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CN110573556B - 抗菌聚合物和抗菌水凝胶 - Google Patents

抗菌聚合物和抗菌水凝胶 Download PDF

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CN110573556B CN201880018661.3A CN201880018661A CN110573556B CN 110573556 B CN110573556 B CN 110573556B CN 201880018661 A CN201880018661 A CN 201880018661A CN 110573556 B CN110573556 B CN 110573556B
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Abstract

一种抗菌聚合物或水凝胶及形成其的方法，所述抗菌聚合物或水凝胶包括式(I)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)的支化聚乙烯亚胺(PEI)；式(II)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)和癸烷的支化聚乙烯亚胺(PEI)；或式(III)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)和烷基(R)的支化聚乙烯亚胺(PEI)，
Figure DDA0002203409040000011
其中：m是1至20的整数；n是1至20的整数；在式(I)中，PEI‑PEGMA的接枝率为1:1至1:20；在式(II)中，PEI‑癸烷‑PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20；在式(III)中，R是取代或未取代的直链或支链C5‑C15烷基；并且PEI‑烷基‑PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20。还提供了一种具有涂覆有所述式(I)、(II)或(III)的抗菌水凝胶的表面的装置。

Description

抗菌聚合物和抗菌水凝胶
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月16日提交的申请号为10201702149V的新加坡专利的优先权，该专利申请的内容为了所有目的通过引用整体并入本文。
技术领域
各种实施例一般涉及抗菌聚合物和抗菌水凝胶，特别是涉及由支化聚乙烯亚胺组成的聚合物和水凝胶，更具体地说，涉及由聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEI-PEGMA)或聚乙烯亚胺-接枝-癸烷-接枝-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEI-癸烷-PEGMA)组成的聚合物和水凝胶。
背景技术
水凝胶可能是产生抗菌涂层的合适材料，因为它们的性质可以调整以适应预期的应用。可以由阳离子聚合物合成在接触时杀死细菌的抗菌水凝胶。
最近，开发了基于聚阳离子聚合物的表面抗菌涂层。表面抗菌涂层相对于全身性抗生素和抗菌剂的显著优点是基于聚阳离子聚合物的抗菌涂层具有(1)缺乏细菌抗性，(2)由于固定化和缺乏扩散而延长的有效性，(3)由于活性剂的固定化而缺乏毒性，以及(4)对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌生物的有效性。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种弱碱性、脂肪族、无毒的合成聚合物。由于其化学键由C-C和C-N组成，因此PEI具有高度的生物稳定性。由于PEI大分子上存在伯、仲和叔氨基，它可以转化为聚阳离子，广泛应用于如基因传递、酶固定化、生物传感器、生物大分子的分离纯化等生物医学应用中。由于它是聚阳离子聚合物，因此也制备了基于PEI的纳米颗粒用于抗菌剂。然而，没有关于使用PEI作为抗菌涂层的水凝胶的报道。
发明内容
本公开基于阳离子聚合物(或更具体地，共聚聚合物)和极其微孔的聚阳离子水凝胶，阳离子聚合物和聚阳离子水凝胶破坏与该阳离子聚合物或聚阳离子水凝胶接触的细菌的细胞包膜(即涉及杀菌的接触-活化机制)。
