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CN110577599A - 人源抗程序性死亡-1(pd-1)抗体及其应用 - Google Patents

人源抗程序性死亡-1(pd-1)抗体及其应用 Download PDF

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CN110577599A
CN110577599A CN201910394015.3A CN201910394015A CN110577599A CN 110577599 A CN110577599 A CN 110577599A CN 201910394015 A CN201910394015 A CN 201910394015A CN 110577599 A CN110577599 A CN 110577599A
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CN
China
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seq
chain variable
amino acid
variable region
acid sequence
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Withdrawn
Application number
CN201910394015.3A
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马冬磊
林科佳
魏宗科
胡锐
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Shenzhen Run Ke Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Run Ke Biotechnology Co Ltd
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Publication date
Application filed by Shenzhen Run Ke Biotechnology Co Ltd filed Critical Shenzhen Run Ke Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种人源抗程序性死亡‑1(PD‑1)抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1‑2、SEQ ID NO:3‑5、SEQ ID NO:6‑8、SEQ ID NO:9‑11、SEQ ID NO:12至少一种所示的氨基酸序列。所述抗体或抗原结合片段在混合淋巴细胞实验中具有诱导白介素‑2释放的生物活性，可高亲和力结合人源程序性死亡－1(PD－1)蛋白靶标，可广泛应用于体外检测PD‑1蛋白，以及用于制作增强T细胞免疫应答的药物和治疗自身免疫病、炎性疾病、变态反应、移植物排斥、癌症或免疫系统紊乱药物。

Description

人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体及其应用
技术领域
本发明属于分子免疫学技术领域，具体地说涉及一种抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或其功能性片段及其在治疗肿瘤等疾病药物中的应用。
背景技术
机体适应性免疫反应涉及两大类主要淋巴细胞，即T细胞和B细胞的激活、选择与克隆化增殖。在机体遇到外来抗原后，其T细胞开始增殖并分化为抗原特异性应答细胞，同时B细胞也增殖并分化形成抗体分泌细胞。T细胞激活是一个多步骤过程，它需要T细胞和抗原提呈细胞(APC)之间来回信号的传导。为了T细胞的激活，两类信号必须传递到其他T细胞：第一类共刺激信号传导受到抗原特异性T细胞受体(TcR)的调节，继而表现为机体的特异性免疫应答；而第二类共刺激信号传导调节特异性免疫应答的强度，其信号通过T细胞上辅助受体来传递。
其中，第一类共刺激信号通过先激活CD28受体，其再结合配体B7-1或B7-2的方式来传递信号。相比之下，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)受体也借助结合同一配体B7-1或B7-2来削减T细胞免疫反应，从而，CTLA-4信号传递起到CD28所调节的共刺激信号传导作用，在抗原浓度至高状况，CD28所调节的共刺激信号传导会超越CTLA-4信号传递带来的抑制效应。CD28和CTLA-4表达的瞬时性调节保持了激活与抑制信号传导的平衡，即在起到护卫机体自身免疫发生的同时，又确保机体有效免疫反应的进行。
近来，研究人员已鉴定出CD28、CTLA-4和其类B7配体的分子同源性。诱导性T细胞共刺激因子(Inducible T-cell COStimulator,ICOS)，又称CD278是类似CD28的共刺激信号受体，程序性死亡-1(Programmed eath-1,PD-1)即PD-1或称CD279是一种与CTLA-4并肩作战的抑制性受体。PD-1是50-55道尔顿大小的I型跨膜受体，最初是在研究T淋巴细胞其诱导激活细胞凋亡时鉴定出此受体。PD-1表达于活化的T细胞、B细胞，以及巨噬细胞。其配体为PD-L1(B7H1/CD274)和PD-L2(B7-DC/CD273)，它们均为B7家族成员。
PD-1也是免疫球蛋白(Ig)超家族成员，在其细胞胞外区有包括单个诸如免疫球蛋白可变区的结构域，PD-1胞内结构域包含两个酪氨酸位点，其常见的近膜酪氨酸就位于ITIM(免疫受体酪氨酸抑制性受体)，PD-1蛋白上有ITIM受体表明这一蛋白分子通过招募细胞内酪氨酸磷酸化酶减弱抗原受体的信号传导。人源与鼠源PD-1蛋白的序列有60％是同源的，其4个潜在N-型糖基化位点以及在疫球蛋白可变区所鉴定的氨基酸均为保守区。实验表明，PD-1通过与其配体的相互作用来调节机体内中枢与外围免疫应答，尤其是在有PD-L1出现时，会抑制野生性T细胞的增值，而并不抑制PD-1缺陷性T细胞的增值。不仅如此，PD-1缺陷性小鼠也呈现自身免疫反应，PD-1缺陷小鼠品系C57BL/6会造成如慢性进行性红斑狼疮肾小球性肾炎及关节炎；Balb/c小鼠PD-1缺陷会由于出现心脏组织特异性自身抗体而导致严重的心肌病变。
