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CN110606900B - 一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法 - Google Patents

一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法 Download PDF

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CN110606900B CN201911008949.5A CN201911008949A CN110606900B CN 110606900 B CN110606900 B CN 110606900B CN 201911008949 A CN201911008949 A CN 201911008949A CN 110606900 B CN110606900 B CN 110606900B
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Abstract

本发明提供一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法，包括制备木枣多糖和对木枣多糖进行分离纯化，对木枣多糖进行分离纯化步骤是：先将木枣多糖通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，依次用PBS溶液和NaCl‑PBS溶液梯度洗脱进行分离，再通过Sephacryl S‑300凝胶柱进行纯化。通过本发明制备方法能够一次性分离纯化得到三种木枣抗氧化活性多糖PZMP1、PZMP2和PZMP3，通过本发明分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖不仅纯度较高，纯度能够高达90％以上，而且得率较高，以木枣粗多糖为基数，PZMP1得率为2.95％，PZMP2得率为14.15％，PZMP3得率为14.61％。除此之外，本发明分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖均有较强的抗氧化性，为抗氧化性功能食品提供原料，促进了木枣的可持续性发展。

Description

一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法
技术领域
本发明属于食品深加工领域，涉及多糖提取技术，更具体地，涉及一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法。
背景技术
大枣(ZiziphusJujubaMill.)又名华枣、贯枣、刺枣，为鼠李科枣属植物枣树的果实。红枣除含有水分、纤维素和多种维生素外，还含有黄酮类物质、三萜类物质、多糖、核苷类物质等。大枣具有良好的医疗保健作用，用于治疗食欲不振，疲劳，贫血等病症。我国是世界上唯一拥有大面积栽培的优良枣树品种的国家。据中华人民共和国国家统计局资料，目前全国红枣产量为734.53万吨(2014年)、634.00万吨(2013年)，占世界总产量的90％以上。枣树在我国分布极广，主要分布在新疆枣区及黄河沿岸流域枣区。
佳县木枣：地处北纬37°41′47"～38°23′34″、东经110°0′45"～110°45′10″之间，来自佳县无污染源的黄河沿岸地区，栽培历史悠久，树体生命力强。据测定分析，佳县木枣中含水分(68％)、可滴定酸(0.32％)、可溶性固形物(27.4％)、总糖(21.9g/100g)、还原型Vc(376.2mg/100g)，总酚(541.8mg GAE eq./100g FW)、总黄酮(255.5mg Rutin eq./100gFW)、总原花青素(184.2mg GSPE eq./100g FW)，肉桂酸(35.2μg/100g FW)等营养成分。多糖是红枣中重要的生物活性物质，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、保肝、降血糖、调节肠道菌群等多种生物活性；但由于佳县木枣粗多糖成分复杂，质量难以有效控制，目前对于佳县木枣这一具有较大潜在药用价值的品种的研究较少。
目前，已有多种大枣多糖分离纯化手段，但是，分离纯化后得到的多糖种类有限，纯度和提取率不高，并且目前没有将多糖成分复杂的佳县木枣分离纯化得到抗氧化作用较好的木枣抗氧化活性多糖。
发明内容:
