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CN110583762B - 一种抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂及使用方法和用途 - Google Patents

一种抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂及使用方法和用途 Download PDF

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CN110583762B CN201910739505.2A CN201910739505A CN110583762B CN 110583762 B CN110583762 B CN 110583762B CN 201910739505 A CN201910739505 A CN 201910739505A CN 110583762 B CN110583762 B CN 110583762B
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Abstract

本发明涉及一种抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂，制备步骤如下：利用25％(w/w)苹果渣复合培养基诱导一种或几种微生物发酵产生果实细胞壁多糖水解酶组合物，于10‑50℃条件下利用该水解酶组合物处理特定苹果渣废弃物，然后加入95％乙醇，于4℃条件下放置过夜，离心后蒸馏旋转或者真空冷冻浓缩得到目标保鲜剂，产物的质量浓度不低于4％。本保鲜剂施用后可以明显抑制果实的软化且对于番茄果实软化的抑制率达到65％；同时减缓可溶性固形物生成，随贮藏期不同减缓效率15％‑35％。此外，该保鲜剂施用后可以加速果实伤口的自我愈合能力，直接或间接减少果实机械损害，延长果实货架期。

Description

一种抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂及使用 方法和用途
技术领域
本发明属于保鲜技术领域，尤其是一种抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂及使用方法和用途。
背景技术
果实成熟是指果实充分发育并出现其特有色、香、味和质地的阶段，然而果实成熟也是果实软化显著增加的过程。果实采后软化过程不利于果实的运输与贮藏，采后软化过程会加速营养成分流失，使果实口感和风味变差，严重地影响其经济价值；同时，采后软化过程往往伴随机械损伤以及病理性腐烂，严重影响了一些不耐贮藏水果的流通和商品价值。
目前，为了减少质量损失，延缓成熟和软化，生产者通常在商业化成熟期左右，甚至更早采摘果实。过早采摘果实虽然不影响果实采后的着色过程，但严重抑制果实风味物质形成，采收过早的果实糖酸比较低，干物质含量较低，口感差。因此，如何控制果实采后软化过程，成为减缓果实口感和风味变差、减少机械损伤以及病理性腐烂的关键技术难题。
果胶、纤维素和半纤维素等是果细胞壁的主要组成成分，在植物内源水解酶的作用下容易降解，造成细胞壁的破坏，导致果实软化。原果胶是果胶的主要组成成分，随着贮藏时间的延长，由不溶状态转变为可溶状态，造成细胞的损伤和硬度下降。纤维素由葡萄糖聚合而成，含有氢键，使果实具有一定硬度。半纤维素是存在于纤维素分子中的多聚糖。果胶、纤维素和半纤维素在果实成熟软化过程中会分别水解为寡聚半乳糖醛酸、纤维素寡糖、和木葡寡糖等小分子，反馈调节果实细胞壁的降解过程，进而影响果实软化进程。
通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