由于PD-1在自身免疫，肿瘤免疫以及传染免疫均发挥极其重要作用，PD-1是免疫治疗的理想靶标。所以，人们一直在研究通过拮抗物，包括单克隆抗体阻断PD-1以用于治疗癌症和慢性病毒感染。但目前，仍需开发新的具有更高亲和力结合人源程序性死亡－1(PD－1)蛋白靶标的功能性特异性抗体。
发明内容
为此，本发明正是要解决上述技术问题，从而提出一种人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体及其应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
本发明提供一种人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-5、SEQID NO:6-8、SEQ ID NO:9-11、SEQ ID NO:12至少一种所示的氨基酸序列。
作为优选，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1-12所示的氨基酸序列。
作为优选，所述抗体或抗原结合片段还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:15-17、SEQ ID NO:18-20、SEQ ID NO:21-23、SEQ ID NO:24至少一种所示的氨基酸序列。
作为优选，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13-24所示的氨基酸序列。
作为优选，所述抗体或抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1-12所示氨基酸序列的重链可变区以及如SEQ ID NO:13-24所示氨基酸序列的轻链可变区。
作为优选，所述抗体或抗原结合片段包括以下物质的至少一种：
R1：具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区；
R2、具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区；
R3：具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区；
R4：具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链可变区；
R5：具有如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区；
R6：具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区；
R7：具有如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区；
R8：具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区；
R9：具有如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的轻链可变区；
R10：具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的轻链可变区；
R11：具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区；
R12：具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区。
或者作为优选，所述抗体或抗原结合片段包括具有如SEQ ID NO:25-36所示氨基酸序列的重链可变区。
作为优选，所述抗体或抗原片段还包括具有如SEQ ID NO:37-48所示氨基酸序列的轻链可变区。
作为优选，所述抗体或抗原结合片段包括如下物质的至少一种：
H1：具有如SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区；
H2：具有如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区；
H3：具有如SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的轻链可变区；
H4：具有如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的轻链可变区；
H5：具有如SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的轻链可变区；
H6：具有如SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区；
H7：具有如SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区；
H8：具有如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区；
H9：具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的轻链可变区；
H10：具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的轻链可变区；
H11：具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的轻链可变区；
H12：具有如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区。
作为优选，所述抗体或抗原结合片段还包括人源化的抗体或人员序列框架区。
作为优选，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人源或鼠源PD-1蛋白的细胞外表位。