本发明的目的是针对上述不足，提出一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法。通过本发明制备方法能够一次性分离纯化得到三种木枣抗氧化活性多糖PZMP1、PZMP2和PZMP3，通过本发明分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖不仅纯度较高，纯度能够高达90％以上，而且得率较高，以木枣粗多糖为基数，PZMP1得率为2.95％，PZMP2得率为14.15％，PZMP3得率为14.61％。除此之外，本发明分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖均有较强的抗氧化性，为抗氧化性功能食品提供原料，促进了木枣的可持续性发展。
本发明的技术方案是：
本发明提供一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法，包括制备木枣多糖和对木枣多糖进行分离纯化，对木枣多糖进行分离纯化步骤是：先将木枣多糖通过DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱，依次用PBS溶液和NaCl-PBS溶液梯度洗脱进行分离，再通过Sephacryl S-300凝胶柱进行纯化。上述NaCl-PBS溶液浓度可以为0M～0.3M。
优选上述具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法，包括制备木枣多糖和对木枣多糖进行分离纯化，对木枣多糖进行分离纯化步骤是：先将木枣多糖通过DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱，依次用PBS溶液和0M的NaCl-PBS溶液梯度洗脱进行分离，再通过Sephacryl S-300凝胶柱进行纯化。将上述梯度洗脱条件下分离纯化得到的木枣抗氧化活性多糖组分，命名为PZMP1。
优选上述具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法，包括制备木枣多糖和对木枣多糖进行分离纯化，对木枣多糖进行分离纯化步骤是：先将木枣多糖通过DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱，依次用PBS溶液、0M的NaCl-PBS溶液和0.2M的NaCl-PBS溶液梯度洗脱进行分离，再通过Sephacryl S-300凝胶柱进行纯化。将上述梯度洗脱条件下分离纯化得到的木枣抗氧化活性多糖组分，命名为PZMP2。
优选上述具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法，包括制备木枣多糖和对木枣多糖进行分离纯化，对木枣多糖进行分离纯化步骤是：先将木枣多糖通过DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱，依次用PBS溶液、0M的NaCl-PBS溶液、0.2M的NaCl-PBS溶液和0.3M的NaCl-PBS溶液梯度洗脱进行分离，再通过Sephacryl S-300凝胶柱进行纯化。将上述梯度洗脱条件下分离纯化得到的木枣抗氧化活性多糖组分，命名为PZMP3。
上述分离采用的梯度洗脱的洗脱速率为1.0-2.0mL/min。优选的，洗脱速率为1.5mL/min。
上述梯度洗脱时，PBS溶液洗脱一个柱体积，每个浓度的NaCl-PBS溶液各洗脱一个柱体积。
所述PBS溶液的pH为6.0。
所述通过SephacrylS-300凝胶柱纯化的条件为：以蒸馏水为洗脱剂洗脱一个柱体积，流速为0.6-1.0mL/min，优选的流速为0.8mL/min。
将DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离得到的多糖组分进行透析除盐、浓缩后再通过Sephacryl S-300凝胶柱纯化；所述透析除盐过程中，透析袋的截留分子量为3500Da，透析时间为65-80h，优选72小时。
所述的木枣多糖由木枣依次通过超声波辅助热水浸提、醇沉和脱色脱蛋白处理得到。
所述超声波辅助热水浸提的料液比23:1，超声功率为420W，提取温度为60-80℃，时间为20-40min。优选的，提取温度为70℃，时间为30min。
所述脱蛋白处理采用木瓜蛋白酶--8％三氟乙酸法；所述脱色处理采用0.4倍木枣多糖水溶液体积的双氧水进行水浴处理；所述水浴温度为40-50℃水浴时间为20-40min；所述双氧水体积浓度为30％。优选的，所述水浴温度为45℃，水浴时间为30min。
所述具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法，分离纯化的具体步骤为：
