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CN110591968A - 一种肉桂链霉菌产磷脂酶d的方法及磷脂酶d活性测定方法 - Google Patents

一种肉桂链霉菌产磷脂酶d的方法及磷脂酶d活性测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法，属于食品生物技术领域。本发明通过筛选获得一株高产磷脂酶D的链霉菌，分类命名为肉桂链霉菌SP.005，保藏编号为CCTCC M 2019558。通过对该肉桂链霉菌进行斜面、种子、发酵三级培养，并在此条件下，生产磷脂酶D酶，经酶活测定方法，其酶活可达15.66U/mL以上，最后将发酵液经分离纯化制得磷脂酶D酶粉。该生产工艺不仅有效地提高了产量，且所生产出的磷脂酶D具有较高的磷酰基转移活性，可用于进行磷脂酰丝氨酸的高效生产。

Description

一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体地涉及一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法。
背景技术
近年来，随着人口老龄化不断加剧，老年痴呆患者人数逐年增加，对于含一定效果的功能性食品的需求日益旺盛。磷脂酰丝氨酸(PS)对于老年痴呆有非常好的保健功效，但是天然的磷脂酰丝氨酸在自然界中数量极少，而磷脂酶D(PLD)作为合成PS的催化剂，是制约其实现量产的关键因素。
植物来源的PLD的酸性范围一般在5～6之间，微生物来源的PLD在4～8之间。而且，微生物来源的PLD相比于植物来源的PLD具有更强大的转酯能力与更低的底物特异性。其中，尤以源自链霉菌属的PLD的转酯能力尤为突出。上世纪70年代起，国内外许多学者开始寻找微生物源磷脂酶D，以扩大酶源。但微生物发酵周期长，酶学性质差异大，在实际生产和工业应用中存在较大困难。2013年胡飞研究表明苍白杆菌产PLD的酶活可达7.35U/mL，但受限于其微生物来源属杆菌。2015年，梁丽敏等所发表的《产磷脂酶D链霉菌发酵条件优化》表明链霉菌酶活达到3.5U/mL。微生物酶转化法具有简单、高效、可控的特点且反应温和、低碳环保，得到的产品也较为安全，是制备PLD的不二选择。但现有微生物产磷脂酶D方法周期长、产量低，难以实现工业化大规模生产。因此筛选获得高效的产PLD菌种非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明使用的菌株，是本实验室由豆油厂附近的土壤中筛选分离得到的一株可以高产磷脂酶D的链霉菌，分类命名为肉桂链霉菌SP.005，该肉桂链霉菌SP.005藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，藏编号为CCTCC M 2019558。
一种所述肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法，具体包括以下步骤：
(1)斜面培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～20g/L，琼脂15～20g/L，K2HPO4 0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得斜面培养基，将肉桂链霉菌接种到斜面培养基上，培养72h，得到斜面培养的肉桂链霉菌。
(2)种子培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～15g/L，K2HPO4 0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得种子培养基，将步骤(1)斜面培养得到的肉桂链霉菌，接种到种子培养基上进行培养。培养温度为28-32℃，摇床转速180-220rpm，培养时间2-5天，得到种子培养液。
(3)基础发酵培养：采用葡萄糖10～25g/L，酵母浸膏5～15g/L，蛋白胨10～20g/L，K2HPO4 0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.5g/L，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，于121℃条件下灭菌30min，制备基础发酵培养基，将步骤(2)得到的种子培养液接种到基础发酵培养基上培养，接种量为基础发酵培养基体积的1-3％，培养温度为28-32℃，搅拌速度为180-220rpm，通风量为0.2-0.6L/min，培养时间2-5天，获得发酵培养液。
(4)分离纯化得到磷脂酶D：将步骤(3)获得的发酵培养液进行过滤，除去肉桂链霉菌菌体，获得发酵液上清液，经超滤后除去盐和杂蛋白，再经体积浓度为25％乙醇水溶液沉淀，在6000rpm转速下离心20min，获得磷脂酶D沉淀，然后将所述磷脂酶D沉淀进行冷冻干燥，即获得磷脂酶D酶粉。
一种磷脂酶D活性测定方法，将权利要求2中磷脂酶D沉淀溶解于浓度为4mg/mL PC的乙醚溶液和浓度为0.2g/mL丝氨酸的醋酸缓冲溶液混合，于30℃、200rpm下反应4h，得到混合溶液，将混合溶液静置，取有机层进行蒸发，再将蒸发后的产物溶解于三氯甲烷和甲醇按体积比为2:1的混合液中，通过HPLC-ELSD法测定磷脂酰丝氨酸的含量。所述醋酸缓冲溶液的pH为5.5，浓度为0.02mol/L。
本发明的有益技术效果是：本发明通过菌种筛选得到一株高产磷脂酶D的肉桂链霉菌，该酶具有较高的磷酰基转移活性，可高效用于磷脂酰丝氨酸的生产。发酵结果显示，本发明利用自行筛选的肉桂链霉菌SP.005发酵生产磷脂酶D酶活可达15.66U/mL以上，可用于工业上大规模生产磷脂酰丝氨酸。
附图说明
图1为筛选各菌株酶活力图；
图2为菌株生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明保护的范围作进一步说明。