作为优选，还包括人源抗体IgG1,IgG2,IgG3或IgG4的重链恒定区。
本发明还提供一种所述人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段在体外检测PD-1蛋白中的应用。
本发明还提供一种所述人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段在增强T细胞免疫应答的药物中的应用。
本发明还提供一种所述人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段在用于治疗自身免疫病、炎性疾病、变态反应、移植物排斥、癌症或免疫系统紊乱药物中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-5、SEQ IDNO:6-8、SEQ ID NO:9-11、SEQ ID NO:12至少一种所示的氨基酸序列。所述抗体或抗原结合片段在混合淋巴细胞实验中具有诱导白介素-2释放的生物活性，可高亲和力结合人源程序性死亡－1(PD－1)蛋白靶标，可广泛应用于体外检测PD-1蛋白，以及用于制作增强T细胞免疫应答的药物和治疗自身免疫病、炎性疾病、变态反应、移植物排斥、癌症或免疫系统紊乱药物。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-923的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图2是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-924的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图3是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-925的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图4是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-926的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图5是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-923的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图6是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-924的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图7是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-925的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图8是本发明实施例3中重组PD-1抗体Abs-r-926的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图9是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-923的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图10是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-924的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图11是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-925的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图12是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-926的重链可变区(H-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图13是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-923的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图14是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-924的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图15是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-925的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图16是本发明实施例3中人源化PD-1抗体Abs-h-926的轻链可变区(L-CVR)的DNA序列和氨基酸序列；
图17是本发明实施例6中四种人源化PD-1抗体与Nivolumab的竞争性比较结果；
图18是本发明实施例7中人源化PD-1抗体诱导IL-2释放效果比较结果。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，或者，作为可变换的实施方式，所述抗体或抗原片段还可以为兔源抗体或其功能性抗原结合片段，特别地，所述兔源抗体是重组抗体，也是人源化抗体。
所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-5、SEQ ID NO:6-8、SEQ ID NO:9-11、SEQ ID NO:12至少一种所示的氨基酸序列。
所述抗体或抗原结合片段还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:15-17、SEQ ID NO:18-20、SEQ ID NO:21-23、SEQ ID NO:24至少一种所示的氨基酸序列。
