因子”等，但若在技术上有意义(即若低表达导致POI产量增加)，则术语“辅助蛋白”或“辅助基因”或“辅助因子”等也包括“KO辅助蛋白”或“KO辅助基因”或“KO辅助因子”。本文还通过工程化宿主细胞以使得这些细胞能够低表达至少一种、即一种或多种参与脂质代谢的蛋白，从而提供了可用于改善POI的产量的方法和材料。优选的多核苷酸编码(参与脂质代谢的)KO蛋白，所述KO蛋白包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
本发明的发明人的发现是相当令人惊讶的，因为本发明之前技术人员最多仅知道，脂质代谢与使真核宿主细胞中、特别是真菌宿主细胞中目标蛋白的产量增加无关。不受理论的束缚，脂质代谢的修饰(modification)改变真核宿主细胞中、特别是真菌宿主细胞中的生物膜脂组成，由此积极地影响重组蛋白质的产生。
假设至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地至少一种本文所述的辅助蛋白的过表达使本文所述的宿主细胞的膜(特别是细胞膜或内质网膜)的脂质组成改变，从而导致使目标蛋白产量增加。
具体而言，假设至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地至少一种本文所述的辅助蛋白的过表达，优选地通过增加神经酰胺和/或含肌醇的磷酰神经酰胺(比如肌醇磷酰神经酰胺(IPC)、甘露糖-肌醇磷酰神经酰胺(MIPC)、甘露糖-二肌醇-磷酰神经酰胺(M(IP)2C))的C26脂肪酰基部分的量和/或降低神经酰胺和/或含肌醇的磷酰神经酰胺(比如肌醇磷酰神经酰胺(IPC)、甘露糖-肌醇磷酰神经酰胺(MIPC)、甘露糖-二肌醇-磷酰神经酰胺(M(IP)2C))的C24脂肪酰基的量，使鞘脂类的分子种类模式(pattern)改变，从而导致使目标蛋白产量增加。
优选地，在神经酰胺如IPC、MIPC和(M(IP)2C中引入的链长为26个碳(C26)的脂肪酰基的相对量增加至少100％，而链长为24个碳(C24)的脂肪酰基的相对量降低至少70％。
优选地，至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地至少一种本文所述的辅助蛋白的过表达导致大多数鞘脂的分子种类模式改变，即神经酰胺和IPC类含肌醇的磷酰神经酰胺(IPC、MIPC、M(IP)2C)的脂肪酰基部分优先含有C26而非C24。与空载体相比，取决于鞘脂种类(神经酰胺、IPC、MIPC和M(IP)2C)的C26的量增强至少100％。
还假设至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地至少一种本文所述的辅助蛋白的过表达使IPC和MIPC的量减少(约230％)和或使成熟形式的含肌醇的磷酰神经酰胺M(IP)2C的形成增加至少6倍(600％)，从而导致使目标蛋白产量增加。
进一步假设至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地至少一种本文所述的辅助蛋白(在本文中为KO辅助蛋白)的低表达消耗非极性贮存脂质三酰甘油(TG)，从而导致使目标蛋白产量增加。
术语“产量”是指本文所述的POI或模型蛋白、特别是SDZ-Fab(重链SEQID NO:37和轻链SEQ ID NO:38)和HyHEL-Fab(重链SEQ ID NO:39和轻链SEQ ID NO:40)的量，其分别是例如从工程化宿主细胞中收获的，并且增加的产量可归因于宿主细胞生产或分泌的POI的量增加。产量可以以mg POI/g宿主细胞的生物质(以干细胞重量或湿细胞重量来度量)表示。当本文使用时，术语“效价”类似地指生产的POI或模型蛋白的量，以mg POI/L培养上清液表示。当从工程化宿主细胞中获得的产量与从工程化之前的宿主细胞(即从未工程化的宿主细胞)中获得的产量相比较时，可以测定产量的增加。优选地，当将“产量”用于本文所述的模型蛋白的上下文中时，其是按照实施例4c的描述测定的。因此，当将所述“产量”用于本文所述的模型蛋白的上下文中时，其还指“Fab产量”或“Fab效价”。Fab效价以mg/L表示，Fab产量以mg/g生物质(以干细胞重量或湿细胞重量来度量)表示。SDZ-Fab和HyHEL-Fab分别由SEQ ID NO:41和42以及SEQ ID NO:43和44中所示的核苷酸序列编码。
简言之，用编码本文所述的辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸工程化分别表达模型蛋白HyHEL-Fab和SDZ-Fab的巴斯德毕赤酵母菌株CBS7435mutS pPM2d_pAOX HyHEL和/或CBS7435mutS pPM2d_pAOX SDZ(它们的产生参见实施例1)。对于共过表达，将编码辅助蛋白的基因克隆在巴斯德毕赤酵母GAP启动子的控制下，然后转化至实施例3b和实施例4中所述的生产Fab的菌株中。基因也可以在巴斯德毕赤酵母AOX启动子的控制下。对于低表达，将编码KO蛋白或其功能同系物的基因从生产Fab的菌株的基因组中敲除(参见实施例5)。在25℃下，使工程化的细胞于含有10g/L甘油和50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YP-培养基中生长过夜(参见实施例4a)。将这种培养物的等分试样(对应终OD600为2.0)转移至包含20g/L葡萄糖和葡萄糖料片的合成培养基M2中(描述于实施例4a)，并在25℃下培养25小时。将培养物洗涤并重悬浮于合成培养基M2中，并将等分试样(对应终OD600为4.0)转移至用5g/L甲醇补充的合成培养基M2中。每12小时添加甲醇(5g/L)。48小时后，通过离心收获细胞。通过测量源于1mL细胞悬浮液的细胞沉淀的重量来测定生物质。所述上清液用于通过ELISA的SDZ-Fab或HyHEL-Fab的分别定量(描述于实施例4c)。具体而言，抗-人IgG抗体(如ab7497，Abcam)用作包被抗体，如山羊抗-人IgG(Fab特异性)抗体(如碱性磷酸酶缀合的SigmaA8542)用作检测抗体。将商业的人Fab/κ，IgG片段用作起始浓度为100ng/mL的标准品，相应地稀释上清液样品。基于细胞被工程化以过表达多肽之前和之后的POI产量的比较，可测定产量的增加。示于实施例中的涉及模型蛋白SDZ-Fab和/或HyHEL-Fab的标准试验可以用于测定产量差异。
因此，本发明涉及一种或多种新发现的参与脂质代谢的多肽(本文也称为“辅助蛋白”)及其或它们用于增加POI产量的用途。本发明基于、但不限于如SEQ ID NO:1至17中任一个所示的辅助蛋白或其功能同系物。功能同系物的含义在本申请的后面部分中定义。本发明的辅助蛋白的核苷酸序列分别列于SEQ ID NO:19至35中。如本文所用，这些蛋白是指，在本发明中其复数形式或单数形式可互换，但是除非另有明确规定外，应当理解为单数形式。包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列的参与脂质代谢的辅助蛋白在真核宿主细胞中优选地被过表达，而包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列的参与脂质代谢的辅助蛋白在真核宿主细胞中优选地被低表达。
本发明还涉及编码所述辅助蛋白的多核苷酸(以下称为“本发明的多核苷酸”)和它们提高POI产量的单独的或组合的用途。可将所述多核苷酸引入宿主细胞，或若已经存在于所述细胞中，以使得该多核苷酸被过表达的方式操作它们。用于辅助蛋白过表达的本发明的多核苷酸编码SEQ ID NO:1至15，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或其功能同系物中的任一个。所述多核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO:19至33，比如SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33。包含示于SEQ ID NO:19-33中任一个的核苷酸序列的编码参与脂质代谢的辅助蛋白的多核苷酸在真核宿主细胞中优选地被过表达，而包含示于SEQ ID NO:34或35的核苷酸序列的编码参与脂质代谢的辅助蛋白的多核苷酸在真核宿主细胞中优选地被低表达。
因此，本发明提供了一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中过表达至少一种编码参与脂质代谢的辅助蛋白的多核苷酸，由此与不过表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比，使所述目标蛋白的产量增加。优选地，所述参与脂质代谢的辅助蛋白不是转录因子。优选地，所述参与脂质代谢的辅助蛋白包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
优选地，在辅助蛋白过表达的上下文中，脂质代谢是鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运或麦角甾醇生物合成。通过使本发明的辅助蛋白过表达来修饰脂质代谢可以改变真核宿主细胞中、特别是真菌宿主细胞中的生物膜脂组成，由此积极地影响重组蛋白的产生。因此，当在本文中使用时，在过表达的上下文中的术语“脂质代谢”可以由术语“生物膜脂组成的修饰”代替，优选地由在真核宿主细胞中、特别是在真菌宿主细胞中的生物膜脂组成的修饰代替。生物膜脂组成的修饰可受鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运或麦角甾醇生物合成的影响。
本发明还提供了一种用于增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：
-工程化所述宿主细胞以过表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，优选地示于SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
-工程化所述宿主细胞以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸，
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
此外，本发明提供了一种用于增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：
-提供所述宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以过表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，优选地示于SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ IDNO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸；
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物并表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
在用于增加目标蛋白产量的方法的上下文中，“工程化以过表达/低表达编码辅助蛋白的多核苷酸的步骤”和“工程化以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸的步骤”的顺序可以可替换地颠倒，以使得“工程化以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸的步骤”在“工程化以过表达/低表达编码辅助蛋白的多核苷酸的步骤”之前。值得注意的是，如本文所述，当辅助蛋白被过表达和/或KO蛋白被低表达时，目标蛋白的产量增加。
本发明还提供了用于制备目标蛋白的重组真核宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以过表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸。
优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以过表达编码辅助蛋白的多核苷酸，所述辅助蛋白包含SEQ ID NO:1-15中任一个，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，优选地SEQ ID NO:1-9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12-15中任一个或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
在优选的实施方案中，与被工程化以过表达所述辅助蛋白之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当过表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab(重链SEQ ID NO:37和轻链SEQ ID NO:38；图2)或HyHEL-Fab(重链SEQ ID NO:39和轻链SEQ ID NO:40；图2)的产量增加至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％，和优选地至少10％。工程化之前的宿主细胞不会过表达本发明的辅助蛋白，而工程化之后的宿主细胞在适宜的培养条件下能够过表达所述辅助蛋白。已惊奇地发现，在实施例中描述的示例性重组细胞均能够使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少20％(1.2倍改变)。
本发明还涉及一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中低表达至少一种编码参与脂质代谢的辅助蛋白的多核苷酸，由此与不低表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比，使所述目标蛋白的产量增加。优选地，所述参与脂质代谢的辅助蛋白包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
因此，本发明提供了一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：
-工程化所述宿主细胞以低表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，
-工程化所述宿主细胞以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸，
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
此外，本发明提供了一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括：
-提供所述宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以低表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸；
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以低表达所述参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物并表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
在用于增加蛋白产量的方法的上下中，“工程化以过表达/低表达编码辅助蛋白的多核苷酸的步骤”和“工程化以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸的步骤”的顺序可以可替换地颠倒，以使得“工程化以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸的步骤”在“工程化以过表达/低表达编码辅助蛋白的多核苷酸的步骤”之前。值得注意的是，如本文所述，当辅助蛋白被过表达和/或KO蛋白被低表达时，目标蛋白的产量增加。
本发明还提供了用于制备目标蛋白的重组真核宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以低表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸。优选地，所述参与脂质代谢的蛋白包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
优选地，在辅助蛋白低表达的上下文中，辅助蛋白参与的脂质代谢是脂质贮存。优选地，在辅助蛋白低表达的上下文中，所述辅助蛋白不是转录因子。通过使本发明的辅助蛋白低表达来修饰脂质代谢可以改变真核宿主细胞中、特别是真菌宿主细胞中的生物膜脂组成，由此积极地影响重组蛋白的产生。因此，当在本文中使用时，在低表达的上下文中的术语“脂质代谢”可以由术语“生物膜脂组成的修饰”代替，优选地由在真核宿主细胞中、特别是在真菌宿主细胞中的生物膜脂组成的修饰代替。生物膜脂组成的修饰可受非极性贮存脂质生物合成或磷脂代谢的影响。
在优选的实施方案中，与被工程化以低表达所述辅助蛋白之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白，优选地当低表达时，可以使宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab(重链SEQ ID NO:37和轻链SEQ ID NO:38)或HyHEL-Fab(重链SEQ ID NO:39和轻链SEQ ID NO:40)的产量增加至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或至少200％，和优选地至少10％。工程化之前的宿主细胞不会低表达本发明的辅助蛋白，而工程化之后的宿主细胞在适宜的培养条件下能够低表达所述辅助蛋白。已惊奇地发现，在实施例中描述的示例性重组细胞均能够使模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量增加至少20％(1.2倍改变)。在一些情况下，产量增加80％，如实施例6b所示。
本发明还提供本文所述的宿主细胞用于制备目标蛋白(POI)的用途。所述宿主细胞可有利地用来引入编码一种或多种POI的多核苷酸，然后可以将该宿主细胞在适宜条件下培养以表达所述POI，通过其本发明的辅助蛋白被过表达或低表达。
本发明还提供一种编码辅助蛋白的分离的多核苷酸，所述辅助蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:1-17中任一个，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-17中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。优选地，本发明还提供一种编码辅助蛋白的分离的多核苷酸，所述辅助蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
同样地，本发明还提供了一种编码辅助蛋白的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含示于SEQ ID NO:19-36中任一个的核苷酸序列。用于整合至宿主细胞或用于制备目标蛋白的多核苷酸优选地包含示于SEQ ID NO:19-33或36中任一个的核苷酸序列。类似地，将如本文所述的分离的辅助蛋白用于制备目标蛋白。这种多核苷酸编码包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列的辅助蛋白。
本发明还涉及一种组合物，其包含至少0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的目标蛋白和编码本发明的辅助蛋白的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地与异源启动子连接。
附图说明
图1示出了本发明的辅助蛋白的氨基酸和多核苷酸序列。
图2示出了模型蛋白SDZ-Fab和HyHEL-Fab各自的重链和轻链的氨基酸和多核苷酸序列，和酿酒酵母α交配因子信号前导序列。加下划线的序列部分代表与模型蛋白序列融合的SEQ ID NO.45或46的前导序列。
本发明的项目
1、一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中过表达至少一种编码至少一种参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸，由此与不过表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比，使所述目标蛋白的产量增加。
2、项目1的方法，其中所述参与脂质代谢的蛋白参与鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运、脂质贮存、麦角甾醇生物合成、脂肪酸生物合成、磷脂酸生物合成和/或磷脂代谢过程。
3、项目1或2的方法，其中所述参与脂质代谢的蛋白不是转录因子。
4、项目1-3中任一项的方法，其中所述至少一种参与脂质代谢的蛋白包含示于SEQID NO:1-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ IDNO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
5、项目1-4中任一项的方法，其中所述至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1-9中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQID NO:1-9中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
6、项目1-4中任一项的方法，其中所述至少一种参与磷脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
7、项目1-4中任一项的方法，其中所述至少一种参与脂质转运的蛋白包含示于SEQID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
8、项目1-4中任一项的方法，其中所述至少一种参与麦角甾醇生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
9、项目1-4中任一项的方法，其中所述参与脂质贮存的蛋白包含示于PP7435_Chr4-0493和PP7435_Chr4-0494(ARV1)之间的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr4-0493和PP7435_Chr4-0494之间的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
10、项目1-9中任一项的方法，所述方法包括：
-工程化所述宿主细胞以过表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个，优选地示于SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-1529中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
-工程化所述宿主细胞以包含编码目标蛋白的异源多核苷酸，
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
11、一种制备根据项目1-9中任一项的目标蛋白的方法，所述方法包括：
-提供所述宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以过表达至少一种编码至少一种蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个，优选地示于SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物并表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
12、项目1-11中任一项的方法，其中所述过表达通过在所述宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个拷贝的所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸实现。
13、项目1-12中任一项的方法，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在所述宿主细胞的至少一个染色体中。
14、项目13的方法，其中所述整合是异位地和/或在天然基因座上。
15、项目14的方法，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在所述宿主细胞基因组的AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4、TYR1、HIS3、LEU2、URA3、LYS2、ADE2、TRP1、GAL1或ADH1基因座上。
16、项目1-12中任一项的方法，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸包含在载体或质粒中。
17、项目15的方法，其中所述载体为YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、pPUZZLE或2μm质粒。
18、项目1-17中任一项的方法，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸的过表达通过采用驱动所述多核苷酸表达的重组启动子实现。
19、项目1-17中任一项的方法，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸的过表达通过修饰与编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的内源多核苷酸可操作地连接的调节序列实现。
20、项目18的方法，其中所述启动子为PAOX1、PTPI、PPGK、PGAPDH、PLAC、PGAL、PPGI、PGAP、PTEF、PENO1、PTPI、PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1、PFLD、PICL、PTHI、PSSA1、PHSP90、PKAR2、PGND1、PGPM1、PTKL1、PPIS1、PFET3、PFTR1、PPHO8、PNMT1、PMCM1、PUBI4、PRAD2、PPET9、PFMD、PGAL1、PADH1、PADH2/GAP、PCUP1或PMAL。
21、项目1-17中任一项的方法，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸的过表达通过采用增强子以增强所述启动子的活性实现。
22、项目21的方法，其中所述增强子为酵母菌上游激活序列UAS/GAL。
23、项目1-22中任一项的方法，其中所述真核宿主细胞为非哺乳动物真核宿主细胞。
24、项目23的方法，其中所述非哺乳动物真核宿主细胞为真菌宿主细胞。
25、项目24的方法，其中所述真菌宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Komagataella sp.、曲霉菌(Aspergillus sp.)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
26、项目1-25中任一项的方法，其中1、2、3、4、5、6、7、8或更多种参与脂质代谢的蛋白被过表达，所述参与脂质代谢的蛋白选自SEQ ID NO:1-15、PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)和PP7435_Chr1-0794(PSD1)中任一个或其功能同系物。
27、项目26的方法，其中以下的至少一个参与鞘脂生物合成的蛋白被过表达：
(a)包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(b)包含示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(c)包含示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(d)包含示于SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(e)包含示于SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(f)包含示于SEQ ID NO:1、3和4的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、3和4的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(g)包含示于SEQ ID NO:1、3、4和8的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、3、4和8的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(h)包含示于SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(i)包含示于SEQ ID NO:1和7的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和7的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(j)包含示于SEQ ID NO:5、6和9的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:5、6和9的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(k)包含示于SEQ ID NO:1、5、6和9的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、5、6和9的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(l)包含示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(m)包含示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(n)包含示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(o)包含示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(p)包含示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(q)包含示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(r)包含示于PP7435_Chr3-0788(SUR2)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr3-0788的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(s)包含示于PP7435_Chr3-1005(PHS1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr3-1005的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(t)包含示于PP7435_Chr2-0350(AUR1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr2-0350的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(u)包含示于PP7435_Chr4-0626(IFA38)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr4-0626的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(v)包含示于PP7435_Chr3-0669(SCS7)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr3-0669的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(w)包含示于SEQ ID NO:3和4的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:3和4的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(x)包含示于SEQ ID NO:3、4和8的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:3、4和8的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(y)包含示于SEQ ID NO:1和5的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和5的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(z)包含示于SEQ ID NO:1、5和6的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、5和6的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(aa)包含示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-0788(SUR1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-0788的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(bb)包含示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-1005(PHS1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-1005的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(cc)包含示于SEQ ID NO:1和8的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和8的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(dd)包含示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr2-0350(AUR1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr2-0350的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(ee)包含示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr4-0626(IFA38)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr4-0626的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(ff)包含示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-0669(SCS7)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-0669的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
28、项目26的方法，其中以下的参与磷脂生物合成的蛋白被过表达：
(a)包含示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(b)包含示于PP7435_Chr3-0636(CRD1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr3-0636的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(c)包含示于PP7435_Chr3-0950(SLC4)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr3-0950的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(d)包含示于PP7435_Chr2-0585(PIS1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr2-0585的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
29、项目26的方法，其中以下的参与脂质转运的蛋白被过表达：
(a)包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(b)包含示于PP7435_Chr1-0934(PRY1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr1-0934的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(c)包含示于SEQ ID NO:11和PP7435_Chr1-0934(PRY1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:11和PP7435_Chr1-0934的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
30、项目26的方法，其中以下的参与脂肪酸生物合成的蛋白被过表达：
(a)包含示于PP7435_Chr4-0963(FAD12)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr4-0963的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
31、项目26的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种参与脂质转运的蛋白被过表达。
32、项目31的方法，其中所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物，和所述参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
33、项目26的方法，其中至少一种参与磷脂生物合成的蛋白和至少一种参与脂质转运的蛋白被过表达。
