CN110579614A - 消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，属于免疫分析技术领域。本发明的技术方案是：化学发光法样品稀释液中含有含有纤溶酶，在进行磁颗粒化学发光法测定中不受纤维蛋白的干扰，特别是肾衰患者，消除了高浓度的纤维蛋白造成磁颗粒化学发光法反应、磁颗粒分离和洗涤不完全等造成的测定偏差，其使用方法和范围与原有的化学发光法相同，不会增加实验人员的负担，经济方便易行，是一种准确性更高的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种应用纤溶酶消除化学发光法干扰的试剂盒配方。
背景技术
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术，化学发光具有荧光的特异性，不需要激发光，避免了荧光分析中激发光杂散光的影响从而提高了灵敏度，是一种实验室常用的定量分析方法。
用于化学发光免疫分析的磁珠种类很多，有磁性琼脂糖微球，磁性二氧化硅微球，磁性聚丙烯酰胺/聚丙烯酸类高分子微球，磁性聚苯乙烯微球等，这些微球颗粒具有亲水性强，温和的条件容易洗脱，不至于引起酶失活或蛋白质变性等特性。
肾脏疾病包括肾炎、肾病综合征以及各种病因引起的继发性肾性改变等。当肾功能不全和衰竭时出现低蛋白血症、血液浓缩、血液黏滞度增加等改变，再加上激素和利尿剂的使用，使血液处于高凝状态，表现为血浆纤维蛋白原(Fbg)水平的升高。当血液离心分离进行化学发光法测定时，血清呈胶冻状，与化学发光法试剂中磁颗粒形成包裹颗粒状，影响化学发光法反应、分离和洗涤而造成结果出现较大偏差。
纤溶酶(plasmin)是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，是一条含 790个氨基酸残基的肽链，N末端为谷氨酸。激活后的纤溶酶形成两条由两对二硫键连结的肽链。轻链为原肽链的 C端部分，共含 230个氨基酸残基，其结构类似于胰蛋白酶，酶的活性部位即位于轻链。重链的N末端为赖氨酸或缬氨酸，C末端即为激活时肽键裂解处的精氨酸。此重链部分的结构与凝血酶原N端的A及S-肽段非常类似，系由5个相似环状结构组成，纤溶酶在逐步降解纤维蛋白时，释放出5个相应的降解碎片A、B、C、D、E。A、B、C为小分子，D、E为大分子。D、E两片段的分子量分别为80000及 48000。片段D以克分子量计算约是片段E的二倍，此外还可得到分子量更大的中间体"X"及"Y"片段。由此推测纤维蛋白的降解过程大致如下:纤维蛋白降解成"X"片段，并释放出小分子片段"A"及"B"，后者分别相当于纤维蛋白β肽链的N端部分约40-50氨基酸残基及α肽链C末端的松散部分。"X"片段再进一步降解为"D"及"Y"片段，D片段相当于纤维蛋白单体的C端主体，而E片段则相当于纤维蛋白单体的中间主体部分，包括二硫键节的结构，"C"片段为连接纤维蛋白N端与C端二主体部位的中间螺旋区结构。
为解决目前磁颗粒化学发光法测定中，由于肾功能不全造成血清纤维蛋白原磁颗粒形成包裹颗粒状，影响化学发光法反应、分离和洗涤等造成结果出现较大偏差的问题，本发明设计了在试剂稀释液中加入纤溶酶，应用纤溶酶降解纤维蛋白原形成可溶性的反应体系，利于化学发光法反应、磁颗粒分离和洗涤，也不干扰正常人群测定。
本发明与现有技术相比有如下优点：本发明配制的样品稀释液中含有纤溶酶，在进行磁颗粒化学发光法测定中不受血清中内源性纤维蛋白含量的干扰，特别是肾衰患者，由于高浓度的纤维蛋白造成磁颗粒化学发光法反应、磁颗粒分离和洗涤不完全，造成磁颗粒化学发光法出现较大偏差，本发明方法能够消除磁颗粒化学发光法纤维蛋白原的干扰，其使用方法和范围与原有的化学发光法相同，不会增加实验人员的负担，经济方便易行，是一种准确性更高的检测方法。
具体实施方式：
下面通过采用安图A2000PLUS化学发光分析仪测定甲状旁腺素实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
试剂的组成：
a. 甲状旁腺素试剂为郑州安图生物工程股份有限公司配套试剂，采用双抗体夹心法原理进行检测，用甲状旁腺素抗体包被磁微粒，辣根过氧化物酶标记甲状旁腺素抗体制备酶结合物，通过免疫反应形成抗体-抗原-抗体-酶复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与甲状旁腺素的含量成正比。