根据本公开的一个方面，提供了一种抗菌聚合物或水凝胶，该抗菌聚合物或水凝胶包括式(I)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)的支化聚乙烯亚胺(PEI)或式(II)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)和癸烷的支化聚乙烯亚胺(PEI)，
Figure BDA0002203409020000021
Figure BDA0002203409020000031
其中：
m是1至20的整数；
n是1至20的整数；
在式(I)中，PEI-PEGMA的接枝率为1:1至1:20；和
在式(II)中，PEI-癸烷-PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20。
根据本公开的另一方面，提供了一种形成式(I)的抗菌聚合物的方法，该方法包括：
将聚乙烯亚胺(PEI)溶解于去离子水中，形成PEI溶液；
将碱溶液加入到PEI溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析最终混合物之前搅拌最终混合物；和
将最终混合物冻干以获得式(I)的抗菌聚合物。
根据本公开的又一方面，提供了一种形成式(II)的抗菌聚合物的方法，该方法包括：
将癸烷接枝的聚乙烯亚胺(PEI-癸烷)溶解于去离子水中，形成PEI-癸烷溶液；
将碱溶液加入到PEI-癸烷溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析最终混合物之前搅拌最终混合物；和
将最终混合物冻干以获得式(II)的抗菌聚合物。
根据本公开的另一方面，提供了一种形成式(I)或式(II)的抗菌水凝胶的方法，该方法包括：
将式(I)或式(II)的抗菌聚合物、交联剂和UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶。
根据本公开的又一方面，提供了一种在表面上形成式(I)或式(II)的抗菌水凝胶涂层的方法，该方法包括：
将式(I)或式(II)的抗菌聚合物、交联剂和可选的UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；
对表面进行改性处理；
将水凝胶溶液沉积在改性表面上；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶涂层。
根据本公开的另一方面，提供了一种具有涂覆有式(I)或式(II)的抗菌水凝胶的表面的装置。
根据本公开的又一方面，提供了一种杀死微生物的方法，该方法包括将式(I)或式(II)的抗菌聚合物或水凝胶与微生物接触。
根据本公开的另一个方面，提供了一种抗菌聚合物或水凝胶，该抗菌聚合物或水凝胶包括式(III)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)和烷基(R)的支化聚乙烯亚胺(PEI)，
Figure BDA0002203409020000051
其中：
m是1至20的整数；
n是1至20的整数；
R是取代或未取代的直链或支链C5-C15烷基；并且
PEI-烷基-PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20。
根据本公开的另一方面，提供了一种形成式(III)的抗菌聚合物的方法，该方法包括：
将烷基接枝的聚乙烯亚胺(PEI-烷基)溶解于去离子水中，形成PEI-烷基溶液；
将碱溶液加入到PEI-烷基溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析最终混合物之前搅拌最终混合物；和
将最终混合物冻干以获得式(III)的抗菌聚合物。
根据本公开的又一方面，提供了一种形成式(III)的抗菌水凝胶的方法，该方法包括：
将式(III)的抗菌聚合物、交联剂和UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶。
根据本公开的另一个方面，提供了一种在表面上形成式(III)的抗菌水凝胶涂层的方法，该方法包括：
将式(III)的抗菌聚合物、交联剂和可选的UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；
对表面进行改性处理；
将水凝胶溶液沉积在改性表面上；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶涂层。
根据本公开的另一方面，提供了一种具有涂覆有式(III)的抗菌水凝胶的表面的装置。
根据本公开的又一个方面，提供了一种杀死微生物的方法，该方法包括将式(III)的抗菌聚合物或水凝胶与微生物接触。
附图说明