34、项目33的方法，其中所述参与磷脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:10或PP7435_Chr1-0794(PSD1)的氨基酸序列，和所述参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
35、项目34的方法，其中以下的参与磷脂生物合成或参与脂质转运的蛋白被过表达：
a)包含示于SEQ ID NO:10和11的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:10和11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
b)包含示于PP7435_Chr1-0794(PSD1)和SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于PP7435_Chr1-0794和SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
36、项目26的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种参与磷脂生物合成的蛋白被过表达。
37、项目36的方法，其中所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和所述参与磷脂生物合成的蛋白包含示于PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
38、项目37的方法，其中以下的参与鞘脂生物合成或参与磷脂生物合成的蛋白被过表达：
a)包含示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr2-0585(PIS1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr2-0585的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
b)包含示于SEQ ID NO:1和10的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和10的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
c)包含示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-0636(CRD1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和PP7435_Chr3-0636的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
39、项目26的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种参与磷脂生物合成的蛋白被过表达。
40、项目26的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种参与麦角甾醇生物合成的蛋白被过表达。
41、项目40的方法，其中所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和所述参与麦角甾醇生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
42、项目26的方法，其中至少一种参与麦角甾醇生物合成的蛋白和至少一种参与脂质转运的蛋白被过表达。
43、项目42的方法，其中所述参与麦角甾醇生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:12或13的氨基酸序列，和所述参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
44、项目37的方法，其中以下的参与麦角甾醇生物合成或参与脂质转运的蛋白被过表达：
a)包含示于SEQ ID NO:12和11的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:12和11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
b)包含示于SEQ ID NO:13和11的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:13和11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
45、项目26的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种参与脂质贮存的蛋白被过表达。
46、项目45的方法，其中所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，和所述参与脂质贮存的蛋白为ARV1，其包含位于PP7435_Chr4-0493和PP7435_Chr4-0493之间的氨基酸序列。
47、项目1-46中任一项的方法，所述方法进一步包括过表达分子伴侣。
48、项目47的方法，其中所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
49、项目47或48的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种分子伴侣被过表达。
50、项目49的方法，其中所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物，和所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
51、项目47或48的方法，其中至少一种参与麦角甾醇生物合成的蛋白和至少一种分子伴侣被过表达。
52、项目51的方法，其中所述参与麦角甾醇生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其功能同系物，和所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
53、项目1-52中任一项的方法，其中所述至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的过表达使所述宿主细胞的膜的脂质组成改变，其中优选地所述宿主细胞的膜为细胞膜或内质网膜。
54、项目1-53中任一项的方法，其中所述目标蛋白为目标非膜蛋白。
55、项目54的方法，其中所述目标非膜蛋白为酶、治疗性蛋白、食品添加剂或饲料添加剂。
56、项目55的方法，其中所述治疗性蛋白包含抗体或仍具有结合其抗原的活性的抗体片段。
57、项目1-56中任一项的方法，其中与工程化之前的宿主细胞相比，所述参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物使模型蛋白HyHEL(重链SEQ ID NO:39和轻链SEQ ID NO:40)的产量增加至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％。
58、一种用于制备目标蛋白的重组真核宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以过表达至少一种编码至少一种参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸。
59、项目58的宿主细胞，其中所述参与脂质代谢的蛋白参与鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运、麦角甾醇生物合成、脂肪酸生物合成、磷脂酸生物合成和/或磷脂代谢过程。
60、项目58或59的宿主细胞，其中所述参与脂质代谢的蛋白不是转录因子。
61、项目58-59中任一项的宿主细胞，其中所述参与脂质代谢的蛋白包含示于SEQID NO:1-15中任一个，优选地示于SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
62、项目58-61中任一项的宿主细胞，其中与工程化之前的宿主细胞相比，所述参与脂质代谢的蛋白或所述其功能同系物使模型蛋白HyHEL(重链SEQ ID NO:39和轻链SEQID NO:40)的产量增加至少10％。
63、项目58-62中任一项的宿主细胞，其中所述过表达通过在所述宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个拷贝的所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸实现。
64、项目58-63中任一项的宿主细胞，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在所述宿主细胞的基因组中。
65、项目64的宿主细胞，其中所述整合是异位地和/或在天然基因座上。
66、项目65的宿主细胞，其中所述至少一种编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在所述宿主细胞基因组的AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4、TYR1、HIS3、LEU2、URA3、LYS2、ADE2、TRP1、GAL1或ADH1基因座上。
67、项目58-66中任一项的宿主细胞，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸包含在载体或质粒中。
68、项目67的宿主细胞，其中所述载体为YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体、pGPD-2、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pHWO10、pPUZZLE或2μm质粒。
69、项目56-68中任一项的宿主细胞，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸的过表达通过采用驱动所述多核苷酸表达的重组启动子实现。
70、项目69的宿主细胞，其中所述启动子为PAOX1、PTPI、PPGK、PGAPDH、PLAC、PGAL、PPGI、PGAP、PTEF、PENO1、PTPI、PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1、PFLD、PICL、PTHI、PSSA1、PHSP90、PKAR2、PGND1、PGPM1、PTKL1、PPIS1、PFET3、PFTR1、PPHO8、PNMT1、PMCM1、PUBI4、PRAD2、PPET9、PFMD、PGAL1、PADH1、PADH2/GAP、PCUP1或PMAL。
71、项目69的宿主细胞，其中所述编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的多核苷酸的过表达通过采用增强子以增强所述启动子的活性实现。
72、项目71的宿主细胞，其中所述增强子为酵母菌上游激活序列UAS/GAL。
73、项目58-72中任一项的宿主细胞，其中所述真核宿主细胞为非哺乳动物真核宿主细胞。
74、项目73的宿主细胞，其中所述非哺乳动物真核宿主细胞为真菌宿主细胞。
75、项目74的宿主细胞，其中所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Komagataella sp.、曲霉菌(Aspergillus sp.)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
76、项目58-75中任一项的宿主细胞，其中1、2、3、4、5、6、7、8或更多种参与脂质代谢的蛋白被过表达，所述参与脂质代谢的蛋白选自SEQ ID NO:1-15、PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)和PP7435_Chr1-0794(PSD1)中任一个或其功能同系物。
77、项目76的宿主细胞，其中如项目27-46所定义的蛋白被过表达。
78、项目58-77中任一项的宿主细胞，其进一步被工程化以过表达编码分子伴侣的多核苷酸。
79、项目78的宿主细胞，其中所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
80、项目78或79的宿主细胞，其中如项目48-52所定义的蛋白被过表达。
81、项目58-80中任一项的宿主细胞，其包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸序列。
82、项目81的宿主细胞，其中所述目标蛋白为目标非膜蛋白。
83、项目82的宿主细胞，其中所述目标非膜蛋白为酶、治疗性蛋白、食品添加剂或饲料添加剂。
84、项目83的宿主细胞，其中所述治疗性蛋白包含抗体或仍具有结合其抗原的活性的抗体片段。
85、项目58-84中任一项的宿主细胞，其中通过修饰与编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的内源多核苷酸可操作地连接的调节序列实现过表达。
86、项目58-85中任一项的宿主细胞，其中所述至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的过表达使所述宿主细胞的生物膜的脂质组成改变。
87、项目58-86中任一项的宿主细胞用于制备目标蛋白的用途。
88、根据项目87的宿主细胞的用途，其中所述目标蛋白为目标非膜蛋白。
89、一种编码蛋白的分离的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ IDNO:1-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，或一种编码分子伴侣的分离的多核苷酸，所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-15和18中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
90、一种分离的多核苷酸，其包含示于SEQ ID NO:19-33和36中任一个的核苷酸序列。
91、根据项目89或90的分离的多核苷酸用于整合在宿主细胞中的用途。
92、根据项目89或90的多核苷酸用于制备目标蛋白、优选地制备目标非膜蛋白的用途。
93、根据项目89或90的多核苷酸用于制备宿主细胞的用途。
94、一种分离的多肽，其包含与示于SEQ ID NO:1-15和18中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸序列。
95、根据项目94的分离的多肽用于制备目标蛋白、优选地制备目标非膜蛋白的用途。
96、一种组合物，所述组合物包含至少0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的目标蛋白和根据项目86或87的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地与异源启动子连接，和其中所述目标蛋白优选地为目标非膜蛋白。
97、一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中低表达至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸，由此与不低表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比，使所述目标蛋白的产量增加。
98、项目97的方法，其中所述参与脂质代谢的蛋白参与脂质贮存。
99、项目97或98的方法，其中所述参与脂质代谢的蛋白不是转录因子。
100、项目98或99的方法，其中所述参与脂质贮存的蛋白包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
101、项目100的方法，其中以下的参与脂质贮存的蛋白被低表达：
a)包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
b)包含示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
c)包含示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
102、项目97-101中任一项的方法，其中所述目标蛋白是目标非膜蛋白。
103、项目97-102中任一项的方法，其中所述真核宿主细胞为非哺乳动物真核宿主细胞。
104、项目103的方法，其中所述非哺乳动物真核宿主细胞为真菌宿主细胞，其中优选地所述真菌宿主细胞为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Komagataella sp.、曲霉菌(Aspergillus sp.)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，其中所述真菌宿主细胞甚至更优选为巴斯德毕赤酵母。
105、项目97-104中任一项的方法，所述方法包括：
-工程化所述宿主细胞以低表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，
-工程化所述宿主细胞以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸，
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
106、一种制备根据项目97-104中任一项的目标蛋白的方法，所述方法包括：
-提供所述宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以低表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸；
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以低表达所述参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物并表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
107、项目97-106中任一项的方法，其中以下的参与脂质代谢的蛋白被低表达：
a)包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
108、项目97-106中任一项的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中过表达至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸。
109、项目108的方法，其中所述被过表达并参与脂质代谢的蛋白参与脂质贮存、鞘脂生物合成、磷脂生物合成、磷脂代谢过程或磷脂酸生物合成。
110、项目109的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白被过表达，和至少两种参与脂质贮存的蛋白被低表达。
111、项目110的方法，其中以下的参与鞘脂生物合成的蛋白被过表达，和以下的参与磷脂贮存的蛋白被低表达：
a)包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被过表达，和包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被低表达，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
112、项目109的方法，其中至少一种参与磷脂生物合成的蛋白被过表达，和至少两种参与脂质贮存的蛋白被低表达。
113、项目112的方法，其中所述参与磷脂生物合成的蛋白包含示于PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和所述参与脂质贮存的蛋白包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列。
114、项目113的方法，其中以下的参与磷脂生物合成的蛋白被过表达，和以下的参与脂质贮存的蛋白被低表达：
a)包含示于PP7435_Chr3-0950(SLC4)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被过表达，和包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被低表达，其中所述功能同系物分别与示于PP7435_Chr3-0950、SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
b)包含示于PP7435_Chr1-0160(SLC1)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被过表达，和包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被低表达，其中所述功能同系物分别与示于PP7435_Chr1-0160、SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
c)包含示于PP7435_CHR1-0078(GPT2)的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被过表达，和包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被低表达，其中所述功能同系物分别与示于PP7435_CHR1-0078、SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
d)包含示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被过表达，和包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被低表达，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:10、16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
115、项目109的方法，其中至少一种参与磷脂代谢过程的蛋白被过表达，和至少两种参与脂质贮存的蛋白被低表达。
116、项目115的方法，其中所述参与磷脂代谢过程的蛋白被过表达并包含示于PP7435_Chr2-0045(CDS1)的氨基酸序列或其功能同系物，和所述参与脂质贮存的蛋白被低表达并包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于PP7435_Chr2-0045、SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
117、项目116的方法，其中至少一种参与磷脂酸生物合成的蛋白被过表达，和至少两种参与脂质贮存的蛋白被低表达。
118、项目117的方法，其中所述参与磷脂酸生物合成的蛋白被过表达并包含示于PP7435_Chr3-1169(DGK1)的氨基酸序列或其功能同系物，和所述参与脂质贮存的蛋白被低表达并包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于PP7435_Chr3-1169、SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
119、项目109的方法，其中至少一种参与脂质贮存的蛋白被过表达和至少两种参与脂质贮存的蛋白被低表达。
120、项目119的方法，其中所述被过表达的参与脂质贮存的蛋白包含示于PP7435_Chr3-0741(ARE2)的氨基酸序列或其功能同系物，和所述被低表达的参与脂质贮存的蛋白包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于PP7435_Chr3-0741、SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
121、一种用于制备目标蛋白的重组真核宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以低表达至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸，其中所述目标蛋白优选为非膜蛋白。
122、项目121的宿主细胞，其中所述参与脂质代谢的蛋白参与脂质贮存并包含示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
123、项目121或122的宿主细胞，其中以下的参与脂质贮存的蛋白被低表达：
a)包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
b)包含示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
c)包含示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
124、项目121至123中任一项的宿主细胞，其中至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸如项目109-120中所定义的被过表达。
125、项目121至124中任一项的宿主细胞，其中与工程化之前的宿主细胞相比，所述参与脂质代谢的蛋白或所述其功能同系物使模型蛋白HyHEL(重链SEQ ID NO:39和轻链SEQ ID NO:40)的产量增加至少10％。
126、一种通过改变真核宿主细胞的膜的脂质组成使所述宿主细胞中目标蛋白的产量增加的方法，其中优选地所述宿主细胞的膜为细胞膜或内质网膜。
127、项目126的方法，其中通过至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地本文所述的一种辅助蛋白的过表达改变所述宿主细胞的膜的脂质组成。
128、一种通过改变鞘脂的分子种类模式、优选地通过增加神经酰胺和/或含肌醇的磷酰神经酰胺(肌醇磷酰神经酰胺、甘露糖-肌醇磷酰神经酰胺、甘露糖-二肌醇-磷酰神经酰胺)的C26脂肪酰基部分的量和/或降低神经酰胺和/或含肌醇的磷酰神经酰胺(肌醇磷酰神经酰胺、甘露糖-肌醇磷酰神经酰胺、甘露糖-二肌醇-磷酰神经酰胺)的C24脂肪酰基部分的量，使真核宿主细胞中目标蛋白的产量增加的方法。
129、项目128的方法，其中通过至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地本文所述的一种辅助蛋白的过表达改变鞘脂的分子种类模式。
130、项目128或129的方法，其中在神经酰胺IPC、MIPC和M(IP)2C中引入的链长为26个碳(C26)的脂肪酰基的相对量增加至少100％，而链长为24个碳(C24)的脂肪酰基的相对量降低至少70％。
131、一种通过使IPC和MIPC的量减少(约30％)和/或使成熟形式的含肌醇的磷酰神经酰胺M(IP)2C的形成增加至少6倍(600％)，使真核宿主细胞中目标蛋白的产量增加的方法。
132、项目131的方法，其中通过至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地本文所述的一种辅助蛋白的过表达实现所述减少和/或增加。
133、项目131或132的方法，其中对鞘脂的相对分布影响如下：M(IP)2C增加6倍(600％)，IPC和MIPC的相对分布减少约30％。
134、一种通过消耗真核宿主细胞的非极性贮存脂质三酰甘油(TG)使所述细胞中目标蛋白的产量增加的方法。
135、项目134的方法，其中通过至少一种参与脂质代谢的蛋白、优选地本文所述的一种辅助蛋白的低表达实现所述消耗。
发明详述
本发明部分地基于这一惊人的发现，即本文所述的参与脂质代谢的辅助蛋白的表达，若为过表达(包含示于SEQ ID NO:1-15的氨基酸序列的辅助蛋白)或低表达(包含示于SEQ ID No:16和17的氨基酸序列的KO辅助蛋白)时，发现该种表达使目标蛋白的产量增加。将有时在本文中、特别是在实施例中使用的每种辅助蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列及其相应的基因标识符列于下表1，命名为“OE”(过表达的辅助蛋白)和“KO”(低表达的辅助蛋白)。在本文中和实施例6中详细描述了过表达的和低表达的辅助蛋白的组合。
表1
从Sturmberger等[J.Biotechnol.(2016).235(4):121-131)]中检索巴斯德毕赤酵母序列的基因特性，和从Cherry J.M.等[Nucleic Acids Res.(2012)40(Databaseissue D700-5)]中检索酿酒酵母序列的基因特性。将基因本体术语定义如下：“鞘脂”意指包括脂肪酸延伸的鞘脂生物合成；“转运”意指脂质转运；“磷脂”意指磷脂生物合成；“甾醇”意指麦角甾醇生物合成和“贮存”意指脂质贮存。从欧洲核苷酸数据集(ENA)中检索基因登录号，和从UniProtKB中检索蛋白质登录号。*KAR2序列(核苷酸以及氨基酸)仅对于巴斯德毕赤酵母菌株GS115注释，该菌株与CBS7435几乎相同。因此，将KAR2的基因/蛋白质登录号列于在巴斯德毕赤酵母菌株GS115背景下注释的序列中。值得注意的是，为避免疑义，SEQID NOs.中提及的氨基酸或核苷酸序列取代此类序列的任何其他来源。
本发明所用的“辅助蛋白”或“本发明的辅助蛋白”意指参与脂质代谢的和使本文所述的模型蛋白或目标蛋白(POI)的产量增加的蛋白，优选地，在还表达目标蛋白的宿主细胞中被过表达(若为示于SEQ ID NO:1-15，比如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的辅助蛋白)时，或被低表达(若为示于SEQ ID NO:16或17的辅助蛋白)时参与脂质代谢的和使本文所述的模型蛋白或目标蛋白(POI)的产量增加的蛋白。本发明的参与脂质代谢并当被过表达时使模型蛋白的产量增强的另外的辅助蛋白示于PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未注释；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)或它们的功能同系物。这一术语应被广泛理解且不应被局限于如分子伴侣或分子伴侣样蛋白。本发明的公开内容明显呈现出，本发明的辅助蛋白的功能是变化的，但是均参与某些类别的脂质代谢。本发明优选的辅助蛋白包含示于SEQ ID NO:1至17中任一个的氨基酸序列或其功能同系物。本发明优选的辅助蛋白可以分别是由SEQ IDNO:19至36中任一个的核苷酸序列编码的，或者是由编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的功能同系物的变体中任一个的核苷酸序列编码的。对于本发明的目的，术语“辅助蛋白”还旨在分别包括示于SEQ ID NO:1至17中任一个的辅助蛋白的功能同系物。本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。本发明提供分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码包含示于PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未注释；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未注释；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
术语“参与脂质代谢”意指辅助蛋白在真核细胞的脂质代谢中具有功能/活性。脂质代谢包括诸如如下功能：脂质合成、脂质降解、(目的为将脂质从其合成位点带至其目的地如并入生物膜中或将过多或失灵的脂质转运至细胞外，而通过蛋白质、囊泡或直接膜接触介导的)脂质转运、脂质贮存(以如甾醇酯或三酰甘油的生物惰性形式贮存脂质从而避免由过量的游离甾醇或脂肪酸引起的脂毒性；脂质贮存发生在专门的、被称为脂滴的细胞器中)、脂质修饰、脂质稳定性、脂-脂相互作用、脂肪酸生物合成和修饰、鞘脂生物合成、磷脂生物合成、麦角甾醇生物合成、改变高丰度鞘脂的分子种类模式，即使神经酰胺(神经酰胺和己糖基-神经酰胺(hexosyl-ceramide))和含肌醇的磷酰神经酰胺(IPC肌醇磷酰神经酰胺、MIPC甘露糖-肌醇磷酰神经酰胺、M(IP)2C甘露糖-二肌醇-磷酰神经酰胺)的脂肪酰基部分优先含有C26(在脂肪酰基链中含26个碳)而非C24(在脂肪酰基链中含24个碳)；以牺牲IPC为代价，使鞘脂分布模式朝着成熟形式的复合鞘脂(即更M(IP)2C)的比例更高改变；消耗细胞的三酰甘油，其是巴斯德毕赤酵母的主要贮存脂质。优选地，所述参与脂质代谢的辅助蛋白不是转录因子。因此，当其如本文所述过表达或低表达时，参与脂质代谢的辅助蛋白可以改变真核宿主细胞、特别是真菌宿主细胞中的生物膜脂质组成，由此积极地影响重组蛋白的产生。本文所用的术语“生物膜”包括但不限于细胞膜和内质网膜、囊泡膜、高尔基体膜等。因此，当在本文中使用时，当分别在辅助蛋白的过表达或低表达的上下文中使用时，术语“脂质代谢”可以由术语“生物膜脂组成的修饰”代替，优选地由在真核宿主细胞中、特别是在真菌宿主细胞中的生物膜脂组成的修饰代替。如本文所述，在辅助蛋白的过表达的上下文中，此类辅助蛋白参与鞘脂生物合成(包含SEQ ID NO:1-9的辅助蛋白)、磷脂生物合成(包含SEQ ID NO:10的辅助蛋白)、脂质转运(包含SEQ ID NO:11的辅助蛋白)、麦角甾醇生物合成(包含SEQ ID NO:12-15的辅助蛋白)、脂肪酸生物合成、磷脂酸生物合成和/或磷脂代谢过程。如本文所用的术语“鞘脂生物合成”包括脂肪酸延伸。因此，参与鞘脂生物合成的辅助蛋白可参与鞘脂生物合成和/或脂肪酸延伸。复合鞘脂如IPC、MIPC或M(IP)2C的生物合成与脂肪酸的延伸密不可分。在脂肪酸延伸过程中长链脂肪酸经历连续的4步循环，从而形成极长链脂肪酸(如C24或C26)。然后，通过脂肪酸的延伸产生的极长链脂肪酸很容易作为直接底物引入鞘脂生物合成过程中，从而产生复合鞘脂(IPC、MIPC、M(IP)2C)。鞘脂生物合成的最初步骤发生在内质网中，但神经酰胺的进一步修饰和成熟过程以得到复合的含肌醇的磷酰神经酰胺发生在高尔基体中。因此，在内质网的生物膜中可以发现大量的神经酰胺和己糖基神经酰胺，但在分泌途径的其他细胞器(囊泡和高尔基体)和细胞质膜中也可以发现较低程度的神经酰胺和己糖基神经酰胺。复合鞘脂(IPC、MIPC、M(IP)2C)在细胞质膜中富集程度最高，与甾醇共定位于所谓的脂筏中，但也以较低量见于内质网和分泌途径中的其他细胞器(囊泡、高尔基体)的生物膜中。如本文还在辅助蛋白的低表达的上下文中提到的，此类辅助蛋白例如参与脂质贮存(如包含SEQ ID NO:16或17的KO辅助蛋白)。因此，在如本文所述的辅助蛋白过表达的情况下，生物膜脂组成的修饰可优选地受鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运或麦角甾醇生物合成的影响，或者在如本文所述的辅助蛋白低表达的情况下，生物膜脂组成的修饰可优选地受脂质贮存的影响。优选地，参与脂质代谢的本发明的辅助蛋白不是转录因子。本文所述的不同组的辅助蛋白(即参与鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运、麦角甾醇生物合成和脂质贮存)基于巴斯德毕赤酵母基因。
本文所用术语“目标蛋白”通常指任何蛋白，但优选地指“异源蛋白”或“重组蛋白”，甚至更优选地指“目标非膜蛋白”。“目标非膜蛋白”意指所述目标蛋白优选地不是构成膜整体的蛋白，所述构成膜整体的蛋白在其天然环境中(即原位)永久地是真核细胞(比如真菌细胞)的生物膜的部分或附着于真核细胞(比如真菌细胞)的生物膜上。将这些蛋白质分类为跨越生物膜至少一次。因此，优选地，如本文所用的目标非膜蛋白不具有跨膜结构域。然而，如本文所用的术语“非膜蛋白”包括GPI-锚定蛋白。
如本文所用，本发明的辅助蛋白的“同系物”或“功能同系物”应是指在其一级、二级或三级结构的对应位置具有相同或保守性残基的蛋白。该术语还延伸至两个或更多个编码同源多肽的核苷酸序列。特别地，与本发明的辅助蛋白同源的多肽与本文公开的序列(SEQ ID-Nos:1-18)具有至少约30％的氨基酸序列同一性。优选地，同源多肽与全长化合物的天然序列或任何其它具体限定的片段具有至少约35％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约40％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约45％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约50％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约55％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约60％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约65％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约70％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约75％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约80％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约85％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约90％的氨基酸序列同一性，比如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性，更优选地至少约95％的氨基酸序列同一性。当这种同系物作为辅助蛋白的功能被验证时，该同系物称为“功能同系物”。功能同系物与其所源自的辅助蛋白履行相同或基本相同的功能，即其在细胞的脂质代谢中具有相同的酶活性或催化相同的代谢反应。若为核苷酸序列，则“功能同系物”优选地指具有与原始核苷酸序列不同的序列的核苷酸序列，但由于简并遗传密码的使用，其仍然编码相同的氨基酸序列。功能同系物也可以是辅助蛋白的生物活性片段。一般而言，辅助蛋白的生物活性片段应指所述辅助蛋白的片段，该片段发挥与全长辅助蛋白类似的或相当的生物作用，即意味着所述生物活性片段导致采用相应的全长辅助蛋白(SEQ ID-NOs 1-18)观察到的POI产量增加的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。如通过氨基-和/或羧基-末端缺失和/或至少1个氨基酸的缺失可获得此类活性片段，所述至少1个氨基酸不是所述全长辅助蛋白的氨基酸序列的氨基-和/或羧基-末端氨基酸。
