CN110591985A

CN110591985A - 微生物共生培养菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110591985A
Application number: CN201911043024.4A
Authority: CN
Inventors: 王代军
Original assignee: Zhejiang Daijun Biomedicine Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Daijun Biomedicine Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2019-12-20

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，提供了一种微生物共生培养菌剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种微生物共生培养菌剂，具体包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌。该菌剂环境适应性好，抗有毒污染能力强，可以良好的应用于各种石油污染环境中，通过共生培养，菌种间达到了稳定的平衡，可以大规模发酵制备。通过将目标菌种共同培养，利用菌种间的相互作用形成稳定的共生体系，制备方法简单，制备得到的微生物共生培养菌剂菌种之间平衡稳定，环境适应能力强。该菌剂可以实现一次性处理石油污水或石油污泥，处理后达到直接排放的标准，极大降低了处理成本。

Description

微生物共生培养菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种微生物共生培养菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

利用微生物降解石油油污是目前油污处理技术研究热点，但就目前来看，现有微生物分解石油油污技术存在诸多问题：一、单菌株降解石油油泥效率差，多种菌联合应用又使得处理过程繁杂、不可控，工程造价大；二、现有复合微生物菌剂为单一菌种复配而来，各菌株生长条件不同，复配制备需要借助多种工业化手段，工艺复杂，且菌剂环境适应性差，抗有毒污染能力弱、无法适应多变的石油环境，分解效率低，处理效果差；三、现有菌剂分解石油油污后，废水还需经后续污水系统再处理才可排放，工艺复杂，成本高。

此外，由于石油组分十分复杂，而微生物分解具有一定的偏向性，单靠某一类菌无法实现石油多组分的快速、彻底分解，石油油污处理较好的方式为多种微生物共同作用，然而现有技术中往往因为菌种的需氧量等不同而不能实现不同种类菌种共同应用的效果，从而现有技术中所用的微生物菌剂由于菌种的限制均不能实现石油油污的更好处理。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种微生物共生培养菌剂，以填补现有技术中缺少可以较好的适应油污环境、高效降解石油油污并且对环境友好的微生物菌剂的空白。

本发明的第二目的在于提供上述微生物共生培养菌剂的制备方法，制备得到的微生物共生培养菌剂环境适应性好。

本发明的第三目的在于提供上述微生物共生培养菌剂在石油油污处理中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种微生物共生培养菌剂，包括：假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌。

进一步地，所述微生物共生培养菌剂还包括产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌或嗜麦芽寡养单胞菌中的至少一种。

进一步地，所述微生物共生培养菌剂还包括丁酸梭菌、乳酸杆菌或双歧杆菌中的至少一种。

微生物共生培养菌剂的制备方法，将目标菌种混合，进行诱导共同培养，得到微生物共生培养菌剂；

所述目标菌种包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌。

进一步地，目标菌种均独立地以2-3％的接种量接种于共同发酵培养基中，25-40℃培养2-3天，得到微生物共生培养菌剂；

所述目标菌种包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌；

所述目标菌种的初始浓度均独立地为10⁵-10⁷cfu/mL。

进一步地，所述目标菌种还包括产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌或嗜麦芽寡养单胞菌中的至少一种。

进一步地，所述目标菌种还包括经过诱导处理的厌氧菌；

所述厌氧菌包括丁酸梭菌、乳酸杆菌或双歧杆菌中的至少一种；

所述诱导处理包括：在厌氧菌的培养过程中，每1-5h加入超氧化物歧化酶0.005-0.5w/v％，和，每2-3天增加O₂含量1％-5％；

优选地，所述超氧化物歧化酶的加入量为0.005-0.1w/v％，进一步优选为0.005-0.05w/v％。

进一步地，所述诱导处理中在增加O₂含量时，将CO₂含量降低到0.02％-0.5％。

进一步地，所述共同发酵培养基每1L包括：牛肉膏4-6g、明胶胨15-17g、K₂SO₄ 9-11g、MgCl₂ 1.2-1.6g、NaCl 4-6g、红糖5-10g和溴化十六烷基三甲胺0.1-3g，pH 7.2±0.2。