在附图中，相同的附图标记在不同视图中通常指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是通常将重点放在说明各种实施例的原理上。在以下描述中，参考以下附图描述本发明的各种实施例。
图1显示了PEI-癸烷在D2O中的1H NMR谱。
图2显示了接枝有PEGMA的PEI-癸烷在D2O中的1H NMR谱。
图3显示了隐形眼镜的经冷冻干燥的表面形态的FESEM图像：(a)原始Clearlab A透镜，(b)PEI-癸烷-PEGMA(1:10:1)涂覆的透镜，(c)PEI-癸烷-PEGMA(1:10:2)涂覆的透镜，(d)PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)涂覆的透镜，(e)PEI-癸烷-PEGMA(1:10:8)和(f)PEI-癸烷-PEGMA(1:10:16)涂覆的透镜。
图4显示了通过琼脂平板可视化的涂层抗菌测定。将细菌在受试表面上孵育1h(对照1为没有涂层表面)，然后转移至Luria肉汤琼脂培养基中，并在37℃下在培养箱中进一步孵育18h。
图5显示了与PEI-癸烷-PEGMA涂覆的隐形眼镜(右)和对照(左，无涂层)接触的细菌的形态。
图6显示了PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶在人真皮成纤维细胞上的体外生物相容性。Transwell MTT(左)显示两种水凝胶的细胞活力都超过95％，这意味着水凝胶的浸出最少。接触式MTT(右)显示两种水凝胶的细胞活力都超过85％，这意味着水凝胶与细胞的接触是非常相容的。
图7显示了水凝胶的溶胀动力学。PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶均非常快速地溶胀，在第一时间点(10min)达到其最大溶胀质量的90％以上。水凝胶能够吸收其水的干重的11倍以上。这些溶胀动力学证明它们是用于伤口敷料的非常合适的材料。
图8显示了当用对照和PEI-PEGMA水凝胶处理时MRSA的体内细菌CFU。在处理3天后，对照中约107CFU的MRSA存活，但是当用PEI-PEGMA水凝胶处理时无一存活。与对照相比，这相当于细菌减少超过7个对数或超过99.99999％的细菌被水凝胶杀死。
图9显示了实验第0、3、5、7、9和14天的伤口状况。在第0天产生直径约6mm的伤口并用MRSA感染。在所有天数里，PEI-PEGMA水凝胶处理的小鼠的伤口比对照小鼠的伤口略小且更清洁。比例尺＝5毫米。箭头表示次要伤口部位。
图10显示了体内伤口感染小鼠模型。在感染后24h处理模型(n＝6)中一天后，各种经处理的伤口和对照伤口上的(A)MRSA USA 300、(B)CR-AB、(C)CR-PA和(D)PA01的细菌计数。*表示P<0.05，**表示P<0.01。E)表汇总了来自图A-D的对数减少数据。F)在第1、3、5和7天(n＝6)对各种经处理的伤口和对照伤口上的MRSA USA 300的细菌计数。
图11显示了PEI(25K)-PEGMA系列(n＝3)的水凝胶的溶胶含量。超过8min的UV时间，取决于PEGMA接枝率，PEI-PEGMA水凝胶具有～11-17％的平稳溶胶含量。随着更高的交联发生，更高的PEGMA接枝降低了溶胶含量。
图12显示了细菌在水凝胶上的成像。a)使用SEM，PEI(25K)-PEGMA(1:5)水凝胶的横截面形态。b-c)使用SEM，(b)MRSA和(c)PA01在水凝胶上的形态。黑色箭头代表细菌碎片。d-g)使用LIVE/DEAD测定在PEI(25K)-PEGMA(1:5)水凝胶上的细菌的共聚焦图像。(d)MRSA对照，(e)水凝胶上的MRSA，(f)PA01对照和(g)水凝胶上的PA01。绿色(d,f)代表活菌，红色(e,g)代表死菌。
图13显示了使用FE-SEM的对照水凝胶上的(A)对照PEGDMA水凝胶、(B)MRSA USA300和(C)PA01的横截面形态。使用FE-SEM在PEI水凝胶上的(D)PEI水凝胶、(E)MRSA USA300和(F)PA01的横截面形态。使用FE-SEM在PDP水凝胶上的(G)PDP水凝胶、(H)MRSA USA300和(I)PA01的横截面形态。插图显示放大的形态(比例尺＝1μm)。箭头代表细菌碎片。
图14显示了水凝胶的特性。A)当用PEI和PDP水凝胶与Transwell孵育24h并进行接触式MTT测定(n＝3)时，人真皮成纤维细胞(HDF)的细胞活力。B)具有刻度参照的6mm PEI和PDP水凝胶圆盘的照片。C)PEI和PDP水凝胶(n＝3)的溶胀比(最终质量/初始质量)与时间的关系。D)使用LIVE/DEAD测定在PEI水凝胶表面上的(i)MRSA USA300和(ii)PA01的共聚焦图像。E)使用LIVE/DEAD测定在对照(PEGDMA)水凝胶表面上的(i)MRSA USA300和(ii)PA01的共聚焦图像。细菌在水凝胶上的孵育时间为1h。绿色表示活菌，而红色表示死菌。