一般而言，可采用本领域已知的任何诱变程序，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组(shuffling)等等，来制备同系物。定点诱变是一项在编码亲本的多核苷酸上的一个或多个限定位点引入一个或多个(如若干)突变的技术。可以通过涉及包含所需突变的寡核苷酸引物的应用的PCR在体外完成定点诱变。还可通过盒式诱变在体外来实施定点诱变，所述盒式诱变涉及通过限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点上的切割和随后在该多核苷酸上的包含所述突变的寡核苷酸的连接。通常，消化所述质粒和所述寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒的粘性末端和插入物彼此相连。参见，如Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。还可通过本领域已知的方法在体内完成定点诱变。参见，如美国专利申请公开文本No.2004/0171 154；Storici等，2001,NatureBiotechnol.19:773-776；Kren等，1998,Nat.Med.4:285-290；和Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子来编码目标多肽。可利用多种技术，如由Tian等(2004,Nature 432:1050-1054)描述的基于多路微芯片的技术及其中将寡核苷酸合成并装配至电流可编程的微流体芯片(photo-programmable microfluidic chip)上的类似技术，来实施基因合成。采用已知的诱变、重组和/或改组的方法，随后是相关的筛选程序，如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413或WO 95/22625公开的那些，可以完成并测试单个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入。其它可用的方法包括易出错(error-prone)PCR、噬菌体展示(如，Lowman等，1991,Biochemistry30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和定区域诱变(Derbyshire等，1986,Gene 46:145；Ner等，1988,DNA 7:127)。可以将诱变/改组方法与高通量、自动筛选方法组合，以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999,NatureBiotechnology 17:893-896)。可自宿主细胞中回收编码活性多肽的诱变的DNA分子并采用本领域已知的标准方法对其快速测序。这些方法允许快速确定单个氨基酸残基在多肽中的重要性。通过将合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的各个方面组合来完成半合成基因构建。半合成构建以利用合成的多核苷酸片段的过程与PCR技术组合为特征。因此，限定区域的基因可以被从头合成，而其它区域可以采用位点特异性诱变引物扩增，而还有其它区域可以经受易出错PCR或无错PCR扩增。然后，将多核苷酸子序列改组。可选地，可以从自然来源，如通过筛选其它生物、优选地近亲或相关生物的cDNA文库获得同系物。
可通过提供已经插入了同系物序列的表达盒，转化携带编码测试蛋白如用于实施例部分的模型蛋白的一种或另一POI的序列的宿主细胞，和测定在相同条件下模型蛋白或POI的产量差异，来测试SEQ ID NO:1至17中任一个或本文公开的其它辅助蛋白(如在[0046]段)的同系物的功能。
本发明提供分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17或者SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17的功能同系物。所述分离的多核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:19-35中的任一个。优选地，所述分离的多核苷酸序列由SEQ ID NO:30-58中任一个的核苷酸序列组成。本发明还提供分离的多核苷酸序列，所述分离的多核苷酸序列编码PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)或它们的功能同系物。
此外，本发明提供一种分离的多肽，所述分离的多肽包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性的多肽序列。此外，本发明提供一种分离的多肽，所述分离的多肽包含与选自PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性的多肽序列。
术语“分离的”是指处于自然界中未出现的形式或环境的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从其在自然界中相关的天然存在的成分的一种或多种或全部中取出的任何物质，包括但不限于，任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅助因子；(3)相对于自然界中发现的物质，经由人工修饰的任何物质，如从mRNA制备cDNA；或(4)通过相对于其天然相关的其他组分增加物质的量来修饰的任何物质(如，在宿主细胞中的重组生产；编码所述物质的基因的多个拷贝；和使用与编码所述物质的基因天然相关的启动子相比更强的启动子)。
本发明提供上述分离的多核苷酸中的任一个用于整合至宿主细胞中的用途。可选地，若一种或多种所述多核苷酸已经存在于所述宿主细胞中，可以以使得其过表达的方式操作该宿主细胞，如稍后所描述的。另一方面，本发明涉及所述多核苷酸用于增加宿主细胞的POI产量的用途，其中所述编码POI的核苷酸序列与所述多核苷酸共表达。
“序列同一性”或“％同一性”是指使用标准化算法比对的至少两个多肽或多核苷酸序列之间的残基匹配的百分数。为了使两条序列之间的比对最佳，这种算法可以以标准化的和可重现的方式在被比较的序列中插入间隙(gap)，因此达到两条序列的更加有意义的比较。对于本发明的目的，采用NCBI BLAST程序2.2.29版本(2014年1月6日)(Altschul等，Nucleic Acids Res.(1997)25:3389-3402)测定两条氨基酸序列或核苷酸序列之间的序列同一性。可以采用设定如下参数的blastp测定两条氨基酸序列的序列同一性：矩阵：BLOSUM62，字长：3；期望值：10；空位成本：存在＝11，延伸＝1；过滤＝低复杂性激活的；过滤字符串：L；组合调整(Compositional adjustment)：有条件的组合评分矩阵调整。对于本发明的目的，采用设定如下示例性参数的blastn的NCBI BLAST程序2.2.29版本(2014年1月6日)测定两条核苷酸序列之间的序列同一性：字长：11；期望值：10；空位成本：存在＝5，延伸＝2；过滤＝低复杂性激活的；匹配/失配得分：2，-3；过滤字符串：L；m。
此外，本发明提供一种被工程化以过表达编码本发明的辅助蛋白的多核苷酸的宿主细胞。所述辅助蛋白分别包括SEQ ID NO:1-15中的任一个或其功能同系物。所述辅助蛋白还包括PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)或其功能同系物。类似地，本发明提供一种被工程化以低表达编码本发明的辅助蛋白(KO辅助蛋白)的多核苷酸的宿主细胞。KO辅助蛋白分别包括SEQ ID NO:16或17中的任一个或其功能同系物。被工程化以低表达编码KO辅助蛋白或本发明的辅助蛋白的多核苷酸的宿主细胞可进一步过表达一种或多种在本文公开的项目中所示的辅助蛋白。
优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以过表达多核苷酸，该多核苷酸编码包含与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。
优选地，本发明提供一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以低表达多核苷酸，该多核苷酸编码包含与示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的KO辅助蛋白。
术语“表达多核苷酸”是指当将多核苷酸转录成mRNA且将mRNA翻译成多肽时。术语“过表达”通常是指大于或等于参考标准品显示的表达水平的任何量。在本发明中术语“过表达(的)”是指基因产物或多肽以高于宿主细胞遗传改变之前的或在限定条件下未被遗传改变的相当的宿主中的相同基因产物或多肽的表达的水平表达。在本发明中，包含示于SEQID NO:1-15中任一个的氨基酸序列的辅助蛋白过表达。若宿主细胞不包含给定基因产物，将该基因产物引入所述宿主细胞用于表达是可能的；在这种情况下，术语“过表达”包括任何可检测的表达。
术语“低表达”通常是指小于参考标准品显示的表达水平的任何量，所述参考标准品为工程化以低表达本文所述的KO辅助蛋白之前的宿主细胞。在本发明中术语“低表达(的)”是指基因产物或多肽以低于宿主细胞遗传改变之前的或未被遗传改变的相当的宿主中的相同基因产物或多肽的表达的水平表达。例如，与参考标准品相比，所述KO蛋白可低表达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或可甚至完全不表达(降低100％)。通过例如缺失/敲除KO辅助基因使基因产物或多肽不表达也涵盖在术语“低表达”中。
如本文所用，术语“工程化的”宿主细胞为已经用遗传工程(即，通过人为干预)操作了的宿主细胞。当宿主细胞被“工程化以过表达”给定蛋白时，操作该宿主细胞以使得该宿主细胞具有表达、优选地过表达辅助蛋白或其功能同系物的能力，由此与操作之前的相同条件下的宿主细胞相比，给定蛋白如POI或模型蛋白的表达增加。
当宿主细胞“低表达”或被“工程化以低表达”给定蛋白时，操作该宿主细胞以使得该宿主细胞具有低表达KO辅助蛋白或其功能同系物的能力，由此与操作之前的相同条件下的宿主细胞相比，给定蛋白如POI或模型蛋白的表达增加。可以通过任何阻止KO辅助蛋白功能性表达的方法实施低表达，所述KO辅助蛋白包含示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列或其功能同系物。低表达的结果是不能发挥其功能。低表达的手段可包括基因沉默(如，RNAi基因反义)、敲除、改变表达水平、改变表达模式、通过诱变基因序列、破坏(disrupt)序列、插入、添加、突变、修饰表达调控序列等。优选的低表达手段是如通过缺失KO辅助蛋白的编码序列或其片段或通过缺失表达KO辅助蛋白所需的调控序列(如启动子)来敲除KO辅助蛋白的功能表达。
当将“工程化之前”用于本发明的宿主细胞的上下文中时，是指这种宿主细胞没有被使用编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸工程化。因此，该术语还指不过表达或低表达编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸的宿主细胞或没有被工程化以过表达或低表达编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸的宿主细胞。
本文所用术语“工程化所述宿主细胞以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸”是指用编码目标蛋白的异源多核苷酸装备本发明的宿主细胞，即，本发明的宿主细胞被工程化以包含编码目标蛋白的异源多核苷酸。这可以通过如转化或转染或用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何其它本领域已知的适宜技术来实现。
过表达
正如将在后面详细描述的，以本领域技术人员已知的任何方式都可实现过表达。一般而言，可通过提高基因的转录/翻译，如通过提高所述基因的拷贝数或者改变或修饰与基因表达相关的调控序列或位点，如编码参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物的内源多核苷酸来实现过表达。例如，可通过引入可操作地连接至调控序列(如启动子)的编码辅助蛋白或功能同系物的多核苷酸的一个或多个拷贝来实现过表达。例如，为了达到高表达水平，可将所述基因可操作地连接至强的组成型启动子和/或强的广谱表达型(ubiquitous)启动子。这种启动子可以是内源启动子或重组启动子。可选地，可以将调控序列移除以使得表达变为组成型的。人们可以用增加给定基因表达的或导致给定基因组成型表达的异源启动子替换给定基因的天然启动子。例如，与工程化之前的并在相同条件下培养的宿主细胞相比，所述宿主细胞可以过表达所述辅助蛋白大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或大于300％。另外地使用诱导型启动子可使宿主细胞培养过程中的表达增加。此外，还可通过以下方式实现过表达，例如修饰特定基因的染色体位置；改变与特定基因相邻的核酸序列，所述特定基因如核糖体结合位点或转录终止子；修饰与所述基因转录和/或与所述基因产物的翻译相关的蛋白(如，调控蛋白、抑制子、增强子、转录激活因子等等)；或任何其它本领域常规的使特定基因表达失调的常规技术，包括但不限于，反义核酸分子的应用，例如以阻断阻遏蛋白的表达，或者缺失或突变通常抑制需要过表达的基因的表达的转录因子的基因。延长mRNA的寿命也可提高表达水平。例如，某些终止子区可用于延长mRNA的半衰期(Yamanishi等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2011)75:2234和US 2013/0244243)。若包括多个拷贝的基因，这些基因既可以位于可变拷贝数的质粒中，也可以是在染色体中整合并扩增的。若所述宿主细胞不包含编码辅助蛋白的基因，则可以将基因引入宿主细胞用于表达。此时，“过表达”是指采用本领域技术人员已知的任何方法表达所述基因产物。
本领域技术人员将在Martin等(Bio/Technology 5,137-146(1987))、Guerrero等(Gene 138,35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))、Eikmanns等(Gene 102,93-98(1991))、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和(Bio/Technology 9,84-87(1991))、Reinscheid等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60,126-132(1994))、LaBarre等(Journal of Bacteriology 175,1001-1007(1993))、WO 96/15246、Malumbres等(Gene 134,15-24(1993))、JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))和Makrides(Microbiological Reviews 60,512-538(1996))中，特别是在公知的遗传和分子生物学教科书中发现相关说明。
辅助蛋白
本发明的辅助蛋白最初是从巴斯德毕赤酵母CBS7435菌株中分离的，或若为SEQID NO:8和9时最初是从酿酒酵母中分离的。该甲基营养型酵母毕赤酵母(Pichiapastoris)(Komagataella phaffii)CBS7435是常用的毕赤酵母重组蛋白生产宿主的亲本菌株。其完整的基因组序列描述于Sturmberger等[J.Biotechnol.(2016).235(4):121-131)]中。编码本文所鉴定的辅助蛋白的基因迄今尚未与对蛋白质产量的有益作用相关联。非常密切相关的巴斯德毕赤酵母菌株GS115的完整基因组序列与CBS7435的基因组序列几乎相同(Nat.Biotechnol.27(6),561-566)，并且对应于CBS7435的序列的GS115的序列也可用于本发明。
设想辅助蛋白能够在广泛的宿主细胞中过表达。因此，辅助蛋白的序列还可取自或源自其它原核或真核生物体，而不是采用对于其种或属而言为天然的序列。可以从多种来源，如从植物、昆虫、真菌或哺乳动物物种，优选地从酵母纲，优选地从酵母目，优选地从酵母科，优选地从Komagataella属中获得编码辅助蛋白的外源(foreign)DNA序列。
特别地，本发明涉及一种基因修饰的宿主细胞，该宿主细胞能够单一地过表达包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白或它们的组合。在一个优选的实施方案中设想了被工程化以反映辅助蛋白组合的宿主细胞。优选地将这些宿主细胞用于本文描述的方法和用途中。组合包括选自SEQ ID NO:1-15中任一个的2种或更多种，如2、3、4、5、6、7、8或更多种辅助蛋白或其功能同系物。
同样地，组合包括过表达的一种或多种选自SEQ ID NO:1-15和PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)中任一个或其功能同系物的辅助蛋白与低表达的选自SEQ IDNO:16或17中任一个或其功能同系物的辅助蛋白的组合。在一个优选的实施方案中设想了被工程化以反映这种组合的宿主细胞。可将这些宿主细胞用于本文描述的方法和用途中。
优选地，将以下参与鞘脂生物合成的本发明的辅助蛋白和辅助蛋白的组合用于本文所述的宿主细胞、方法和用途中：
(a)包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(b)包含示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(c)包含示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(d)包含示于SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(e)包含示于SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(f)包含示于SEQ ID NO:1、3和4的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、3和4的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(g)包含示于SEQ ID NO:1、3、4和8的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、3、4和8的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(h)包含示于SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(i)包含示于SEQ ID NO:1和7的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和7的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(j)包含示于SEQ ID NO:5、6和9的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:5、6和9的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；
(k)包含示于SEQ ID NO:1、5、6和9的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、5、6和9的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
本发明的辅助蛋白的组合包括过表达至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种参与脂质转运的蛋白。在优选的用于本文所述的宿主细胞、方法和用途的组合中，参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物，和参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
本发明的辅助蛋白的组合包括过表达至少一种参与磷脂生物合成的蛋白和至少一种参与脂质转运的蛋白。在优选的用于本文所述的宿主细胞、方法和用途的组合中，参与磷脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其功能同系物，和参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
本发明进一步涉及过表达除本发明的辅助蛋白之外的分子伴侣。本文所用术语“分子伴侣”涉及协助其他多肽折叠、展开、组装或拆卸的多肽。优选地，分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
因此，本发明的辅助蛋白的组合包括过表达至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种分子伴侣。优选地，所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物，和所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
本发明的辅助蛋白的另一组合包括过表达至少一种参与麦角甾醇生物合成的蛋白和至少一种分子伴侣。优选地，所述参与麦角甾醇生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列或其功能同系物，和所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ IDNO:13和18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
目标蛋白
本文所用术语“目标蛋白”(POI)是指在宿主细胞中通过重组技术生产的蛋白。更具体地，所述蛋白既可以是非天然地存在于宿主细胞中的多肽，即异源蛋白，也可以是对于所述宿主细胞而言天然的，即是宿主细胞的同源蛋白，但通过例如用含有编码POI的核酸序列的自复制载体的转化、或通过重组技术将编码POI的核酸序列的一个或多个拷贝整合至宿主细胞的基因组、或通过控制编码POI的基因表达的一个或多个调控序列(如启动子序列)的重组修饰而生产的。一般而言，可以通过本领域技术人员熟知的重组表达方法生产本文提及的目标蛋白。优选地，目标蛋白不是膜蛋白，即优选地POI是目标非膜蛋白。
宿主细胞
如本文所用，“宿主细胞”是指一种能够表达蛋白和可选地分泌蛋白的细胞。将此类宿主细胞用于本发明的方法。针对使宿主细胞过表达或低表达参与脂质代谢的多肽这一目的，使编码所述多肽的核苷酸序列存在于该细胞或将其引入该细胞。本发明提供的宿主细胞可以是真核宿主细胞。更优选地为非哺乳动物真核宿主细胞。甚至更优选地为真菌宿主细胞。如本领域技术人员所理解的，原核细胞无核膜，而真核细胞具有核膜。真核细胞的实例包括但不限于：脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞、线虫细胞、昆虫细胞、干细胞、真菌细胞或酵母细胞。
酵母细胞的实例包括但不限于：酵母属(如酿酒酵母、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))、Komagataella属(Komagataellapastoris、Komagataella pseudopastoris或Komagataella phaffii)、克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))、假丝酵母属(如产朊假丝酵母(Candina utilis)、可可假丝酵母(Candida cacaoi))、地霉属(如发酵地霉(Geotrichum fermentans))、以及多形汉森酵母和解脂耶氏酵母。
毕赤酵母属是特别感兴趣的。毕赤酵母属包含许多种，包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)种、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)种、克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)种和安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)种。最优选的是巴斯德毕赤酵母种。
已将以前的种巴斯德毕赤酵母分类并重新命名为Komagataella pastoris和Komagataella phaffii。因此巴斯德毕赤酵母与Komagataellapastoris和Komagataellaphaffii是同义词。
用于本发明的巴斯德酵母菌株的实例是X33及其亚型GS115、KM71、KM71H；CBS7435(mut+)及其亚型CBS7435 muts、CBS7435 mutsΔArg、CBS7435 mutsΔHis、CBS7435 mutsΔArg、ΔHis、CBS7435 muts PDI+、CBS 704(＝NRRL Y-1603＝DSMZ 70382)、CBS 2612(＝NRRLY-7556)、CBS9173-9189和DSMZ 70877及其突变体。这些酵母菌株可以从诸如美国组织培养库(ATCC)、位于德国不伦瑞克的“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen”(DSMZ)或从位于荷兰Uetrecht的荷兰“Centraalbureau voorSchimmelcultures”(CBS)的细胞库获得。
根据进一步优选的实施方案，所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)和Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。其也可以是来自玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的宿主细胞。这些酵母菌株可以从诸如美国组织培养库(ATCC)、位于德国不伦瑞克的“Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen”(DSMZ)或从位于荷兰Uetrecht的荷兰“Centraalbureau voorSchimmelcultures”(CBS)的细胞库获得。
大肠杆菌的实例包括源自大肠杆菌K12菌株的那些，具体为HMS174、HMS174(DE3)、NM533、XL1-Blue、C600、DH1、HB101、JM109，以及源自B-菌株的那些，具体为BL-21、BL21(DE3)等。大肠杆菌细胞可用于例如克隆的目的，也可以用作本发明的宿主细胞。这些细菌菌株可以从诸如美国组织培养库(ATCC)、位于德国不伦瑞克的“Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen”(DSMZ)或从位于荷兰Uetrecht的荷兰“Centraalbureau voor Schimmelcultures”(CBS)的细胞库获得。
优选地，所述由宿主细胞表达的辅助蛋白是来自相同的细胞或是从相同的种、属或科的细胞重组的。如本文所用，“重组(的)”是指通过人为干预的遗传材料的改变。通常，重组是指通过分子生物学(重组DNA技术)方法(包括克隆和重组)对病毒、细胞、质粒或载体中DNA或RNA的操作。典型地可以参考重组细胞、多肽或核酸与天然存在的对应物(“野生型”)如何相区别来描述重组细胞、多肽或核酸。“重组细胞”或“重组宿主细胞”是指这样一种细胞或宿主细胞，所述细胞或宿主细胞已经被遗传改变从而包含了对所述细胞而言为非天然的核酸序列。
本文所用术语“制备”是指目标蛋白表达的过程。“用于制备目标蛋白的宿主细胞”是指可引入编码目标蛋白的核酸序列的宿主细胞。本发明中的重组宿主细胞并不一定包含编码目标蛋白的核酸序列。本领域技术人员理解，可以例如在试剂盒中提供所述宿主细胞，用于将所需核苷酸序列插入该宿主细胞中。“制备”还指采用本发明的宿主细胞生产POI的过程，包括在适宜条件下培养所述本发明的宿主细胞以过表达参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物并表达所述目标蛋白，和可选地从细胞培养物中分离所述目标蛋白。
本文所用术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指DNA或RNA。“核酸序列”或“多核苷酸序列”或简单地“多核苷酸”是指从5’至3’端读出的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。其包括自复制质粒、DNA或RNA的感染性聚合物和非功能DNA或RNA。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的氨基酸类似物(analog)和氨基酸模拟物(mimetic)。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及之后修饰的那些氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构的化合物，即，将碳连接至氢、羧基、氨基和R基，如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但是以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的化学化合物。
术语“多肽”与“蛋白”互换使用。术语“多肽”是指一种含有两个或更多个氨基酸，典型地至少3个、优选地至少20个、更优选地至少30个、诸如至少50个氨基酸的蛋白或肽。因此，多肽包含氨基酸序列和因此的有时包含氨基酸序列的多肽在本文中称为“包含多肽序列的多肽”。因此，本文中术语“多肽序列”与术语“氨基酸序列”互换使用。如所提及的，可通过插入一个或大于一个另外的所选辅助蛋白的拷贝来实现过表达。根据优选的实施方案，编码辅助蛋白的多核苷酸可以以每个细胞中单一拷贝或多个拷贝的形式呈现。这些拷贝可以是彼此毗邻的或彼此远离的。根据另一个优选的实施方案，本发明的方法使用编码辅助蛋白的重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列以每个细胞中单一拷贝或多个拷贝的形式提供在一个或多个适用于整合入宿主细胞基因组的质粒中。这些拷贝可以是彼此毗邻的或彼此远离的。在一个实施方案中，可以通过每个宿主细胞表达多核苷酸的一个或多个拷贝，如2、3、4、5、6或更多个所述多核苷酸的拷贝来实现过表达。优选地，所述多核苷酸可操作地连接至在宿主细胞中提供多肽表达的转录和翻译调控序列。本文所用术语“转录调控序列”是指与基因核酸序列有关的并调控该基因转录的核苷酸序列。本文所用术语“翻译调控序列”是指与基因核酸序列有关的并调控该基因翻译的核苷酸序列。转录和/或翻译调控序列既可以位于质粒或载体中，也可以整合至宿主细胞的染色体。转录和/或翻译调控序列位于该序列所调控的基因的相同的核酸分子中。优选地，可以通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4或更多个编码包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白的多核苷酸的拷贝，或通过在每个宿主细胞中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个编码包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白的多核苷酸的拷贝来实现过表达。
优选地，将编码辅助蛋白的多核苷酸和/或编码POI的多核苷酸整合至宿主细胞的基因组中。术语“基因组”通常是指以DNA(或对于某些病毒物种以RNA)编码的生物体的全部遗传信息。基因组可存在于染色体中、质粒或载体中或两者兼有。优选地，将编码辅助蛋白的多核苷酸整合至所述细胞的染色体中。
可以将编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在其天然基因座上。“天然基因座”是指在特定染色体上的位置，在该处编码辅助蛋白的多核苷酸位于例如编码本发明的辅助蛋白的基因的天然基因座中。可以根据如上表1中所示的基因标识符鉴定任何此类基因。然而，在另一个实施方案中，存在于宿主细胞的基因组中的编码辅助蛋白的多核苷酸未在它们的天然基因座上，而是被异位地整合。术语“异位的整合”是指在微生物基因组中不是其通常染色体基因座的位点的核酸的插入，即预定的或随机的整合。可选地，可以将所述编码辅助蛋白或其功能同系物的多核苷酸整合在其天然基因座上和异位地整合。
对于酵母细胞，可以将编码辅助蛋白的多核苷酸和/或编码POI的多核苷酸插入所需的基因位，比如、但不限于AOX1、GAP、ENO1、TEF、HIS4(Zamir等，Proc.NatL Acad.Sci.USA(1981)78(6):3496-3500)、HO(Voth等，Nucleic Acids Res.2001June 15；29(12):e59)、TYR1(Mirisola等，Yeast 2007；24:761–766)、His3、Leu2、Ura3(Taxis等，BioTechniques(2006)40:73-78)、Lys2、ADE2、TRP1、GAL1、ADH1或在5S核糖体RNA基因的整合上。
在其它实施方案中，可以将编码辅助蛋白的多核苷酸和/或编码POI的多核苷酸整合在质粒或载体中。术语“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合的核苷酸序列。技术人员能够依据所使用的宿主细胞选用适宜的质粒或载体。
优选地，所述质粒是真核表达载体，优选为酵母表达载体。
质粒可用于在适宜的宿主生物体中克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)的转录和它们的mRNA的翻译。质粒还可用于通过本领域已知的方法，如J.Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NewYork(2001)描述的方法，将靶多核苷酸整合至宿主细胞基因组中。“质粒”通常包括用于在宿主细胞中自主复制的起点、选择标记、多个限制性酶切割位点、适宜的启动子序列和转录终止子，所述组分可操作地连接在一起。将编码多肽的目标序列可操作地连接至在宿主细胞中提供多肽表达的转录和翻译调控序列。
当核酸被置于与相同核酸分子上的另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作地连接”的。例如，当启动子能够实现重组基因的编码序列的表达时，该启动子与该重组基因的编码序列是可操作地连接的。
大多数质粒以每个细菌细胞中仅一个拷贝存在。但是，一些质粒以较多拷贝数存在。例如，质粒ColE1通常以对于大肠杆菌中每条染色体的10至20个质粒拷贝存在。如果质粒中包含本发明的核苷酸序列，则每个宿主细胞中，该质粒可具有1-10、10-20、20-30、30-100或更多的拷贝数。使用高拷贝数的质粒，可以通过细胞过表达辅助蛋白。
本领域技术人员已知大量适宜的质粒或载体，并且很多质粒或载体是商购可获得的。Sambrook等编辑，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)，和Ausubel等编辑，Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1997)提供了适宜的载体的实例。
本发明的载体或质粒涵盖包含端粒(telomeric)、着丝粒(centromeric)和复制的起点(复制起点)序列的酵母人工染色体，所述酵母人工染色体是指可以被遗传修饰为含有异源DNA序列(如，大到3000kb的DNA序列)的DNA构建体。
本发明的载体或质粒还涵盖包含复制的起点序列(Ori)并可包含一个或多个解旋酶(如parA、parB和parC)的细菌人工染色体(BAC)，所述细菌人工染色体是指可以被遗传修饰为含有异源DNA序列(如，大到300kb的DNA序列)的DNA构建体。
将酵母作为宿主的质粒的实例包括YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体(Yxp型载体描述于如Romanos等，1992,Yeast.8(6):423-488中)、pGPD-2(描述在Bitter等，1984,Gene,32:263-274中)、pYES、pAO815、pGAPZ、pGAPZα、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、pPICZ、pPICZα、pPIC3K、pPINK-HC、pPINK-LC(均可来自Thermo FisherScientific/Invitrogen)、pHWO10(描述于Waterham等，1997,Gene,186:37-44中)、pPZeoR、pPKanR、pPUZZLE和pPUZZLE衍生物(描述于Stadlmayr等，2010,J Biotechnol.150(4):519-29.；Marx等，2009,FEMS Yeast Res.9(8):1260-70中)、pJ-载体(如pJAN、pJAG、pJAZ和它们的衍生物；均可来自BioGrammatics,Inc)、pJexpress载体、pD902、pD905、pD915、pD912和它们的衍生物、pD12xx、pJ12xx(均可来自ATUM/DNA2.0)、pRG质粒(描述于Gnügge等，2016,Yeast 33:83–98)和2μm质粒(描述于如Ludwig等，1993,Gene 132(1):33-40中)。这些载体是已知的，并且例如，这些载体描述在Cregg等，2000,Mol Biotechnol.16(1):23-52或Ahmad等，2014.,Appl Microbiol Biotechnol.98(12):5301-17中。此外，通过如由Lee等，2015,ACS Synth Biol.4(9):975-986；Agmon等，2015,ACS Synth.Biol.,4(7):853–859；或Wagner和Alper,2016,Fungal Genet Biol.89:126-136描述的先进的模块化克隆技术可容易地产生合适的载体。此外，还可从www.addgene.org获得这些及其他合适的载体。
将大肠杆菌作为其宿主的质粒的实例包括pBR322(可从如New England Biolabs和ThermoFisher Scientific获得)、pBAD-载体、pET-载体系列(两者均可从如ThermoFisher Scientific获得，pET载体也可从Novagen获得)、pUC18、pUC19、pUC118/119(均可从如Takara获得)、pVC119(描述于Del Sol等，2006,J Bacteriol.188(4):1540–1550中)、pSP64、pSP65(两者来自Promega)、pTZ-18R/-18U(来自Amersham)，pTZ-19R/-19U(来自Sigma-Aldrich)、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)(pGEM载体可来自Promega)和pBluescript KS(可来自Agilent)。适于在大肠杆菌中表达的质粒的实例包括pKK223(描述于Brosius和Holy,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6929-6933中)、pMC1403、pMC931(两者均描述于Casadaban等1980,J Bacteriol.143(2):971-980中)和pKC30(描述于Rao,1984,Gene 31(1-3):247-250中)。此外，还可从www.addgene.org获得这些及其他合适的载体。
启动子