(1)分离：将木枣多糖水溶液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，在1.5mL/min洗脱速率下，先依次用PBS溶液(pH为6.0)和0M的NaCl-PBS溶液各梯度洗脱一个柱体积，收集第一种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP1；然后再用0.2M的NaCl-PBS溶液继续梯度洗脱一个柱体积，收集第二种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP2；最后再用0.3M的NaCl-PBS溶液继续梯度洗脱一个柱体积，收集第三种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP3；将上述三种粗品ZMP1、ZMP2和ZMP3分别通过透析除盐，浓缩后备用；
(2)纯化：先将上述三种浓缩后的木枣抗氧化活性多糖的粗品分别通过SephacrylS-300凝胶柱进行纯化，在流速0.8mL/min条件下，用蒸馏水洗脱一个柱体积，再通过减压浓缩、真空冷冻干燥，得到三种纯化的木枣抗氧化活性多糖。其中，ZMP1纯化后得到的木枣抗氧化活性多糖命名为PZMP1，ZMP2纯化后得到的木枣抗氧化活性多糖命名为PZMP2，ZMP3纯化后得到的木枣抗氧化活性多糖命名为PZMP3。
优选所述DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱为Φ26mm×100mm阴离子交换柱；所述Sephacryl S-300凝胶柱为26mm×100mm凝胶柱。所述DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(Φ26mm×100mm)的制备方法为：将柱材搅匀后以玻璃棒引流方式注入玻璃柱(Φ26mm×100mm)中，在此过程中不断用洗耳球敲打，防止产生气泡，得到DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱。所述DEAE Sepharose Fast Flow柱材和和SephacrylS-300凝胶柱均购自于GE Healthcare Life Sciences。
本发明通过大量实验研究确定选用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱来分离木枣多糖，选用Sephacryl S-300凝胶柱进行纯化，才能一次性同时得到三种纯化的木枣抗氧化活性多糖，使用其他的阴离子交换柱分离，或者使用其他的凝胶柱进行纯化，均得不到本发明的纯度较高，得率较高的具有较强抗氧化性的木枣抗氧化活性多糖。
本发明的有益效果：
(1)通过本发明制备方法能够一次性分离纯化得到三种木枣抗氧化活性多糖PZMP1、PZMP2和PZMP3，通过本发明分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖不仅纯度较高，纯度能够高达90％以上，而且得率较高，以木枣粗多糖为基数，PZMP1得率为2.95％，PZMP2得率为14.15％，PZMP3得率为14.61％，。除此之外，本发明分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖均有较强的抗氧化性，为抗氧化性功能食品提供原料，促进了木枣的可持续性发展。
(2)本发明采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离木枣多糖，DEAESepharose Fast Flow性质稳定，更利于三种木枣抗氧化活性多糖的分离，提高三种木枣抗氧化活性多糖的得率；采用Sephacryl S-300凝胶柱进行纯化，Sephacryl S-300凝胶柱的纯化范围利于三种木枣多糖的纯化，且纯化效率高，高达90％以上。
(3)本发明采用NaCl-PBS溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，比NaCl溶液更稳定，能够有效防止一年四季中环境温度的变化对提取的多糖组分性质的影响，保持了分离得到的木枣多糖组分性质的稳定性。依次用PBS溶液和NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱，可一次性分离得到木枣抗氧化活性多糖，提高木枣多糖得率，不仅保证木枣多糖结构的一致性，而且降低了对柱材的耗损，延长柱材使用寿命。