一种提高樱桃果实硬度的方法(CN103999700B)，具体涉及一种提高樱桃果实硬度的处理方法，本发明所述的方法是在樱桃果实的发育期间，喷施复合生长调节制剂1-2次，使其果实在生长发育成熟的同时，保持较高的硬度，达到成熟果实的硬度提高的目的。实验证明，本发明所述的方法可以达到显著提高果实硬度，且不影响果实，无任何残留的作用效果。此方法安全，实用，可以用于樱桃生产中。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。上述专利公开文献所述复合生长调节制剂为赤霉素、氯化钙和硼砂的混合溶液；所述赤霉素的浓度为20-100mg/L；所述氯化钙的质量浓度为0.1-0.5％；所述硼砂的质量浓度为0.1-0.3％。本发明所属内容为果胶、纤维素和半纤维素等果实细胞壁组分部分水解而成的寡聚糖复合物。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种能够抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂及使用方法和用途，该保鲜剂是基于果实细胞壁水解产物能够触发果实生理以及病理响应，具有抑制果实软化进程、促进果实机械损伤愈合和减轻机械损伤次生危害的贮藏保鲜功效。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物，制备步骤如下：
⑴将扩展青霉、意大利青霉、指状青霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、米曲霉、稻瘟菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰孢菌、白粉病菌、壳针孢叶枯菌、炭疽病菌和酵母菌以单一或者组合的方式接种到添加25％(w/w)苹果渣复合培养基中，于4-45℃条件下进行培养0至120小时；
其中，所述25％(w/w)苹果渣复合培养基的制备方法为：称取苹果榨汁后的加工副产物苹果渣加入水、植物细胞壁组分多糖和无机氮源，苹果榨汁后的加工副产物苹果渣：水：植物细胞壁组分多糖：无机氮源的质量比为1：3：0-0.1：0-0.1，置于90-121℃下灭菌20分钟待用；
⑵将发酵液离心，收集上清，再用质量浓度10％-90％的饱和硫酸铵进行盐析，低温-10℃-+10℃放置过夜后于低温离心，即4℃和4000-9000g条件下离心30分钟，弃去上清，用pH＝6.5的磷酸缓冲液溶解沉淀得到蛋白；
⑶最后，将该蛋白置于pH＝6.5的磷酸缓冲液中并使用3500Da纤维素透析袋透析24小时，期间换液3次，即得到能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物；
或者，将离心后的上清溶液打入喷雾干燥塔喷粉，塔内温度180℃，出风温度85℃，在塔底得到蛋白酶组合物。
如上所述的能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物在直接用于增强果实系统抗病能力，防止果实被坏死性真菌感染方面中的应用。
如上所述的能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物在用于处理食品加工废弃物，使处理后的废弃物中含有高活性果实机械损伤愈合促进因子方面中的应用。
而且，所述食品加工废弃物为苹果渣、柚子皮渣、柠檬皮渣或柑橘皮渣。
一种利用如上所述的能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物制备抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂，制备步骤如下：
用能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物，于10-50℃条件下水解高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣，该苹果渣的质量浓度为0.5％-10％w/v，蛋白酶组合物：苹果渣的体积比为1：0.1-10，然后加入1-5倍体积的95％乙醇，于4℃条件下放置过夜，4℃条件下4000-9000g离心20分钟，收集上清液；
将上清液于60℃，20r/min条件下蒸馏旋转直至旋干或者真空冷冻浓缩，最后用去离子水溶解沉淀，得到目标保鲜剂，且产物的质量浓度不低于4％。
而且，所述高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣的制备方法为：
①将苹果渣迅速加热至60-100℃后，保持15分钟；