图15显示了在0和2分钟期间水在PEI和PDP水凝胶上的接触角。
图16显示了体内预防模型的伤口完全愈合研究。A)表汇总了感染后0+小时处理模型的对数减少数据。B)感染对照和经PEI水凝胶处理的伤口在不同天数的伤口大小占初始伤口大小的百分比(n＝6)。C)在不同天数的感染对照和经PEI水凝胶处理的伤口的伤口图片。比例尺＝5mm。黑色箭头表示继发感染部位。D)创面旁组织的H&E染色显示在第3天感染对照的伤口和经PEI水凝胶处理的伤口的炎症程度。黑色箭头表示如黑点所示的发炎区域。比例尺＝300μm。E)用MRSA USA 300和PA01感染的小鼠处理3天后伤口上CD11b+细胞的百分比(n＝6)。CD11b+细胞的百分比与皮肤中的炎症程度成正比。*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图17显示了对细菌对照和在水凝胶上处理的细菌进行的LIVE/DEAD测定。绿色(即对照)表示活菌，红色(即水凝胶)表示死菌。
具体实施方式
以下详细描述参考附图，其通过图示的方式示出了可以实施本发明的具体细节和实施例。这些实施例进行了充分详细的描述，以使本领域技术人员能够实施本发明。可以利用其他实施例，并且可以在不脱离本发明范围的情况下进行结构、逻辑和化学改变。各种实施例不一定是相互排斥的，因为一些实施例可以与一个或多个其他实施例组合以形成新的实施例。
水凝胶是高度亲水的聚合物链的网络，其具有高吸收性并且含有高含水量。水凝胶可以由共价或非共价交联的单个或多个单体构成，以控制它们的溶胀能力和结构。它们的溶胀能力、结构、强度和含水量可能受pH值、温度或离子强度的影响。
本公开涉及由阳离子聚合物形成的聚阳离子水凝胶，其显示出显示抗菌活性。聚阳离子水凝胶或阳离子聚合物可以固定化或以其他方式涂覆在表面上以赋予抗菌能力。固定化聚阳离子水凝胶或阳离子聚合物的抗菌作用可能是由于它们与带负电荷的磷脂强烈相互作用的能力，允许静电相互作用控制与靶细胞膜的初始结合，然后聚合物上的疏水部分与细菌膜的内部疏水核相互作用，导致完整性破坏和随后的细胞死亡。因此，表面电荷密度和疏水性是影响表面涂层抗菌活性的主要因素。由于亚氨基的pKa值约为10至11，因此聚乙烯亚胺(PEI)是生理环境溶液(pH值约7.2)中的带正电荷的分子。
特别地，本文讨论了在PEI大分子的骨架上含有伯、仲和叔氨基的支化PEI。
因此，根据本公开的一个方面，提供了一种抗菌聚合物或水凝胶，该抗菌聚合物或水凝胶包括式(I)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)的支化聚乙烯亚胺(PEI)或式(II)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)和癸烷的支化聚乙烯亚胺(PEI)，
Figure BDA0002203409020000101
Figure BDA0002203409020000111
其中：
m是1至20的整数；
n是1至20的整数；
在式(I)中，PEI-PEGMA的接枝率为1:1至1:20；并且
在式(II)中，PEI-癸烷-PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20。
本领域技术人员将容易认识到，在式(I)中，支化PEI在主链或骨架中含有一个叔氨基，该叔氨基与含聚乙二醇甲基丙烯酸酯的部分接枝(此处表示为PEI-PEGMA)。阳离子PEI接枝有PEGMA以使PEI-PEGMA变成可UV聚合的。PEGMA不仅在PEI上赋予修饰后特性，而且还可以改善与哺乳动物细胞的生物相容性。
在式(I)中，接枝率表示接枝到PEI上的PEGMA部分的数量(或密度)。PEGMA部分的数量可以为1至20。换句话说，PEI-PEGMA的接枝率为1:1至1:20。在各种实施例中，接枝到一个PEI上的PEGMA部分的数量可以是5、10、或者甚至20。在优选实施例中，接枝到一个PEI上的PEGMA部分的数量为5。
式(II)的抗菌聚合物或水凝胶是式(I)的延伸或变体，其中除了如上所述式(I)的PEGMA接枝部分之外，还有另一部分接枝到PEI上。式(II)中的该其他部分可以是烷基，具体地，癸烷接枝到PEI上。