(4)本发明以23:1的料液比在特定条件下进行超声波辅助热水浸提，保证了最大程度的提取木枣中的各多糖组分。
附图说明
图1示出了测试例2中三种木枣抗氧化活性多糖的1H-NMR谱图；其中，(A)为PZMP1的1H-NMR谱图，(B)为PZMP2的1H-NMR谱图，(C)为PZMP3的1H-NMR谱图。
图2示出了测试例2中三种木枣抗氧化活性多糖的13C-NMR谱图；其中，(A)为PZMP1的13C-NMR谱图，(B)为PZMP2的13C-NMR谱图，(C)为PZMP3的13C-NMR谱图。
具体实施方式
实施例1
一种木枣多糖的分离纯化制备方法，步骤为：
1、木枣多糖的制备：
(1)超声波辅助热水浸提：选取干燥的佳县木枣，将木枣原料经过50℃干燥，冷却后，运用高速粉碎机将原料粉碎，将粉碎好的原料过100目筛，将筛子上部的渣子重新放入粉碎机中重新粉碎。将一定质量的木枣枣粉样品以料液比23:1在70℃水浴超声辅助浸提30min，超声功率为420W。离心过滤后，将得到的清液进行浓缩得到浓缩液。
(2)醇沉：向步骤(1)浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，直至体系中乙醇体积分数达到85％，常温过夜、抽滤、取沉淀、冷冻干燥，即得木枣粗多糖。
(3)脱色脱蛋白处理：将步骤(2)制得的木枣粗多糖溶于水，先采用木瓜蛋白酶--8％三氟乙酸法进行脱蛋白处理，剧烈震荡后静置分层，去上清液，再加入0.4倍木枣多糖水溶液体积的30％双氧水(体积浓度)，在45℃水浴温度下保温30min进行脱色处理；再进行二次浓缩醇沉，沉淀依次用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，复溶后冷冻干燥，即得到精制的木枣多糖。
2、木枣多糖的分离纯化：
(1)分离：称取上述精制的木枣多糖1.0g溶解于蒸馏水中，过0.45μm滤膜上样，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(Φ26mm×100mm)进行一次层析，将木枣多糖水溶液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，在1.5mL/min洗脱速率下，先依次用PBS溶液(pH为6.0)和0M的NaCl-PBS溶液各梯度洗脱一个柱体积，收集第一种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP1；然后再用0.2M的NaCl-PBS溶液继续梯度洗脱一个柱体积，收集第二种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP2；最后再用0.3M的NaCl-PBS溶液继续梯度洗脱一个柱体积，收集第三种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP3。再将上述三种粗品ZMP1、ZMP2和ZMP3分别通过透析(透析袋的截留分子量为3500Da)除盐72h，得到三种木枣抗氧化活性多糖粗品的浓缩液，备用；
(2)纯化：先将上述三种浓缩后的木枣抗氧化活性多糖的粗品分别通过SephacrylS-300凝胶柱(Φ26mm×100mm)进行纯化，在0.8mL/min条件下，用蒸馏水洗脱一个柱体积，再通过减压浓缩、真空冷冻干燥，得到三种纯化的木枣抗氧化活性多糖。其中，ZMP1纯化后得到的木枣抗氧化活性多糖命名为PZMP1，ZMP2纯化后得到的木枣抗氧化活性多糖命名为PZMP2，ZMP3纯化后得到的木枣抗氧化活性多糖命名为PZMP3。
实施例2
一种木枣多糖的分离纯化制备方法，步骤为：
1、木枣多糖的制备：
(1)超声波辅助热水浸提：选取干燥的佳县木枣，将木枣原料经过60℃干燥，冷却后，运用高速粉碎机将原料粉碎，将粉碎好的原料过100目筛，将筛子上部的渣子重新放入粉碎机中重新粉碎。将一定质量的木枣枣粉样品以料液比23:1在60℃水浴超声辅助浸提20min，超声功率为420W。离心过滤后，将得到的清液进行浓缩得到浓缩液。
(2)醇沉：向步骤(1)浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，直至体系中乙醇体积分数达到85％，常温过夜、抽滤、取沉淀、冷冻干燥，即得木枣粗多糖。
(3)脱色脱蛋白处理：将步骤(2)制得的木枣粗多糖溶于水，先采用木瓜蛋白酶--8％三氟乙酸法进行脱蛋白处理，剧烈震荡后静置分层，去上清液，再加入0.4倍木枣多糖水溶液体积的30％双氧水(体积浓度)，在50℃水浴温度下保温50min进行脱色处理；再进行二次浓缩醇沉，沉淀依次用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，复溶后冷冻干燥，即得到精制的木枣多糖。