②用4％(w/v)的NaOH 50％(v/v)乙醇混合溶液漂洗苹果渣2～6小时，取滤渣；
③加入10-50％乙醇三氟乙酸溶液，其pH＝1.5，室温下搅拌30分钟，抽滤后用温水继续漂洗苹果渣至水为无色或中性为止；
④滤渣用流化床干燥机干燥至恒重，粉碎，即得高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣。
如上所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在抑制采后易软化果实硬度的变化、减缓可溶性固形物生成方面中的应用。
如上所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在促进果实机械损伤愈合、减轻果实机械损伤次生危害方面中的应用。
而且，所述保鲜剂于番茄果实中施用后可以有效缩短番茄果实机械损伤伤口的愈合时间至12小时以内，以病原菌侵染成功率低于10％为伤口有效愈合的表征。
而且，所述保鲜剂于番茄果实中施用后的下游作用靶标为果胶酶编码基因SlPG或扩展蛋白编码基因SlEXP。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本生物源寡糖保鲜剂是基于果实细胞壁水解产物能够触发果实生理、以及病理响应，具有抑制果实软化进程、促进果实机械损伤愈合、减轻机械损伤次生危害的贮藏保鲜功效。该保鲜剂的活性成分包括果胶降解寡糖、纤维素降解寡糖和半纤维素降解寡糖的一种或几种组合。本发明保鲜剂可以有效控制果实采后软化过程，直接或间接减少机械损伤以及病理性腐烂。
2、本发明利用苹果渣废弃物制备促果实机械损伤愈合保鲜剂，其制备方法是通过微生物源水解酶组合物酶解高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣，进一步采用醇沉法即能获得一种能够抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂。
3、本发明高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣价格低廉、易于获取，且含有高活性果实机械损伤诱抗因子，制备高效；以该底物制备寡糖保鲜剂具有反应重复性好、条件温和、产物分离纯化过程简单、所得到的寡糖品质优良等特点。
4、本发明中将扩展青霉、意大利青霉、指状青霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、米曲霉、稻瘟菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰孢菌、白粉病菌、壳针孢叶枯菌、炭疽病菌和酵母菌以单一或者组合的方式进行发酵，建立了分离、制备和诱导增产其孢外活性分泌蛋白的方法，所述微生物为微生物源活性蛋白生产菌株，发酵培养基为25％(w/v)苹果渣复合培养基。其中，苹果渣培养基本身即具有诱导所属微生物高产孢外活性蛋白的能力。同时，为增加所述微生物孢外活性蛋白的含量，培养过程中选择性添加果胶、纤维素或半纤维素等植物细胞壁多糖，硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠等无机氮源，对所述微生物孢外分泌蛋白进行诱导，以增加其产量。
5、本发明一种能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物可以具有如下的用途：
①该多糖水解酶组合物可以直接用于增强果实系统抗病能力，防止果实被灰霉病等坏死性真菌感染；
②该多糖水解酶组合物可以用于处理苹果渣、柑橘皮渣等食品加工废弃物，处理后的废弃物中含有高活性果实机械损伤愈合促进因子，即一种减轻果实机械损伤次生危害的保鲜剂。
6、本发明保鲜剂能够抑制番茄果实的软化和减缓可溶性固形物生成，该保鲜剂施用后可以明显抑制番茄果实的软化，抑制率达到65％。同时减缓可溶性固形物生成，随贮藏期不同减缓效率为15％-35％。