可通过修饰转录和翻译调控序列，包括例如提供宿主细胞中多核苷酸序列表达的启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内核糖体进入位点(IRES)等等，来实现重组细胞中内源多肽的过表达。这种序列特异性地与参与转录的细胞蛋白相互作用(Maniatis等，Science,236:1237-1245(1987))。示例性序列描述于例如Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。
例如，可通过修饰启动子来实现重组细胞中内源辅助蛋白的过表达，例如，为了实现高表达水平，通过用另一个更强的启动子替换可操作地连接至辅助蛋白的内源启动子。这种启动子可以是诱导型的或组成型的。可以通过采用本领域已知的方法的突变或同源重组来实施内源启动子的修饰。
可通过本领域已知的其它方法，例如通过如Marx等，2008(Marx,H.,Mattanovich,D.和Sauer,M.Microb Cell Fact 7(2008):23)和Pan等，2011(Pan等，FEMS Yeast Res.(2011)May；(3):292-8.)描述的遗传修饰辅助蛋白的内源调控区域来实现编码辅助蛋白的多核苷酸的过表达，这种方法包括例如增加辅助蛋白表达的重组启动子的整合。转化描述于Cregg等，(1985)Mol.Cell.Biol.5:3376-3385。“重组”启动子是指针对其驱动表达的序列。如本文所用，重组启动子的含义是，当该启动子对于给定序列而言不是天然启动子时，即，当该启动子与天然存在的启动子(“天然启动子”)不同时。有时这种启动子在本文中还称为异源启动子。
文本所用术语“启动子”是指有助于特定基因转录的区域。与无启动子存在时所表达的重组产物的量相比，启动子通常使从核苷酸序列表达的重组产物的量增加。可利用源自一个生物体的启动子来增强从源自另一生物体的序列的重组产物表达。可以通过采用本领域已知的方法的同源重组来将启动子整合至宿主细胞染色体中(如，Datsenko等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97(12):6640-6645(2000))。此外，一个启动子元件能够增加串联连接的多条序列所表达的产物的量。因此，一个启动子元件能够增强一种或多种重组产物的表达。
可以通过启动子的转录效率来评估启动子活性。可通过测量从该启动子的mRNA转录的量来直接地测定启动子活性，如通过RNA印迹法、定量PCR，或通过测量自该启动子表达的基因产物的量来间接地测定启动子活性。
启动子可以是“诱导型启动子”或“组成型启动子”。“诱导型启动子”是指可以被某些因子的存在或缺少诱导的启动子，“组成型启动子”是指允许启动子的一种或多种相关基因连续转录的不受调控的启动子。
在优选的实施方案中，编码辅助蛋白和POI的核苷酸序列的转录均各自被诱导型启动子驱动。在另一个优选的实施方案中，编码辅助蛋白和POI的核苷酸序列的转录均各自被组成型启动子驱动。在又一个优选的实施方案中，编码辅助蛋白的核苷酸序列的转录被组成型启动子驱动，编码POI的核苷酸序列的转录被诱导型启动子驱动。在再一个优选的实施方案中，编码辅助蛋白的核苷酸序列的转录被诱导型启动子驱动，编码POI的核苷酸序列的转录被组成型启动子驱动。例如，辅助蛋白基因的转录可以被组成型GAP启动子驱动，编码POI的核苷酸序列的转录可以被诱导型AOX1启动子驱动。在一个实施方案中，编码辅助蛋白和POI的核苷酸序列的转录被相同启动子或就启动子活性和/或表达行为而言的相似启动子驱动。
本领域已知很多诱导型启动子。在Gatz,Curr.Op.Biotech.,7:168(1996)(还参见Gatz,Ann.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol.,48:89(1997))的综述中描述了许多诱导型启动子。实例包括四环素抑制子系统(tetracycline repressor system)、Lac抑制子系统、铜诱导系统、水杨酸诱导系统(如PR1系统)、糖皮质激素诱导型(Aoyama等，1997)、醇诱导系统(如AOX启动子)和蜕皮激素诱导系统(ecdysome-inducible system)。还包括苯磺酰胺诱导系统(美国专利No.5,364,780)和醇诱导型系统(WO 97/06269和WO 97/06268)以及谷胱甘肽S-转移酶启动子。
在Mattanovich等，Methods Mol.Biol.(2012)824:329-58中描述了与酵母宿主细胞一起使用的适宜的启动子序列，包括如磷酸丙糖异构酶(TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH或GAP)的糖酵解酶及其变体、乳糖酶(LAC)和半乳糖苷酶(GAL)、巴斯德酵母(P.pastoris)葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PPGI)、3-磷酸甘油酸激酶启动子(PPGK)、甘油醛磷酸脱氢酶启动子(PGAP)、翻译延伸因子启动子(PTEF)和巴斯德酵母烯醇化酶1启动子(PENO1)、丙糖磷酸异构酶(PTPI)、核糖体亚基蛋白(PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1)、醇氧化酶启动子(PAOX)或其具有修饰特性的变体、甲醛脱氢酶启动子(PFLD)、异柠檬酸裂合酶启动子(PICL)、α-酮异己酸脱羧酶启动子(PTHI)、热休克蛋白家族成员的启动子(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6-磷酸葡糖酸脱氢酶(PGND1)、磷酸甘油酸变位酶(PGPM1)、转酮酶(PTKL1)、磷脂酰肌醇合成酶(PPIS1)、铁-O2-氧化还原酶(ferro-O2-oxidoreductase)(PFET3)、高亲和力铁通透酶(PFTR1)、抑制性碱性磷酸酶(PPHO8)、N-肉豆蔻酰基转移酶(PNMT1)、信息素应答转录因子(PMCM1)、泛素(PUBI4)、单链DNA核酸内切酶(PRAD2)、线粒体内膜的主要ADF/ATP载体的启动子(PPET9)(WO2008/128701)和甲酸脱氢酶(FMD)启动子。GAP启动子、AOX启动子或源自GAP或AOX启动子的启动子是特别优选的。AOX启动子可被甲醇诱导和例如被葡萄糖抑制。
适宜的启动子的进一步实例包括酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、和麦芽糖酶基因启动子(MAL)。
Romanos等，1992,Yeast 8:423-488描述了酵母宿主细胞的其它有用启动子。
与大肠杆菌一起使用的适宜的启动子序列包括质粒中的T7启动子、T5启动子、色氨酸(trp)启动子、乳糖(lac)启动子、色氨酸/乳糖(tac)启动子、脂蛋白(lpp)启动子和λ噬菌体PL启动子。
优选地，相对于辅助基因的启动子而言，驱动编码辅助蛋白的多核苷酸表达的启动子不是内源的。优选地，采用重组启动子而不是辅助蛋白基因的内源启动子。
增强子
在优选的实施方案中，通过采用增强子来增强驱动辅助蛋白表达的启动子活性来实现过表达。转录增强子相对不依赖于方向和位置，已在转录单位的5’和3’、内含子中以及自身的编码序列中发现了转录增强子。增强子可以在编码序列的5’或3’位置被剪接入表达载体，但是优选位于启动子的5’位。大多数酵母基因含有仅一个UAS，其通常位于帽位的几百个碱基对中，并且当位于启动子的3’时，大多数酵母增强子(UAS)无法发挥功能，但是高等真核生物中的增强子在启动子的5’和3’都能发挥功能。
目前已知很多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、RSV、SV40、EMC、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。人们也可使用来自真核细胞病毒的增强子，如SV40晚期增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子和腺病毒增强子。酵母增强子，也称为上游激活序列(UAS)，如来自酿酒酵母的UAS/GAL系统，可有利地与酵母启动子一起使用(描述于欧洲专利No.0317254和Rudoni等，TheInternationalJournal of Biochemistry and Cell Biology,(2000),32(2):215-224)。
在优选的实施方案中，本发明公开的2、3、4、5、6、7、8、9或更多类型的辅助蛋白过表达。例如，宿主细胞可被工程化以过表达2、3、4、5、6、7、8、9或更多个选自SEQ ID NO:1-15中任一个或其功能同系物的辅助蛋白，其中其功能同系物包含分别与SEQ ID NO:1-15中任一个具有至少30％的序列同一性的氨基酸。在进一步的实施方案中，宿主细胞可被工程化以过表达2、3、4、5、6、7、8、9或更多个选自SEQ ID NO:1-15、PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)中任一个或其功能同系物的辅助蛋白，其中其功能同系物包含分别与SEQID NO:1-15、PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)中任一个具有至少30％的序列同一性的氨基酸。
目标蛋白
设想可以将宿主细胞培养在对于辅助蛋白和目标蛋白的过表达适宜的条件下时，该宿主细胞将表达目标蛋白并过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。进一步设想可以将宿主细胞培养在对于辅助蛋白和目标蛋白的共表达适宜的条件下时，该宿主细胞将表达目标蛋白并过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码包含示于SEQ ID NO:1-15、PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)中任一个的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1-15、PP7435_Chr3-0788(SUR2)、PP7435_Chr3-1005(PHS1)、PP7435_Chr2-0350(AUR1)、PP7435_Chr4-0626(IFA38)、PP7435_Chr3-0669(SCS7)、PP7435_Chr3-0636(CRD1)、PP7435_Chr3-0950(SLC4)、PP7435_Chr2-0585(PIS1)、PP7435_chr1-0934(PRY2)、ARV1(ORF未命名；位于PP7435_Chr4-0493/0494之间)、PP7435_Chr3-0741(ARE2)、PP7435_Chr4-0963(FAD12)、PP7435_Chr1-0794(PSD1)、PP7435_Chr1-0160(SLC1)、PP7435_CHR1-0078(GPT2)、PP7435_Chr3-1169(DGK1)和PP7435_Chr2-0045(CDS1)中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
本文所用术语“目标蛋白”(POI)是指在宿主细胞中通过重组技术生产的蛋白。更具体地，所述蛋白既可以是非天然地存在于宿主细胞中的多肽，即异源蛋白，也可以是对于所述宿主细胞而言天然的，即是宿主细胞的同源蛋白，但通过例如用含有编码POI的核酸序列的自复制载体的转化、或通过重组技术将编码POI的核酸序列的一个或多个拷贝整合至宿主细胞的基因组、或通过控制编码POI的基因表达的一个或多个调控序列(如启动子序列)的重组修饰而生产的。一般而言，可以通过本领域技术人员熟知的重组表达方法生产本文提及的目标蛋白。
本文对目标蛋白(POI)没有限制。通常，POI是真核或原核多肽，其变体或衍生物。POI可以是任何真核或原核蛋白。Schmidt,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2004),65:363-372或Kirk等，Curr.Opin.Biotechnol.(2002),13:345-351中描述了POI的实例。Schmidt的表1和表2中以及Kirk等的表1中提到的任何蛋白均涵盖在本文所用术语“POI”中。所述蛋白可以是天然分泌蛋白，也可以是细胞内蛋白(即非天然分泌的蛋白)。本发明还包括蛋白的生物活性片段。在另一个实施方案中，POI可以是氨基酸链或以复合物如二聚体、三聚体、异-二聚体、多聚体或寡聚体存在。
目标蛋白可以是用作营养的、膳食的(dietary)、消化的、补充剂的蛋白，如用在食品、饲料产品或化妆品中。所述食品可以是例如肉汤、甜点、谷物棒、糕饼(confectionery)、运动饮料、膳食产品或其他营养产品。优选地，所述目标蛋白是食品添加剂。
在另一个实施方案中，目标蛋白可用在动物饲料中。所述POI可以是如真菌毒素(mycotoxin)降解酶的解毒酶。真菌毒素降解酶包括黄曲霉毒素降解酶、玉米赤霉烯酮酯酶(zearalenone esterase)、玉米赤霉烯酮内酯酶(zearalenone lactonase)、玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase)、伏马菌素羧酸酯酶(fumonisin carboxylesterase)、伏马菌素转氨酶(fumonisin aminotransferase)、氨基多元醇胺氧化酶(aminopolyol amineoxidase)、脱氧雪腐镰刀菌醇环氧化物水解酶(deoxynivalenol expoxide hydrolase)。所述POI还可以是降解赭曲霉毒素衍生物或麦角生物碱的酶。这些化合物对包括人和农场动物的活的生物体是有毒性的。这些酶的实例包括赭曲霉毒素酰胺酶、麦角胺水解酶、麦角胺淀粉酶。动物饲料中的真菌毒素降解酶对控制饲料的真菌毒素污染是有用的。
POI的进一步实例包括抗微生物蛋白，如乳铁蛋白、溶菌酶、乳铁素(lactoferricin)、lactohedrin、κ-酪蛋白、咕啉结合蛋白(haptocorrin)、乳过氧化物酶、牛奶蛋白、急性期蛋白，如在生产动物中响应感染而正常产生的蛋白。
可用作饲料添加剂的酶的实例包括植酸酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。“食品”是指旨在或适合用于人食用、摄入、消化的任何天然或人工饮食膳食等或这些膳食的组份。
可用作食品添加剂的酶的实例包括蛋白酶、脂酶、乳糖酶、果胶甲基酯酶(pectinmethyl esterase)、果胶酶、谷氨酰胺转移酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、乙酰乳酸脱羧酶和漆酶。
酶
POI可以是酶。优选的酶是可用于如制备洗涤剂、淀粉、燃料、纺织品、纸浆和纸、油、个人护理产品或如用于烘烤、有机合成等工业应用的那些。(参见Kirk等，CurrentOpinion in Biotechnology(2002)13:345-351)。
治疗性蛋白
POI可以是治疗性蛋白。如本文更详细的描述，POI可以是但不限于，适合作为如抗体或抗体片段、或衍生自抗体的支架、单结构域抗体及其衍生物、其它非抗体衍生的亲和支架、生长因子、激素、酶、疫苗等的生物制药物质的蛋白。
优选地，所述目标蛋白是哺乳动物多肽，或甚至更优选地是人多肽。特别优选的治疗性蛋白是指可施用于哺乳动物的任何多肽、蛋白、蛋白质变体、融合蛋白和/或其片段。设想但不是必须的，根据本发明的治疗性蛋白是细胞异源的。可通过本发明的细胞生产的蛋白的实例是但不限于，酶、调控蛋白、受体、肽激素、生长因子、细胞因子、支架结合蛋白(如anticalin)、结构蛋白、淋巴因子、粘附分子、受体和可作为激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其他多肽。此外，所述目标蛋白可以是用于接种的抗原、疫苗、抗原结合蛋白、免疫刺激蛋白。
这些治疗性蛋白包括但不限于：胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子，例如如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18的白细胞介素、干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ、肿瘤坏死因子(TNF)TNFα和TNFβ、TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。
在优选的实施方案中，所述蛋白是抗体。术语“抗体”旨在包括含有具有适合并识别表位的特异性形状的分子结构的任何多肽链，其中一个或多个非共价结合相互作用稳定该分子结构与所述表位之间的复合物。原型的抗体分子是免疫球蛋白，且来自所有来源(如人、啮齿动物、兔、牛、羊、猪、狗、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等)的所有类型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgY等)都被认为是“抗体”。例如，抗体片段可包括但不限于：Fv(一种包含VL和VH的分子)、单链Fv(scFV)(一种包含由肽连接子连接的VL和VH的分子)、Fab、Fab'、F(ab')2、单结构域抗体(sdAb)(包含单可变结构域和3CDR的分子)和它们的多价呈现形式(presentation)。所述抗体或其片段可以是鼠、人、人源化或嵌合的抗体或其片段。治疗性蛋白的实例包括抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗体片段，如Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联scFv、双特异性串联scFv、sdAb、纳米抗体、VH和VL，或人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、IgA抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG抗体、IgM抗体、胞内抗体、双抗体、四抗体、微抗体或单抗体(monobody)。
治疗性蛋白的进一步实例包括凝血因子(VII、VIII、IX)、镰刀菌属碱性蛋白酶、降钙素、CD4受体达贝泊汀(darbepoetin)、DNA酶(囊性纤维化)、促红细胞生成素、eutropin(人生长激素衍生物)、促卵泡激素(促滤泡素)、明胶、胰高血糖素、葡糖脑苷脂酶(戈谢病)、源自黑曲霉(A.niger)的葡糖淀粉酶、源自黑曲霉的葡萄糖氧化酶、促性腺激素、生长因子(GCSF、GMCSF)、生长激素(生长激素(somatotropine))、乙肝疫苗、水蛭素、人抗体片段、人载脂蛋白AI、人降钙素前体、人胶原酶IV、人表皮生长因子、人胰岛素样生长因子、人白细胞介素6、人层粘连蛋白、人前脱脂蛋白AI、人血清白蛋白、胰岛素、胰岛素和突变蛋白、胰岛素、干扰素α和突变蛋白、干扰素β、干扰素γ(突变蛋白)、白细胞介素2、促黄体生成激素、单克隆抗体5T4、小鼠胶原蛋白、OP-1(成骨的，神经保护因子)、奥普瑞白介素(白细胞介素11-激动剂)、有机磷酸水解酶(organophosphohydrolase)、PDGF-激动剂、植酸酶、血小板衍化生长因子(PDGF)、重组血纤溶酶原激活剂G、葡萄球菌激酶、干细胞因子、破伤风毒素片段C、组织型纤溶酶原激活物和肿瘤坏死因子(参见Schmidt,ApplMicrobiol Biotechnol(2004)65:363-372)。
前导序列
可将目标蛋白与引发POI自宿主细胞中分泌的前导序列连接。当旨在重组表达和分泌的POI是这样一种蛋白时，即其是非天然分泌的并因此缺乏天然分泌前导序列，或其核苷酸序列已经被克隆而不含其天然分泌前导序列时，使所述分泌前导序列存在于表达载体中是必须的。一般而言，任何对引发POI自宿主细胞中分泌有效的分泌前导序列均可用于本发明中。所述分泌前导序列可以来自酵母源(如来自如酿酒酵母的MFa的酵母α-因子，或酵母磷酸酶)，来自哺乳动物或植物源，或其它。对技术人员而言，适宜的分泌前导序列的选择是显而易见的。可选地，可以在将核苷酸序列克隆在表达载体中之前，通过技术人员已知的常规克隆技术，将所述分泌前导序列融合至编码旨在重组表达的POI的核苷酸序列，或者将包含天然分泌前导序列的编码POI的核苷酸序列克隆在表达载体中。在这些情况下，无需使表达载体中存在分泌前导序列。
也可以以每个细胞单一拷贝或多拷贝形式在一个或多个自主复制质粒中提供所述编码一种或多种POI的重组核苷酸序列，以及编码辅助蛋白的重组核苷酸序列。
可选地，所述编码POI的重组核苷酸序列和编码辅助蛋白的重组核苷酸序列以每个细胞单一拷贝或多拷贝的形式存在于相同质粒中。
辅助蛋白的低表达
发明人还鉴定了几种参与脂质贮存的辅助蛋白(KO辅助蛋白)，观察到它们的表达对自宿主细胞中POI的产量具有负面作用。优选地，此类对自宿主细胞中POI的产量具有负面作用的辅助蛋白不是转录因子。优选的为包含示于SEQ ID NO 16或17中任一个的氨基酸序列的辅助蛋白或其功能同系物。包含示于SEQ ID NO 16或17中任一个的氨基酸序列的辅助蛋白的功能同系物与示于SEQ ID NO 16或17中任一个的氨基酸序列具有至少30％，如至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的序列同一性。此外，已经发现，编码SEQ ID NO 16或17的KO辅助蛋白的基因的修饰(如突变或缺失)能够增加POI的产量。这一发现提供了通过将宿主细胞工程化以使得其低表达由发明人鉴定的KO辅助基因来提供可用于进一步改善POI产量的方法和材料。若宿主细胞中存在此类辅助蛋白，则可将它进行修饰(如突变或敲除)以改善POI的产量。基于本文提供的基因标识符或核苷酸序列，可采用本领域已知的任何方法来鉴定此类KO辅助蛋白的存在。有利地从宿主细胞中缺少以便改善目标非膜蛋白的产量的KO辅助蛋白列于上表1中。
优选地，所述宿主细胞可被工程化以低表达多核苷酸，所述多核苷酸编码包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物的KO蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。例如，所述宿主细胞可被工程化以低表达多核苷酸，该多核苷酸编码包含与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白。例如，所述宿主细胞可被工程化以低表达多核苷酸，该多核苷酸编码包含与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的蛋白。
优选地，与被工程化以低表达KO蛋白之前的宿主细胞相比，当低表达KO1(包含示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列的辅助蛋白)和/或KO2(包含示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列的辅助蛋白)时，宿主细胞中模型蛋白SDZ-Fab或HyHEL-Fab的产量可以增加至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或至少300％和优选地增加至少10％。
术语“低表达”通常是指小于参考标准品显示的表达水平的任何量，所述参考标准品是被工程化以低表达KO蛋白之前的宿主细胞。本发明的术语“低表达(的)”是指基因产物或多肽以小于宿主细胞遗传改变之前的或未被遗传改变的相当的宿主中的相同基因产物或多肽的表达的水平表达。例如，与参考标准品相比，KO蛋白可低表达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或可甚至完全不表达(降低100％)。所述术语“低表达”还涵盖基因产物或多肽的无表达。
可通过阻止KO1和KO2或其功能同系物中一个或多个的功能表达的任何方法来实施低表达。低表达的结果是不能发挥其功能或全部功能。低表达的手段可包括基因沉默(如，RNAi基因反义)、敲除、改变表达水平、改变表达形式、通过诱变基因序列、破坏(disrupt)序列、插入、添加、突变、修饰表达调控序列等。
优选地，通过敲除宿主细胞中编码KO蛋白的多核苷酸来实现低表达。可通过缺失全部或部分编码序列来敲除基因。本领域已知进行基因敲除的方法，如参见Kuhn和Wurst(Eds.)Gene Knockout Protocols(Methods in Molecular Biology)Humana Press(March27,2009)。还可通过移除所述基因序列的部分或全部来敲除基因。可选地，可通过如抗性基因的核苷酸序列的插入来敲除或灭活基因。可选地，通过灭活基因的启动子可使该基因敲除或灭活。因此，对于KO1和KO2的低表达，优选的宿主细胞表达SEQ ID NO:16或17或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，比如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Komagataella和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的真菌宿主细胞是优选的。甚至更优选地为来自巴斯德毕赤酵母属的、表达SEQ ID NO:16或17的真菌宿主细胞。
在一个实施方案中，通过破坏宿主细胞中代表编码所述KO蛋白的基因的多核苷酸来实现低表达。
“破坏”是一种在核苷酸或氨基酸序列中的改变，与破坏之前的原始序列相比，其导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加、缺失或置换。
“插入”或“添加”是一种在核酸或氨基酸序列中的改变，与破坏之前的原始序列相比，所述核酸或氨基酸序列中加入了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
“缺失”定义为一种在核苷酸或氨基酸序列中的改变，在所述核苷酸或氨基酸序列中相应地移除(即，缺失)了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。缺失涵盖整个序列的缺失、所述编码序列的部分的缺失或者单一核苷酸或氨基酸残基的缺失。
“置换”通常是指核苷酸或氨基酸残基被其它核苷酸或氨基酸残基替代。例如可通过定点突变、随机突变的产生和缺口双链体方法(gapped-duplex approach)(参见，如美国专利No.4,760,025；Moring等，Biotech.(1984)2:646；和Kramer等，Nucleic Acids Res.,(1984)12:9441)来实施“置换”。
优选地，破坏导致了阅读框移码突变(frame shift mutation)、早期终止密码子(early stop codon)、关键残基的点突变、无义的翻译或其它非功能蛋白产物。
在另一个实施方案中，通过破坏可操作地与所述待敲除多肽连接的启动子来实现低表达。启动子指导下游基因的转录。所述启动子是必须的，其与其他表达控制序列如增强子、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列一起表达给定基因。因此，还可以破坏任何所述表达控制序列以阻碍所述多肽的表达。
在另一个实施方案中，通过转录后基因沉默(PTGS)来实现低表达。作为本领域常用的技术，PTGS通过异源RNA序列(对需要破坏的基因而言，往往是反义的)的表达降低基因的表达水平(Lechtreck等，J.Cell Sci(2002).115:1511-1522；Smith等，Nature(2000).407:319-320；Furhmann等，J.CellSci(2001).114:3857-3863；Rohr等，Plant J(2004).40(4):611-21)。
可通过本领域已知的减少基因表达的任何技术来实现“低表达”。例如，与所述多肽可操作地连接的启动子可被具有较低启动子活性的另一启动子替代。可以通过启动子的转录效率来评估启动子活性。可通过测量从该启动子的mRNA转录的量来直接地测定启动子活性，如通过RNA印迹法、定量PCR，或通过测量自该启动子表达的基因产物的量来间接地测定启动子活性。在另一个实施方案中，可通过干预表达的KO蛋白的折叠，以使得该KO蛋白不能正确折叠成为功能性蛋白来实现低表达。例如，可引入突变以移除所述KO蛋白的二硫键的形成或破坏α螺旋和β折叠的形成。
在另一实施方案中，低表达辅助蛋白KO1和/或KO2的宿主细胞可过表达一种或多种本发明的辅助蛋白。在本文的项目中公开了过表达和低表达的辅助蛋白的具体组合。
用途
本发明进一步提供所述工程化宿主细胞用于制备目标蛋白的用途。所述宿主细胞可有利地用于引入编码一种或多种POI的多肽，之后可将该宿主细胞在适宜的条件下培养以表达所述POI。在本文中关于本发明的方法部分描述了这一用途的细节。
可以通过将相关基因各自连接(ligating)至一个载体中，使编码辅助蛋白和POI的多核苷酸重组于所述宿主细胞中。可以构建携带所述基因的单一载体，或两个独立的载体，其中一个携带辅助蛋白基因而另一个携带POI基因。可通过采用一种或多种所述载体转化宿主细胞，将这些基因整合至所述宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，将编码POI的基因整合至所述基因组中，而将编码辅助蛋白的基因整合至质粒或载体中。在一些实施方案中，将编码辅助蛋白的基因整合至所述基因组中，而将编码POI的基因整合至质粒或载体中。在一些实施方案中，将编码POI和辅助蛋白的基因均整合至所述基因组中。在一些实施方案中，将编码POI和辅助蛋白的基因整合至质粒或载体中。若采用编码POI的多个基因，则将编码POI的一些基因整合至所述基因组中，而将另一些基因整合至相同或不同的质粒或载体中。若采用编码辅助蛋白的多个基因，则将编码辅助蛋白的一些基因整合至所述基因组中，而将另一些基因整合至相同或不同的质粒或载体中。可在本申请的以下部分找到更多教导。
通常，可采用重组宿主细胞，通过在合适的培养基中培养该宿主细胞，自培养物中分离表达的POI，并通过适合表达产物的方法将POI纯化，特别是将POI自细胞中分离，生产目标蛋白。
本发明进一步提供分离的多肽用于制备目标蛋白的用途，其中所述分离的多肽包含与示于SEQ ID NO:1-15和18中任一个的氨基酸序列具有至少30％同一性的氨基酸序列。
方法
本发明进一步涉及增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括过表达本发明的多核苷酸。所述多核苷酸编码包含与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。
本发明进一步涉及增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括低表达包含与示于SEQ ID NO:16和/或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。
如本文所用，术语“增加宿主细胞中目标蛋白的产量”是指与在相同培养条件下表达相同POI但是编码辅助蛋白的多核苷酸未过表达的相同细胞相比，目标蛋白的产量增加了。
本领域技术人员将理解，本发明的辅助蛋白的过表达已经表明增加了POI的产物产量。因此，对于以应当被增加的水平表达POI的给定宿主细胞而言，如果辅助蛋白不存在于该宿主细胞中，则可通过在该宿主细胞中表达任一种或若干种辅助蛋白而应用本发明，或者如果编码辅助蛋白的基因已经存在于该宿主细胞中，则可通过进一步增加该宿主细胞中辅助蛋白的表达水平而应用本发明。
本发明进一步提供一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法。所述方法包括(i)将宿主细胞工程化以表达或过表达辅助蛋白，(ii)将所述宿主细胞工程化以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸，和(iii)在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白和并表达目标蛋白和任选地(iv)自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。应当注意，在(i)和(ii)中所述的步骤无需按照所述的顺序实施。可以首先实施(ii)中所述的步骤然后实施(i)中所述的步骤。在步骤(i)中，所述宿主细胞可被工程化以过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。
本发明进一步提供一种增加宿主细胞中目标蛋白的产量的方法。所述方法包括(i)将宿主细胞工程化以低表达辅助蛋白，(ii)将所述宿主细胞工程化以包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸，和(iii)在适宜条件下培养所述宿主细胞以表达目标蛋白和任选地(iv)自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。应当注意，在(i)和(ii)中所述的步骤无需按照所述的顺序实施。可以首先实施(ii)中所述的步骤然后实施(i)中所述的步骤。在步骤(i)中，所述宿主细胞可被工程化以低表达多核苷酸，所述多核苷酸编码包含与示于SEQ IDNO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性的氨基酸的辅助蛋白。
本领域技术人员熟知用于操作如编码辅助蛋白和/或POI的多核苷酸序列、启动子、增强子、前导区(leader)等的程序，如J.Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(2001)描述的。
可通过多种手段，如通过同源重组或通过采用特异性靶向在整合位点的序列的混合重组酶(hybrid recombinase)，将外源或靶多核苷酸(如编码过表达的辅助蛋白或POI的多核苷酸)插入染色体中。典型地，所述外源或靶多核苷酸存在于载体(“插入载体”)中。典型地，在用于同源重组之前，这些载体是环状的和线性的。作为一种选择，所述外源或靶多核苷酸可以是稍后被重组至宿主细胞中的通过融合PCR连接的DNA片段或合成构建的DNA片段。除了同源臂之外，载体还可含有适于选择或筛选的标记、复制起点和其它元件。还可以采用导致随机或非靶向整合的异源重组。异源重组是指DNA分子与显著不同的序列之间的重组。本领域已知重组的方法，例如在Boer等，Appl Microbiol Biotechnol(2007)77:513–523中所描述的。对于酵母细胞的遗传操作还可参考Primrose和Twyman的Principles ofGene Manipulation and Genomics(第七版，Blackwell Publishing 2006)。
编码过表达的辅助蛋白和/或POI的多核苷酸还可存在于表达载体上。这些载体是本领域已知的并已经在上文描述过。在表达载体中，启动子置于编码异源蛋白的基因的上游，并调控所述基因的表达。由于多克隆载体的多克隆位点，其是特别有用的。对于表达，通常将启动子置于多克隆位点的上游。既可通过首先制备含有编码辅助蛋白和/或POI的完整DNA序列的DNA构建体，并随后将这一构建体插入适宜的表达载体中，也可以通过顺序地插入含有个体元件(如，前导序列、靶DNA序列)遗传信息的DNA片段，然后连接，来构建用于编码辅助蛋白和/或POI的多核苷酸的整合的载体。作为片段的限制和连接的替代，可把基于附着位点(att)的重组方法和重组酶用于将DNA序列插入载体中。这些方法由例如Landy(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913-949描述，并是本领域技术人员已知的。
可通过将包含靶多核苷酸序列的载体或质粒引入细胞来获得根据本发明的宿主细胞。本领域熟知用于转染或转化真核细胞或者转化原核细胞的技术。这些技术可以包括脂囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、病毒感染(特别是使用经修饰的病毒诸如例如经修饰的腺病毒)、显微注射和电穿孔。对于原核转化，技术可以包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。用于植物转化的技术包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转移(诸如通过根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)实现的)、被快速推进的钨或金微弹、电穿孔、显微注射和聚乙二醇介导的摄取。DNA可以是单链的或双链的、线性的或环状的、松弛的或超螺旋的DNA。对于用于转染哺乳动物细胞的多种技术，参见例如Keown等(1990)Processes in Enzymology185:527-537。
本发明进一步提供一种在宿主细胞中制备目标蛋白的方法，所述方法包括(i)提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码包含示于SEQID NO:1-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；和(ii)在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述辅助蛋白或其功能同系物和表达目标蛋白和任选地自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
本发明进一步提供一种在宿主细胞中制备目标蛋白的方法，所述方法包括(i)提供宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以低表达多核苷酸，所述多核苷酸编码包含示于SEQID NO:16或17中任一个的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；和(ii)在适宜条件下培养所述宿主细胞以表达目标蛋白和任选地分离所述目标蛋白。优选地，将所述宿主细胞工程化以低表达两种编码辅助蛋白的多核苷酸，所述辅助蛋白包含示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列或其功能同系物。
应当理解，本文公开的方法可进一步包括在允许所述POI和辅助蛋白表达的条件下培养所述重组宿主细胞。然后，根据表达系统和表达的蛋白的性质，例如所述蛋白是否融合为单一肽和所述蛋白是可溶的还是不溶的，可以从细胞或细胞培养基中分离重组生产的POI。本领域技术人员将理解，根据包括宿主细胞(特别是所采用的表达载体)的类型的因素，培养条件将改变。通常，信号肽含有带正电的N-末端，随后是疏水内核，随后是用于称为信号肽酶的酶的识别位点。在易位期间，这种酶从所述蛋白切割信号肽。将所述蛋白从内质网转运至高尔基体，然后根据该蛋白的性质进行分泌途径中多个路线的一个。所述蛋白可分泌至培养基中或可例如保留在细胞中。某些分泌的蛋白的前导序列包含位于信号肽C-末端的肽，并在信号肽的切割后自成熟目标蛋白加工。这种前导区常常是指前原肽(prepropeptide)，其中前区(pre region)是信号序列，原区(pro region)是指前导区的剩余部分。
一个实例是酵母α-因子前导区，其含有信号肽(包括C-末端信号肽酶识别位点(Ala-Leu-Ala)，随后是含有构成KEX2蛋白酶加工位点的碱性氨基酸对(Lys-Arg)的原区，紧随其后的是在原区的C-末端的肽Glu-Ala-Glu-Ala。这一前导区的加工涉及通过信号肽酶的信号肽的移除，随后是KEX2蛋白酶对Lys和Arg残基之间的切割。之后，通过是STE13基因的产物的肽酶将GluAlaGluAla残基移除(Julius等，Cell(1983)32:839)。在美国专利4,546,082中描述了所述酵母α-因子前导区。已经在用于酵母中异源蛋白的生产的重组表达系统中应用了衍生自由酵母细胞天然分泌的蛋白的信号肽。尽管某些哺乳动物信号肽在促进酵母中异源蛋白的分泌方面不是有效的，但是也已经报道了哺乳动物信号肽在酵母表达系统中的应用。