2、木枣多糖的分离纯化：
(1)分离：称取上述精制的木枣多糖1.0g溶解于蒸馏水中，过0.45μm滤膜上样，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(Φ26mm×100mm)进行一次层析，将木枣多糖水溶液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，在1.0mL/min洗脱速率下，依次用PBS溶液(pH为6.0)和0M的NaCl-PBS溶液各梯度洗脱一个柱体积，收集木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP1；再将上述粗品ZMP1通过透析(透析袋的截留分子量为3500Da)除盐72h，得到木枣抗氧化活性多糖粗品的浓缩液，备用；
(2)纯化：先将上述浓缩后的木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP1通过Sephacryl S-300凝胶柱(Φ26mm×100mm)进行纯化，在0.6mL/min流速条件下，用蒸馏水洗脱一个柱体积，再通过减压浓缩、真空冷冻干燥，得到纯化的木枣抗氧化活性多糖PZMP1。
实施例3
一种木枣多糖的分离纯化制备方法，步骤为：
1、木枣多糖的制备：
(1)超声波辅助热水浸提：选取干燥的佳县木枣，将木枣原料经过50℃干燥，冷却后，运用高速粉碎机将原料粉碎，将粉碎好的原料过100目筛，将筛子上部的渣子重新放入粉碎机中重新粉碎。将一定质量的木枣枣粉样品以料液比23:1在70℃水浴超声辅助浸提30min，超声功率为420W。离心过滤后，将得到的清液进行浓缩得到浓缩液。
(2)醇沉：向步骤(1)浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，直至体系中乙醇体积分数达到85％，常温过夜、抽滤、取沉淀、冷冻干燥，即得木枣粗多糖。
(3)脱色脱蛋白处理：将步骤(2)制得的木枣粗多糖溶于水，先采用木瓜蛋白酶--8％三氟乙酸法进行脱蛋白处理，剧烈震荡后静置分层，去上清液，再加入0.4倍木枣多糖水溶液体积的30％双氧水(体积浓度)，在45℃水浴温度下保温30min进行脱色处理；再进行二次浓缩醇沉，沉淀依次用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，复溶后冷冻干燥，即得到精制的木枣多糖。
2、木枣多糖的分离纯化：
(1)分离：称取上述精制的木枣多糖1.0g溶解于蒸馏水中，过0.45μm滤膜上样，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(Φ26mm×100mm)进行一次层析，将木枣多糖水溶液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，在2.0mL/min洗脱速率下，依次用PBS溶液(pH为6.0)、0M的NaCl-PBS溶液和0.2M的NaCl-PBS溶液各梯度洗脱一个柱体积，收集木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP2。再将上述粗品ZMP2通过透析(透析袋的截留分子量为3500Da)除盐72h，得到木枣抗氧化活性多糖粗品的浓缩液，备用；
(2)纯化：先将上述浓缩后的木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP2通过Sephacryl S-300凝胶柱(Φ26mm×100mm)进行纯化，在1.0mL/min条件下，用蒸馏水洗脱一个柱体积，再通过减压浓缩、真空冷冻干燥，得到纯化的木枣抗氧化活性多糖PZMP2。
实施例4
一种木枣多糖的分离纯化制备方法，步骤为：
1、木枣多糖的制备：
(1)超声波辅助热水浸提：选取干燥的佳县木枣，将木枣原料经过60℃干燥，冷却后，运用高速粉碎机将原料粉碎，将粉碎好的原料过100目筛，将筛子上部的渣子重新放入粉碎机中重新粉碎。将一定质量的木枣枣粉样品以料液比23:1在60℃水浴超声辅助浸提20min，超声功率为420W。离心过滤后，将得到的清液进行浓缩得到浓缩液。
(2)醇沉：向步骤(1)浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，直至体系中乙醇体积分数达到85％，常温过夜、抽滤、取沉淀、冷冻干燥，即得木枣粗多糖。