7、本发明保鲜剂能够促进果实机械损伤愈合和减轻果实机械损伤次生危害，该保鲜剂施用后可以加速果实伤口的自我愈合能力，将愈合时间缩短至12小时以内。通常病原真菌的孢子萌发时间为18至24小时，该保鲜剂缩短果实伤口愈合时间可以有效避免病原菌侵染情况的发生，显著减少因机械损伤而给鲜活果实带来的损失。同时，该保鲜剂施用后显著增加伤口处的活性氧含量，且远远高于空白对照组。此外，该保鲜剂施用后苯丙氨酸解氨酶活性显著增高。
8、本发明保鲜剂在施用后可以抑制番茄果实软化的主要下游作用靶标为果胶酶编码基因SlPG2和扩展蛋白编码基因SlEXP1。
附图说明
图1为本发明中基于岛津高效液相色谱系统示差折光检测器RID-20A的苹果渣水解产物谱图；
图2为本发明中苹果渣复合培养基中多糖水解酶组合物含量与果胶酶活性图；
图3为本发明中可诱导性微生物源多糖水解酶组合物对番茄果实系统抗病能力的影响图；
图4为本发明中果实机械损伤愈合保鲜剂(PRP组)对番茄(S.lycopersicum)果实采后硬度的影响图；
图5为本发明中果实机械损伤愈合保鲜剂(PRP组)对番茄果实(S.lycopersicum)中可溶性固形物的影响图；
图6为本发明中果实机械损伤愈合保鲜剂(PRP组)对番茄果实(S.lycopersicum)果胶酶编码基因表达量的影响图；其中，PG：多聚半乳糖醛酸酶、PG1：多聚半乳糖醛酸酶1、PG2：多聚半乳糖醛酸酶2、EXP1：扩张蛋白2、PL8：果胶裂解酶8、CEL2：纤维素酶2、PME1：果胶甲酯酶1、PME2：果胶甲酯酶2、PME3：果胶甲酯酶3、PME31：果胶甲酯酶31)；
图7为本发明中果实机械损伤愈合保鲜剂(PRP组)对番茄果实(S.lycopersicum)伤口自愈的影响图；
图8为本发明中果实机械损伤愈合保鲜剂(PRP组)对番茄果实(S.lycopersicum)伤口处活性氧含量和PAL酶活性的影响图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物，制备步骤如下：
⑴将扩展青霉、意大利青霉、指状青霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、米曲霉、稻瘟菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰孢菌、白粉病菌、壳针孢叶枯菌、炭疽病菌和酵母菌以单一或者组合的方式接种到添加25％(w/w)苹果渣复合培养基中，于4-45℃条件下进行培养0至120小时；
其中，所述25％(w/w)苹果渣复合培养基的制备方法为：称取苹果榨汁后的加工副产物苹果渣加入水、植物细胞壁组分多糖和无机氮源，苹果榨汁后的加工副产物苹果渣：水：植物细胞壁组分多糖：无机氮源的质量比为1：3：0-0.1：0-0.1，置于90-121℃下灭菌20分钟待用；
⑵将发酵液离心，收集上清，再用质量浓度10％-90％的饱和硫酸铵进行盐析，低温-10℃-+10℃放置过夜后于低温离心，即4℃和4000-9000g条件下离心30分钟，弃去上清，用pH＝6.5的磷酸缓冲液溶解沉淀得到蛋白；
⑶最后，将该蛋白置于pH＝6.5的磷酸缓冲液中并使用3500Da纤维素透析袋透析24小时，期间换液3次，即得到能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物；
或者，将离心后的上清溶液打入喷雾干燥塔喷粉，塔内温度180℃，出风温度85℃，在塔底得到蛋白酶组合物。
如上所述的能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物在直接用于增强果实系统抗病能力，防止果实被坏死性真菌感染方面中的应用。
如上所述的能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物在用于处理食品加工废弃物，使处理后的废弃物中含有高活性果实机械损伤愈合促进因子方面中的应用。
较优地，所述食品加工废弃物为苹果渣、柚子皮渣、柠檬皮渣或柑橘皮渣。
一种利用如上所述的能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物制备抑制果实软化和减轻果实机械损伤危害的寡糖保鲜剂，制备步骤如下：