短语“在适宜的条件下培养以使得所需多肽表达”是指在适合或足够获得所需化合物的生产或获得所需多肽的条件(如温度、压力、pH、诱导、生长速率、培养基、持续时间等)下维持微生物和/或使微生物生长。
通过用一种或多种辅助蛋白基因和/或POI基因转化或通过低表达所述一种或多种辅助蛋白基因和/或通过POI基因转化获得的根据本发明的宿主细胞可优选首先在这样的条件下培养，所述条件允许宿主细胞在没有表达异源蛋白的负担下高效生长至大的细胞数量。当细胞准备进行POI表达时，选择并优化适宜的培养条件以产生POI。
作为示例，使用针对一种或多种辅助基因和/或一种或多种POI的不同启动子和/或拷贝和/或整合位点，可关于与一种或多种POI的表达有关的时间点和诱导强度来控制辅助基因的表达。例如，在POI表达的诱导之前，可首先表达一种或多种辅助蛋白。这样做具有如下优势：在POI翻译开始时所述一种或多种辅助蛋白已经存在。可选地，可在同一时间诱导一种或多种辅助蛋白和一种或多种POI。在另一实例中，在诱导POI表达之前，所述一种或多种辅助蛋白可已经先表达。这样做具有如下优势：在POI翻译开始时所述一种或多种辅助蛋白已经存在。
一旦施加诱导刺激就会被激活的诱导型启动子可用于在该启动子控制下的基因的直接转录。在有诱导刺激的生长条件下，细胞通常比在正常条件下生长得慢，但因为培养物已经在前一阶段生长至大的细胞数量，培养系统整体产生大量的异源蛋白。诱导刺激优选是适当试剂(如针对AOX-启动子的甲醇)的添加或适当营养物(如针对MET3-启动子的甲硫氨酸)的消耗。此外，根据与所述一种或多种辅助基因和一种或多种POI可操作地连接的启动子，乙醇、甲胺、镉或铜的添加以及热或渗透压增加剂也可诱导表达。
优选将根据本发明的宿主在生物反应器中在优化的生长条件下培养以获得至少1g/L、优选至少10g/L细胞干重、更优选至少50g/L细胞干重的细胞密度。不仅在实验室规模中，而且在中试或工业规模中，实现这样的生物分子生产量是有益的。
根据本发明，由于辅助蛋白的过表达和/或KO蛋白的低表达，即使在生物质保持较低的情况下都可高产量地获得POI。因此，在实验室、中试和工业规模中达到高单位产量(specific yield)是可行的，其中单位产量以mg POI/g干生物质度量，可以在1至200的范围，比如50至200、如100至200的范围。当与无辅助蛋白过表达和/或KO蛋白低表达情况下的产物表达相比时，根据本发明的生产宿主的单位产量优选提供至少1.1倍、更优选至少1.2倍、至少1.3或至少1.4倍的增加，在一些情况下，可以显示超过2倍的增加。
根据本发明的宿主细胞可通过以下标准试验来测试其表达/分泌能力或产量：如ELISA、活性检验、HPLC、表面等离子体共振(Biacore)、蛋白质印迹法、毛细管电泳(Caliper)或SDS-Page。
优选将细胞培养在含有合适碳源的矿物质培养基中，由此进一步显著地简化分离过程。作为示例，所述矿物质培养基含有可利用碳源(例如葡萄糖、甘油、乙醇或甲醇)、含有常量元素(钾、镁、钙、铵、氯化物、硫酸盐、磷酸盐)和痕量元素(铜、碘、锰、钼酸盐、钴、锌和铁盐以及硼酸)的盐。
在酵母细胞的情况下，可以用上述一种或多种表达载体的一种或多种转化所述细胞，使这些细胞交配(mated)以形成二倍体菌株，并在被修饰为适合诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。本领域已知许多适于酵母菌生长的最低限度培养基。根据需要，可向这些培养基的任一种中补充盐(比如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES、柠檬酸和磷酸盐缓冲液)、核苷(如腺嘌呤和胸腺嘧啶)、抗生素、痕量元素、维生素和葡萄糖或等效能源。还可包括以本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必须的补充物。所述培养条件(如温度、pH等)是之前用于选择进行表达的宿主细胞的条件，这是普通技术人员已知的。针对其它类型宿主细胞的细胞培养条件也是已知的并可由技术人员容易地确定。对各种微生物的培养基的描述例如涵盖在美国微生物学会(American Society for Bacteriology)的“一般细菌学方法手册”的指南(华盛顿D.C,USA,1981)中。
可以通过常规的培养方法，例如静止培养、试管培养、振荡培养(例如旋转振荡培养、摇瓶培养等)、掺气旋动培养(aeration spinner culture)或发酵，优选地连续或间歇地在液体培养基中培养(例如维持和/或生长)细胞。在一些实施方案中，在摇瓶或深孔板中培养细胞。在另一些实施方案中，在生物反应器(例如在生物反应器培养过程)中培养细胞。培养过程包括、但不限于，分批培养、进料分批培养和连续方法培养。术语“分批过程”和“分批培养”是指一个封闭的系统，该系统中的培养基组成、营养物、补充添加剂等在培养开始时已设定，并在培养期间不经受改变；但是，可尝试控制如pH和氧浓度的因素来阻止过度培养基酸化和/或细胞死亡。术语“进料分批过程”和“进料分批培养”是指具有以下例外的一种分批培养：随着培养的进行，添加(例如，以增量或连续方式添加)一种或多种底物或补充物。术语“连续过程”和“连续培养”是指一种系统，在该系统中将限定的培养基连续地添加至生物反应器，并同时将等量的用过的或“条件化”的培养基移除，例如用于回收所需产物。已经开发了多种这样的过程并且这些过程是本领域熟知的。
在一些实施方案中，将细胞培养约12至24小时，在另一些实施方案中，将细胞培养约24至36小时，约36至48小时，约48至72小时，约72至96小时，约96至120小时，约120至144小时，或培养持续时间大于144小时。在又一些实施方案中，培养持续一段足以达到POI的所需生产产量的时间。
上述提及的方法可进一步包括分离表达的POI的步骤。若所述POI是从细胞中分泌出来的，则该POI可采用现有技术从培养基中分离并纯化。POI从细胞中分泌出来通常是优选的，因为是从培养上清液中回收产物，而不是从当细胞被破坏以释放胞内蛋白时产生的复杂蛋白混合物中回收。蛋白酶抑制剂，如苯基甲基磺酰氟(PMSF)，在抑制纯化过程中的蛋白质降解可能是有益的，且可包括抗生素以阻止外来污染物的生长。可采用本领域已知的方法将组合物浓缩、过滤、透析等。可选地，培养的宿主细胞也可以通过超声波或机械法、酶法或化学法来破裂以得到含有所需POI的细胞提取物，从该细胞提取物中可以分离和纯化到POI。
可以使用的用于获得POI的分离和纯化方法，可以基于利用溶解度差异的方法，比如盐析和溶剂沉淀；利用分子量差异的方法，比如超滤和凝胶电泳；利用电荷差异的方法，比如离子交换层析；利用特异亲和性的方法，比如亲和层析；利用疏水性差异的方法，比如反相高效液相层析；以及利用等电点差异的方法，比如等电点聚集。优选采用特异的纯化步骤来移除同时表达的并会对POI制品造成污染的任何辅助蛋白。
分离和纯化的POI可以通过常规方法，比如蛋白质印迹法或对POI活性的特异性检验来鉴定。纯化的POI的结构可以通过氨基酸分析、氨基-末端肽测序、如通过质谱的一级结构分析等来测定。优选可以大量和高纯度水平获得POI，这样即可满足作为药物组合物中的活性成分或者作为饲料或食品添加剂的必要要求。
实施例
提出下述实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不是要限制被认为是本发明的且权利要求中限定的内容的范围。已经尝试保证所使用的数字(例如量、温度、浓度等)的准确性，但应该允许一些实验误差和偏差。除非另外说明，份是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
以下实施例将证明，基于POI的表达，新鉴定的参与脂质生物合成的蛋白(即辅助蛋白)基于它们的过表达和/或低表达分别增加了POI的效价(以mg/L表示的每体积的产物)和产量(以mg/g生物质表示的每生物质的产物，生物质以干细胞重量或湿细胞重量来度量)。作为实例，在巴斯德毕赤酵母中重组抗体Fab片段和重组酶的产量增加。在振荡培养(在摇瓶或深孔板中进行)和实验室规模的进料-分批培养中显示出了积极作用。
实施例1：巴斯德毕赤酵母生产菌株的产生
a)分泌抗体Fab片段HyHEL的巴斯德毕赤酵母菌株的构建
将巴斯德毕赤酵母CBS7435(CBS，由Küberl等，2011对其基因组测序)muts(自荷兰Uetrech的CBS-KNAW真菌生物多样性中心获得)变体用作宿主菌株。pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX表达载体是WO2008/128701A2中描述的pPuzzle_ZeoR载体骨架的衍生物，其包含pUC19细菌复制起点和博来霉素(Zeocin)抗生素抗性盒。异源基因的表达分别由巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子或醇氧化酶(AOX)启动子和酿酒酵母CYC1转录终止子介导。采用表3中HyHEL-HC和HyHEL-LC的引物，将抗体Fab片段HyHEL(图2)的轻链(LC)(SEQ IDNO:44)和重链(HC)(SEQ ID NO:43)从载体DNA模板(携带具有N-末端酿酒酵母α交配因子信号前导序列的目的基因)中扩增，并且将每一条链都连接到由SbfI和SfiI消化的载体pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX上。将所述LC片段连接到pPM2d_pGAP和pPM2d_pAOX变体上，其中启动子区中的一个限制性酶位点被换为另一个，以允许随后的线性化(在pPM2d_pGAP中是NdeI而不是AvrII，在pPM2d_pAOX中是Bsu36I而不是Bpu1102I)；将所述HC片段连接到所述载体的未修饰版本中。在LC和HC的序列验证之后，通过采用相容性限制性酶MreI和AgeI将两条链的表达盒组合到一个载体上。
在电穿孔(采用描述于Gasser等，2013.Future Microbiol.8(2):191-208中的标准的转化方案)至巴斯德毕赤酵母中之前，分别采用NdeI限制性酶(针对pPM2d_pGAP)或Bsu36I限制性酶(针对pPM2d_pAOX)将质粒线性化。在含有50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YPD板(每升：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂)上实施阳性转化体的筛选。使用菌落PCR(colony PCR)来确保转化的质粒的存在。因此，通过将巴斯德毕赤酵母菌落蒸煮(cook)和冷冻各5分钟获得基因组DNA，并将其直接用于采用适当引物的PCR。将得到的菌株分别命名为CBS7435 mutS pAOXHyHEL-Fab或CBS7435 mutS pGAP HyHEL-Fab。
b)分泌抗体Fab片段SDZ的巴斯德毕赤酵母菌株的构建
采用表2中SDZ-HC和SDZ-LC的引物，将抗体Fab片段SDZ(图2)的轻链(LC)和重链(HC)从载体DNA模板(携带具有N-末端α交配因子信号前导序列的目的基因)中扩增，并且将每一条链连接到分别由SbfI和SfiI消化的pPM2d_pAOX或具有Bsu36I限制性位点的pPM2d_pAOX的变体上。在LC和HC的序列验证之后，通过采用相容性限制性酶MreI和AgeI将两条链的表达盒组合到一个载体上。
在电穿孔(采用描述于Gasser等，2013.Future Microbiol.8(2):191-208中的标准的转化方案)至巴斯德毕赤酵母中之前，采用Bsu36I限制性酶将质粒线性化。在含有50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YPD板(每升：10g酵母提取物、20g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂-琼脂)上实施阳性转化体的筛选。使用菌落PCR(colony PCR)来确保转化的质粒的存在。因此，通过将巴斯德毕赤酵母菌落蒸煮(cook)和冷冻各5分钟获得基因组DNA，并将其直接用于采用适当引物的PCR。将得到的菌株分别命名为CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab或CBS7435 mutSpGAP SDZ-Fab。
表2示出了HyHEL LC和HC以及SDZ LC和HC的PCR扩增的寡核苷酸引物(α-交配因子_上游是用于所有Fab链的扩增的上游引物)。
表2
实施例2：工程化的巴斯德毕赤酵母菌株的评估
甲基营养型酵母毕赤酵母是公认的过表达和产生包括已经利用许多应用的目标蛋白(POI)在内的异源或重组蛋白的宿主，所述应用提供过剩的生产/分泌能力。工程化此类宿主菌株的策略包括例如辅助蛋白，比如分子伴侣或蛋白质折叠机构的其他组分(Zhang等，Biotechnol Prog.(2006).22(4):1090-1095)的过表达。大多旨在改善巴斯德毕赤酵母作为宿主的重组蛋白产生/分泌的应用并未在更广泛的背景下考虑巴斯德毕赤酵母的细胞生物学。
尽管巴斯德毕赤酵母在生物技术相关的应用中得到广泛应用，但是其细胞生物学信息(例如在巴斯德毕赤酵母上可获得的膜特性和特征)的量却很低。因此研究了如本文所定义的参与脂质代谢的蛋白单独或组合过表达或低表达对重组或异源蛋白质产生/分泌的影响，所述脂质代谢例如包括脂肪酸延伸的鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运、麦角甾醇生物合成、或脂质贮存。作为这种目标蛋白的模型蛋白，使用了两种不同的Fab蛋白。此外，还研究了分子伴侣与参与脂质代谢的蛋白的组合过表达。
实施例3：过表达靶基因的菌株的产生
为了研究对Fab分泌的阳性效应，在两种不同的Fab生产菌株：CBS7435 pPM2d_pAOX HyHEL和CBS7435 pPM2d_pAOX SDZ(产生参见实施例1)中过表达参与脂质代谢的不同蛋白(参见本文表1)的一个或它们的组合，或与分子伴侣的组合。
a)脂质代谢或分子伴侣基因的扩增和向pPM2aK21表达载体中的克隆
采用示于表3和5的引物，通过PCR(Phusion Polymerase，ThermoFisherScientific)从起始(包括真正(authentic)Kozak序列的起始3或4个核苷酸)到终止密码子扩增单独(表3；参见实验4a-c的结果)和组合(表3；实验6a的结果)过表达的基因。除了不能从序列搜索中检索到所需基因的相应编码序列，将来自巴斯德毕赤酵母菌株CBS7435 mutS的基因组DNA用作模板(表3)。因此，更准确地说，对于LIP1或TSC3，使用示于表3的引物从酿酒酵母BY4741的基因组DNA中扩增酿酒酵母编码的序列。将序列克隆至具有两个限制性酶SbfI和SfiI的pPM2aK21表达载体的MCS中。pPM2aK21是pPM2d(描述于实施例1a)的衍生物，其包含AOX终止子序列(用于整合入天然AOX终止子基因座)、大肠杆菌的复制起点(pUC19)、用于大肠杆菌和酵母中选择的抗生素抗性盒(kanMX，赋予对卡那霉素和G418的抗性)、用于目标基因(GOI)的表达盒，其编码参与脂质代谢的蛋白或分子伴侣，包含GAP启动子、多克隆位点(MCS)和酿酒酵母CYC1转录终止子。通过Sanger测序验证基因序列。
表3从Sturmberger等[J.Biotechnol.(2016).235(4):121-131)]检索巴斯德毕赤酵母序列的基因特性，和从Cherry J.M.等[Nucleic Acids Res.(2012)40(Databaseissue)]检索酿酒酵母序列的基因特性。
表3
§在全长序列之后的HMG1的DNA-序列为两个截短的变体(t1、t2)，它们的膜锚定结构域被去掉，其中(除了其起始ATG-密码子)变体t1HMG1缺少起始1449个核苷酸，或变体t2HMG1缺少1543个核苷酸。
b)编码参与脂质代谢的蛋白或分子伴侣的至少两种基因在Fab生产菌株中的过表达
将巴斯德毕赤酵母Fab过生产菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab和CBS7435 mutSpAOX SDZ-Fab用作宿主菌株以过表达编码参与脂质代谢的蛋白或分子伴侣的两种、三种或四种基因(参见实施例3a)。在(采用描述于Gasser等，2013.Future Microbiol.8(2):191-208中的标准的转化方案)转化至Fab生产菌株之前，所述含有选自表3的基因的pPM2aK21载体在AOX终止子序列中用限制性酶AscI线性化。在含有G418和博来霉素(Zeocin)的YPD琼脂平板上选择阳性转化体。
实施例4：Fab表达的筛选
在小规模筛选中，测试巴斯德毕赤酵母Fab生产菌株CBS7435 mutSpAOX HyHEL-Fab中每个过表达一种编码参与脂质代谢的蛋白的基因(参见表1和3)的8至12个转化体。通过与用线性化空载体(pPM2aK21)共转化的亲本宿主CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab相比较来评估这些转化体，并基于它们对细胞生长、Fab效价和Fab产量的影响进行排名。
在另外的宿主菌株CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab的背景下再次评估了编码参与脂质代谢的蛋白的一批基因。并且，与用线性化空载体(pPM2aK21)共转化的亲本宿主CBS7435mutS pAOX SDZ-Fab相比，测试了8至12个转化体。
a)巴斯德毕赤酵母Fab生产菌株的小规模培养
将巴斯德毕赤酵母菌株的单一菌落接种于2mL含有10g/L甘油和50μg/mL博来霉素(Zeocin)的YP-培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨)，并在25℃下生长过夜。将这些培养物的等分试样(对应于终OD600为2.0)转移到2mL补充有20g/L葡萄糖和葡萄糖饲料片(Kuhner,Switzerland；CAT#SMFB63319)的合成筛选培养基M2(在下面给出该培养基的组成)中，并于25℃下，以280rpm在24深孔板中温育25小时。通过离心洗涤培养物一次，然后将沉淀重悬于合成筛选培养基M2中，将等分试样(对应于终OD600为4.0)转移到新鲜24深孔板中的2mL合成筛选培养基M2中。每12小时重复加入甲醇(5g/L)共48小时，然后在室温下以2,500xg离心10分钟而收获细胞并准备用于分析。通过测量1mL细胞悬浮液的细胞重量来测定生物质，而在上清液中重组分泌蛋白的测定在以下实施例4b-4c中描述。
每升合成筛选培养基M2含有：22.0g柠檬酸一水合物、3.15g(NH4)2PO4、0.49gMgSO4*7H2O、0.80g KCl、0.0268g CaCl2*2H2O、1.47mLPTM1痕量金属、4mg生物素；用KOH(固体)将pH设定至5。
b)SDS-PAGE&蛋白质印迹分析
采用Bio-Rad Mini-Protean Tetra Cell系统进行蛋白质凝胶分析，其使用12.5％分离凝胶(基于Tris的不连续缓冲系统)和Tris-Glycin运行缓冲液。电泳后，蛋白质或是通过胶体考马斯染色而显色，或是被转移至硝酸纤维素膜用于蛋白质印迹分析。因此，采用用于湿(槽(tank))转移的MiniCell(Bio-Rad)，根据制造商的说明，将蛋白质电印迹至硝酸纤维素膜上。在封闭后，用以下抗体探测蛋白质印迹：对于Fab轻链：抗-人κ轻链(结合的和游离的)-过氧化物酶(HRP)缀合的抗体，Sigma A7164(1:5,000)；对于Fab重链：以1:1,000稀释的小鼠抗人IgG抗体(Ab7497，Abcam)和以1:5,000稀释的在山羊中产生的抗小鼠IgG(整个分子)-过氧化物酶缀合的抗体(A4416，Sigma)作为第二抗体。
采用用于HRP缀合物的化学发光Super Signal West ChemiluminescentSubstrate(Thermo Scientific)进行检测。
c)通过ELISA的Fab的定量
采用抗-人IgG抗体(ab7497,Abcam)作为包被抗体和山羊抗-人IgG(Fab特异性)-过氧化物酶缀合的抗体(Sigma A0293)作为检测抗体，通过ELISA进行完整Fab的定量。人Fab/κ、IgG片段(Bethyl P80-115)用作标准品，起始浓度为100ng/mL，相应地稀释上清液样品。将TMB(biomol E102)用作检测的底物。包被-、稀释-和洗涤缓冲液是基于PBS(2mMKH2PO4、10mM Na2HPO4.2 H2O、2.7mM g KCl、8mM NaCl，pH 7.4)的，并相应地用BSA(1％(w/v))和/或吐温20(0.1％(v/v))来完成。
表4示出了通过过表达表5所示基因的工程化的菌株的ELISA评估得到的模型POIHyHEL-Fab的效价和产量的倍数变化(FC)水平。数值以与过表达空整合载体的亲本菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab的相对数给出。所研究的克隆的数目在括号中给出(n，检测的克隆数)。从Sturmberger等[J.Biotechnol.(2016).235(4):121-131)]检索巴斯德毕赤酵母序列的基因特性，和从Cherry J.M.等[Nucleic Acids Res.(2012)40(Databaseissue)]检索酿酒酵母序列的基因特性。
表4：
§在全长序列之后的HMG1的DNA-序列为两个截短的变体(t1、t2)，它们的膜锚定结构域被去掉，其中(除了其起始ATG-密码子)变体t1HMG1缺少起始1449个核苷酸，或变体t2HMG1缺少1543个核苷酸。
如表4所示，由过表达编码参与脂质代谢的蛋白的基因(根据上表4)的工程化的菌株生产/分泌的HyHEL-Fab的产量增加了至少20％。在CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab中也过表达ELO3(PP7435_chr3-0987)，其效价FC为1.3(n＝11)和产量FC为1.4(n＝11)。
实施例5：低表达所选择的基因的菌株的产生
将巴斯德毕赤酵母POI生产菌株工程化以包含基因的敲除，所述基因为参与脂质生物合成途径的基因，例如参与脂质贮存的基因。所选择的基因为两种编码三酰甘油合成酶的基因：dga1(PP7435_Chr3-1009(表1))和lro1(PP7435_Chr2-0587表1))。
将巴斯德毕赤酵母Fab过生产菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab用作宿主菌株。按照Heiss等(2013)[Appl Microbiol Biotechnol.97(3):1241-9.]所描述的，采用分裂标记盒方法来产生具有被破坏基因座的转化体。使用能够在G418上生长的转化体的基因组DNA和在破坏盒外的引物，通过PCR进行阳性敲除菌株的验证。
表5列出了所有用于敲除盒(每个敲除靶标2个重叠的分裂标记盒)的构建的引物：通过PCR(Phusion聚合酶，Thermo Scientific)，将引物对A_正向/A_反向、B_正向/B_反向、C_正向/C_反向、D_正向/D_反向用于扩增片段A、B、C和D。片段A从巴斯德毕赤酵母基因组DNA扩增，在相应ATG(靶基因的)的5起始(prime)方向上的1000bp开始，直到ATG的5起始方向的约200bp。片段D从巴斯德毕赤酵母基因组DNA扩增，在相应ATG(靶基因的)的3起始方向上的200bp开始，直到ATG的3起始方向的1000bp。片段B由KanMX选择标记盒的前三分之二组成，并从pPM2aK21载体DNA模板中扩增。片段B由KanMX选择标记盒的后三分之二组成，并从pPM2aK21载体DNA模板中扩增。采用引物A_正向和B_反向通过重叠PCR使片段A和B退火在一起(AB)。采用引物C_正向和D_反向通过重叠PCR使片段C和D退火在一起(CD)。为了产生敲除菌株，用总共1μg的片段AB和CD的DNA转化生产Fab的宿主菌株，其中片段AB和CD也是重叠的。在含有500μg/mL G418的YPD琼脂平板上选择细胞。通过PCR，采用引物对检验(check)_正向(在选择标记盒中结合)和检验_反向(在引物序列D_反向之后的3起始区域上结合)验证阳性敲除克隆。由于用KanMX盒替代了400bp区域(ATG周围)，适当尺寸的PCR产物条带(band)确认了在预期基因座处的选择标记盒的整合。
表5
实施例6：编码参与脂质代谢的蛋白的基因的组合(过表达和低表达)
对于过表达编码参与脂质代谢的蛋白的基因的组合，将全部处于组成型pGAP启动子控制下的过表达ELO3(PP7435_Chr3-0987)的CBS7435mutS pAOX HyHEL-Fab菌株或过表达PRY1(PP7435_Chr3-1160)的CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab菌株或过表达HMG1(PP7435_Chr2-0242)的CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab菌株(按照实施例3a和3b所述产生)作为起源菌株。对于低表达编码参与脂质代谢的蛋白的基因的组合，将具有被破坏的基因座DGA1(Δdga1，PP7435_Chr3-1009；如实施例5所述)的CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab菌株作为起源菌株。在所有这些菌株中，编码模型蛋白(POI)HyHEL-Fab的质粒基于博来霉素(Zeocin)作为选择标记，而共过表达编码参与脂质代谢的蛋白的任何其他基因或用于基因座的破坏的盒的质粒携带两侧为共定向loxP识别位点的KanMX抗性盒。
在用至少一种编码参与脂质代谢的蛋白或分子伴侣的其它基因或用于破坏编码参与脂质生物合成的其它蛋白的基因座的盒转化之前，Cre重组酶再循环标记基因表达盒(KanMX–两侧为loxP位点)。因此，用附加型pTAC_Cre_HphMX4质粒转化所选择的用于标记救援(marker rescue)的菌株，该质粒在酿酒酵母TPI启动子的控制下表达Cre重组酶，并且只要培养基中存在潮霉素(Hyg)的选择压力，该质粒就瞬时地保持在巴斯德毕赤酵母中。于28℃下，将转化体在YPD/Zeo/Hyg琼脂平板上生长2天，并在选择性琼脂平板上复印平板，在28℃下再生长2天。仅选择那些在2-3个涂板轮次后丧失了在G418和Hyg上生长的能力的克隆用于24深孔板(DWP)筛选(在实施例4a中描述)。如实施例4c中所述测定Fab效价和产量。然后用另一种过表达编码参与脂质生物合成的蛋白的其他基因的质粒(在实施例3a和b中描述)转化Fab产量和/或效价最佳的菌株，或者然后用一组新的重叠的分裂标记敲除盒(在实施例5中描述)转化Fab产量和/或效价最佳的菌株。在选择性琼脂平板(含有Zeo和G418)上选择8至16个转化体(具有参与脂质生物合成的两种组合的蛋白或参与脂质生物合成的蛋白的敲除)并如实施例4中所述筛选Fab分泌。对于进一步组合的步骤，重复上述程序，从而产生具有三种组合等等的菌株。在所有筛选实验中，将亲本(具有或不具有空载体的过生产宿主菌株)菌株作为参照。
a)编码参与脂质代谢的蛋白的基因的组合的过表达的结果
在过生产菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab的背景中，过表达编码参与脂质代谢的蛋白的至少两种基因的组合揭示了，当以组合过表达鞘脂生物合成(包括脂肪酸延伸途径)的酶组分时，当以与脂质转运途径的组分的组合或以与分子伴侣的组合过表达鞘脂生物合成(包括脂肪酸延伸途径)的酶组分时，当以与磷脂生物合成途径的组分的组合过表达脂质转运途径的酶组分时，或当以与分子伴侣的组合过表达麦角甾醇生物合成途径的酶组分时，Fab产量和/或效价得到明显改善。
结果示于表6。
表6示出了在巴斯德毕赤酵母中过表达编码参与脂质代谢的蛋白的基因的组合(+)的结果。通过ELISA评估得到的HyHEL-Fab的效价/产量的倍数变化(FC)水平以与过表达空整合载体的亲本菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab的相对数给出。CBS7435 mutS pAOXHyHEL-Fab ELO3是用于进一步组合的起源菌株，因此给出的效价的FC值和/或产量的FC值参考该显性克隆(n＝1)。
表6
*sc：酿酒酵母
ELO3(PP7435_chr3-0987)与ELO2(PP7435_Chr3-0603)组合和ELO3(PP7435_chr3-0987)与PRY1(PP7435_chr3-1160)组合也在CBS7435 mutS pAOX SDZ-Fab中过表达，并分别显示了效价的FC为1.2(n＝12)和产量的FC为1.4(n＝12)，以及效价的FC为1.3(n＝10)和产量的FC为1.3(n＝10)。
可以看出，与被空载体对照转化的亲本菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab相比，所列的每一种组合均导致模型蛋白HyHEL-Fab(POI)的Fab效价和/或Fab产量增加(参见表7结果)。与起源菌株相比Fab效价和/或产量的增加表明参与鞘脂生物合成(包括脂肪酸延伸途径)、磷脂生物合成途径、麦角甾醇生物合成途径或脂质转运途径的基因的组合，和任选地与分子伴侣的组合，甚至可以进一步改善以模型蛋白HyHEL-Fab作为示例的POI的效价和/或产量。
b)编码参与脂质代谢的蛋白的基因的组合的低表达的结果
对于两种编码参与脂质代谢的蛋白的基因的敲除的组合，采用具有被破坏的基因座DGA1(PP7435_Chr3-1009)和LRO1(PP7435_Chr2-0587)的CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab菌株。菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab，其具有被成功破坏的基因座DGA1和LRO1并如表7所显示展示了Fab产量和效价方面的结果：
表7示出了两种编码参与脂质生物合成(脂质贮存途径)的蛋白的基因的敲除的结果。通过ELISA评估得到的HyHEL-Fab的效价和产量的倍数变化(FC)水平以与亲本菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL的相对数给出。
表7
实施例7：进料分批培养
在进料分批生物反应器培养中分析直接或间接影响脂质代谢(比如例如包括脂肪酸延伸的鞘脂生物合成和脂质转运)的实施例3和6的工程化菌株，用于验证生产宿主菌株的改进。
a)进料分批方案
将相应的菌株接种到装有50mL YPhyG的宽颈、带挡板(baffled)、有盖的300mL振荡摇瓶中，并在28℃下以110rpm振荡过夜(预培养物1)。从预培养物1中以OD600(在600nm处测量的光密度)在下午晚些时候(倍增时间：约2小时)达到约20(针对YPhyG培养基测量)的方式接种预培养物2(宽颈、带挡板、有盖的1000mL振荡摇瓶中的100mL YPhyG)。预培养物2的温育也在28℃下以110rpm进行。
进料分批在1.0L工作体积的生物反应器(Minifors,Infors,Switzerland)中进行。将所有生物反应器(装有400mL pH约为5.5的BSM-培养基)从预培养物2分别接种至OD600为2.0。一般而言，巴斯德毕赤酵母在甘油上生长以产生生物质，并且所述培养物随后经受甘油进料，随后是甲醇进料。
在初始分批阶段，将温度设定为28℃。在开始生产阶段之前的最后一小时期间，将其降至25℃并在整个剩余过程中保持在该水平，同时pH降至5.0并保持在该水平。将整个过程(级联控制：搅拌器，流量，氧补充)的氧饱和度设定为30％。以700至1200rpm施加搅拌并选择1.0-2.0L/min的流量范围(空气)。使用25％铵实现pH在5.0的控制。根据需要通过加入消泡剂Glanapon 2000控制发泡。
在分批阶段，生成生物质(μ～0.30/h)直至约110-120g/L的湿细胞重量(WCW)。经典的分批阶段(生物质产生)将持续约14小时。通过方程2.6+0.3*t(g/h)所定义的速率使甘油进料，因此在8小时内总共供应30g甘油(60％)。第一取样点选为20小时。
在接下来的18小时(从处理时间20到38小时)的时间内，应用甘油/甲醇的混合进料：甘油进料速率由方程2.5+0.13*t(g/h)定义，供应66g甘油(60％)，和甲醇进料速率由方程0.72+0.05*t(g/h)定义，加入21g甲醇。
在随后72小时(从处理时间38到110小时)的时间内供应总共215-216g的甲醇(进料速率由方程2.2+0.016*t(g/L)定义)。
采用以下程序，在多个时间点取样：将取样的培养液(broth)的第一个3mL(用注射器)弃去。将1mL的新鲜采集样品(3-5mL)转移至1.5mL离心管中，并在13,200rpm(16,100g)下旋转5分钟。将上清液迅速转移至一个单独的小瓶中。
将1mL的培养液在称量去皮的Eppendorf小瓶中以13,200rpm(16,100g)离心5分钟，然后将所得的上清液准确地移除。将小瓶称重(精确度0.1mg)，并减去空瓶的皮重以获得湿细胞重量。
培养基如下：
YPhyG预培养基(每升)含有：20g植物蛋白胨、10g细菌酵母提取物、20g甘油
分批培养基：修饰的基础盐培养基(BSM)(每升)含有：13.5mL H3PO4(85％)、0.5gCaCl·2H2O、7.5g MgSO4·7H2O、9g K2SO4、2g KOH、40g甘油、0.25g NaCl、4.35mL PTM1、0.1mL Glanapon 2000(消泡剂)
PTM1痕量元素(每升)含有：0.2g生物素、6.0g CuSO4·5H2O、0.09g KI、3.00gMnSO4·H2O、0.2g Na2MoO4·2H2O、0.02g H3BO3、0.5g CoCl2、42.2g ZnSO4·7H2O、65.0gFeSO4·7H2O和5.0mL H2SO4(95％-98％)。
进料-溶液甘油(每kg)含有：600g甘油、12mL PTM1
进料-溶液甲醇含有：纯甲醇。
b)结果
表8列出了一些基因或基因组合，与未工程化的含有空载体的Fab生产菌株(对照菌株)相比，这些基因或基因组合的过表达显示出增加在进料分批生产过程中的巴斯德毕赤酵母中的Fab分泌/生产。所述Fab产物效价通过ELISA定量(实施例4c)。生物质被测定为湿细胞重量。产物效价和产量的改变以相对于相应对照菌株的倍数变化值表示。相对于平行地生长和取样以用于直接比较的AOX HyHEL亲本宿主(空载体对照)，进料分批生产过程的倍数变化值表明了效价和产物产量的改善。
表8示出了在进料分批培养中在巴斯德毕赤酵母中使编码参与脂质代谢的蛋白的基因单独或组合过表达的结果。通过ELISA评估得到的HyHEL-Fab的效价/产量的倍数变化(FC)水平以与过表达空整合载体的亲本菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab的相对数给出。
表8
*sc：酿酒酵母
如表8所示，所有所列的基因或基因组合在过表达后都成功地使模型蛋白HyHEL-Fab的产量(mg/生物质)增加了至少20％(倍数变化＞1.2)。直接或间接影响鞘脂生物合成(包括脂肪酸延伸)或代谢或与参与脂质转运的基因或分子伴侣组合的组合过表达表现优于生物反应器中单独过表达ELO3(PP7435_chr3-0987)的起源菌株。
实施例8：小规模培养的脂质分析
将在小规模培养(根据实施例4a中的描述)生产的过表达所选择的基因(列于表3)的巴斯德毕赤酵母生产菌株的生物质用于进行脂质分析。在将细胞重悬浮于10mM Tris/HCl[pH7.5]后，将细胞于4℃下在GenieDisruptor(Scientific Industries)中用玻璃珠破碎10分钟。将得到的匀浆以及细胞碎片和玻璃珠转移到10ml玻璃Pyrex管中，并如Folch等[Folch J.等，Asimple method for the isolation and purification of total lipidsfrom animal tissues,J.Biol.Chem.226(1957)497-509.]所述提取脂质。简言之，用3mlCHCl3：MeOH(2:1；v/v)通过在室温下剧烈摇动1小时提取脂质。通过采用0.2体积0.034％MgCl2、1ml 2N KCl/MeOH(4:1；v/v)和1ml人工上层相(CHCl3:MeoH:H2O；3:48:47；每体积)的连续洗涤步骤除去蛋白质和非极性物质。在台式离心机中以2,000g离心3分钟后，通过抽吸除去水相。最后，将脂质在氮气流下干燥并储存在-20℃。
对于磷脂分析，将脂质提取物手动地加载到硅胶60板(Merck,Darmstadt,Germany)上。通过采用(CHCl3/MeOH/25％NH3；每体积)作为第一和(CHCl3/C3H6O/MeOH/CH3COOH/H2O；每体积)作为第二溶剂系统的二维薄层色谱分离各个磷脂。通过用碘蒸气染色检测磷脂。刮掉染色的斑点，并通过Broekhuyse[Broekhuyse R.M.,Phospholipids intissues of the eye I isolation,characterization and quantitative analysis bytwo-dimensional thin-layer chromatography of diacyl and vinyl-etherphospholipids,Biochim.Biophys.Acta 152(1968)307-315]的程序对磷脂定量。对于总磷脂分析，将干燥的脂质提取物的等分试样直接进行使用磷酸盐作为标准品的磷酸盐测定。
对于非极性脂质(甾醇酯(SE)和三酰基甘油(TG))分析，将脂质提取物加载到硅胶60板(Merck,Darmstadt,Germany)上并通过薄层色谱法分离。采用两步展开系统，逐级展开色谱图。首先，将轻质石油/乙醚/乙酸(35/15/1；每体积)作为流动相，并将色谱图展开至板的半距离。然后，将板干燥，并使用轻质石油/乙醚(49/1；v/v)作为第二流动相，将色谱图进一步展开至板的顶部。通过将板浸入由0.63MnCl2·4H2O、60ml H2O、60ml甲醇和4ml浓硫酸组成的溶液中达15秒使条带可视化，并在105℃的加热室中温育30分钟。通过与适当的标准品(胆固醇油酸酯和三油酰甘油酯)进行比较并用扫描仪(CAMAG TLC Scanner 3)在400nm处进行密度(densitrometric)扫描来鉴定并定量SE和TG条带。
如Quail和Kelly[Quail M.A.,Kelly Sl L.,The extraction and analysis ofsterols from yeast,Methods Mol.Biol.53(1996)123-31]所述进行甾醇分析。在碱性水解脂质提取物后，使用胆固醇作为内标，使用采用HP 5-MS毛细管柱(20mx 0.25mm内径×0.25μm膜厚)的配备质量选择检测器(HP 5972)的Hewlett-Packard 5890气液色谱仪实施气液色谱/质谱(GLC/MS)。以氦气作为载气并且以恒定流速模式设定为0.9ml/min的流速在270℃注射温度下以不分流模式注射1μl的样品等分试样。温度程序为100℃达1分钟，10℃/分钟至250℃，和3℃/分钟至310℃。通过甾醇的质量碎裂模式对其进行鉴定。
表9.亲本菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab和在相应亲本背景下双缺失突变体Δdga1Δlro1的脂质特征。脂质以mg脂质(磷脂、麦角甾醇、三酰甘油、甾醇酯)/g细胞湿重(CWW)列出。如果可能，给出了标准偏差。N.d.(未检测到)。
表9：
表10.亲本菌株CBS7435 mutS pAOX HyHEL-Fab和在相应亲本背景下双缺失突变体Δdga1Δlro1的总细胞提取物的磷脂模式。PI：磷脂酰肌醇；PS：磷脂酰丝氨酸；PC：磷脂酰胆碱；PE：磷脂酰乙醇胺；CL：心磷脂；PA：磷脂酸。
表10
