CN110585242A - 多系分化持续应激细胞的应用、治疗糖尿病的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明还提供一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，至少包括多系分化持续应激细胞的细胞悬液。本发明的一种治疗糖尿病的药物还可以含有药学上可接受的辅料。本发明另外还提供一种治疗糖尿病的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备及培养多系分化持续应激细胞；（2）配制多系分化持续应激细胞的细胞悬液。本发明的多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用，为糖尿病的治疗提供了新的方向。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用、治疗糖尿病的药物其及制备方法。
背景技术
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，糖尿病(血糖)一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病(Diabetes)分1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊类型的糖尿病。在糖尿病患者中，2型糖尿病所占的比例约为95%。
中国糖尿病患病人数和发病率都是世界第一，2013年JAMA杂志上的一项调查研究，有将近12%的中国成年人（约1.139亿人），患有糖尿病。中国糖尿病患病人数占全球糖尿病患的1/3（2012年，全球有超过3.71亿糖尿病患者）。2018年10月，国外知名杂志《糖尿病和代谢》发表了一份研究报告，这个研究报告的数据来源于国家疾控中心（CDC）。研究指出从2000年到2016年中国糖尿病的患病率和死亡风险增加60%。仅在2016年，就有14万人死于糖尿病。目前针对糖尿病的治疗都以对症治疗为主，患者需要终生服药。现阶段还没有任何药物可以彻底的、长效的、无副作用的治疗糖尿病。患者急需更有效的治疗方法。因此，寻找和开发新的治疗糖尿病药物具有重要的医学意义和深远的社会意义。
发明内容
本发明提供多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用、治疗糖尿病的药物其及制备方法，以解决背景技术中所提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明的实施例首先提供多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用。
进一步的，所述多系分化持续应激细胞来源于骨髓、脂肪、脐带、真皮的间充质组织。本发明中所需保护的多系分化持续应激细胞不仅限来源于骨髓、脂肪、脐带或真皮的间充质组织，本发明的实施例中使用的多系分化持续应激细胞来源于骨髓。
进一步的，所述多系分化持续应激细胞悬浮成球生长或贴壁生长。本发明的多系分化持续应激细胞表达SSEA-3，Oct3/4，Sox2，CD105，CD90，不表达CD34，CD45，CD11b。
本发明的实施例另外一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，至少包括多系分化持续应激细胞的细胞悬液。本发明的一种治疗糖尿病的药物还可以含有药学上可接受的辅料。
进一步的，所述多系分化持续应激细胞悬液的药物用量为以多系分化持续应激细胞个数计数5~10×106个/kg 体重，局部注射（鞘内注射、皮下注射，肌肉注射等）1~5次；或5~10×107个/kg 体重，静脉输注1~5次。
本发明的实施例另外还提供一种治疗糖尿病的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备及培养多系分化持续应激细胞；（2）配制多系分化持续应激细胞的细胞悬液。
具体的，本发明的步骤（1）的多系分化持续应激细胞制备方法如下：
参考文献（Kuroda， et al.， PNAS， 2010， 107:8639-8643.）公开的方法制备得到骨髓细胞，利用多系分化持续应激细胞表达SSEA-3+/CD105+/CD45- 的特性采用流式细胞分选技术对骨髓细胞进行分选，对分选出的多系分化持续应激细胞进行悬浮培养，使用a-MEM+ 0.9%MethoCult H4100 + 20%FBS培养基，培养1d 后细胞开始聚集，单个细胞聚集成团形成细胞集落，之后细胞集落又分裂生长，形成干细胞球，3-5d细胞数目逐渐增多，细胞球逐渐增大，呈现大而透亮的形态。多系分化持续应激细胞传代培养后的成球时间要比第1 代细胞明显缩短，从第2代开始，一般2d 即可形成细胞球。采用多能干细胞标记物SSEA-3、Nanog、Oct4 和Sox2 对多系分化持续应激细胞做鉴定。