优选地，本实施例中，所述重链可变区包括具有如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体；所述轻链可变区包括具有如SEQ ID NO:13-15所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
或者，本实施例中，所述重链可变区包括具有如SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体；所述轻链可变区包括具有如SEQ ID NO:16-18所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
或者，本实施例中，所述重链可变区包括具有如SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体；所述轻链可变区包括具有如SEQ ID NO:19-21所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
或者，本实施例中，所述重链可变区包括具有如SEQ ID NO:10-12所示的氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体；所述轻链可变区包括具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
如前所述，PD-抗体或其抗原结合片段可为兔源抗体或其片段，其中，兔源抗体选自abs-r-923、abs-r-924、abs-r-925和abs-r-926，其抗体重链可变区进一步包含兔源IgG或其变体的重链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，所述兔源抗体或其片段进一步包含兔源IgG或其变体的重链恒定区。
进一步地，本实施例中，所述兔源抗体或其片段进一步包含兔源κ链或其变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，所述兔源抗体或其片段进一步包含兔源λ链或其变体的轻链恒定区。
或者作为优选的实施方式，所述PD-1抗体或其抗原结合片段，为嵌合抗体或其片段。所述嵌合抗体重链可变区包括如SEQ ID NOs:50、54、58和62所示的氨基酸序列。
所述嵌合抗体或其片段中，嵌合抗体轻链可变区包括如SEQ ID NOs:52、56、60和64所示的氨基酸序列。
或者，本实施例中所述的PD-1抗体为人源化抗体或其功能性抗原结合片段，其中，抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区包括如如SEQ ID NO:25-36所示氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:37-39所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
作为可变换的实施方式，所述人源化抗体或其功能性片段中的重链可变区包括如SEQ ID NO:28-30所示氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:40-42所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
或者，所述人源化抗体或其功能性片段中的重链可变区包括如SEQ ID NO:31-33所示氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:43-45所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
或者，所述人源化抗体或其功能性片段中的重链可变区包括如SEQ ID NO:34-36所示氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3或其变体，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:46-48所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或其变体。
其中，人源化抗体选自hu923、hu924、hu925和hu926。
作为优选，所述人源化抗体或其片段，其人源化抗体重链可变区进一步包含人源IgG1,IgG2,IgG3,IgG4或其变体的重链FR区。
作为优选，人源化抗体进一步包括重链恒定区。
作为优选，所述人源化抗体或其片段，其人源化抗体轻链可变区进一步包括人源κ、λ链或其变体。
作为优选，人源化抗体进一步包括轻链FR区序列。
在本发明一个优选的实施方案中，所述人源化抗体或其片段为嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1或IgG4重链恒定区。所述嵌合抗体或其片段进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，所述PD-1人源化抗体或其片段中，PD-1人源化抗体或其片段。
本实施例中，PD-1嵌合抗体或其片段，其中嵌合抗体重链可变区包括如SEQ IDNOs:66、70、74和78所示的氨基酸序列，嵌合抗体轻链可变区包括如SEQ ID NO:68、72、76和80所示的氨基酸序列。
在本发明优选的实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合片段中，所述的抗原结合片段为Fab、Fv、scFv、F(ab’)2。
进一步地，本实施例还提供一种用于编码上述PD-1抗体或其抗原结合片段的多核苷酸(DNA)分子或分离的多核苷酸的组合，所述组合包括编码本发明抗PD-1抗体或其功能性片段之轻链的多核苷酸和编码本发明抗PD-1抗体或其功能性片段之重链的多核苷酸。