DGA1和LRO1的缺失得到双缺失突突体Δdga1Δlro1。DGA1和LRO1编码酰基转移酶，其是合成三酰甘油所必需的。两种酶都能够使二酰甘油酰基化。DGA1以酰基-CoA依赖性方式使二酰甘油酯化，而LRO1不依赖于酰基-CoA作为酰基供体。从表9中可以看出，三酰甘油-酰基转移酶两者的缺失导致了三酰甘油的完全损失。三酰甘油和甾醇酯都是非极性脂质，它们参与过量甾醇和/或脂肪酸的贮存。然而，它们的存在对于细胞的存活不是必需的。在三酰甘油耗尽的强烈作用下，双缺失突变体Δdga1Δlro1也显示出第二类贮存脂质(即甾醇酯)的强烈减少(表9)。与亲本生产菌株相比，甾醇酯减少了10倍。三酰甘油的消耗和甾醇酯的强烈减少伴随着磷脂和甾醇的普遍减少(表9)。然而，双缺失突变体Δdga1Δlro1的单个磷脂不会受到很大影响(表10)。观察到了磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇的微小变化，与亲本生产菌株相比，两者均以牺牲磷脂酸为代价而增加。
表11.过表达空整合载体(空载体)的或过表达编码参与巴斯德毕赤酵母的麦角甾醇生物合成的蛋白的基因的亲本菌株CBS7435 mutS pAOXHyHEL-Fab的总细胞提取物的甾醇组成。HMG1以其天然全长形式以及缺失其N-末端跨膜结构域(详情参见表1的脚注)的两种截短的形式(t1HMG1和t2HMG1)被过表达。
表11
麦角甾醇的生物合成途径非常复杂，其受多达25种酶的高度调节和参与。选择一些处于关键作用或限速步骤的酶用于过表达。对甾醇组成和总甾醇量的影响示于表11中。与过表达空整合载体的亲本生产菌株相比，HMG1以其全长变体的过表达没有导致关于甾醇模式和量的任何变化。然而，HMG1作为截短形式(缺失其N-末端跨膜结构域)的过表达导致麦角甾醇产生增加。当ERG11过表达时，实现了总甾醇量的最大变化，ERG11是一种参与麦角甾醇生物合成途径进一步下游的蛋白质。
-)双缺失突变体Δdga1Δlro1完全耗尽了贮存脂质三酰甘油。
-)与亲本生产菌株相比，双缺失突变体Δdga1Δlro1显示出强烈的甾醇酯减少。与亲本生产菌株相比，缺失Δdga1Δlro1后，仅保留了10％的甾醇酯。
-)与亲本生产菌株相比，双缺失突变体Δdga1Δlro1中磷脂的总量减少至～65％。
-)类似地，Δdga1Δlro1的缺失导致甾醇总量减少至约68％。
-)
-)ERG11的过表达导致麦角甾醇和甾醇前体的增加最高。与过表达空整合载体的亲本生产菌株相比，麦角甾醇的量增加了70％。
实施例9：进料分批培养的脂质分析
将在生物反应器培养的最终取样点获得的细胞沉淀(上文示出了结果)用于分析鞘脂。当辅助蛋白ELO3过表达时，关于鞘脂类和相应类别的分子种类的鞘脂分布模式的特征显示出明显的变化。当鞘脂生物合成过程或脂质转运的其他组分过表达时，可以进一步增强或改变由辅助蛋白ELO3过表达引起的作用。
将来自进料分批培养的细胞沉淀溶解于TE-缓冲液(10mM Tris；1mM EDTA；pH7.4)中，并通过于4℃下用玻璃珠剧烈摇动15分钟制备总细胞提取物。向来自总细胞提取物的相同量(300μg蛋白)中掺入30μl内标混合物(0.15nmol N-(月桂酰)-鞘-4-氨醇、0.15nmolN-–(月桂酰)-1-β-葡萄糖基-鞘-4-氨醇、4.5nmol C17二氢鞘氨醇，Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL,USA)，悬浮于6ml丙-2-醇/己烷/水(60:26:14；每体积)中，并在60℃下温育30分钟，即对J.E.Markham等[J.Biol.Chem.(2006).281:22684-22694.]先前描述的方案稍加改动。在温育过程中，将样品短时涡旋并在0、10、20和30分钟后超声处理。然后，通过离心将提取物从细胞碎片中分离，在氮气下干燥，再溶于800μl四氢呋喃/甲醇/水中(4:4:1；每体积)[C.Buré等，RapidCommun.Mass Spectrom.(2011).25:3131-3145.]，并在-20℃下在氩气下储存。为了分析，通过温和加热和超声处理使样品重新溶解。
通过在配备了ACQUITYHSS T3柱(100mm×1mm,1μm；Waters Corp.,Milford,MA,USA)的ACQUITY系统(Waters Corp.,Milford,MA,USA)上实施的超高效液相色谱(UPLC)启动UPLC-nanoESI-MS/MS。将2μl的等分试样注射到具有针溢出模式的部分环中。流速为0.12ml/min，分离温度为35℃。通过如下线性梯度洗脱分离含肌醇的鞘脂：65％溶剂B达2分钟，线性增加至100％溶剂B达8分钟，100％溶剂B保持2分钟并在2分钟内平衡至65％溶剂B。按照如下分离神经酰胺(Cer)和己糖基神经酰胺(HexCer)：80％溶剂B保持2分钟，线性增加至100％溶剂B达8分钟，100％溶剂B保持2分钟并在2分钟内平衡至80％溶剂B。溶剂B为含有0.1％(v/v)乙酸的四氢呋喃/甲醇/20mM乙酸铵，和溶剂A为含有0.1％(v/v)乙酸的甲醇/20mM乙酸铵。使用正离子模式的、具有5μm内径喷嘴的TriVersa(Advion,Ithaca,NY,USA)以209nl/min的流速和1.5kV的电压实现基于芯片的纳米电喷雾电离。采用4000串联质谱仪(AB Sciex,Framingham,MA,USA)，通过监测(i)对于Cer、HexCer和LCB的从[M+H]+分子离子到脱水长链碱基(LCB)的转变，和(ii)对于含肌醇的鞘脂，含头部基团的磷酸肌醇的损失，从而实施鞘脂分子种类的检测[C.S.Ejsing等，J.Mass Spectrom(2006).41:372-389；J.E.Markham等，RapidCommun.Mass Spectrom.(2007).21:1304-1314]。停留时间为30ms，并且优化MS参数以使检测器响应最大化。
辅助蛋白ELO3的过表达导致鞘脂的总量、组成和分子种类分布的一些显著变化。详细而言，当辅助蛋白ELO3过表达时，观察到神经酰胺和鞘脂的IPC类(IPC、MIPC、M(IP)2C)的分子种类分布的显著变化(参见表12至16)。己糖基-神经酰胺的种类组成不受辅助蛋白ELO3过表达的影响。亲本宿主菌株的鞘脂(空载体对照)主要含有在其脂肪酰基部分含有极长链脂肪酸(VLCFA)C24:0的分子种类变体，而过表达辅助蛋白ELO3的工程化的菌株显示出了向VLCFA C26:0的显著变化。
与过表达辅助蛋白ELO3的起源菌株相比，鞘脂生物合成过程或脂质转运的其他组分的过表达对分子种类分布没有太大影响(数据未示出)，但是观察到了某些鞘脂类的相对和总丰度的明显变化。表17和18显示了所有鞘脂的相对分布。辅助蛋白ELO3的过表达导致了改变的分布模式，其中成熟的含肌醇的磷酰神经酰胺(M(IP)2C)以牺牲IPC为代价而增强。所有与ELO3的组合均显示IPC的显著降低，其中在组合ELO3+LAG1、ELO3+KAR2和ELO3+LCB1+LCB2+TSC3的情况下，IPC的显著降低伴随着M(IP)2C的强烈增加，或在组合ELO3+PRY1的情况下，IPC的显著降低伴随着己糖基-神经酰胺的高增长。
以绝对值评估辅助蛋白ELO3过表达也显示出显著的变化(参见表18)。即，ELO3单独过表达，或与参与鞘脂生物合成、脂质转运的其他因子或分子伴侣组合的过表达导致了IPC显著降低。同时，当ELO3过表达时，M(IP)2C的绝对水平显著升高。当与ELO3其它组分一起共-过表达时，M(IP)2C的累积甚至更有效地增强。当ELO3过表达与KAR2过表达组合时，实现M(IP)2C的最高积累。ELO3与PRY1的组合导致含有复合肌醇的磷酰神经酰胺的出现的普遍减少。
ELO3的过表达导致大多数鞘脂的分子种类变化，即神经酰胺和含肌醇的磷酰神经酰胺(IPC、MIPC、M(IP)2C)的脂肪酰基部分优先含有C26而非C24。与空载体相比，不同种类鞘脂(神经酰胺、IPC、MIPC和M(IP)2C)的C26的量增强至少100％。(表12-16)。
ELO3的过表达不影响己糖基-神经酰胺种类的分布模式(表13)。
在神经酰胺和含肌醇的磷酰神经酰胺(IPC、MIPC、M(IP)2C)的分子种类模式方面，将辅助蛋白ELO3与其他辅助蛋白(比如LAG1、LCB1+LCB2+TSC3Sc、KAR2或PRY1)的过表达组合导致了与ELO3单一过表达导致的相同的趋势(含有C24的种类较少，含有C26的种类更多)。与空载体相比，不同种类鞘脂(神经酰胺、IPC、MIPC和M(IP)2C)的C26的量增强至少100％。(数据未示出)。
在神经酰胺和含肌醇的磷酰神经酰胺(IPC、MIPC、M(IP)2C)方面，将辅助蛋白ELO3与其他辅助蛋白(比如KAR2)的过表达组合增强了从含有C24的种类向含有C26的种类的转变。与空载体相比，不同种类鞘脂(神经酰胺、IPC、MIPC和M(IP)2C)的C26的量增强至少200％。(数据未示出)。
ELO3的过表达导致了鞘脂相对分布的显著改变(表17)。
ELO3的过表达导致IPC和MIPC降低约30％并且强烈地增加了含肌醇的磷酰神经酰胺M(IP)2C的成熟形式的形成，与过表达空载体的菌株相比，M(IP)2C升高了6倍。(表17)。
通过与LAG1或KAR2共-过表达，协同地增强了ELO3过表达对积累M(IP)2C的作用。与过表达空载体的菌株相比，M(IP)2C至少升高了10倍。(表17)。
ELO3的过表达不会增加鞘脂的一般形成。(表18)。
LAG1的过表达不会像ELO3的过表达那样改变鞘脂的脂肪酰基部分，其作用类似空载体对照。未观察到从C24向C26的转变。(数据未示出)。
然而，LAG1的过表达导致鞘脂的相对分布模式的相似变化，即以牺牲IPC为代价使M(IP)2C增加。(表17)。
与过表达空载体的菌株相比，LAG1的过表达使M(IP)2C的形成增加了至少10倍。(表18)。
PRY1的过表达既未显示种类分布的变化，也未显示鞘脂分布的变化。(表17)。
PRY1的过表达显示含肌醇的磷酰神经酰胺的一般降低的水平(较少的IPC、MIPC和M(IP)2C)。(表18)。
序列表
<110> 贝林格尔·英格海姆RCV两合公司
瓦利多根股份有限公司
龙沙有限公司
<120> 具有改变的膜脂组成的重组宿主细胞
<130> LC19310010P
<150> 17163588.1
<151> 2017-03-29
<160> 103
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 1
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Arg Ile Cys Glu Leu Lys Lys Lys Phe Lys Tyr Arg Leu Phe Leu Asp
145 150 155 160
Glu Thr Leu Ser Ile Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Arg Gly Leu Pro
165 170 175
Glu Leu Tyr Gly Ile Pro Arg Thr Asp Val Glu Val Thr Thr Gly Ala
180 185 190
Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Ser Ser Gly Gly Phe Cys Val Gly Glu Asn
195 200 205
Ala Met Val His His Gln Leu Ile Ser Ser Ser Ala Tyr Val Phe Ser
210 215 220
Ala Ala Ile Pro Pro Tyr Phe Ala Arg Val Ala Ser Val Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Leu Gln Glu Asp Asp Ser Val Ser Arg Leu Gln Ser Ser Ile Asn
245 250 255
Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Lys Glu Cys Gln Lys Leu Lys Lys Leu Val
260 265 270
Ile Ile Thr Ser Ser Asp Val Ser Pro Ile Leu His Leu Arg Leu His
275 280 285
Arg Asp Leu Arg Ser Arg Leu Asp Leu Pro Val Ser Tyr Gly Gly Pro
290 295 300
Gly Ser Ala Met Glu Lys Ile Val Gln Arg Gly Asp Glu His Gly Tyr
305 310 315 320
Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Arg Glu Ser Gln Ile Leu Gln Gln Ile Val
325 330 335
Asp Arg Val Leu Asn Asn His Asn Ile Leu Ile Thr Arg Cys Lys Arg
340 345 350
Ile Leu His His Glu Lys Leu Pro Leu Leu Pro Glu Leu Met Ile His
355 360 365
Ile Asn Val Ala Phe Ser Glu Ser Glu Leu Ser Glu Ala Phe Glu Ala
370 375 380
Val Ser Ser Glu Ile Tyr Asn Val Leu Gln Gln Leu
385 390 395
<210> 6
<211> 561
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 6
Met Ser Lys Thr Ile Pro Asp Ala Leu Ile Asp Asn Asp Ser Pro Gln
1 5 10 15
Glu Lys Ala Glu Lys Glu Phe Gly Ser Leu Thr Ser Lys Glu Trp Leu
20 25 30
Phe Val Ser Lys His Asn Pro Gly Glu Pro Leu Pro Val Pro Ile Glu
35 40 45
Asp Glu Pro Pro Tyr Phe Ile Leu Ile Ala Thr Tyr Leu Asn Tyr Leu
50 55 60
Ile Leu Ile Ile Ile Gly His Ile Arg Asp Phe Phe Gly Lys Leu Phe
65 70 75 80
His Pro Glu Leu Phe Arg Asp Val Met Val Lys Asp Gly Ile Ala Pro
85 90 95
Trp Tyr Ala Asn Phe Glu Ser Phe Tyr Thr Arg Arg Leu Lys Thr Arg
100 105 110
Leu Asp Asp Cys Phe Ala Arg Pro Ile Cys Gly Val Pro Gly Arg Tyr
115 120 125
Ile Lys Cys Tyr Asp Arg Thr Ser Asp Asp Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn
130 135 140
Tyr Ser Gly Thr Val Thr Glu Arg Leu Asn Leu Ser Ser Tyr Asn Tyr
145 150 155 160
Leu Gly Phe Ala Gln Ser Ser Gly Leu Cys Thr Ser Glu Ser Ile Lys
165 170 175
Thr Val Glu Lys Tyr Gly Thr Asn Ser Ala Gly Pro Arg Val Ser Val
180 185 190
Gly Thr Thr Asp Leu His Leu Glu Cys Glu Asp Val Val Ala Lys Phe
195 200 205
Thr Gly Lys Asp Asn Ala Leu Val Phe Ser Met Gly Tyr Gly Thr Asn
210 215 220
Ala Asn Leu Phe Thr Ser Leu Val Asp Ser Lys Cys Cys Val Ile Ser
225 230 235 240
Asp Ser Leu Asn His Gly Ser Ile Arg Thr Gly Val Arg Leu Ser Gly
245 250 255
Ala Ser Val Lys Thr Phe Ala His Asn Asp Met Ala Ala Leu Glu Arg
260 265 270
Thr Leu Arg Ser Val Ile Ser Gln Gly Gln Pro Lys Thr His Arg Pro
275 280 285
Trp Lys Lys Ile Phe Val Ala Val Glu Gly Leu Tyr Ser Met Glu Gly
290 295 300
Thr Leu Cys Asn Leu Pro Lys Leu Val Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Lys
305 310 315 320
Phe Tyr Leu Phe Val Asp Glu Ala His Ser Ile Gly Ala Met Gly Pro
325 330 335
Asn Gly Lys Gly Val Cys Asp Tyr Phe Gly Ile Ser Ser Ser Asn Ile
340 345 350
Asp Ile Met Met Gly Thr Phe Thr Lys Ser Phe Gly Ala Thr Gly Gly
355 360 365
Tyr Ile Ala Ala Asp Lys Ala Ile Ile Asp Arg Leu Lys Leu Asp Leu
370 375 380
Thr Thr Asn Thr Tyr Gly Glu Ser Met Ser Pro Ala Val Leu Thr Gln
385 390 395 400
Ile Ile Thr Ser Leu Lys Ile Ile Asp Gly Gln Leu Asn Gly Asn Glu
405 410 415
Gly Lys Glu Arg Leu Gln Arg Ile Ala Phe Asn Ser Arg Tyr Leu Arg
420 425 430
Leu Gly Leu Lys Arg Leu Gly Phe Ile Val Tyr Gly Ala Asp Asp Ser
435 440 445
Pro Val Ile Pro Leu Leu Leu Tyr Leu Pro Pro Lys Met Pro Ala Phe
450 455 460
Ser Arg Met Met Tyr Asp Arg Lys Val Ala Val Val Val Val Gly Tyr
465 470 475 480
Pro Ala Thr Asp Ile Thr Ser Ser Arg Ile Arg Phe Cys Val Ser Ser
485 490 495
Ser Leu Lys Lys Glu Asp Ile Asp Tyr Leu Leu Lys Cys Cys Asp Glu
500 505 510
Ile Gly Asp Thr Leu Phe Leu Lys Phe Ser Thr Gly Ile Ala Gly Gly
515 520 525
Glu Lys His Pro Gly Asp Tyr Lys Lys Gly Ile Ala Pro Arg Trp Thr
530 535 540
Leu Glu Glu Val Leu Glu Lys Thr Pro Glu Asp Cys Lys Lys Ala Met
545 550 555 560
Tyr
<210> 7
<211> 320
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 7
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1 5 10 15
Asn Val Asp Thr Thr Pro Asn Thr Arg Val Arg Asp Ile Val Val Ala
20 25 30
Tyr Gly Lys Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Ser Arg Ile Arg Phe Thr
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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195 200 205
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210 215 220
Asn Phe Ile Thr His Gln Lys Leu Ala Ser Leu Arg Ala Asp Gly Ser
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<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
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<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 9
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 10
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Leu Gly His Val Phe Thr Met Ile Gly Arg Asp Trp Thr His Lys Gly
355 360 365
Val Ala Lys Leu Phe Ser Asp Ile Lys Ser Asn Gly Tyr Asn Ile Met
370 375 380
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385 390 395 400
Leu Asn Asn Ile Glu Gln Glu Gly Leu Arg Leu Pro Gln Gly Pro Val
405 410 415
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420 425 430
Leu Lys Lys Pro Glu Val Phe Lys Met Ala Cys Leu Asn Asp Ile Lys
435 440 445
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485 490 495
Thr Asp Ala Leu Ser Tyr Arg Ser Val Gly Ile Pro Ser Ser Arg Ile
500 505 510
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530 535 540
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545 550 555 560
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<211> 313
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 11
Met Lys Leu Ser Thr Asn Leu Ile Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ser Ala
1 5 10 15
Val Val Ser Ala Ala Pro Val Ala Pro Ala Glu Glu Ala Ala Asn His
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<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 12
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1 5 10 15
Thr Leu Val Glu Lys Leu Ser Ile Leu Phe Val Ala Pro Phe Leu Leu
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Val Ile Tyr Asp Cys Pro Asn Trp Lys Leu Met Asp Gln Lys Lys Phe
130 135 140
Val Lys Gly Ser Leu Thr Lys Glu Ser Phe Arg Ser Tyr Val Pro Lys
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Ile Arg Asp Glu Val Leu Asp Tyr Ile Asn Asn Asp Pro Asn Phe Met
165 170 175
Gly Gly Asp Ser Lys Lys Lys Thr Gly Lys Thr Asn Val Leu Asn Ser
180 185 190
Gln Ser Glu Leu Thr Ile Leu Thr Ala Ser Arg Ser Leu Leu Gly Asp
195 200 205
Asp Met Arg Lys Leu Leu Thr Lys Lys Trp Ala Lys Leu Phe Ser Asp
210 215 220
Leu Asp Lys Gly Phe Thr Pro Leu Asn Phe Ile Phe Ser His Leu Pro
225 230 235 240
Leu Pro Ser Tyr Trp Thr Arg Asp His Ala Gln Lys Thr Ile Ser Glu
245 250 255
Thr Tyr Leu Ser Leu Ile Asn Lys Arg Arg Ala Thr Asn Asp Ile Gly
260 265 270
Asp Arg Asp Leu Ile Asp Ser Leu Met Lys Ser Ser Thr Tyr Lys Asp
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Gly Ser Lys Met Thr Asp Glu Glu Ile Ser His Leu Leu Ile Gly Val
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Leu Met Gly Gly Gln His Thr Ser Ala Ser Thr Ser Ser Trp Phe Leu
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Leu His Leu Gly Glu Lys Pro Glu Leu Gln Glu Glu Leu Phe Glu Glu
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340 345 350
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355 360 365
Met Pro Leu His Ser Ile Phe Arg Lys Val Thr Arg Pro Leu Pro Val
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405 410 415
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420 425 430
Ala Lys Glu Thr Val Asp Tyr Gly Phe Gly Lys Val Ser Lys Gly Val
435 440 445
Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Phe Gly Gly Gly Arg His Arg Cys Ile Gly
450 455 460
Glu His Phe Ala Tyr Cys Gln Leu Gly Thr Ile Leu Asn Thr Phe Val
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485 490 495
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<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gly Leu Lys Asn Phe Cys Ile Leu Ser Ala Asn Ile Leu Thr Phe Asp
305 310 315 320
Leu Ile Met Ile Phe Thr Phe Phe Thr Ala Val Leu Ser Leu Lys Ala
325 330 335
Gln Ile Asn Lys Val His Glu Thr Thr Ala Leu Gln Gln Val Leu Glu
340 345 350
Glu Asp Gly Ile Ala Glu Asp Val Ala Glu Arg Ile Ala Ala Ser Asn
355 360 365
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370 375 380
Met Ile Ala Gly Phe Leu Gly Phe His Leu Phe Val Leu Gly Thr Ser
385 390 395 400
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405 410 415
Asn Val Ser Ala Leu Ser Lys Ala Ala Ala Lys His Ile Pro Ile Gly
420 425 430
Ser Glu Gly Thr Ile Val Thr Ile Met Pro Thr Arg Val Tyr Met Pro
435 440 445
Val Asp Leu Leu Leu Lys Leu Glu Asp Asp Phe Leu Asn Ile Phe Ser
450 455 460
Lys Ile Ser Ala Ser Ile Thr Asp Pro Leu Ile Ser Lys Leu Leu Phe
465 470 475 480
Ile Ile Thr Gly Ile Ser Ala Thr Ile Asn Val Tyr Leu Leu Asn Ala
485 490 495
Ala Arg Phe His Ser Ser Arg Glu Ile Ala Val Ser Thr Ile Ala Lys
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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660 665 670
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675 680 685
Leu Ser Arg Ala Gly Ala Ala Lys Met Trp Leu Asp Ser Glu Glu Gly
690 695 700
Gln Lys Thr Ile Lys Gly Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala Arg
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725 730 735
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740 745 750
Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Phe Met Ser Glu Glu Cys Asp Trp Pro
755 760 765
Asp Met Glu Val Ile Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys Lys
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Val Thr Ala Val Tyr Leu Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val
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Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Met Asn Lys Leu Pro Asn Gly Asp
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Leu Gln Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly
885 890 895
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Val Lys Gly Pro His Pro Thr Asn Pro Gly Ala Asn Ser Arg Gln Leu
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Ala Lys Ile Val Ala Ser Ala Val Leu Ala Ala Glu Leu Ser Leu Cys
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50 55 60
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<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
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<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
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<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
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<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 18
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Met Lys Leu Ile Ala Glu Asp Tyr Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala
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Ser Leu Leu Ser Ile Glu Gly Gly Ala Phe Glu Val Leu Ala Thr Ala
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275 280 285
Asn Asp Lys Ala Leu Gly Lys Leu Lys Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys
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Arg Thr Leu Ser Ser Gln Met Thr Thr Arg Ile Glu Ile Asp Ser Phe
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Glu Ile Asn Ile Glu Leu Phe Lys Lys Thr Leu Lys Pro Val Glu Gln
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Val Leu Lys Asp Ala Gly Val Lys Lys Ser Glu Ile Asp Asp Ile Val
355 360 365
Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Val Gln Gln Leu Leu Glu
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Asp Tyr Phe Asp Gly Lys Lys Ala Ser Lys Gly Ile Asn Pro Asp Glu
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Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Glu
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Gly Ile Glu Thr Thr Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile Asn Arg Asn
435 440 445
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450 455 460
Asn Gln Pro Thr Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala Leu
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Ala Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu Thr Gly Ile Pro
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580 585 590
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<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
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<210> 20
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<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 20
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tacagaaaac aaggtaaaaa gtccagatac gttaaaaagg tcagaggtgg tgttgctgcc 900
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<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 21