用能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物，于10-50℃条件下水解高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣，该苹果渣的质量浓度为0.5％-10％w/v，蛋白酶组合物：苹果渣的体积比为1：0.1-10，然后加入1-5倍体积的95％乙醇，于4℃条件下放置过夜，4℃条件下4000-9000g离心20分钟，收集上清液；
将上清液于60℃，20r/min条件下蒸馏旋转直至旋干或者真空冷冻浓缩，最后用去离子水溶解沉淀，得到目标保鲜剂，且产物的质量浓度不低于4％。
较优地，所述高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣的制备方法为：
①将苹果渣迅速加热至60-100℃后，保持15分钟；
②用4％(w/v)的NaOH 50％(v/v)乙醇混合溶液漂洗苹果渣2～6小时，取滤渣；
③加入10-50％乙醇三氟乙酸溶液，其pH＝1.5，室温下搅拌30分钟，抽滤后用温水继续漂洗苹果渣至水为无色或中性为止；
④滤渣用流化床干燥机干燥至恒重，粉碎，即得高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣。
如上所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在抑制采后易软化果实硬度的变化、减缓可溶性固形物生成方面中的应用。所述保鲜剂于番茄果实中施用后可以抑制番茄果实软化进程并减缓可溶性固形物生成速率。
如上所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在促进果实机械损伤愈合、减轻果实机械损伤次生危害方面中的应用。
较优地，所述保鲜剂于番茄果实中施用后可以有效缩短番茄果实机械损伤伤口的愈合时间至12小时以内，以病原菌侵染成功率低于10％为伤口有效愈合的表征。
较优地，所述保鲜剂于番茄果实中施用后的下游作用靶标为果胶酶编码基因SlPG或扩展蛋白编码基因SlEXP。
本发明中更为具体的实施例如下：
实施例1：苹果渣源植物细胞壁多糖酶解寡聚糖复合物的制备与应用
A.利用苹果渣废弃物制备促果实机械损伤愈合保鲜剂的制备
通过酶解醇沉法制备促果实机械损伤愈合保鲜剂。用10mL微生物源多糖水解酶复合物水解50mL苹果渣(0.5％-10％w/v)(水浴，37℃)后，加入1-5倍体积的95％乙醇，于4℃条件下放置过夜。4000-9000g条件下离心20分钟(4℃)，收集上清液。将上清液于60℃，20r/min条件下蒸馏旋转直至旋干或者真空冷冻浓缩，最后用去离子水溶解沉淀，得到目标保鲜剂，且产物的浓度不低于4％(w/v)。利用岛津高效液相色谱系统示差折光检测器RID-20A对目标产物进行检测(柱温：40℃，泵B流速：0.6ml/min，流动相：纯水，凝胶色谱柱：100-5K寡糖柱UltrahydrogelTM DP 120A:WAT011550(7.8×300mm Column)与1K-80K寡糖柱UltrahydrogelTM 250:WAT011525(7.8×300mm Column)并联，保护柱选用UltrahydrogelTMDP:WAT011570(6×40mm Guard Column))，所得保鲜剂组分见图1。图1表示目标物的保留时间分别为23.808分钟(占比低于1.5％)，26.885(占比53.56％)，27.827分钟(占比低于1.5％)，28.416分钟(占比低于1.5％)，30.603(占比6.57％)，31.894(占比37.26％)39.442分钟(占比低于1.5％)。图1表明该保鲜剂的活性成分为其中的一种组分或几种组分组合，类别包括果胶降解寡糖、纤维素降解寡糖和半纤维素降解寡糖的一种或着组合。
B.高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣的制备
①利用恒温箱将榨之后的苹果渣迅速加热至60-100℃后，保持15分钟。②用4％(w/v)的NaOH/50％(v/v)乙醇混合溶液漂洗苹果渣2至6小时，取滤渣。③加入100mL 10-50％乙醇三氟乙酸溶液(pH＝1.5)，室温下搅拌30分钟，抽滤后用温水继续漂洗苹果渣至水为无色或中性为止。④滤渣用流化床干燥机干燥至恒重，粉碎，备用。该方法可以高效制备高活性果实机械损伤诱抗因子。