(3)脱色脱蛋白处理：将步骤(2)制得的木枣粗多糖溶于水，先采用木瓜蛋白酶--8％三氟乙酸法进行脱蛋白处理，剧烈震荡后静置分层，去上清液，再加入0.4倍木枣多糖水溶液体积的30％双氧水(体积浓度)，在50℃水浴温度下保温50min进行脱色处理；再进行二次浓缩醇沉，沉淀依次用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，复溶后冷冻干燥，即得到精制的木枣多糖。
2、木枣多糖的分离纯化：
(1)分离：称取上述精制的木枣多糖1.0g溶解于蒸馏水中，过0.45μm滤膜上样，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(Φ26mm×100mm)进行一次层析，将木枣多糖水溶液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，在1.5mL/min洗脱速率下，依次用PBS溶液(pH为6.0)、0M的NaCl-PBS溶液、0.2M的NaCl-PBS溶液和0.3M的NaCl-PBS溶液各梯度洗脱一个柱体积，收集木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP3。再将上述粗品ZMP3通过透析(透析袋的截留分子量为3500Da)除盐72h，得到木枣抗氧化活性多糖粗品的浓缩液，备用；
(2)纯化：先将上述浓缩后的木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP3通过Sephacryl S-300凝胶柱(Φ26mm×100mm)进行纯化，在0.8mL/min流速条件下，用蒸馏水洗脱一个柱体积，再通过减压浓缩、真空冷冻干燥，得到纯化的木枣抗氧化活性多糖PZMP3。
实施例5
一种木枣多糖的分离纯化制备方法，步骤为：
1、木枣多糖的制备：
(1)超声波辅助热水浸提：选取干燥的佳县木枣，将木枣原料经过60℃干燥，冷却后，运用高速粉碎机将原料粉碎，将粉碎好的原料过100目筛，将筛子上部的渣子重新放入粉碎机中重新粉碎。将一定质量的木枣枣粉样品以料液比23:1在60℃水浴超声辅助浸提20min，超声功率为420W。离心过滤后，将得到的清液进行浓缩得到浓缩液。
(2)醇沉：向步骤(1)浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，直至体系中乙醇体积分数达到85％，常温过夜、抽滤、取沉淀、冷冻干燥，即得木枣粗多糖。
(3)脱色脱蛋白处理：将步骤(2)制得的木枣粗多糖溶于水，先采用木瓜蛋白酶--8％三氟乙酸法进行脱蛋白处理，剧烈震荡后静置分层，去上清液，再加入0.4倍木枣多糖水溶液体积的30％双氧水(体积浓度)，在50℃水浴温度下保温50min进行脱色处理；再进行二次浓缩醇沉，沉淀依次用丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，复溶后冷冻干燥，即得到精制的木枣多糖。
2、木枣多糖的分离纯化：
(1)分离：称取上述精制的木枣多糖1.0g溶解于蒸馏水中，过0.45μm滤膜上样，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(Φ26mm×100mm)进行一次层析，将木枣多糖水溶液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，在1.5mL/min洗脱速率下，依次用PBS溶液(pH为6.0)、0M的NaCl-PBS溶液、0.2M的NaCl-PBS溶液、0.3M的NaCl-PBS溶液和0.4M的NaCl-PBS溶液各梯度洗脱一个柱体积，收集木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP4。再将上述粗品ZMP4通过透析(透析袋的截留分子量为3500Da)除盐72h，得到木枣抗氧化活性多糖粗品的浓缩液，备用；
(2)纯化：先将上述浓缩后的木枣抗氧化活性多糖的粗品ZMP4通过Sephacryl S-300凝胶柱(Φ26mm×100mm)进行纯化，在0.8mL/min流速条件下，用蒸馏水洗脱一个柱体积，再通过减压浓缩、真空冷冻干燥，得到纯化的木枣抗氧化活性多糖PZMP4。
经木枣多糖纯品的理化性质分析：PZMP4得率(以粗多糖计)0.76％，分子量(kDa)：27.89，多糖纯度(％)：90.64。可见，上述多糖得率极低，纯度差，产品不适于后续抗氧化性测试。
实施例6三种木枣抗氧化活性多糖的单糖组成分析
通过常规的气相色谱单糖衍生化法测定实施例1分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖PZMP1、PZMP2和PZMP3的单糖组成，结果如表1所示。