微生物共生培养菌剂在石油油污处理中的应用。

进一步地，所述石油油污包括石油污水或石油油泥。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种微生物共生培养菌剂，具体包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌。该菌剂避免了多种菌种需要联合依次使用的繁杂过程，降低了石油油污的处理成本。并且该菌剂环境适应性好，抗有毒污染能力强，可以良好的应用于各种污染环境中，通过共生培养，菌种间达到了稳定的平衡，生长速度快，可以大规模发酵制备。此外，该微生物共生培养菌剂石油分解效率高，处理后的污水达到处理标准，可以直接排放。

本发明提供上述微生物共生培养菌剂的制备方法，该方法通过将目标菌种共同培养，利用菌种间的相互作用形成稳定的共生体系，制备方法简单，制备得到的微生物共生培养菌剂菌种之间平衡稳定，环境适应能力强。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

假单胞菌具有极强的有机物分解能力，多种有机物均可作为能量来源；枯草芽孢杆菌生长速度快，对环境要求低，具有较强的降解蛋白质等大分子物质的酶系；假丝酵母对日光、化学制剂等抵抗力较强，可用于石油发酵脱蜡；黄单胞菌可用于石油降解中，对石油烃的降解具有良好的作用。该菌剂避免了多种菌种需要联合依次使用的繁杂过程，降低了石油油污的处理成本。并且该菌剂中各菌种配合使用，环境适应性好，抗有毒污染能力强，可以良好的应用于各种石油污染环境中，通过共生培养，菌种间达到了稳定的平衡，生长速度快，可以大规模发酵制备。此外，该微生物共生培养菌剂石油分解效率高，处理后的污水达到处理标准，可以直接排放。

在优选地实施方式中，微生物共生培养菌剂还包括产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌或嗜麦芽寡养单胞菌中的至少一种。

产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌以及嗜麦芽寡养单胞菌均为好氧菌，与假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌的需氧量相近，可以直接与假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌共同培养制得共生菌剂。可以理解的是，本申请中的微生物共生培养菌剂除了假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌外，例如但不限于还含有产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、球形芽孢杆菌、短杆菌、巴氏醋杆菌和短杆菌、短杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌、或者球形芽孢杆菌和巴氏醋杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌等。上述菌种的加入增加了微生物共生培养菌剂的生物多样性，菌种之间相互作用关系更加多样，代谢途径更加复杂，提高了石油降解能力和环境适应能力。

在优选地实施方式中，微生物共生培养菌剂还包括丁酸梭菌、乳酸杆菌或双歧杆菌中的至少一种。

本申请提供的微生物共生培养菌剂不仅仅为需氧量相同的好氧菌，也可以含有丁酸梭菌、乳酸杆菌或双歧杆菌这些厌氧菌，产品实现了不同需氧量菌种的共同存在，极大地丰富了微生物共生培养菌剂中菌种的生物多样性。并且克服了现有技术中由于需氧量不同，菌种需要分环境和工序处理石油油污的弊端。丁酸梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的添加进一步提高了微生物共生培养菌剂的石油降解能力，实现石油油污的一次处理。微生物共生培养菌剂例如可以为但不限于还包括丁酸梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌、丁酸梭菌和乳酸杆菌和双歧杆菌等等。

本发明提供上述微生物共生培养菌剂的制备方法，将目标菌种混合，进行诱导共同培养，得到微生物共生培养菌剂，其中，目标菌种包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌。

该方法通过将目标菌种共同培养，利用菌种间的相互作用形成稳定的共生体系，制备方法简单，制备得到的微生物共生培养菌剂菌种之间平衡稳定，环境适应能力强。目标菌种均独立地进行活化和培养，达到富集目的后，按照相近的菌种数量共同加入到共同发酵培养基中，实行共同发酵，在这期间目标菌种间通过相互作用和自然发酵，达到菌种间的相互平衡。

目标菌种均独立地以2-3％的接种量接种于共同发酵培养基中，25-40℃培养2-3天，得到微生物共生培养菌剂，其中，目标菌种包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌；目标菌种的初始浓度均独立地为10⁵-10⁷cfu/mL。

需要说明的是，1L共同发酵培养基例如可以但不限为包括：牛肉膏4-6g、明胶胨15-17g、琼脂15-20g、K₂SO₄ 9-11g、MgCl₂ 1.2-1.6g、NaCl 4-6g、红糖5-10g和溴化十六烷基三甲胺0.1-3g，pH 7.2±0.2；接种量典型但非限制性的为2％、2.5％或3％；培养温度典型但非限制性的为25℃、27℃、30℃、33℃、35℃、37℃或40℃；培养时间典型但非限制性的为2天、2.5天或3天；目标菌种的初始浓度均独立地为10⁵cfu/mL、10⁶cfu/mL或10⁷cfu/mL。