一种肉桂链霉菌，该肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)命名为SP.005，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2019558。
实施例1菌种筛选
1.平板初筛：将豆油厂附近土壤样品经处理后，以卵磷脂为底物和诱导物，以溴甲酚紫为显色剂，30℃恒温培养，菌落周围能产生白色透明圈者为磷脂酶产生的菌株，后挑取有透明圈的单菌落，斜面培养72h，进行下一步的复筛。斜面培养条件为：采用葡萄糖12g/L，酵母浸膏15g/L，蛋白胨10g/L，琼脂18g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，在121℃条件下灭菌30min。
2.摇瓶菌活检测复筛
摇瓶复筛：将平板初筛所获得的菌株进行摇瓶培养，采用葡萄糖12g/L，酵母浸膏15g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得种子培养基，将得到的斜面培养的菌株，接种到种子培养基上进行培养。其中培养温度为30℃，摇床转速200rpm，培养时间5天，得到种子培养液。接着采用葡萄糖12g/L，酵母浸膏15g/L，蛋白胨12g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，于121℃条件下灭菌30min，制备基础发酵培养基，将得到的种子培养液接种到基础发酵培养基上培养，接种量为基础发酵培养基体积的的2％，培养温度为30℃，搅拌速度为200rpm，通风量为0.4L/min，培养时间2天，获得发酵培养液。将发酵培养液放置一段时间，6000rpm离心取上清液，经超滤后除去盐和杂蛋白，再经体积浓度为25％乙醇水溶液沉淀，在6000rpm转速下离心20min，获得磷脂酶D沉淀，按照酶活力测定的方法进行酶活性测定，以筛选出磷酰基转移活性高的菌株，以用于磷脂酰丝氨酸的制备。比较酶活力的大小，最终结果如图1，菌株SP.005的酶活力为11.13U/ml，为5株中最高，后用接种针刮取菌，接入斜面培养基中培养。培养条件为28～30℃、5～8d。斜面保存。
本发明中磷脂酶D的活性测定方法是通过用发酵提取的粗酶液催化PC与丝氨酸生成PS来测定，具体方法如下：将磷脂酶D沉淀溶解于浓度为4mg/mLPC的乙醚溶液和浓度为0.2g/mL丝氨酸的醋酸缓冲溶液混合，于30℃、200rpm下反应4h，得到混合溶液，将混合溶液静置，取有机层进行蒸发，再将蒸发后的产物溶解于三氯甲烷和甲醇按体积比为2:1的混合液中，通过HPLC-ELSD法测定磷脂酰丝氨酸的含量。酶活力单位定义为30℃条件下，1min之内由PC转化成1μmol PS所需要消耗的酶量。
实施例2菌种发酵
将肉桂链霉菌在下述条件下进行发酵：
(1)斜面培养：采用葡萄糖10g/L，酵母浸膏20g/L，蛋白胨5g/L，琼脂15g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得斜面培养基，将肉桂链霉菌接种到斜面培养基上，培养72h，得到斜面培养的肉桂链霉菌。
(2)种子培养：如图2可知，该肉桂链霉菌在48h时处于生长期活菌数呈线性上升，84h之后进入稳定期。适用于进行发酵培养。采用葡萄糖10g/L，酵母浸膏20g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得种子培养基，将步骤(1)得到的斜面培养的肉桂链霉菌，接种到种子培养基上进行培养。培养温度为28℃，摇床转速180rpm，培养时间2天，得到种子培养液。
(3)基础发酵培养：采用葡萄糖10g/L，酵母浸膏15g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，于121℃条件下灭菌30min，制备基础发酵培养基，将步骤(2)得到的种子培养液接种到基础发酵培养基上培养，接种量为基础发酵培养基的1vt％，培养温度为28℃，搅拌速度为180rpm，通风量为0.2L/min，培养时间2天，获得发酵培养液。经测试，得到含有磷脂酶D的发酵液酶活15.66U/mL。
(4)分离纯化得到磷脂酶D：将步骤(3)获得的发酵培养液进行过滤，除去肉桂链霉菌菌体，获得发酵液上清液，再经截留分子量1万的超滤膜超滤除去盐和杂蛋白，再经25vt％乙醇沉淀，在6000rpm转速下离心20min，获得磷脂酶D沉淀，再将所述磷脂酶D沉淀进行冷冻干燥，即获得磷脂酶D酶粉，经酶活检测，测得酶活达463.54U/mg。
实施例3
(1)斜面培养：采用葡萄糖15g/L，酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得斜面培养基，将肉桂链霉菌接种到斜面培养基上，培养72h，得到斜面培养的肉桂链霉菌。
(2)种子培养：采用葡萄糖15g/L，酵母浸膏10g/L，蛋白胨15g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得种子培养基，将步骤(1)得到的斜面培养的肉桂链霉菌，接种到种子培养基上进行培养。培养温度为32℃，摇床转速220rpm，培养时间5天，得到种子培养液。
(3)基础发酵培养：采用葡萄糖25g/L，酵母浸膏5g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O2.5g/L，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，于121℃条件下灭菌30min，制备基础发酵培养基，将步骤(2)得到的种子培养液接种到基础发酵培养基上培养，接种量为基础发酵培养基的3vt％，培养温度为32℃，搅拌速度为220rpm，通风量为0.6L/min，培养时间5天，获得发酵培养液。
(4)分离纯化得到磷脂酶D：将步骤(3)获得的发酵培养液进行过滤，除去肉桂链霉菌菌体，获得发酵液上清液，再经截留分子量1万的超滤膜超滤除去盐和杂蛋白，再经25vt％乙醇沉淀，在6000rpm转速下离心20min，获得磷脂酶D沉淀，再将所述磷脂酶D沉淀进行冷冻干燥，即获得磷脂酶D酶粉，经酶活检测，酶活达524.72U/mg。