C.一种能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物的制备
将扩展青霉、意大利青霉、指状青霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、米曲霉、稻瘟菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰孢菌、白粉病菌、壳针孢叶枯菌、炭疽病菌和酵母菌以单一或者组合的方式接种到添加25％(w/w)苹果渣复合培养基(苹果渣复合培养基组成：称取鲜榨汁后的苹果渣25g加入75mL水，置于121℃下灭菌20分钟待用)中，于4-45℃条件下进行培养，4000-9000g条件下离心20分钟(4℃)收集上清，用质量浓度10％-90％的饱和硫酸铵进行盐析，-10℃-+10℃放置过夜后于4000-9000g条件下离心30分钟(4℃)，弃去上清，用pH＝6.5的磷酸缓冲液溶解沉淀得到酶液。最后，将活性蛋白置于pH＝6.5的磷酸缓冲液中透析(3500Da纤维素透析袋)24小时，期间换液3次，即得其孢外活性分泌蛋白。
为增加能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物的浓度，培养过程中可选择性添加鲜榨汁后的苹果渣质量0.1％-10％果胶、纤维素或半纤维素等植物细胞壁组分多糖，对多糖水解酶复合物进行诱导，以增加其产量。不同浓度果胶添加物诱导增加果胶酶含量的结果见图2，蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，用不同浓度牛血清蛋白(BSA)建立标准曲线。图2表明随外源添加果胶浓度的提高，多糖水解酶组合物水解果胶的能力随之提高，表现在单位浓度酶活力的提升或者总的所属微生物孢外分泌蛋白质中果胶水解酶含量提高。
D能够水解纤维素、果胶或半纤维素的蛋白酶组合物对番茄果实系统抗病能力的 影响
用无菌钻孔器在番茄果实表面制造深2毫米、直径5毫米的伤口，将50微升所述多糖水解酶复合物添加到伤口表面，采用无菌蒸馏水进行空白对照，在接种诱导48小时后，在距离最初伤口约1/4距离处的第二个伤口中，接入30μl的灰霉孢子悬浮液(5×104孢子ml-1)。在90-95％相对湿度和25℃条件下储存36和48小时，分别测量感染伤口的发病率和病斑直径。
结果见图3，图3表明培养过程中选择性添加果胶、纤维素或半纤维素等植物细胞壁多糖，除了增加所述水解酶复合物占比以外，该活性蛋白可以有效增强番茄果实的抗病能力。图3也表明该水解酶复合物分泌蛋白包括纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等水解蛋白的一种或几种。
实施例2：果实生理学实验
A.果实机械损伤愈合保鲜剂减缓番茄(S.lycopersicum)果实采后硬度的下降速 率
用无菌钻孔器钻取一小块圆柱形的番茄组织，在番茄表面造成伤口，深度2mm，直径5mm。番茄数个，每个番茄先打一个孔，在孔上方标上48小时，加50μL本发明寡糖保鲜剂，用保鲜膜包好，放入培养箱中。于0、2、4、6天后用手持硬度计测量果实硬度。各个时间段每组拿出两个番茄用于硬度的测量。
结果如图4所示，图4表示诱导2、4和6天后番茄果实硬度变化情况，寡糖保鲜剂处理组可以明显抑制果实软化，抑制率达到65％。报告了平均±SE的值(n＝12)，ANOVA检验表示用果实机械损伤愈合保鲜剂处理的果实与对照组之间统计学显著差异(P小于0.05)。
B.果实机械损伤愈合保鲜剂减缓番茄(S.lycopersicum)可溶性固形物的生成速 率
番茄的处理同上述硬度的测定，于0、2、4、6天取番茄测定番茄糖度。称取番茄组织各2.0g放入研钵中研磨成匀浆，经过离心后取上清液进行测定。测定前先用蒸馏水清洗镜面使读数为0，用柔软绒布擦净折光镜面后吸取适量上清液进行测定，每个样品做3个平行。
结果见图5，图5表示空白对照组含糖量最高，果实机械损伤愈合保鲜剂处理组的升高幅度最低，推测果实机械损伤愈合保鲜剂可能会诱导抑制某些大分子碳水化合物的分解。诱导2天后，空白对照组的含糖量最高，果实机械损伤愈合保鲜剂组含糖量最低。诱导6天后，空白对照组数值最高。报告了平均±SE的值(n＝3)，ANOVA检验表示用果实机械损伤愈合保鲜剂处理的果实与对照组之间统计学显著差异(P小于0.05)。