在优选地实施方式中，目标菌种还包括产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌或嗜麦芽寡养单胞菌中的至少一种。

可以理解的是，产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌或嗜麦芽寡养单胞菌均为好氧菌，在制备过程中，只需将各菌种分别活化富集后，按照上述的制备过程，以相近的接种量共同接种到共生发酵培养基中即可，利用微生物自身的相互作用和影响，最终得到体系稳定的微生物共生培养菌剂。

在优选地实施方式中，目标菌种还包括经过诱导处理的厌氧菌，其中，厌氧菌包括丁酸梭菌、乳酸杆菌或双歧杆菌中的至少一种，其中，诱导处理包括：在厌氧菌的培养过程中，每1-5h加入超氧化物歧化酶0.005％-0.5％(w/v，20000IU/g)，和，每2-3天增加O₂含量1％-5％，提高培养过程的O₂量到5％-20％。

当目标菌种中含有丁酸梭菌、乳酸杆菌或双歧杆菌中的至少一种时，目标菌种按照需氧量的不同可以分为好氧菌和厌氧菌。目标菌剂中，对厌氧菌进行超氧化物歧化酶诱导处理，先将分别活化富集的厌氧菌以相同的接种量接种，在厌氧条件下混合培养得到稳定体系，以1-5h加入超氧化物歧化酶0.005％-0.5％(w/v，20000IU/g)，和，每2-3天增加O₂含量1％-5％，提高培养过程的O₂量到5％-20％，再向混合培养体系中加入相同接种量的各好氧菌，混合培养，通过各菌种间的相互作用和影响实现菌种间的稳定平衡，得到微生物共生培养菌剂。超氧化物歧化酶的加入时间典型但非限制性的为1h、2h、3h、4h或5h；超氧化物歧化酶的量典型但非限制性的为0.005％、0.01％、0.05％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％；O₂增加时间典型但非限制性的为2天、2.5天或3天，O₂增加量典型但非限制性的为1％、2％、3％、4％或5％。

在优选地实施方式中，超氧化物歧化酶的加入量为0.005％-0.1％(w/v，20000IU/g)，进一步优选为0.005％-0.05％(w/v，20000IU/g)。超氧化物歧化酶可以提高厌氧菌的耐氧能力，帮助厌氧菌逐步适应培养条件中升高的氧含量。

在优选地实施方式中，诱导处理中在增加O₂含量时，将CO₂含量降低到0.02％-0.5％。

厌氧菌培养条件下，CO₂含量一般为9％-11％，本发明提供的微生物共生培养菌剂为在正常空气条件下的菌剂，所以，在培养过程中需要将CO₂含量逐步降低到正常大气CO₂含量。

在优选地实施方式中，1L共同发酵培养基包括：牛肉膏4-6g、明胶胨15-17g、K₂SO₄9-11g，MgCl₂ 1.2-1.6g，NaCl 4-6g，红糖5-10g，溴化十六烷基三甲胺0.1-3g，pH 7.2±0.2。该发酵培养基营养丰富全面，可以为目标菌种提供足够的生长需要，促进目标菌种的快速繁殖。需要说明的是，牛肉膏典型但非限制性的为4g、4.5g、5g、5.5g或6g、明胶胨典型但非限制性的为15g、16g或17g；K₂SO₄典型但非限制性的为9g、10g或11g；MgCl₂典型但非限制性的为1.2g、1.4g或1.6g；NaCl典型但非限制性的为4g、5g或6g；红糖典型但非限制性的为5g、6g、7g、8g、9g或10g；溴化十六烷基三甲胺典型但非限制性的为0.1g、0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g或3g。

本发明最后提供微生物共生培养菌剂在石油油污处理中的应用。

可以理解的是，石油油污包括石油污水或石油油泥。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌。

实施例2

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌和节杆菌。

实施例3

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌和巴氏醋杆菌。

实施例4

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌、巴氏醋杆菌和球形芽孢杆菌。

实施例5

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌、巴氏醋杆菌、球形芽孢杆菌和短杆菌。

实施例6

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌、产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌。