Claims (3)

1.一种肉桂链霉菌，该肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)为SP.005，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2019558。
2.一种如权利要求1所述肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)斜面培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～20g/L，琼脂15～20g/L，K2HPO4 0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得斜面培养基，将肉桂链霉菌接种到斜面培养基上，培养72h，得到斜面培养的肉桂链霉菌。
(2)种子培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～15g/L，K2HPO40.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得种子培养基，将步骤(1)斜面培养得到的肉桂链霉菌，接种到种子培养基上进行培养。培养温度为28-32℃，摇床转速180-220rpm，培养时间2-5天，得到种子培养液。
(3)基础发酵培养：采用葡萄糖10～25g/L，酵母浸膏5～15g/L，蛋白胨10～20g/L，K2HPO4 0.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.5g/L，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，于121℃条件下灭菌30min，制备基础发酵培养基，将步骤(2)得到的种子培养液接种到基础发酵培养基上培养，接种量为基础发酵培养基体积的1-3％，培养温度为28-32℃，搅拌速度为180-220rpm，通风量为0.2-0.6L/min，培养时间2-5天，获得发酵培养液。
(4)分离纯化得到磷脂酶D：将步骤(3)获得的发酵培养液进行过滤，除去肉桂链霉菌菌体，获得发酵液上清液，经超滤后除去盐和杂蛋白，再经体积浓度为25％乙醇水溶液沉淀，在6000rpm转速下离心20min，获得磷脂酶D沉淀，然后将所述磷脂酶D沉淀进行冷冻干燥，即获得磷脂酶D酶粉。
3.一种磷脂酶D活性测定方法，其特征在于，将权利要求2中磷脂酶D沉淀溶解于浓度为4mg/mL PC的乙醚溶液和浓度为0.2g/mL丝氨酸的醋酸缓冲溶液混合，于30℃、200rpm下反应4h，得到混合溶液，将混合溶液静置，取有机层进行蒸发，再将蒸发后的产物溶解于三氯甲烷和甲醇按体积比为2:1的混合液中，通过HPLC-ELSD法测定磷脂酰丝氨酸的含量。所述醋酸缓冲溶液的pH为5.5，浓度为0.02mol/L。
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