C.果实机械损伤愈合保鲜剂对番茄(S.lycopersicum)果实中果胶降解相关基因 表达的影响
将番茄果实分为两组，机械损伤组、果实机械损伤愈合保鲜剂处理组，对番茄果实机械损伤后，加入30μL本发明寡糖保鲜剂诱导，诱导0、3、6、12、24小时后取样，提取番茄组织总RNA、RNA纯度与浓度检测、第一条cDNA链的合成、荧光定量PCR的方法参考实验操作手册。
结果如图6所示，图6表示果实机械损伤愈合保鲜剂处理组果胶酶编码基因SlPG2和扩展蛋白编码基因SlEXP1表达量显著受到抑制，而未处理的机械损伤对照组中SlPG2和SlEXP1的表达量较高，表明果胶酶编码基因SlPG2和扩展蛋白编码基因SlEXP1是果实机械损伤愈合保鲜剂的靶点。报告了平均±SE的值(n＝3)，ANOVA检验表示用果实机械损伤愈合保鲜剂处理的果实与对照组之间统计学显著差异(P小于0.05)。
实施例3：采后病理学及果实生理生化实验
A.果实机械损伤愈合保鲜剂促进番茄(S.lycopersicum)果实伤口自愈
以番茄果实伤口处的采后病理学发病情况来表示番茄果实的伤口愈合能力。
用无菌钻孔器钻取一小块圆柱形的番茄组织，在番茄表面造成伤口，深度2mm，直径5mm。番茄数个，每个番茄先打一个孔，在孔上方标上24小时，加50μL本发明寡糖保鲜剂，用保鲜膜包好，放入培养箱中。隔12小时后，拿出番茄，每个番茄再打一个孔，在孔上方标上12小时，加50μL本发明寡糖保鲜剂，用保鲜膜封好放入培养箱中。再隔6小时后，拿出番茄，每个番茄再打一个孔，在孔上方标上6小时，加50μL对应的试剂，用保鲜膜封好放入培养箱中。再隔3小时后，拿出番茄，每个番茄再打一个孔，在孔上方标上3小时，加50μL对应的试剂，用保鲜膜封好放入培养箱中。再隔3小时后，拿出番茄，每个番茄再打一个孔，在孔上方标上0小时，加50μL对应的试剂，所有番茄所有孔都加30μL配好的灰霉孢子菌悬液(104–106spores/mL)。相临两个孔之间的距离相等。
将四筐番茄放入培养箱中，25℃，90％-95％相对湿度培养，培养24、36、48小时后分别测定病斑直径，并且计算发病率。
结果见图7，图7表示番茄果实自身具有伤口愈合能力，但愈合时间超过24小时，该时间点有高达37.5％的伤口会被病原菌所感染。果实机械损伤愈合保鲜剂处理组可以加速果实伤口的自我愈合能力，将愈合时间缩短至12小时以内(以病原菌侵染成功率低于10％为伤口有效愈合的表征)。24小时后，处理组无果实伤口被病原菌感染情况发生。通常病原真菌的孢子萌发时间为18至24小时，缩短果实伤口愈合时间可以有效避免病原菌侵染情况的发生，果实机械损伤愈合保鲜剂的应用可在一定程度上减少因机械损伤而给鲜活果实带来的损失。报告了平均±SE的值(n＝12)，ANOVA检验表示用果实机械损伤愈合保鲜剂处理的果实与对照组之间统计学显著差异(P小于0.05)。
B.果实机械损伤愈合保鲜剂促进番茄(S.lycopersicum)果实伤口原位活性氧含 量累积
果实伤口原位活性氧含量采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)法测定。
取3.5g番茄于提前用锡箔纸包住的10mL离心管中，加5mL 20μM的H2DCFDA(溶于0.2％二甲基亚砜)，注意避光。用封口膜封住管口，30℃水浴一小时，吸净液体，加5mL(pH，7.0)的PBS清洗，吸净PBS，将番茄倒入研钵中避光研磨成匀浆，将匀浆倒入20mL离心管中，1000r/min离心5分钟，吸取上清。吸取2mL上清和6mL的PBS于新的10mL离心管中，每个样品做3个平行，于530nm测吸收光。
结果见图8，图8表示果实机械损伤愈合保鲜剂处理组活性氧增加最显著，且远远高于其他三组。证明诱导足够时间后，果实机械损伤愈合保鲜剂处理组能够使活性氧含量增加，从而增强果实伤口自我愈合能力。报告了平均±SE的值(n＝3)，ANOVA检验表示用果实机械损伤愈合保鲜剂处理的果实与对照组之间统计学显著差异(P小于0.05)。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (6)