采用本发明所述方法制备得到的多系分化持续应激细胞传代稳定性好，研究表明传代60代之后细胞性状仍保持稳定，体现为：一、仍能形成细胞球悬浮生长；二、和传代5代之内的MUSE细胞具有相同的镇痛效果；三、蛋白质谱分析显示和传代5代的MUSE细胞相比，在细胞因子、趋化因子和受体等多方面蛋白表达都没有统计差异。
进一步的，所述步骤（2）中的多系分化持续应激细胞的细胞悬液按以下过程进行制备：将步骤（1）培养的多系分化持续应激细胞用0.25%trypsin-EDTA进行消化制成单细胞悬液，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，得到多系分化持续应激细胞悬液。
进一步的，所述多系分化持续应激细胞悬液中多系分化持续应激细胞的细胞浓度为1~10×107 个/ml。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
（1）本发明的多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用，为临床治疗糖尿病的药物提供一种新的选择。
（2）本发明中的多系分化持续应激细胞是2010年在成人骨髓和真皮组织中新发现的一种成体干细胞，具备如下特性：1）特异性表达阶段特异性胚胎抗原3(stage specificembryonic antigen一3，SSEA3)和CDl05；2）有应激耐受力；3）单细胞能形成细胞球，具备很强的自我更新能力；4）能分化为内、中、外三个胚层的细胞，但在裸鼠体内不形成畸胎瘤。本发明发现，多系分化持续应激细胞能够有效治疗糖尿病；注射多系分化持续应激细胞可以促进糖尿病的胰岛细胞恢复并且可以降低血糖，具有极大的临床应用价值。
（3）本发明的实施例中利用链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病模型，首次证明通过局部注射或静脉注射的方式移植多系分化持续应激细胞可以长时间的显著抑制糖尿病模型小鼠的病程发展，保护损伤的胰岛细胞，降低血糖，抑制糖尿病引起的早起痛觉过敏和晚期袜套样感觉障碍。
（4）本发明所述的多系分化持续应激细胞稳定的传代特性，对要求提供大量、标准化的细胞产品来制备治疗糖尿病药物极其有利。
附图说明
图1为本发明的实施例中中人多系分化持续应激细胞（MUSE细胞）的鉴定结果图；其中，图1A为收集培养到第3代的人骨髓细胞，利用多系分化持续应激细胞SSEA-3+/CD105+的特性采用流式细胞分选技术进行分选的结果图；图1B为分选出的多系分化持续应激细胞在悬浮培养下可由分选得到的单细胞形成细胞球的图；图1C为将多系分化持续应激细胞的悬浮细胞球消化成单细胞后，进行贴壁培养时的细胞形态图。
图2为本发明的实施例中胰腺组织冰冻切片的免疫荧光染色图；其中，Anti-Insulin标记的是胰岛的β细胞，Anti-Glucagon标记的是胰岛的ɑ细胞；STZ诱导的小鼠糖尿病模型主要损害胰岛的β细胞，静脉注射Muse细胞后可以保护损伤的胰岛的β细胞。
图3为本发明的实施例中小鼠血糖检测结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1
多系分化持续应激细胞的制备
由专业医生在捐献者的髂前上棘后上方行骨髓穿刺术，抽取1ml骨髓。将骨髓与磷酸缓冲盐溶液按1∶1 混合加入到淋巴细胞分离液上层，离心后液体分为四层，最上层约占液柱的1/2，为淡红色的血浆层；第三层约占液柱的1/4，为澄清的淋巴细胞分离液层；在两层的交界处为高约5 mm 的乳白色云雾状层，为单核细胞层（此层为所要提取的细胞层）；最底层紧附试管壁，呈深红色，主要为密度较大的红细胞层。取第二层的细胞，使用含15%FBS的DMEM／F12完全培养基，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养24h 后，可见有散在单个细胞贴壁；2-3d 后贴壁细胞开始分裂增殖，由最初的圆形逐渐伸展开，细胞两极朝向不规律，形态不规则，周围有混杂细胞；4-7d 后细胞呈集落样生长，以梭形居多；1w 后细胞扁平，多突起，胞体互相融合。至第3 代后，细胞形态基本单一，呈梭形，流式细胞仪检测约有95%的细胞为CD90+/CD45-/CD11b-。收集培养到第3代的细胞，利用Muse 细胞SSEA-3+/CD105+的特性采用流式细胞分选技术进行分选，对分选出的Muse 细胞进行悬浮培养，使用a-MEM +0.9%MethoCult H4100 + 20%FBS培养基，1d 后细胞开始聚集，单个细胞聚集成团形成细胞集落，之后细胞集落又分裂生长，形成干细胞球，3-5d细胞数目逐渐增多，细胞球逐渐增大，呈现大而透亮的形态。Muse 细胞传代培养后的成球时间要比第1 代细胞明显缩短，从第2代开始，一般2d 即可形成细胞球。采用多能干细胞标记物SSEA-3、Nanog、Oct4 和Sox2 对Muse细胞做鉴定。
鉴定结果见图1，其中图1A是收集培养到第3代的人骨髓细胞，利用多系分化持续应激细胞SSEA-3+/CD105+的特性采用流式细胞分选技术进行分选的结果。该结果表明在培养的骨髓细胞中有大约0.89%的细胞是多系分化持续应激细胞。图1B是分选出的多系分化持续应激细胞在悬浮培养下可由分选得到的单细胞形成细胞球。该结果表明在多系分化持续应激细胞可以在体外大量扩增。图1C是将多系分化持续应激细胞的悬浮细胞球消化成单细胞后，进行贴壁培养时的细胞形态。该结果表明多系分化持续应激细胞也可以进行贴壁培养，且细胞形态一致。可用来做进一步的实验。