表1 PZMP1、PZMP2、PZMP3的单糖组成
Figure BDA0002243599950000151
“—”代表含微量的单糖组分
测试例1三种木枣抗氧化活性多糖的理化性质测试
对实施例1分离纯化得到的PZMP1、PZMP2和PZMP3三种木枣抗氧化活性多糖进行理化性质测定。其中，多糖分子量采用常规的高效液相色谱凝胶色谱测定，多糖纯度、蛋白质、总酚含量分别采用常规的苯酚硫酸法、考马斯亮蓝法、福林酚法测定。分析结果见表2所示：
表2三种木枣抗氧化活性多糖的理化性质分析结果
Figure BDA0002243599950000161
测试例2三种木枣抗氧化活性多糖的核磁分析
对实施例1木枣多糖分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖PZMP1、PZMP2和PZMP3分别进行核磁分析。将PZMP1、PZMP2、PZMP3分别溶解于重水中，采用600MHz型核磁共振仪进行一维1H-NMR谱、13C-NMR谱检测。PZMP1的1H-NMR谱如图1中(A)图所示，PZMP2的1H-NMR谱如图1中(B)图所示，PZMP3的1H-NMR谱如图1中(C)图所示，PZMP1的13C-NMR谱如图2中(A)图示，PZMP2的13C-NMR谱如图2中(B)图所示，PZMP3的13C-NMR谱如图2中(C)图所示。
通过核磁一维1H-NMR谱和13C-NMR谱分析，确定PZMP1主链主要以1,3,5-Araf和1,5-Araf连接方式构成，1,4-Galp可能在主链存在。PZMP2主链由半乳糖醛酸通过1,4-GalpA与鼠李糖通过1,2,4-Rhap相连接构成，属于I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖类。PZMP3主链由半乳糖醛酸通过1,4-GalpA和1,2,4-GalpA相连接构成，属于HG型半乳糖醛酸聚糖类。
PZMP1的糖苷键归属如表3所示，PZMP2的糖苷键归属如表4所示，PZMP3的糖苷键归属如表5所示。
表3 PZMP1的糖苷键归属
Figure BDA0002243599950000171
表4 PZMP2的糖苷键归属
Figure BDA0002243599950000172
Figure BDA0002243599950000181
表5 PZMP3的糖苷键归属
Figure BDA0002243599950000182
测试例3三种木枣抗氧化活性多糖的抗氧化性测试
1.羟自由基清除能力
将实施例1分离纯化得到的PZMP1、PZMP2和PZMP3用蒸馏水分别配制成浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，再分别将PZMP1、PZMP2和PZMP3的浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液各取2mL分别加入FeSO4和水杨酸-乙醇的混合溶液(由9mmol/L FeSO4溶液2mL与9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL组成)中，混合均匀之后，再分别加入8.8mmol/L H2O2溶液2mL反应，待反应结束再在37℃下静置1h后在510nm下分别测定PZMP1、PZMP2和PZMP3分别在0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL浓度下的吸光度值，以Vc为阳性对照。羟自由基清除能力按下列公式计算：
羟自由基清除率(％)＝[1－(As－Ab)]/Ac×100％
式中：As为Vc溶液的吸光度值；Ab为空白吸光度值，即用蒸馏水替换H2O2溶液的体系的吸光度值；Ac为对照吸光度值，即用蒸馏水替换木枣抗氧化活性多糖溶液的体系的吸光度值。羟自由基清除能力测试结果如表6所示：
表6羟自由基清除能力(％)
Figure BDA0002243599950000191
2.羟自由基清除能力
将实施例1分离纯化得到的PZMP1、PZMP2和PZMP3用蒸馏水分别配制成浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，再分别将PZMP1、PZMP2和PZMP3的浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液各取1mL分别与1mL DPPH甲醇溶液(0.1mmol/L)混合，避光反应30min，以2.0mL甲醇溶液作零管为空白组，1mL DPPH溶液和1mL甲醇溶液混合作对照组，在517nm下分别测定PZMP1、PZMP2和PZMP3分别在0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL浓度下的吸光度值以Vc作阳性对照，并测定空白组、对照组和Vc阳性对照组的吸光度值，DPPH自由基清楚能力按下列公式计算：