1.一种利用包含纤维素酶、果胶酶或半纤维素酶的酶组合物制备抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂，其特征在于：制备步骤如下：
用包含纤维素酶、果胶酶或半纤维素酶的酶组合物，于10-50℃条件下水解高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣，该苹果渣的质量浓度为0.5％-10％w/v，蛋白酶组合物：苹果渣的体积比为1：0.1-10，然后加入1-5倍体积的95％乙醇，于4℃条件下放置过夜，4℃条件下4000-9000g离心20分钟，收集上清液；
将上清液于60℃，20r/min条件下蒸馏旋转直至旋干或者真空冷冻浓缩，最后用去离子水溶解沉淀，得到目标保鲜剂，且产物的质量浓度不低于4％；
所述包含纤维素酶、果胶酶或半纤维素酶的酶组合物，其特征在于：制备步骤如下：
⑴将扩展青霉、意大利青霉、指状青霉、灰葡萄孢菌、黑曲霉、米曲霉、稻瘟菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰孢菌、白粉病菌、壳针孢叶枯菌、炭疽病菌和酵母菌以单一或者组合的方式接种到添加25％(w/w)苹果渣复合培养基中，于4-45℃条件下进行培养0至120小时，其中培养时间取值不为0；
其中，所述25％(w/w)苹果渣复合培养基的制备方法为：称取苹果榨汁后的加工副产物苹果渣加入水、植物细胞壁组分多糖和无机氮源，苹果榨汁后的加工副产物苹果渣：水：植物细胞壁组分多糖：无机氮源的质量比为1：3：0-0.1：0-0.1，置于90-121℃下灭菌20分钟待用；
⑵将发酵液离心，收集上清，再用质量浓度10％-90％的饱和硫酸铵进行盐析，低温-10℃-+10℃放置过夜后于低温离心，即4℃和4000-9000g条件下离心30分钟，弃去上清，用pH＝6.5的磷酸缓冲液溶解沉淀得到蛋白；
⑶最后，将该蛋白置于pH＝6.5的磷酸缓冲液中并使用3500Da纤维素透析袋透析24小时，期间换液3次，即得到包含纤维素酶、果胶酶或半纤维素酶的酶组合物；
或者，将离心后的上清溶液打入喷雾干燥塔喷粉，塔内温度180℃，出风温度85℃，在塔底得到酶组合物。
2.根据权利要求1所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂，其特征在于：所述高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣的制备方法为：
①将苹果渣迅速加热至60-100℃后，保持15分钟；
②用4％(w/v)的NaOH 、 50％(v/v)乙醇混合溶液漂洗苹果渣2～6小时，取滤渣；
③加入10-50％乙醇三氟乙酸溶液，其pH＝1.5，室温下搅拌30分钟，抽滤后用温水继续漂洗苹果渣至水为无色或中性为止；
④滤渣用流化床干燥机干燥至恒重，粉碎，即得高果胶、纤维素和半纤维素含量苹果渣。
3.如权利要求1所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在抑制采后易软化果实硬度的变化、减缓可溶性固形物生成方面中的应用。
4.如权利要求1所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在促进果实机械损伤愈合、减轻果实机械损伤次生危害方面中的应用。
5.根据权利要求4所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在促进果实机械损伤愈合、减轻机械损伤次生危害方面中的应用，其特征在于：所述保鲜剂于番茄果实中施用后可以有效缩短番茄果实机械损伤伤口的愈合时间至12小时以内，以病原菌侵染成功率低于10％为伤口有效愈合的表征。
6.根据权利要求4或5所述的抑制果实软化和减轻机械损伤危害的寡糖保鲜剂在促进果实机械损伤愈合、减轻机械损伤次生危害方面中的应用，其特征在于：所述保鲜剂于番茄果实中施用后的下游作用靶标为果胶酶编码基因SlPG2或扩展蛋白编码基因SlEXP1。
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