本实施例还提供一种包含本发明的抗PD-1抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种抗体或肽或蛋白质以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体事实上可以进行衍生化或连接至一个以上其它功能性分子以生成与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子。
更进一步地，本实施例还提供一种含有上述DNA分子的表达载体。
且进一步提供如上所述的表达载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞优选为仓鼠卵巢细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
本发明所述的抗PD-1抗体或其功能性片段阻断PD-1与PD-L1的相互作用和/或PD-1与PD-L2的相互作用。
本实施例所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段可用于体外检测PD-1蛋白，还可用于增强T细胞免疫应答的药物，所述增强T细胞免疫应答包括增强T细胞的细胞因子产生，优选地所述细胞因子如IL-2。还具有竞争性结合PD-1蛋白的功能，在特定实施方案中，所述竞争性结合人的PD-1蛋白的特性，优选为纳武单抗(Nivolumab)。所述人源抗程序性死亡-1(PD-1)还可用于治疗自身免疫病、炎性疾病、变态反应、移植物排斥、癌症或免疫系统紊乱药物中。
本实施例中，PD-1抗体Abs-r-923的H-CDR和完整重链可变序列如表1所示。
表1
PD-1抗体Abs-r-923的L-CDR和完整轻链可变序列如表2所示。
表2
PD-1抗体Abs-h-923的H-CDR和完整重链可变序列还如表3所示。
表3
PD-1抗体Abs-h-923的L-CDR和完整轻链可变序列还如表4所示。
表4
PD-1抗体Abs-r-924的H-CDR和完整重链可变序列如表5所示。
表5
PD-1抗体Abs-r-924的L-CDR和完整轻链可变序列如表6所示。
表6
PD-1抗体Abs-h-924的H-CDR和完整重链可变序列还如表7所示。
表7
PD-1抗体Abs-h-924的L-CDR和完整轻链可变序列还如表8所示。
表8
PD-1抗体Abs-r-925的H-CDR和完整重链可变序列如表9所示。
表9
PD-1抗体Abs-r-925的L-CDR和完整轻链可变序列如表10所示。
表10
PD-1抗体Abs-h-925的H-CDR和完整重链可变序列还如表11所示。
表11
PD-1抗体Abs-h-925的L-CDR和完整轻链可变序列还如表12所示。
表12
PD-1抗体Abs-r-926的H-CDR和完整重链可变序列如表13所示。
表13
PD-1抗体Abs-r-926的L-CDR和完整轻链可变序列如表14所示。
表14
PD-1抗体Abs-h-926的H-CDR和完整重链可变序列还如表15所示。
表15
PD-1抗体Abs-h-926的L-CDR和完整轻链可变序列还如表16所示。
表16
实施例2
兔抗PD-1抗体的制备
a、动物免疫
对4只4个月大的雌性家兔进行免疫，每只家兔皮下注射50μg混合完全弗氏佐剂的重组人PD-1(Sigma-Aldrich,Cat#263810)。两到三周后，给家兔接种25μg可溶性PD-1与不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，Cat#263910)，采集家兔的耳静脉血检测免疫反应，分离血清，随后用PBS1/1000稀释，且进行ELISA检测，分析其效价是否增强，之后选择获得足够抗体量的家兔，并对所选择的家兔进行细胞融合过程。
b、脾细胞和细胞融合物的制备
提取出家兔脾脏，制备混合的脾的单细胞悬液。用DMEM洗涤脾细胞和骨髓瘤细胞数次，在1ml 50％(w/v)PEG 3550存在的情况下融合2次(脾细胞对SP2/0的比率为2.5:1和2.4:1)。将产生的杂交瘤重悬浮于含有20％FCS和氨基蝶呤的CGM(HAT培养基)中。每一个融合物的细胞悬液(140Cl/孔)于含有20％FCS的CGM中铺板至8个含有140Cl/孔腹膜渗出细胞作为饲养细胞的96孔组织培养平底板(Corning-Costar)。将板温育10天。在该时期中，用HAT培养基饲养细胞2次。将脾细胞制备物的等分试样(约8x106个脾细胞、)于24孔板的孔中培养10天，细胞培养物上清液用作ELISA中的阳性对照。
c、筛选测定
采用ELISA检测筛选细胞培养上清液中的IgG。用50μl/孔的于0.5M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂，pH 9.6的PD-1Fc抗原(5μg/ml)包被96孔平底聚苯乙烯微量滴定板(Greiner，Cat#655061)。在于保湿室中4℃下温育过夜后，用含有0.01％TritonX-100的tris-缓冲盐溶液(TBS,50mM Tris,pH 7.8,500mM氯化钠)(洗涤缓冲液)洗涤板，然后在摇床上用200μl/孔的TBS中的2％FCS(封闭缓冲液)在室温(RT)下温育1小时。用洗涤缓冲液洗涤孔，将100μl细胞培养上清液添加在适当的孔中。将来自SP 2/0骨髓瘤细胞的细胞培养上清液用作阴性对照。将来自脾细胞培养物的细胞培养上清液用作阳性对照。将板在摇床上于RT下温育1小时，然后洗涤数次。为了检测结合的抗体，在摇床上在RT下用50μl/孔的在封闭缓冲液中的缀合有碱性磷酸酶的山羊抗–兔IgG温育板1小时，洗涤数次，添加150μl/孔的底物缓冲液(5％二乙醇胺+0.5mM MgCl2,pH9.8中的2mM 4-硝基苯基磷酸盐)。在Dynex Opsys MR微量板读数器中405nm处读取吸光度值(OD)。
d、单克隆挑选