实施例2
多系分化持续应激细胞用于治疗糖尿病模型小鼠
1）链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病模型
链脲佐菌素(STZ)注射造模：STZ对一定种属胰岛Β细胞选择性的破坏，可使许多动物产生糖尿病。由于其对组织毒性较小，动物存活率高，所以是目前国内外使用较多的研究糖尿病及其慢性并发症的一种理想的动物模型。1型糖尿病与2型糖尿病动物模型的制备与STZ注射的剂量有关系：大剂量注射时，由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成1型糖尿病模型；而注射较少量STZ时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类2型糖尿病的动物模型。
链脲佐菌素配制方法：取柠檬酸(FW:210.14)2.1g加入双蒸水100mL中配成A液；取柠檬酸钠(FW:294.10)2.94g加入双蒸水100mL中配成B液。注射时先配制柠檬酸缓冲液：将A、B液按一定比例混合（1：1.32），PH计测定ph值，调节ph=4.2-4.5，即是所需配置STZ的柠檬酸缓冲液。
链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）诱导的糖尿病模型制备：STZ按最终使用浓度(空腹体重80 mg/kg)溶解，小鼠在手术平台上用异氟烷气体持续麻醉，并在1分钟内经腹腔注射完毕。共注射STZ 3次，每次间隔24小时。
2）Muse细胞移植
在注射STZ术后2周，检测小鼠的血糖值。禁食12小时后血糖值在25mmol/L以上者为造模成功（正常小鼠禁食12小时血糖值低于10mmol/L）。将Muse细胞用PBS重悬后，按照5~10×107个/kg 体重经静脉输注，在10分钟内完成。
3）小鼠胰腺组织病理学检测
小鼠用4 %甲醛溶液全身灌注后取胰腺组织。放置进装有4 %的多聚甲醛中，4 ℃条件固定过夜。然后将胰腺组织放入由0.1 M PB 所配制而成的10 %、20 %和30 %的蔗糖溶液里进行脱水后进行冰冻切片，免疫组化染色，荧光显微镜下观察。结果如图2，与注射生理盐水的模型组相比，静脉注射Muse细胞的模型组中胰腺细胞明细增加，提示移植Muse细胞可以保护损伤的胰腺细胞。
4）小鼠血糖检测
小鼠禁食12小时后，75%乙醇消毒尾巴后部，待干后剪小鼠的尾巴尖端，取自然流出的一滴血用快速血糖仪测全血中葡萄糖浓度。结果如图3，与注射生理盐水的模型组相比，静脉注射Muse细胞的模型组中血糖含量显著降低，提示移植Muse细胞可以降低血糖。由图3可知，腹腔注射Muse细胞后，可以长时间显著降低糖尿病模型小鼠的血糖值。
综上所述，静脉注射的方式移植多系分化持续应激细胞可以有效治疗糖尿病，促进损伤的胰腺组织恢复，长时间的血糖。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述多系分化持续应激细胞来源于骨髓、脂肪、脐带、真皮的间充质组织。
3.根据权利要求1所述的多系分化持续应激细胞在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述多系分化持续应激细胞悬浮成球生长或贴壁生长。
4.一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，至少包括多系分化持续应激细胞的细胞悬液。
5.根据权利要求4所述的一种治疗糖尿病的药物，其特征在于，所述多系分化持续应激细胞悬液的药物用量为以多系分化持续应激细胞个数计数5~10×106个/kg 体重，局部注射1~5次；或 5~10×107个/kg 体重，静脉输注1~5次。
6.一种根据权利要求4所述的治疗糖尿病的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备及培养多系分化持续应激细胞；（2）配制多系分化持续应激细胞的细胞悬液。
7.根据权利要求6所述的一种治疗糖尿病的药物的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的多系分化持续应激细胞的细胞悬液按以下过程进行制备：将步骤（1）培养的多系分化持续应激细胞用0.25%trypsin-EDTA进行消化制成单细胞悬液，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，得到多系分化持续应激细胞悬液。
8.根据权利要求6所述的一种治疗糖尿病的药物的制备方法，其特征在于，所述多系分化持续应激细胞悬液中多系分化持续应激细胞的细胞浓度为1~10×107 个/ml。
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