DPPH自由基清除率(％)＝[1－(As－Ac)/Ab]×100％
式中：As为Vc水溶液的吸光度值；Ac为对照组的吸光度值；Ab为空白组吸光度值。
DPPH自由基清除能力测试结果如表7所示：
表7 DPPH自由基清除能力(％)
Figure BDA0002243599950000201
Figure BDA0002243599950000211
3.铁离子螯合能力
将实施例1分离纯化得到的PZMP1、PZMP2和PZMP3用蒸馏水分别配制成浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，再分别将PZMP1、PZMP2和PZMP3的浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液各取1mL分别加入FeCl2溶液(由2mmol/LFeCl2溶液0.1mL和蒸馏水3.7mL组成)中，混合30s后分别加入5mmol/L Ferrozine工作液0.2mL，室温下反应10min，在562nm下分别测定PZMP1、PZMP2和PZMP3分别在0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL浓度下的吸光度值，并以Vc作阳性对照。
铁离子螯合能力按下式计算：
铁离子螯合能力(％)＝[1－(As－Ab)]/Ac×100％
式中：As为多糖或Vc溶液的吸光度值；Ab为空白吸光度值，即用蒸馏水替换H2O2溶液的体系的吸光度值；Ac为对照吸光度值，即用蒸馏水替换多糖溶液的体系的吸光度值。
铁离子螯合能力如表8所示：
表8铁离子螯合能力(％)
Figure BDA0002243599950000212
Figure BDA0002243599950000221
通过羟自由基清除能力、羟自由基清除能力、铁离子螯合能力分析，发现本发明分离纯化得到的三种木枣抗氧化活性多糖PZMP1、PZMP2和PZMP3均有抗氧化性，并且较PZMP1和PZMP2，PZMP3的抗氧化活性更为显著，由实施例5表1中看出，这是由于PZMP1和PZMP2，PZMP3中单糖组成和单糖的比例不同。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (1)

1.一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法，包括制备木枣多糖和对木枣多糖进行分离纯化，其特征在于，对木枣多糖进行分离纯化步骤是：先将木枣多糖通过DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱，依次用PBS溶液和NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱分离，再通过Sephacryl S-300凝胶柱纯化，具体如下：
(1)分离：将木枣多糖水溶液通过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，在1.5mL/min洗脱速率下，先在pH为6.0条件下一次用PBS溶液和0M的NaCl-PBS溶液各梯度洗脱一个柱体积，收集第一种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP1；然后再用0.2M的NaCl-PBS溶液继续梯度洗脱一个柱体积，收集第二种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP2；最后再用0.3M的NaCl-PBS溶液继续梯度洗脱一个柱体积，收集第三种木枣抗氧化活性多糖的粗品，命名为ZMP3；将上述三种粗品ZMP1、ZMP2和ZMP3分别通过透析除盐，浓缩后备用；
(2)纯化：先将上述浓缩后的木枣抗氧化活性多糖ZMP3的粗品通过SephacrylS-300凝胶柱进行纯化，在流速0.8mL/min条件下，用蒸馏水洗脱一个柱体积，再通过减压浓缩、真空冷冻干燥，得到纯化的木枣抗氧化活性多糖ZMP3；所述的木枣多糖由木枣依次通过超声波辅助热水浸提、醇沉和脱色脱蛋白处理得到；所述超声波辅助热水浸提的料液比23:1，超声功率为420W，提取温度为60-80℃，时间为20-40min。
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