如上所述，阳离子聚合物或聚阳离子水凝胶的疏水性是影响表面涂层的抗菌活性的一个主要因素。因此，有目的地将诸如癸烷的烷基接枝到亲水性PEI上以赋予疏水性，从而改善其抗菌活性。本领域技术人员应当理解和认识到，本公开的范围不限于烷基为癸烷。例如，可以将取代或未取代的直链或支链C5-C15烷基接枝到亲水性PEI上，只要C5-C15烷基赋予疏水性以改善抗菌活性。C4及以下的烷基的沸点过低而不能参与化学反应形成PEI-烷基。由于反应可在约80℃进行，因此这些烷基可能只是回流而不是参与反应。另外，它们不太疏水，并且可能不会使抗菌性能有任何明显的增加。另一方面，C16及以上的烷基过于疏水并且可能极大地降低聚合物在水中的溶解度，因此可能不会形成水凝胶溶液。
在式(II)中，接枝率表示接枝到PEI上的癸烷部分的数量(或密度)。癸烷部分的数量可以为1至20。换句话说，PEI-癸烷的接枝率为1:1至1:20。在优选实施例中，接枝到一个PEI上的癸烷部分的数量为10。
在式(II)中，接枝率进一步表示接枝到PEI上的PEGMA部分的数量(或密度)。PEGMA部分的数量可以为1至20。换句话说，PEI-PEGMA的接枝率为1:1至1:20。在各种实施例中，接枝到一个PEI上的PEGMA部分的数量可以为1、2、4、8或甚至16。在优选实施例中，接枝到一个PEI上的PEGMA部分的数量为16。
在各种实施例中，抗菌聚合物或水凝胶可以是PEI-PEGMA(1:5)、PEI-PEGMA(1:10)或PEI-PEGMA(1:20)，其中括号中的数字是指PEI-PEGMA的比例。
在各种实施例中，抗菌聚合物或水凝胶可以是PEI-癸烷-PEGMA(1:10:1)、PEI-癸烷-PEGMA(1:10:2)、PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)、PEI-癸烷-PEGMA(1:10:8)、或PEI-癸烷-PEGMA(1:10:16)，其中括号中的数字是指PEI-癸烷-PEGMA的比例。
在各种实施例中，PEI的平均分子量为800至750K Da。例如，PEI的平均分子量可以是800、25K或750K Da。在优选实施例中，PEI的平均分子量可以是25K Da。
根据本公开的另一方面，提供了一种形成式(I)的抗菌聚合物的方法，该方法包括：
将聚乙烯亚胺(PEI)溶解于去离子水中，形成PEI溶液；
将碱溶液加入到PEI溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析最终混合物之前搅拌最终混合物；和
将最终混合物冻干以获得式(I)的抗菌聚合物。
根据本公开的又一方面，提供了一种形成式(II)的抗菌聚合物的方法，该方法包括：
将癸烷接枝的聚乙烯亚胺(PEI-癸烷)溶解于去离子水中，形成PEI-癸烷溶液；
将碱溶液加入到PEI-癸烷溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析最终混合物之前搅拌最终混合物；和
将最终混合物冻干以获得式(II)的抗菌聚合物。
根据本公开的另一方面，提供了一种形成式(I)或式(II)的抗菌水凝胶的方法，该方法包括：
将式(I)或式(II)的抗菌聚合物、交联剂和UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶。
根据本公开的又一方面，提供了一种在表面上形成式(I)或式(II)的抗菌水凝胶涂层的方法，该方法包括：
将式(I)或式(II)的抗菌聚合物、交联剂和可选的UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；
对表面进行改性处理；
将水凝胶溶液沉积在改性表面上；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶涂层。
在各种实施例中，改性处理可以包括等离子体处理、臭氧处理、氧化亚铁处理或在表面上产生自由基的任何其他处理。在某些实施例中，可以无需在上述在表面上形成式(I)或式(II)的抗菌水凝胶涂层的方法中使用UV引发剂，因为在改性处理过程中生成的自由基有助于随后的聚合过程以形成抗菌水凝胶涂层。
根据本公开的另一方面，提供了一种具有涂覆有式(I)或式(II)的抗菌水凝胶的表面的装置。
根据本公开的又一方面，提供了一种杀死微生物的方法，该方法包括将式(I)或式(II)的抗菌聚合物或水凝胶与微生物接触。
根据本公开的另一个方面，提供了一种抗菌聚合物或水凝胶，该抗菌聚合物或水凝胶包括式(III)的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)和烷基(R)的支化聚乙烯亚胺(PEI)，
Figure BDA0002203409020000151
其中：
m是1至20的整数；