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gaatttttga tgcaagcgtt actgaaacct ttggccagta agttgggtat cacaagagag 480
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aaggaagaat ag 1212
<210> 22
<211> 1137
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 22
atgggtgttg aaacatcttc ctctggaact caacatttca gtgatgacgg ttgtgtatct 60
tcaaggaagc caaatgctac tgtaagcttt gagaagcctg agcgtgctaa cgagctgaag 120
aatcacaaaa tctataaaaa gtccaaggct tcatggttac agagaaatca aattttacta 180
gcatcttcat tgttgaacgc gttgttcatc ttaaagcaaa ttccctcatt tcaatcactc 240
gttaataaat tctttcattt acagtacaag aacttagatg gtacttatga tattggtaaa 300
gacgactatt ttttcgttat ttactggata atcaacttga ctattattcg cagtgtcttg 360
atggattggg tcctagaacc cttggcaatt aagatagttg ggattaacaa tagaaaagct 420
cttaccagat ttaaagaaca gggttggtct ttattctact acaccacgtc atggactgtg 480
ggcttctatt tatactacaa gtccgactat tttttcaatt gtgatcatat tttcatcggc 540
tggcccaaca ataagctgga tttctacttc aaatcttact acttgattca aatgtcatgt 600
tggctccagc agatcgttgt tttgaacata gaggagagaa gaaaagatta tgttcaaatg 660
ttctcgcatc atataataac ctgtttgctg attattggct cttactacta ttacttttta 720
cagattggac acgtcatttt ggttatgatg gacattgttg acgtttttct cagtcttgcc 780
aaaatgttaa aatactgtgg ttacagcact ctctgcgacg tgatgttttt catattcttg 840
gtttcatgga tagctataag acacgtgtgt tacaactacg tgttctggca cacatgcacc 900
aagtctaggg atctaatgaa cgcagattgt tccaggtacg caatctacgg aggtcccttg 960
gacgttactc cagtacgatg ctatacagat agtaccatta gatacttcat tttccttctt 1020
ggaggtctcc aaattatcac actaatctgg atgtacctca ttctaaaagt tttcataggg 1080
gtaataacgg gcaaaggtgc tgaagacgtt agaagtgatg atgaggagag ttcttga 1137
<210> 23
<211> 1191
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 23
atgagccaac gtgaagaaac aaaagatgct gcaaagaaac agatcgcctt ttcgggaatt 60
ggagcctgcg gtcctccaaa cttctatggt acacaggatg ctcacgctag attggaagaa 120
gatctagccc gatttcttgg tgctgaacgt gccatattgt attcccagga tttctgtact 180
gtgccgtcag ttatagcatg ttttttgaaa agaggtgata ttgttgtgta tgactctggt 240
attgctttgg caacccaaaa gggaatcgaa ttatccagat gtaccgccta ccatttcaac 300
cataatgaca tggataacct ggagaaagtg ttagctgatc tgaagcccat gttagatgaa 360
ggacctttaa ctaggagatt tattatcaca gaaggtcttt ttcaaaactt tggagactct 420
ccagacttgc gtcgtatatg tgagctgaag aaaaagttca agtacagact gttcttagat 480
gaaactcttt caattggtgt tctaggtgct actggtagag gattgccaga attatacgga 540
atccctcgca cagacgttga ggtgaccacc ggcgctttat cctacgccct gggttcttct 600
ggaggattct gcgtcggtga aaacgccatg gtacatcacc agctaatttc ctctagtgcc 660
tatgtgtttt ctgcagctat tccaccttat tttgccagag ttgcatcggt atctcttcga 720
ttactccaag aagatgactc cgtgtcaaga ttacaatcca gtattaattt cctttactca 780
aagtttaaag aatgccagaa actcaaaaag ctggtaataa tcacttcatc tgacgtatct 840
ccaatcctac atctacgatt gcatcgtgac ttgagaagca gactcgatct tccggtgagt 900
tatggtggtc ccggatctgc tatggagaaa atagtacaga ggggagatga acacggttac 960
ttcgacgaaa attacaacag ggagtctcag atcttacaac aaattgtaga cagagtttta 1020
aacaaccata atatcctaat aacgagatgt aagaggatac ttcaccatga aaagctacca 1080
ttactgcctg agcttatgat ccatattaat gttgcatttt cggaatctga gctttcagaa 1140
gcatttgagg ccgtctcctc tgagatttac aatgttttgc aacagctttg a 1191
<210> 24
<211> 1686
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 24
atgtcaaaaa ctatcccaga tgctctcata gacaatgatt caccacaaga gaaggccgag 60
aaagaatttg ggtccttgac cagtaaagaa tggctctttg tctctaagca taaccctggc 120
gagccgcttc cagttcccat cgaggacgaa cctccatatt tcatcctgat tgcaacatac 180
cttaattacc ttattttgat cataataggc catattagag acttctttgg gaagttgttt 240
caccctgaac tattcagaga tgtgatggtg aaagatggta ttgctccatg gtatgccaat 300
tttgaaagtt tctacacgcg tcgtttgaaa acaagattag atgactgttt tgcaaggccc 360
atatgtggag ttcccggtag gtacatcaaa tgttacgaca gaaccagtga cgattacaac 420
aatacctata attattccgg caccgtcaca gagcgcttga atttgagttc atacaactat 480
ttagggttcg cacaatcctc tggtctgtgc acctcagaaa gtatcaagac ggtggagaag 540
tatggtacca acagtgctgg tcctcgagtt agtgtgggaa ctactgatct ccatcttgaa 600
tgtgaggacg tcgttgccaa atttactggc aaggacaatg ctttggtatt ttccatgggt 660
tatgggacca atgcaaatct cttcacctct ttggtggact ctaagtgttg tgttatctca 720
gattctttaa accacggatc tatcaggaca ggtgttcgtt tgtctggcgc ctcagtcaaa 780
acttttgctc acaacgacat ggcagcgctg gaaagaactt tgagaagtgt catttcccaa 840
ggtcagccaa agactcatag accctggaag aagatttttg ttgctgtaga gggactttat 900
tccatggaag gaaccctttg taatttgcca aaactggtag aattgcgtaa gcgttacaag 960
ttttatttat ttgttgacga ggcacattct attggtgcta tgggacccaa tggtaagggt 1020
gtttgtgact attttggcat ttcttcttcc aatattgata ttatgatggg tacttttacc 1080
aaatcatttg gagccacagg cggttacatc gctgccgaca aagccatcat agacagattg 1140
aagttagatc tcacaacaaa tacttatgga gaatcaatgt cacctgctgt gctcacacaa 1200
atcattactt ctttgaaaat tatagatgga caactcaatg gtaatgaagg taaagagagg 1260
ctacaaagga ttgccttcaa ttctaggtat ctgcgattag gactaaagcg attaggattt 1320
attgtttatg gtgctgatga ttctcctgtt atcccccttt tactgtatct tccccccaag 1380
atgcctgcat ttagccgaat gatgtacgat agaaaggttg ctgtcgttgt tgtgggatat 1440
cctgcaacgg atataacgtc ttctcgtatt cgattctgcg tttcctcttc tttgaagaag 1500
gaggatatag attatttgct caaatgttgt gatgagatag gagatacttt gtttttgaag 1560
ttcagcacag ggattgctgg tggtgagaag cacccgggag actataagaa gggcattgct 1620
cctaggtgga cattggagga ggttctggag aagacaccgg aggattgcaa gaaagccatg 1680
tactaa 1686
<210> 25
<211> 962
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 25
atggttaaac tcattgttaa tccaaggtct gagaccctga gacaaatcaa cgtagacact 60
acccccaata caagagtcag agacattgtg gtagcttacg gaaaggcaaa taacagttta 120
tccagctcca gaatcagatt cactaaactg gaagaagacg cagtttccaa gaaaccaaag 180
catgtcactc tggactacga gaaatcctta gctcaaaatg ggatagtctt cacagatgat 240
tcagattcca aagaagtcta tgcgaaagat ttgggacccc agatcagttg gaaattagtg 300
ttcctgatcg aatacgtggg cccgctgatt attcatccat tgctctatta cggctggttc 360
aaacctgact ataacactct tacacagaaa gtttctttca ttttggtgat gctgcacttc 420
ctgaaacgtg aatacgaaac aacttttgtg cacctgtttt catctgatac aatgcctctt 480
ttcaacgttt tcaagaactc agctcattat tggattctta gtggattgag ccttgctgtc 540
actatttatg ctccggattc ataccgaaat aagtttgcac ccacttggaa acagtttttt 600
tccatgtatc tgaccatgaa gactccacag ttctagcact gattggactg tgggtatttg 660
ctgaattgtc caacttcatc actcaccaga aattggccag tctcagagcc gatggctcca 720
gagaacataa aattccctat ggatatggct tcaacctggt ctctttcccc aactatttct 780
ttgaatctgt agcttggttg gcatttgccc ttctcaacaa taactggtca tcttgggtgt 840
tccttaccat tgcctccatt cagatgtata tttgggccgc taagaaacac aaaagatatc 900
tcaaggagtt tggggaccaa tatcccaaga acaggaaagc aatgattcca ttccttttgt 960
ag 962
<210> 26
<211> 453
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 26
atgtctcaac ccactcccat cataactaca aaatcagctg ctaagccaaa accaaaaatt 60
tttaatttat tccgcgtttg cttcatttca ttattgctga tcgctgcggt tgaatacttc 120
aagtatggta caagaattaa ctatgaatgg ttccattgta ccccaatcaa agaaccccag 180
tctggctcag taatcaagct ttgggcacgt ggtgggccaa gttgtgacaa aagaggcgaa 240
tataaaacta tagtaaagag aatcactaga gattatgaac caaatgatga acatctctcg 300
ttctgtatca tcgagaatga taatgttcca cccgtccact acccaattca cgaagataaa 360
ggtgaacctg gctacgtagc ttatgtcggg tacgacacag actctgagct ggttcaagaa 420
ctatgtgctg attccacaat ttatcacatg tga 453
<210> 27
<211> 243
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 27
atgacacaac ataaaagctc gatggtgtac atacccacca ctaaggaagc taaaagacgt 60
aatgggaaat cagaaggcat actaaatact attgaagaag tggtggaaaa gctttattgg 120
acctactaca tacatttacc cttttattta atggcctctt ttgattcatt cttcctccat 180
gttttttttc tcacaatttt cagtttgagt ttcttcggta tactaaagta ttgcttcctt 240
tga 243
<210> 28
<211> 2328
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 28
atgcagtacg taggtagagc cattggatca gtatccaaaa cctggtcgtc cattaacccg 60
gccacactga gtggtgctat tgatatcatc gtggtggaac aagaaaatgg tgatctggct 120
tgctctccct tccatgttcg gtttggaaag tttcaattat tgaggccttc ccaaaagaaa 180
gtggatttca tcgtcaatgg agaaaagaca gacttaccaa tgaaactggg cgatgggggc 240
gaagctttct ttgtgtttga aaccgatgct gccatcccga gtgagcttca aacttccccc 300
gtcatctcac ctgtatccag cccagaacca gcctctccac tgagtactcc ttccagacca 360
aactctgaac cagattattt agaattaggg gatggagaat ctacaaccag tgaattagag 420
aacttcaagt taaatcgata tccctattta tcaactgagg tatcgcattc agatcctggt 480
gttgggtctg tgagctcaag tcctgagaat acgaagatta ttcaaaagat ctctcggaaa 540
ctcaatacga aaaatattcc ttccaaggtt gataataacg gaaatcttgt attggatata 600
caaggttaca aaagtgatga tctagacgac aattccaaat ctttgaaaca gttgttattg 660
gctgaactcg gagaagatgt agatttggac aaggttattg aaaaagatca cgaaggaaac 720
attatgatca atggtgccat atctttgttg agcggagaag atgatctgga atcatttcct 780
cagaccgacg accaagctga gagtctcaaa ttggatctgg agtcagataa atctgacatt 840
gaatcagaca caaatcatga attgtctcgc tacttcaaaa cgctaagact tacatcagat 900
caattgaaat gtcttacact gaagaaggga attaacgagc tgaaattcag tgtcaacaag 960
ggcaaatctg tggtgacggc aaatctatac ttctgggact attatgaccc catagtcata 1020
tcggatatag atggaaccat tactaaatct gatgccttag gccatgtatt taccatgatt 1080
ggccgtgatt ggactcacaa aggtgtagcc aaattatttt cagatatcaa atccaatgga 1140
tacaatatca tgtatttgac tgcaaggtct gttggtcaag ccgattcgac ccgctactat 1200
ttaaacaaca ttgaacaaga aggcttgagg cttcctcaag ggccggtgat cctttctccg 1260
gatcgcacaa tggccgcttt acgaagagag gtaattttga agaaacctga ggtgttcaag 1320
atggcatgtt taaacgacat aaagaaactg tatctcacca ataccaaaga cctaaatccg 1380
aacacagatt ctgcagattt cacggatatc aatacgaaca ctttgagatc ttcaagtctt 1440
acagaggatg tacaaacgcc attttacgcc ggttttggta atagaattac cgatgctttg 1500
tcctataggt cagtagggat accatcatca agaattttta ccataaaccc agacggtgat 1560
gttcacatgg agctactcga attggctggg tatagaagtt cttatgtaca tattagtgag 1620
ctggtagatc atttctttcc accagtgaac actgaactat ttaagtcgat gccttctgat 1680
acctatcgga acacggcaaa gttctctgat gtcaattatt ggaaagagcc tttgtacaat 1740
tttgaggagc tcagtgatga agattctagt gaagatgagc taagaagaag aaaggaggag 1800
gaacgtttac agtctgctcc tcgtagtcca atattggcag caggagcatc gtttttcaaa 1860
ggaagtagta gccttttagg ttcaccagaa cggatgactt tgagtgaccc aaagccaact 1920
gaagttgccc ctagcacaat caaaccccca aaatcagttg gttctgtatc atccgatgaa 1980
gaaaagctga aagatcatga tgatttcatt gacgttgatc acgaagatga aaccttggat 2040
gatgatgacg atccctttga ctacgattac gagtatgaag atgaagaaga ggaaaatgac 2100
gacgtagatg aagttgatga tggggaagag tattcagatg attattatga cgaagaagac 2160
gactacgatg aagaattaga tcatacttta gaaccagacc aaaagaaaga actggaccaa 2220
acagctgaag ccaaccagtt acccccttca ggacccgatg aaatggaatc aaaatctttc 2280
aagaaagcca gtgatttaat aagcaaaatg agaatcgatg acagctga 2328
<210> 29
<211> 942
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 29
atgaagctct ccaccaattt gattctagct attgcagcag cttccgccgt tgtctcagct 60
gctccagttg ctccagccga agaggcagca aaccacttgc acaagcgtgc ttactacacc 120
gacacaacca agactcacac tttcactgag gttgttactg tctaccgaac tttgaaaccg 180
ggcgaaagta tcccaactga ctctccaagc cacggtggta aaagtactaa aaagggtaag 240
ggtagtacca ctcactctgg tgctccagga gctacctctg gtgctccaac tgacgacacc 300
acttcgacta gtggctcagt agggttacca actagcgcaa cttcagttac ctcttctacc 360
tcctctgcaa gtacaacaag cagtggaact tcagccacta gcactggtac cggtactagc 420
actagcacta gcactggtac tggtactggt actacaggca caggaaccac tagttccagc 480
actagctctt ctgctacttc gactccaacc ggttctatcg acgctatcag ccagacactt 540
ctggatactc acaatgataa gcgtgctttg cacggcgtcc cagaccttac ttggtctacc 600
gaactcgctg actacgccca aggttacgcc gattcataca cttgtggctc ttcattagaa 660
cacacaggtg gaccatacgg tgaaaatttg gcctctggat actctcctgc tggcagtgta 720
gaagcatggt acaacgagat cagcgactac gatttctcta acccaggtta ttctgctggt 780
accggtcact tcacccaagt tgtctggaaa tcaactacac agctgggctg tggatacaag 840
gagtgcagta ccgacagata ctacatcatc tgcgaatacg cacctcgtgg aaatattgtt 900
tctgccggct acttcgaaga caacgtcctg cctcctgttt ga 942
<210> 30
<211> 1548
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 30
atgagtctgg tccaggagtt gattcaaaag ataagctctt tggagctcac cttggtggaa 60
aagctttcca tcctgttcgt agctcccttc ttgttgaacg cgctatggca gtttatctac 120
agtttcagaa aggacagagt tcctttggta ttccactggg ttccatgggt aggctcagca 180
gtcacatatg gaatgcaacc atatgaattt tttgcagact gtcaaagaaa atacggagac 240
gtgtttgcct ttgttttgtt gggtaaagtt atgacagtgt acctcggacc aaaaggccat 300
gagtttattt taaatgctaa actaaacgac gtttgtgctg aagatgccta caagcacctg 360
accactcctg tatttggtga aggtgttatt tacgattgtc ccaactggaa gttgatggac 420
cagaagaagt ttgttaaagg atctttaacc aaggagtcct tcagatctta tgtccctaag 480
attagagatg aagtcctgga ttacatcaat aatgacccta acttcatggg aggtgattct 540
aaaaagaaaa ctggaaagac caatgtcctg aactctcagt ccgagcttac gatcttgacc 600
gcttccagat ctctactggg agatgatatg agaaaactac tgactaagaa atgggctaaa 660
ctgtttagtg acctagacaa aggatttact cctttaaact tcattttctc tcatcttcct 720
ctaccaagtt actggactcg tgatcatgct caaaagacca tttctgagac ttatttatct 780
ttgattaaca agagaagagc tacaaacgac attggtgaca gagatttgat cgattcatta 840
atgaaatctt ctacatacaa agatggtagc aagatgaccg acgaggagat ttcccacttg 900
ttaatcggag ttcttatggg tggccagcac acttctgcct ccacttcatc gtggtttttg 960
ttgcatctcg gagagaaacc agagctgcag gaggaattat ttgaagaaca ggaaagggta 1020
cttcaagggc gtgagttgac ttatgacgat cttgctaata tgcctttaca caatcaagtc 1080
atcaaggaaa ctttgcgcat gcacatgcct ctacactcaa tctttagaaa ggtcactcgt 1140
cctcttcccg ttcctaactc aaagtatgtg gttcctaagg gtcattatgt attggtttca 1200
cctggatttg ccatgaccaa cgatgcgtac ttcccaaacg ctagtgactt ccagccacac 1260
agatgggatg aaactgttga accagtctca gctgacgcaa aggaaactgt tgactacgga 1320
tttggtaaag tctccaaagg tgtttcttct ccttacttac catttggagg aggaagacat 1380
agatgtattg gcgaacattt tgcgtactgt cagttaggaa ccatcttgaa cacattcgtt 1440
agaaccttca agtggaaggc cgtagtccct cagccggact atacctcaat ggttactctt 1500
cctgaaccta atttgtctac tattacatgg gaaagacgcg ataattag 1548
<210> 31
<211> 2961
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 31
atgcttactg ggttgtccaa gatatgtgcg catagaccaa tccataccat agtggtgacc 60
gctctcttag tttccttagc atacctaacc attgtggagg agtacacatc gagatcttca 120
ttatccaatc cttttatatc gttttaccac ccaccaggaa acagtgatta ccaaaattgg 180
attccagtgg atgactctgt gaagctcaaa agcaagtcag cccagcatct ctctgtatgc 240
gctttgaagt ttaaaagggt taatggacat cagattcccg atctggcagg aagttttcag 300
agcgcagacc caactgaaat atttgtcgtt caggattttg acaaatcatt tgactatttt 360
gattcaattt caaccattga gggtaaggat ggcatccaat ggaaagtcag acaccccaat 420
aggttgggac gttattctga gtacttcaga tctgtttttt caaaaacttt gagactggtt 480
cagggtgctg aaccattcga cattgtgctt attgcttttg cttacgttgc tatgtggtac 540
acatttttgc agctctatta tgaaatgaaa acaaaggcca actctaactt ttggctgact 600
ttcggctctc tgctgtcttc aggttgtgca tttgtgtttg cattggccgt cactgtaaaa 660
gtatacggta tcaaggttcc actcacatct ttaactgaag gtgtcccatt tttggtagct 720
accattggtt tcaaacacaa agttgcattc actgttccta ttctccaagc ttcccgttca 780
aaaaaagcca aagaaattcc tgacaccatt atttcagtga ttgaacaaac cacagggtgg 840
cctctgatta aggatcatct cattatgatt tccgccttct tagcatgttc tttttatgcc 900
ccccgtatgg aaggactcaa aaacttttgc attctctccg ctaatatctt aacgtttgac 960
cttataatga ttttcacatt ttttaccgct gtattatctt taaaagctca gattaataag 1020
gttcacgaaa caactgcttt gcagcaagtt ctggaggaag atggaattgc tgaagatgtt 1080
gctgaacgca ttgctgcttc aaaccgaaat atgttttccc gtagtaccag cgtcgtcagc 1140
ttcaaagtga taatgatcgc tgggttcctt ggattccatt tatttgtgtt gggaacttca 1200
tggctctatg actctgacgt ttcaagctct tctatatttg gtaagagcaa tgtatctgcc 1260
ttatccaaag ctgctgccaa acatattcct attggatccg aaggaactat tgtgaccatt 1320
atgcctacga gggtttacat gcctgttgat ttacttctaa agttggaaga tgattttctg 1380
aacatttttt ccaagatatc ggctagcata actgatcctt tgattagcaa acttcttttc 1440
ataattaccg gaataagtgc cacaatcaac gtttacttgt tgaatgctgc tcgattccac 1500
tcgtctagag aaattgctgt ctctacaatt gcaaagcctc aaacgccaga cgttgttccc 1560
acagtagaac cgcttccaaa tgaaaatgac acaagcattc gaccattgga ggagatggtt 1620
tcattgctga aggaaggtaa aacacgagag ctgaacaatg atgaggtatc atctctcgtt 1680
gttcaaggaa aacttccctt gtacgcccta gaaaaacaac ttgttgataa gacccgcgca 1740
gttattgtaa gaaggaaggc aattgcttcc ttagcagatg ctccggtctt gagaaccgaa 1800
aagctgcctt acaaagatta tgattatgac cgtgtatttg gcgcttgttg tgagaatgtt 1860
atcggattca tgcccttacc agtcggcgtt gctggtccct tgatcattga cggtaaacct 1920
tatcacattc ccatggctac tactgaaggc tgcttagtag cctcaaccat gagaggttgt 1980
aaagctatca attctggagg cggtgtagaa actgttctga cagccgacgg aatgacaaga 2040
ggaccatgcg tttctttccc atctctttct cgtgcaggtg cagctaagat gtggctagat 2100
agtgaagaag ggcaaaagac cattaagggt gcgtttaact ccacctctag atttgcccgt 2160
ttgcagcatg ttaagacaac ccttgctggt acattattgt tcatccgatt caagactact 2220
actggtgatg cgatgggtat gaacatgatt tctaagggtg tggagtattc actaaagttt 2280
atgtcggaag aatgtgactg gcctgacatg gaagttattt ctgtttcagg taattactgt 2340
acagacaaaa aagttgctgc aatcaactgg atcgaaggtc gtggtaagtc tgtcgttgct 2400
gaagctcgta ttccagccga tgttgtcaga agcgttctga agtccgatgt tgaggcattg 2460
gtagaattga atgttagcaa gaacttgatt ggatccgcaa tggcaggatc aattggtggt 2520
ttcaacgcac aagctgccaa tctagttaca gcagtatact tagctacagg acaggatcca 2580
gcccagaatg tcgaaagttc caactgtatt accttgatga acaagctccc aaatggagat 2640
ttacaaattt cagtctctat gccatctatc gaagttggaa ccattggtgg aggaaccgtt 2700
ttggaacctc aaggatcaat gttggaacta ttaggagtta aaggtcctca cccaactaat 2760
ccaggtgcaa actcaaggca gttggctaag atcgttgctt ctgctgtctt ggctgcagag 2820
ctgtccttgt gctctgccct tgcagctggt cacttagtcc aaagtcatat gacccataac 2880
agaaagcaag ctccagtcaa ggaggtaaac ggcactgccg ctaggctagc ggaacaatct 2940
aagatttgca ttaaatcttg a 2961
<210> 32
<211> 1422
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 32
atgacgccag acgttgttcc cacagtagaa ccgcttccaa atgaaaatga cacaagcatt 60
cgaccattgg aggagatggt ttcattgctg aaggaaggta aaacacgaga gctgaacaat 120
gatgaggtat catctctcgt tgttcaagga aaacttccct tgtacgccct agaaaaacaa 180
cttgttgata agacccgcgc agttattgta agaaggaagg caattgcttc cttagcagat 240
gctccggtct tgagaaccga aaagctgcct tacaaagatt atgattatga ccgtgtattt 300
ggcgcttgtt gtgagaatgt tatcggattc atgcccttac cagtcggcgt tgctggtccc 360
ttgatcattg acggtaaacc ttatcacatt cccatggcta ctactgaagg ctgcttagta 420
gcctcaacca tgagaggttg taaagctatc aattctggag gcggtgtaga aactgttctg 480
acagccgacg gaatgacaag aggaccatgc gtttctttcc catctctttc tcgtgcaggt 540
gcagctaaga tgtggctaga tagtgaagaa gggcaaaaga ccattaaggg tgcgtttaac 600