实施例7

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌、丁酸梭菌和乳酸杆菌。

实施例8

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌。

实施例9

一种微生物共生培养菌剂，包括假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母、黄单胞菌、产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、丁酸梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌。

实施例10

本实施例提供一种微生物共生培养菌剂的制备方法，目标菌种均独立地活化富集培养，调整各目标菌种的初始浓度均独立地为10⁶cfu/mL，每种菌种均以2.5％接种量接种于共同发酵培养基中，25-40℃培养2-3天，得到微生物共生培养菌剂。

实施例11

本实施例提供一种微生物共生培养菌剂的制备方法，目标菌种分为好氧菌和厌氧菌。

1、当厌氧菌菌种数为1种时，将厌氧菌现在厌氧条件下培养，每1-5h加入超氧化物歧化酶0.005％-0.5％(w/v，20000IU/g)，同时，每2-3天增加O₂含量1％-5％，提高培养过程的O₂量到18％-20％。

当厌氧菌菌种数为2种以上时，将厌氧菌现有厌氧条件下分别培养，调整各目标菌种的初始浓度均独立地为10⁶cfu/mL，每种菌种均以2.5％接种量接种于共同发酵培养基中，混合培养2-3天，每1-5h加入超氧化物歧化酶0.005％-0.5％(w/v，20000IU/g)，同时，每2-3天增加O₂含量1％-5％，提高培养过程的O₂量到18％-20％。

2、调整好氧菌初始浓度均独立地为10⁶cfu/mL，每种菌种均以2.5％接种量接种于步骤1中的混合菌液中，培养2-3天，得到微生物共生培养菌剂。

试验例

实施例1-6中菌剂按照实施例10的制备方法得到，实施例7-9中菌剂按照实施例11的制备方法得到。

实施例1-9中的菌剂分别按照如下方式对油泥进行处理：

取油泥样5kg，含油率50％，补充3倍体积水；将微生物共生培养菌剂按照5％(v/v)加入石油油污中，搅拌混合均匀，控制温度35-37℃，处理15天左右，抽走混合物表面油层后，高速离心机油水分离，转速8000-10000r/pm，得到油，水和沙三相分离物，油回收利用，水循环使用，再向沙中补充3-5倍水，搅拌3-5分钟后离心，如此反复离心3-5次。

向上述所得沙中按3-5倍补充水，再加入1‰表面活性剂，搅拌3-5min后离心，离心机转速8000-10000r/pm，固液分离，水相循环利用，如此反复离心3-5次。检测泥土中的含油率，结果如下：

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种微生物共生培养菌剂，其特征在于，包括：假单胞菌、枯草芽孢杆菌、假丝酵母和黄单胞菌。

2.根据权利要求1所述的微生物共生培养菌剂，其特征在于，所述微生物共生培养菌剂还包括产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌或嗜麦芽寡养单胞菌中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的微生物共生培养菌剂，其特征在于，所述微生物共生培养菌剂还包括丁酸梭菌、乳酸杆菌或双歧杆菌中的至少一种。

4.权利要求1所述的微生物共生培养菌剂的制备方法，其特征在于，将目标菌种混合，进行诱导共同培养，得到微生物共生培养菌剂；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，目标菌种均独立地以2-3％的接种量接种于共同发酵培养基中，25-40℃培养2-3天，得到微生物共生培养菌剂；

所述目标菌种的初始浓度均独立地为10⁵-10⁷cfu/mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述目标菌种还包括产碱杆菌、节杆菌、巴氏醋杆菌、友好戈登氏菌、喜盐微球菌、脱氮硫杆菌、短小芽孢杆菌、亚硝化单胞菌、球形芽孢杆菌、短杆菌或嗜麦芽寡养单胞菌中的至少一种；

优选地，所述目标菌种还包括经过诱导处理的厌氧菌；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述诱导处理中在增加O₂含量时，将CO₂含量降低到0.02％-0.5％。

8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述共同发酵培养基每1L包括：牛肉膏4-6g、明胶胨15-17g、K₂SO₄ 9-11g、MgCl₂1.2-1.6g、NaCl 4-6g、红糖5-10g和溴化十六烷基三甲胺0.1-3g，pH 7.2±0.2。

9.权利要求1-3任一项所述的微生物共生培养菌剂在石油油污处理中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述石油油污包括石油污水或石油油泥。