将来自阳性IgG产生性培养物的细胞转移至48孔板的孔中，培养数天(取决于细胞的生长特征)。进行ELISA(在PD-1Fc上和在无预包被的抗原的情况下)以选择特异性结合剂。将来自ELISA-阳性孔的细胞冷冻在冷冻培养基(90％FCS,10％DMSO)中。进一步培养细胞的等分试样以产生细胞培养上清液，用于进一步的表征。一旦鉴定阳性孔，就克隆杂交瘤细胞以减少非产生性细胞的过度生长的风险(第一次克隆)。为了确保抗体为真实单克隆的，再次克隆杂交瘤(第二次克隆)。将有限稀释的方法用于两个克隆过程。将IgG产生性细胞以每孔1-3个细胞的密度分配入一个含有饲养细胞的96孔板。在8-10天(取决于生长特征)后，在显微镜下视觉观察所有板以检测单克隆生长。使用上述筛选测定法，就特异性免疫球蛋白含量筛选来自这些孔的培养上清液。针对生长特征和ELISA信号选择适当的克隆，将其转移至24孔板的孔中，培养数天进行筛选测定。重复该过程2至3次。分别选择适当的亚克隆以进行第二克隆法或进行培养(用于冷冻保存)。共筛选出的4株特异性和结合力强的抗PD-1抗体，分别命名为Abs-r-923，Abs-r-924，Abs-r-925，Abs-r-926，对其进行特异性检测，发现均不与其他非特异性抗体结合，且不与鼠PD-1交叉反应。
实施例3
PD-1抗体的人源化
a、人源化重链可变区序列
比较已知的人类免疫球蛋白重链可变区序列，筛选出低免疫原性的人类开放阅读序列对四种PD-1抗体进行人源化，包括Abs-r-923，Abs-r-924，Abs-r-925，Abs-r-926。重组后的四种抗体的DNA和氨基酸序列见图1-4；也可查询SEQ ID NOS:49，50，53，54，57，58，61和62。
人源化的Abs-h-923，Abs-h-924，Abs-h-925，Abs-h-926的重链可变区的DNA和氨基酸序列可查询SEQ ID NOS:65，66，69，70，73，74，77和78。
比较已知的人类免疫球蛋白轻链可变区序列，筛选出低免疫原性的人类开放阅读序列对四种PD-1抗体进行人源化，包括Abs-r-923，Abs-r-924，Abs-r-925，Abs-r-926。重组后的四种抗体的DNA和氨基酸序列见图5-8；也可查询SEQ ID NOS:51，52，55，56，59，60，63和64。
人源化的Abs-h-923，Abs-h-924，Abs-h-925，Abs-h-926的重链可变区的DNA和氨基酸序列如图9-12所示。
人源化的Abs-h-923，Abs-h-924，Abs-h-925，Abs-h-926的轻链可变区的DNA和氨基酸序列如图13-16所示，也可查询SEQ ID NOS:67，68，71，72，75，76，79和80。
实施例4
人源化PD-1抗体的构建和表达
人IgG4重链恒定区片段IgG4Fc序列和k轻链恒定区序列由IDT公司(IntegratedDNA Technologies,Coralville,lowa)合成，将合成的片段连接至pcDNA3.1载体，将质粒载体转至pBA-H4和pBA-Ck，pBA-H4(包含人IgG4重链恒定区片段IgG4Fc)，pBA-Ck(包含人k轻链恒定区)，质粒载体由Bioabs公司构建，将质粒表达在CHO细胞中，之后进一步修饰编码重链和轻链可变区的DNA序列，本发明中所述的编码人源化抗PD-1抗体重链可变区的DNA序列在SEQ ID Nos:65(Abs-h-923)，69(Abs-h-924),73(Abs-h-925)和77(Abs-h-926)，本发明编码人源化抗PD-1抗体轻链可变区DNA序列见SEQ ID Nos:67(Abs-h-923)，71(Abs-h-924),75(Abs-h-925)和79(Abs-h-926)。
实施例5
人源化抗体的亲和力
利用SPR BacoreTM技术检测PD-1抗体Abs-h-923，Abs-h-924，Abs-h-925，Abs-h-926的亲和力，该技术尤其适用于抗原抗体相互反应的检测。两倍浓度的抗PD-1抗体稀释到检测缓冲液中，从浓度范围为0.14-7.68nM，检测其缔合的动力学速率常数(Ka)、离解的动力学速率常数(Kd)以及离解平衡常数(KD)。与Abs-h-923，Abs-h-924，Abs-h-925，Abs-h-926的亲和力结果见表17。
表17
实施例6
比较人源化PD-1抗体与Nivolumab的竞争性
采用ELISA检测分析Abs-h-923，Abs-h-924，Abs-h-925，Abs-h-926和Nivolumab的竞争性。具体方法如下：一系列不同浓度的Abs-h-923，Abs-h-924，Abs-h-925，Abs-h-926PD-1抗体、50ng/ml的Nivolumab或对照抗体(阴性对照)在37℃预孵育1小时，将混合物加入到包被100ng/ml人PD-1的96孔板中再孵育1小时，洗涤，加入HRP，孵育，加入TMB，之后终止反应，并在450nm处读取吸光度值(OD)。
人源化PD-1抗体具有与Nivolumab竞争性结合人的PD-1蛋白的特性。但是，Abs-h-923的竞争性较弱，Abs-h-926的竞争性最强，对照抗体无法与Nivolumab竞争结合PD-1，结果如图17所示。
实施例7
人源化PD-1抗体诱导IL-2释放
四种抗体：Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925、Abs-h-926采用混合淋巴反应(MLR)方法检测其对IL-2释放的增强作用。采用Nivolumab做为对照进行本实验。采用DC细胞做为刺激细胞，纯化的CD4+T淋巴细胞做为效应细胞，2.5天后采集上清，进行检测。
如图18所示，采用PD-1抗体Abs-h-923、Abs-h-924、Abs-h-925、Abs-h-926处理后，可以显著增强IL-2因子的释放，其中，Abs-h-923的诱导作用最弱，Abs-h-926的诱导作用和Nivolumab类似。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (15)

1.一种人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:3-5、SEQID NO:6-8、SEQ ID NO:9-11、SEQ ID NO:12至少一种所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:1-12所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:15-17、SEQ ID NO:18-20、SEQ ID NO:21-23、SEQ ID NO:24至少一种所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:13-24所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1-12所示氨基酸序列的重链可变区以及如SEQ ID NO:13-24所示氨基酸序列的轻链可变区。