tccacctcta gatttgcccg tttgcagcat gttaagacaa cccttgctgg tacattattg 660
ttcatccgat tcaagactac tactggtgat gcgatgggta tgaacatgat ttctaagggt 720
gtggagtatt cactaaagtt tatgtcggaa gaatgtgact ggcctgacat ggaagttatt 780
tctgtttcag gtaattactg tacagacaaa aaagttgctg caatcaactg gatcgaaggt 840
cgtggtaagt ctgtcgttgc tgaagctcgt attccagccg atgttgtcag aagcgttctg 900
aagtccgatg ttgaggcatt ggtagaattg aatgttagca agaacttgat tggatccgca 960
atggcaggat caattggtgg tttcaacgca caagctgcca atctagttac agcagtatac 1020
ttagctacag gacaggatcc agcccagaat gtcgaaagtt ccaactgtat taccttgatg 1080
aacaagctcc caaatggaga tttacaaatt tcagtctcta tgccatctat cgaagttgga 1140
accattggtg gaggaaccgt tttggaacct caaggatcaa tgttggaact attaggagtt 1200
aaaggtcctc acccaactaa tccaggtgca aactcaaggc agttggctaa gatcgttgct 1260
tctgctgtct tggctgcaga gctgtccttg tgctctgccc ttgcagctgg tcacttagtc 1320
caaagtcata tgacccataa cagaaagcaa gctccagtca aggaggtaaa cggcactgcc 1380
gctaggctag cggaacaatc taagatttgc attaaatctt ga 1422
<210> 33
<211> 1515
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 33
atgggaataa gtgccacaat caacgtttac ttgttgaatg ctgctcgatt ccactcgtct 60
agagaaattg ctgtctctac aattgcaaag cctcaaacgc cagacgttgt tcccacagta 120
gaaccgcttc caaatgaaaa tgacacaagc attcgaccat tggaggagat ggtttcattg 180
ctgaaggaag gtaaaacacg agagctgaac aatgatgagg tatcatctct cgttgttcaa 240
ggaaaacttc ccttgtacgc cctagaaaaa caacttgttg ataagacccg cgcagttatt 300
gtaagaagga aggcaattgc ttccttagca gatgctccgg tcttgagaac cgaaaagctg 360
ccttacaaag attatgatta tgaccgtgta tttggcgctt gttgtgagaa tgttatcgga 420
ttcatgccct taccagtcgg cgttgctggt cccttgatca ttgacggtaa accttatcac 480
attcccatgg ctactactga aggctgctta gtagcctcaa ccatgagagg ttgtaaagct 540
atcaattctg gaggcggtgt agaaactgtt ctgacagccg acggaatgac aagaggacca 600
tgcgtttctt tcccatctct ttctcgtgca ggtgcagcta agatgtggct agatagtgaa 660
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catgttaaga caacccttgc tggtacatta ttgttcatcc gattcaagac tactactggt 780
gatgcgatgg gtatgaacat gatttctaag ggtgtggagt attcactaaa gtttatgtcg 840
gaagaatgtg actggcctga catggaagtt atttctgttt caggtaatta ctgtacagac 900
aaaaaagttg ctgcaatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agtctgtcgt tgctgaagct 960
cgtattccag ccgatgttgt cagaagcgtt ctgaagtccg atgttgaggc attggtagaa 1020
ttgaatgtta gcaagaactt gattggatcc gcaatggcag gatcaattgg tggtttcaac 1080
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atttcagtct ctatgccatc tatcgaagtt ggaaccattg gtggaggaac cgttttggaa 1260
cctcaaggat caatgttgga actattagga gttaaaggtc ctcacccaac taatccaggt 1320
gcaaactcaa ggcagttggc taagatcgtt gcttctgctg tcttggctgc agagctgtcc 1380
ttgtgctctg cccttgcagc tggtcactta gtccaaagtc atatgaccca taacagaaag 1440
caagctccag tcaaggaggt aaacggcact gccgctaggc tagcggaaca atctaagatt 1500
tgcattaaat cttga 1515
<210> 34
<211> 1383
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 34
atgcctgaaa agaagaacag tcgttccgct gacgaagctc ttagctttct tgctaaaacg 60
aacgtagagc gcccgatgca ttactctaag acagggaaca taacgcccga cacggtatct 120
tcaagagaag atcactacca agattacgac gactcacaag atgacattat aaataacaaa 180
ctattacaaa gaagacaggg tgggccacac aacaagatag agaagcaaag gaggtttgct 240
ttgttgagga gttccctaaa caggagattg gaaactctag taatattgtg gcatactatc 300
acgattccat ttttagcatc actatttttc gttctgtgta caattcccat gttgtggcct 360
cttataatag tttacttggt ttatttttac atcgatgcca atactccaag caatggaaag 420
tctgctgacc gaagagtgga atggttcaga agtttgcata tttggaaaca ttttgtcaat 480
tattacccta tatctgtgta caaaactgtt gacctggaac cgacgttcaa gactaagaag 540
attgaaatta ttcttccgaa gtatcaccaa gtaaccactt atttgccaag ttctgttaga 600
aagtacatac cgacacacag agttctcata gaaaaggaga tcaaaacagg gccaagatac 660
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actcaattca aacttcctct attgagagat tacttaatgg cattgggtat ttcttctgtt 840
tcgaaacgta atgtgactgc actgataaaa cgaaatcagt ctgtctgtat tgtcattgga 900
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aaaggctttg tgaaagtcgc actagagctg ggtgacactg agttagttcc agtatttggt 1020
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gtcctaaatt acgtgcggaa gcaaatgtgt gggtttcaat tatggttaaa acaacacttt 1140
ggctttacct ttccattttt tcatgctagg ggtgttttca atcacgactt tggccttcta 1200
ccatatcgga aacctatcaa cttggtcatc ggtagaccca tcccggttcc ttacattcat 1260
tcaccaaccc aagaacagat tgaccattac cattccctat atgtcgaaga actgaaacga 1320
gtttttgagc agaataagga gaggtttaat gctggatcct tggagctacg aattgtcgag 1380
tga 1383
<210> 35
<211> 1959
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 35
atgcaactac ggaaaagagg aaacgagaga tccagacttg aatcgcacat cggcgattcg 60
gacacggtta ttgacttgga tgactcttca gtaaacgaca cgcttccgga tgaagacaac 120
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gctgagactg tccgtcgttt ctatgagtca aagaatgtaa tttttatttt tggagccttc 240
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ttaccaaagt cccttcaaag tattgttgag agtactcagt tcaatcagaa ttctaagata 420
ttgagctctg aatcatttgc agtaggtaag caattgaaga gtaagtcaat gattgaagct 480
aatcattcca ttgttcttgt tcctggtgtg atcagcaccg ggctggaaag ttggggcttg 540
gaaggaactc ctgactgccc ctccgaaggt cattttagaa aacgtctatg gggatcattt 600
tacatgttgc ggacaatgtt tttggataag gcgtgttggc tgaaacatat tatgctagat 660
acaacaacgg gattagaccc tccaggaata agcctcagag cagctcaggg gtttgaagct 720
gctgatttct ttatagcagg ttactggatt tggaataaaa tccttcagaa cttggcagtt 780
attggatata atccaaacaa catggtgagc gctgcttatg attggagact tgcttttctg 840
gatttagaat tacgggatgc atacttttca aaattaaaag gtttcgttga acttcaaaag 900
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<210> 36
<211> 2037
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 36
atgctgtcgt taaaaccatc ttggctgact ttggcggcat taatgtatgc catgctattg 60
gtcgtagtgc catttgctaa acctgttaga gctgacgatg tcgaatctta tggaacagtg 120
attggtatcg atttgggtac cacgtactct tgtgtcggtg tgatgaagtc gggtcgtgta 180
gaaattcttg ctaatgacca aggtaacaga atcactcctt cctacgttag tttcactgaa 240
gacgagagac tggttggtga tgctgctaag aacttagctg cttctaaccc aaaaaacacc 300
atctttgata ttaagagatt gatcggtatg aagtatgatg ccccagaggt ccaaagagac 360
ttgaagcgtc ttccttacac tgtcaagagc aagaacggcc aacctgtcgt ttctgtcgag 420
tacaagggtg aggagaagtc tttcactcct gaggagattt ccgccatggt cttgggtaag 480
atgaagttga tcgctgagga ctacttagga aagaaagtca ctcatgctgt cgttaccgtt 540
ccagcctact tcaacgacgc tcaacgtcaa gccactaagg atgccggtct catcgccggt 600
ttgactgttc tgagaattgt gaacgagcct accgccgctg cccttgctta cggtttggac 660
aagactggtg aggaaagaca gatcatcgtc tacgacttgg gtggaggaac cttcgatgtt 720
tctctgcttt ctattgaggg tggtgctttc gaggttcttg ctaccgccgg tgacacccac 780
ttgggtggtg aggactttga ctacagagtt gttcgccact tcgttaagat tttcaagaag 840
aagcataaca ttgacatcag caacaatgat aaggctttag gtaagctgaa gagagaggtc 900
gaaaaggcca agcgtacttt gtcttcccag atgactacca gaattgagat tgactctttc 960
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gctaaggaca acaacttgct tggtaaattc gagctgactg gtattccacc agctccaaga 1500
ggtactcctc aagttgaggt tacttttgtt ttagacgcta acggaatttt gaaggtctct 1560
gccaccgata agggaactgg aaaatccgag tccatcacca tcaacaatga tcgtggtaga 1620
ttgtccaagg aggaggttga ccgtatggtt gaagaggccg agaagtacgc cgctgaggat 1680
gctgcactaa gagaaaagat tgaggctaga aacgctctgg agaactacgc tcattccctt 1740
aggaaccaag ttactgatga ctctgaaacc gggcttggtt ctaaattgga cgaggacgac 1800
aaagagacat tgacagatgc catcaaagat accctagagt tcttggaaga caacttcgac 1860
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atcacttcta agctatacgg tgctccagag ggtggtactc cacctggtgg tcaaggtttt 1980
gacgatgatg atggagactt tgactacgac tatgactatg atcatgatga gttgtag 2037
<210> 37
<211> 312
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 37
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu
85 90 95
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
100 105 110
Thr Phe Ser His Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
115 120 125
Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr
130 135 140
Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
145 150 155 160
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
165 170 175
Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu Glu Gly Leu His Gly Asp Gly
180 185 190
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
195 200 205
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser
210 215 220
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
225 230 235 240
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
245 250 255
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
260 265 270
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr
275 280 285
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
290 295 300
Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
305 310
<210> 38
<211> 299
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 38
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln
100 105 110
Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
115 120 125
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro
130 135 140
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Pro Asp Phe Thr Leu Thr Ile
145 150 155 160
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
180 185 190
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
195 200 205
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
210 215 220
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
225 230 235 240
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
245 250 255
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
260 265 270
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
275 280 285
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
290 295
<210> 39
<211> 303
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 39
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu
85 90 95
Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp
100 105 110
Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn
115 120 125
Arg Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr
130 135 140
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys
145 150 155 160
Asn Gln Tyr Tyr Leu Asp Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala
165 170 175
Thr Tyr Tyr Cys Ala Asn Trp Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
180 185 190
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
195 200 205
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
210 215 220
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
225 230 235 240
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245 250 255
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
260 265 270
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
275 280 285
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
290 295 300
<210> 40
<211> 299
<212> PRT
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 40
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Ile Gly Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser
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Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro
130 135 140
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile
145 150 155 160
Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser
165 170 175
Asn Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
180 185 190
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
195 200 205
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
210 215 220
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
245 250 255
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260 265 270
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
275 280 285
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
290 295
<210> 41
<211> 939
<212> DNA
<213> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
<400> 41
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cctgcagttt tgcagtcatc tggtctgtac tctctgtcct cagttgtcac tgttccttcc 840
tcatctcttg gtaccaagac ctacacttgc aacgttgacc ataagccatc caataccaag 900
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<210> 100
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> gene
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<223> 用于核酸扩增的寡核苷酸
<400> 100
tcatggccga ggcggcccta ttacttgtca caggactttg gctc 44
<210> 101
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 用于核酸扩增的寡核苷酸
<400> 101
ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39
<210> 102
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> gene
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<223> 用于核酸扩增的寡核苷酸
<400> 102
tatcggccga ggcggcccta ttacttacct ggggacaag 39
<210> 103
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> gene
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<223> 用于核酸扩增的寡核苷酸
<400> 103
ctatggccga ggcggcccta ttaacactca cctctgttg 39

Claims (15)

1.一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中过表达至少一种编码至少一种参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸，由此与不过表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比，使所述目标蛋白的产量增加，
其中所述参与脂质代谢的蛋白优选地参与鞘脂生物合成、磷脂生物合成、脂质转运和/或麦角甾醇生物合成，
其中所述至少一种参与脂质代谢的蛋白包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列或所述至少一种蛋白的功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1-9中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQID NO:1-9中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，
其中所述至少一种参与磷脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，或
其中所述至少一种参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，或
其中所述至少一种参与麦角甾醇生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
3.一种制备根据权利要求1-2中任一项的目标蛋白的方法，所述方法包括：
-提供所述宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以过表达至少一种编码至少一种蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个、优选地示于SEQID NO:1-9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码目标蛋白的异源多核苷酸；
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以过表达所述参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物并表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中1、2、3、4、5、6、7、8或更多种参与脂质代谢的蛋白被过表达，所述参与脂质代谢的蛋白选自SEQ ID NO:1-15中任一个或其功能同系物，其中任选地进一步过表达编码分子伴侣的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中以下的至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白被过表达：
(a)包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(b)包含示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(c)包含示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(d)包含示于SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(e)包含示于SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和3的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(f)包含示于SEQ ID NO:1、3和4的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、3和4的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(g)包含示于SEQ ID NO:1、3、4和8的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、3、4和8的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(h)包含示于SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(i)包含示于SEQ ID NO:1和7的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和7的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(j)包含示于SEQ ID NO:5、6和9的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:5、6和9的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性；或
(k)包含示于SEQ ID NO:1、5、6和9的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1、5、6和9的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
6.根据权利要求4所述的方法，其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种参与脂质转运的蛋白被过表达，
其中至少一种参与磷脂生物合成的蛋白和至少一种参与脂质转运的蛋白被过表达，或
其中至少一种参与鞘脂生物合成的蛋白和至少一种分子伴侣被过表达，或
其中至少一种参与麦角甾醇生物合成的蛋白和至少一种分子伴侣被过表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ IDNO:1的氨基酸序列或其功能同系物，和所述参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，或
其中所述参与磷脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其功能同系物，和所述参与脂质转运的蛋白包含示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，或
其中所述参与鞘脂生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能同系物，和所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，或
其中所述参与麦角甾醇生物合成的蛋白包含示于SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQID NO:15的氨基酸序列或其功能同系物，和所述分子伴侣包含示于SEQ ID NO:18的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
8.一种用于制备目标蛋白的重组真核宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以过表达至少一种编码至少一种参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸，
其中所述参与脂质代谢的蛋白优选地包含示于SEQ ID NO:1-15中任一个、优选地示于SEQ ID NO:1-9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12-15中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:1-15中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
9.一种增加真核宿主细胞中目标蛋白的产量的方法，所述方法包括在所述宿主细胞中低表达至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸，由此与不低表达编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸的所述宿主细胞相比，使所述目标蛋白的产量增加，
其中所述参与脂质代谢的蛋白优选地参与脂质贮存。
10.根据权利要求9所述的方法，其中包含示于SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白被低表达，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
11.一种制备根据权利要求9-10中任一项的目标蛋白的方法，所述方法包括：
-提供所述宿主细胞，所述宿主细胞被工程化以低表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白参与脂质代谢且包含示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性，其中所述宿主细胞包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸；
-在适宜条件下培养所述宿主细胞以低表达所述参与脂质代谢的蛋白或其功能同系物并表达所述目标蛋白，和任选地
-自所述细胞培养物中分离所述目标蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述蛋白包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
13.一种用于制备目标蛋白的重组真核宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化以低表达至少一种编码参与脂质代谢的蛋白的多核苷酸，其中所述目标蛋白优选为非膜蛋白，
其中所述参与脂质代谢的蛋白优选地参与脂质贮存并包含示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列或其功能同系物，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:16或17中任一个的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中以下的参与脂质代谢的蛋白被低表达：
(a)包含示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列或其功能同系物的蛋白，其中所述功能同系物分别与示于SEQ ID NO:16和17的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。
15.根据权利要求1-7和9-12中任一项所述的方法或根据权利要求8、13或14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母、多形汉森酵母、里氏木霉、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、甲醇毕赤酵母、博伊丁假丝酵母、Komagataella sp.、曲霉菌和粟酒裂殖酵母。
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