n是1至20的整数；
R是取代或未取代的直链或支链C5-C15烷基；并且
PEI-烷基-PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20。
根据本公开的另一方面，提供了一种形成式(III)的抗菌聚合物的方法，该方法包括：
将烷基接枝的聚乙烯亚胺(PEI-烷基)溶解于去离子水中，形成PEI-烷基溶液；
将碱溶液加入到PEI-烷基溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析最终混合物之前搅拌最终混合物；并且
将最终混合物冻干以获得式(III)的抗菌聚合物。
根据本公开的又一方面，提供了一种形成式(III)的抗菌水凝胶的方法，该方法包括：
将式(III)的抗菌聚合物、交联剂和UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶。
根据本公开的另一个方面，提供了一种在表面上形成式(III)的抗菌水凝胶涂层的方法，该方法包括：
将式(III)的抗菌聚合物、交联剂和可选的UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；
对表面进行改性处理；
将水凝胶溶液沉积在改性表面上；和
用UV光照射水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶涂层。
在各种实施例中，改性处理可以包括等离子体处理、臭氧处理、氧化亚铁处理或在表面上产生自由基的任何其他处理。
根据本公开的另一方面，提供了一种具有涂覆有式(III)的抗菌水凝胶的表面的装置。
根据本公开的又一个方面，提供了一种杀死微生物的方法，该方法包括将式(III)的抗菌聚合物或水凝胶与微生物接触。
为了清楚和简洁起见，应当理解，在合适的情况下，上述关于式(I)或式(II)的抗菌聚合物或水凝胶的讨论适用于式(III)的抗菌聚合物或水凝胶，在此不再赘述。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述具体实施例。
实施例
实施例1
在该实施例中，通过等离子体处理和烷基化聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEI-癸烷-PEGMA)的UV光聚合的组合，开发了一种用于隐形眼镜的耐久抗菌水凝胶涂层。由此开发的PEI-癸烷-PEGMA水凝胶涂层对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌及真菌均显示出优异的广谱抗菌活性。涂层的杀死％和对数减少分别高于99.99％和4.0。
材料和方法
材料
在使用前将支化聚乙烯亚胺(PEI,Sigma-Aldrich,Mn＝104,Mw/Mn＝2.5)冻干至干燥。按如下简要描述，合成了氯官能化聚乙二醇甲基丙烯酸酯(Cl-PEGMA)。首先将11.8mL(35.3mmol)PEGMA溶解于100mL甲苯中，向溶液中加入11.25mL(141.2mmol)氯乙酰氯，然后在120℃下搅拌和回流24小时。反应后，将溶液进行溶剂蒸发，随后向浓缩物中加入二氯甲烷(100mL)进行溶解。然后加入碳酸钾并将混合物搅拌10分钟。过滤并对滤液进行溶剂蒸发后获得产物。
1-溴癸烷、氢氧化钠(NaOH)和异丙醇购自Sigma-Aldrich公司，并按原样使用。无水乙醇购自VWR Pte Ltd(新加坡)，使用无需进一步纯化。
表征
在Bruker AV 300 NMR光谱仪上记录25℃、300MHz下的1H NMR谱。参考四甲基硅烷(TMS)的内标质子，化学位移(δ)以百万分率(ppm)报告。场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)观察在JSM-6701F(日本JEOL)上进行。
烷基化聚乙烯亚胺的制备
通过改变1-溴癸烷/PEI的进料比，经烷基化反应制备具有不同烷基的聚乙烯亚胺(PEI)(方案1，表1)。
Figure BDA0002203409020000181
方案1PEI-癸烷和PEI-癸烷-PEGMA的合成策略。根据PEGMA和癸烷基团的接枝率，即m、n的值，将PEI-癸烷-PEGMA标记为PEI-癸烷-PEGMA(1:n:m)。
表1.具有不同分子量的qPEI的MIC
Figure BDA0002203409020000182