b.样品稀释液为本发明配置稀释液，每升Tris-HCl 缓冲液内含Tris150 mmol(pH6.0)溶解8000U纤溶酶，200µl Proclin-300防腐剂，纤溶酶的在反应体系中终浓度为≥7800U/L。
实施例2
试剂的组成：
a. 甲状旁腺素试剂为郑州安图生物工程股份有限公司配套试剂。
b.样品稀释液为郑州安图生物工程股份有限公司配套试剂。
实施例3
1.检测对象：肾衰患者10例，男性5例，平均年龄38.5岁；女性5例，平均年龄34.5岁；健康体检者10例，其中男性5例，平均年龄44.5岁；女性5例，平均年龄36.5岁。
2.方法：采用实施例1和实施例2分别测定肾衰患者甲状旁腺素和健康体检者甲状旁腺素水平，比较肾衰患者和健康体检者甲状旁腺素水平；采用实施例1和实施例2分别在采血后放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0小时测定肾衰患者甲状旁腺素高值（439.85pg/ml) 和健康体检者（51.93pg/ml)测定，进行批内发光值精密度实验。
3.仪器： AutoLumo A2000 PLUS化学发光分析仪。
4.结果
4.1 采用实施例1和实施例2分别测定肾衰患者和健康体检者甲状旁腺素水平比较如表1：
4.2 采用实施例1和实施例2分别在采血后放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0小时测定肾衰患者甲状旁腺素高值（439.85pg/ml) 和健康体检者（51.93pg/ml)测定，进行批内发光值精密度实验比较如表2。
表2 测定肾衰甲状旁腺素高值（439.85pg/ml）和健康体检者（51.93pg/ml）分别在采血后放置不同时间进行批内精密度实验比较：
通过表1和2统计学分析得知：采用实施例1在测定肾衰患者甲状旁腺素在 498.3±322.4pg/ml，在测定健康体检者为 55.2±38.3pg/ml，实施例1和2两种方法无显著性差异（t=2.02, P=0.3897）；在采血后放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0小时进行批内精密度实验比较中，采用实施例1方法肾衰患者发光值与实施例2方法比较有高度显著性差异（t=243.24, P=0.0022），说明在采用原有方法中，由于肾衰患者高纤维蛋白原造成血液凝固差、反应不完全，使得在进行磁颗粒化学发光法测定中造成纤维蛋白原包裹磁颗粒而使反应不完全、分离洗涤不充分等而造成较大偏差，数值分散度大，精密度低；两种方法在测定健康体检者两种方法比较无显著性差异（t=2.46, P=0.4536）。
经过以上统计学分析可看出，本发明采用本发明方法可以有效地降低纤维蛋白原对磁颗粒化学发光法的干扰，特别是肾衰等高纤维蛋白原患者使测定结果具有一致性和可靠性，具有推广应用前景和应用价值。
Claims (3)
1.一种消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方，其特征在于样品稀释液中含有纤溶酶，在进行磁颗粒化学发光法测定中，消除了血清中内源性纤维蛋白的干扰，特别是肾衰患者，由于高浓度的纤维蛋白造成磁颗粒化学发光法反应、磁颗粒分离和洗涤不完全等而造成较大偏差，其使用方法和范围与原有的化学发光法相同，不会增加实验人员的负担，经济方便易行，是一种准确性更高的检测方法。
2.根据权利要求1所述的消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方，其特征在于样品稀释液每升Tris-HCl 150 mmol(pH6.0)缓冲液中溶解8000U纤溶酶，200µl Proclin-300防腐剂，纤溶酶的在反应体系中终浓度为≥7800U/L。
3.根据权利要求1所述的消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方，其特征在于样品稀释液中Tris-HCl缓冲液的浓度为150mmol/L，pH值为6.0±0.2。
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