6.根据权利要求5所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括以下物质的至少一种：
R1：具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区；
R2、具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区；
R3：具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的轻链可变区；
R4：具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链可变区；
R5：具有如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的轻链可变区；
R6：具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区；
R7：具有如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区；
R8：具有如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区；
R9：具有如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的轻链可变区；
R10：具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的轻链可变区；
R11：具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的轻链可变区；
R12：具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区。
7.根据权利要求1所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括具有如SEQ ID NO:25-36所示氨基酸序列的重链可变区。
8.根据权利要求7所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原片段还包括具有如SEQ ID NO:37-48所示氨基酸序列的轻链可变区。
9.根据权利要求8所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括如下物质的至少一种：
H1：具有如SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区；
H2：具有如SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区；
H3：具有如SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的轻链可变区；
H4：具有如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的轻链可变区；
H5：具有如SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的轻链可变区；
H6：具有如SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区；
H7：具有如SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区；
H8：具有如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区；
H9：具有如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的轻链可变区；
H10：具有如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的轻链可变区；
H11：具有如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的轻链可变区；
H12：具有如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的重链可变区和如SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区。
10.根据权利要求1-9任一项所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段还包括人源化的抗体或人源序列框架区。
11.根据权利要求10所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人源或鼠源PD-1蛋白的细胞外表位。
12.根据权利要求11所述的人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段，其特征在于，还包括人源抗体IgG1,IgG2,IgG3或IgG4的重链恒定区。
13.一种如权利要求1-12任一项所述人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段在体外检测PD-1蛋白中的应用。
14.一种如权利要求1-12任一项所述人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段在增强T细胞免疫应答的药物中的应用。
15.一种如权利要求1-12任一项所述人源抗程序性死亡-1(PD-1)抗体或抗原结合片段在用于治疗自身免疫病、炎性疾病、变态反应、移植物排斥、癌症或免疫系统紊乱药物中的应用。
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