聚合物名称的数字表示1-溴癸烷与PEI的进料比。制备PEI-癸烷(1:10)的典型方法如下：将PEI(2.0g，0.2mmol)溶解于50mL无水乙醇中，并在回流条件下用0.442g 1-溴辛烷(2mmol)烷基化24小时。在相同条件下在另外的24小时用0.2g氢氧化钠中和所生成的HBr。除去溶剂后，将所得残余物溶解于水中并用蒸馏水透析4天。将所获得的产物冷冻干燥24小时，得到聚合物PEI-癸烷(1:10)。其他具有各种接枝率的聚合物通过类似的方法来制备，详细的表征结果在图1中给出。PEI-癸烷(10:1)的1H NMR(300MHz,D2O)：δ＝0.75-0.96ppm(癸烷基团中的CH3)、δ＝0.96-1.6ppm(癸烷基团中的CH2)、δ＝2.1-3.18ppm(PEI中的CH2)。
接枝有PEGMA的PEI-癸烷(PEI-癸烷-PEGMA)的制备
按以下简要描述进行PEI-癸烷与各种比例的PEGMA的接枝。为了简单起见，描述PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)作为示例。首先将1g PEI-癸烷(1:10)溶解于10mL去离子水中，然后加入0.4mL NaOH溶液(1M)。然后以逐滴方式将Cl-PEGMA(0.16g)的异丙醇溶液(1mL)加入到溶液中。将混合物在室温下搅拌反应3小时，然后进行透析(截留分子量(MWCO)10344)。通过冻干获得最终产物。
最低抑菌浓度(MIC)
针对抗菌聚合物的抗菌敏感性，评估MIC(最低抑菌浓度)。在MIC测试中使用细菌物种诸如大肠杆菌(E.coli，K12)、金黄色葡萄球菌(S.aureus，newman)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，PA01)和白色念珠菌(C.albicans，ATCC10231)。将细菌接种并在5mLMueller-Hinton肉汤(MHB，Fluka，MIC测试为分析级)中37℃下在200rpm连续摇动下生长至对数中期。然后，将对数中期细菌培养基用于制备细菌稀释悬浮液以进行抗菌敏感性试验。所使用的抗菌聚合物的起始浓度为1000μg/mL。然后，对于无菌96孔平底微量滴定板的每个孔，在100μL MHB中制备12个连续两倍稀释的抗菌聚合物溶液。MHB中抗菌剂的稀释范围在1000μg/mL至8μg/mL之间。之后，每个孔用100μL光密度为0.0002的细菌稀释悬浮液接种，其，并且每个孔的最终接种物为5×105CFU/mL(其中CFU表示菌落形成单位)。将微量滴定板在培养箱中于37℃孵育18小时。通过用Biorad微孔板分光光度计(Benchmarkplus)测量每个孔中悬浮液的600nm光密度(OD)来确定每个孔中的微生物生长。针对每种细菌和抗菌剂的浓度进行重复测量。在该实验中应用不含抗菌剂的阳性对照样品和不含细菌悬浮液的阴性对照样品。根据孵育18小时后抑制细菌生长所需的抗菌剂的最低浓度来评估MIC。
隐形眼镜上的PEI-癸烷-PEGMA表面涂层
隐形眼镜A由Clearlab公司提供。首先用氩等离子体(March PX-500TM，条件为100W，400mTorr和120s)活化隐形眼镜，然后暴露于空气15分钟以产生表面过氧基。接着，将预处理的隐形眼镜浸入含有PEI-癸烷-PEGMA(10wt％)和PEGDMA(5％)的0.49mL溶液中，然后用UV光(波长365nm，强度10mW cm-2)照射15min。UV照射后，取出样品并用去离子水洗涤以除去未接枝的反应物和吸附的均聚物。
qPEI-PEGMA表面涂层的抗菌测定
(1)细菌培养基的制备
细菌菌株接种于5mL MHB培养基中并在5mL MHB培养基中在37℃、200rpm连续摇动下生长至对数中期。将1mL细菌悬浮液加入到无菌管中，通过离心除去MHB培养基。用1mL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS-由137mM NaCl、2.7mM KCl和10mM磷酸盐缓冲液组成，pH值7.2)洗涤细菌两次，并用1mL PBS制备细菌悬浮液。
(2)在经涂覆的隐形眼镜上接种细菌
用抗菌聚合物涂覆隐形眼镜。涂覆后，用去离子水洗涤经涂覆的隐形眼镜5次。将10μL细菌悬浮液(5×108CFU/mL)的PBS溶液分布到经涂覆的隐形眼镜的表面上，隐形眼镜置于组织培养板内。将不含样品的细菌悬浮液用作对照。将板在37℃下孵育1小时，相对湿度为90％。
(3)细菌的平板计数
在孵育后将2mL PBS加入到每个组织培养板中。将900μL PBS插入24孔板的每个孔中。然后，制备一系列10倍稀释的细菌悬浮液，并在Luria肉汤(LB)琼脂培养基(具有琼脂的LB肉汤，Sigma)中准备铺板。将平板在培养箱中37℃孵育18h并计算CFU。
结果评估如下：
对数减少=Log(对照细胞计数)-Log(经涂覆的镜片上的幸存计数)
Figure BDA0002203409020000211
微生物形态研究
将每种病原体的10μL接种物(5×108CFU mL-1)铺开在隐形眼镜表面上，并在37℃下和相对湿度不低于90％下孵育1h，然后立即用戊二醛(4.0％，3mL)溶液固定4h。通过加入梯度系列(20％-100％)的含水乙醇使膜脱水，然后通过氮气流干燥。通过FE-SEM观察隐形眼镜上的微生物。
结果和讨论
合成
固定化阳离子聚合物的抗菌作用可能是由于它们与带负电荷的磷脂强烈相互作用的能力，允许静电相互作用控制与靶细胞膜的初始结合，然后聚合物上的疏水部分与细菌膜的内部疏水核相互作用，导致完整性破坏和随后的细胞死亡。因此，表面电荷密度和疏水性是影响表面涂层抗菌活性的主要因素。由于亚氨基的pKa值约为10至11，因此PEI是生理环境溶液(pH值约7.2)中的带正电荷的分子。
为了进一步改善其抗菌性能，将疏水基团如烷基部分引入到聚合物骨架中。借助于1-溴癸烷与PEI骨架上的氨基之间的烷基化反应，通过改变溴癸烷/PEI的比例制备接枝有各种癸烷基团的PEI。使用1H NMR表征PEI-癸烷。如图1所示，在1H NMR谱中发现了PEI和癸烷基团的质子信号。此外，基于癸烷质子的积分面积(约0.7至0.9ppm)，发现接枝癸烷基团的程度随着进料比的增加而增加，表明获得了一系列具有各种癸烷基团的PEI-癸烷。
为了在隐形眼镜表面形成稳定的涂层，需要将PEI-癸烷共价接枝到隐形眼镜上。隐形眼镜表面的等离子体处理和光聚合的组合表明是在隐形眼镜上形成稳定涂层的合适策略。为了进行光聚合，需要在PEI-癸烷中引入双键基团。考虑到生物相容性，通过Cl-PEGMA与PEI-癸烷的氨基之间的烷基化反应将PEGMA引入PEI-癸烷中，形成PEI-癸烷-PEGM。
为了探讨PEGMA含量对涂层形成的影响，制备了具有不同密度的PEGMA官能团的PEI-癸烷-PEGMA。使用1H NMR表征PEI-癸烷-PEGMA。如图2所示，观察到PEI-癸烷和PEGMA的信号，特别是在5.58ppm和6.14ppm的双键质子，表明制备了PEI癸烷-PEGMA。此外，接枝PEGMA的程度随着其进料比的增加而增加。
隐形眼镜上的涂层形成
为了形成涂层，首先对隐形眼镜进行氩等离子体处理，以在隐形眼镜的表面上产生过氧基。这些过氧基在UV引发的表面接枝聚合中用作表面引发剂(方案2)。
Figure BDA0002203409020000231
方案2在隐形眼镜上形成PEI-癸烷-PEGMA涂层的示意图。
使用PEI-癸烷-PEGMA在Clearlab隐形眼镜(A镜片)上制备表面涂层。为了确认涂层形成，进行FESEM观察(未示出)，因为FESEM观察是表征表面形态的典型技术。未涂覆的隐形眼镜表现出光滑的表面。然而，涂覆有PEI-癸烷-PEGMA的隐形眼镜显示出皱褶表面，表明在隐形眼镜的表面上固定有PEI-癸烷-PEGM薄层。
同时，研究了由具有不同PEGMA密度的聚合物形成的涂层。发现随着PEI-癸烷-PEGM中PEGMA含量的增加，皱褶涂层变得越来越均匀。当PEGMA的接枝度为4时，即PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)时，观察到均匀的涂层。如果PEGMA接枝度进一步增加时，则涂层变得致密，这归因于更高的交联度。
为了进一步观察涂层在水中的形态，通过液氮将经涂覆的镜片固定，然后冷冻干燥。类似于在烘箱中干燥的未涂覆的隐形眼镜，未涂覆的隐形眼镜也显示出光滑的表面(图3(a))。对于用PEI-癸烷-PEGMA(1:10:1)涂覆的隐形眼镜，表面表现出衬套结构(图3(b))，因为聚合物被设计和合成为每条链仅具有一个PEGMA基团，使其从表面形成刷子。随着PEGMA含量的增加，清楚地观察到作为典型特征的网络结构(图3(c-f))，表明涂层由聚合物交联产生的水凝胶形成。与PEI-癸烷-PEGMA(1:10:2)涂层相比，PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)的网络更加均匀，这与烘箱下干燥的样品的结果一致。涂层的网络结构将根据由交联的增加引起的PEGMA含量的进一步增加而消失，例如，PEI-癸烷-PEGMA(1:10:8)和PEI-癸烷-PEGMA(1:10:16)涂层(图3(e-f))。
PEI-癸烷的抗菌活性
如前所述，疏水部分通过插入病原体膜的内部疏水核而在杀死病原体中起重要作用，导致细胞死亡。因此，通过将疏水基团引入PEI骨架可以改善抗菌活性。为了确认接枝有癸烷基团的PEI的抗菌活性是否得到改善，研究了MIC。MIC值汇总在表1中。如表1所示，与原始PEI相比，细菌的MIC随着癸烷基团的引入而降低，PEI-癸烷(1:10)在所有分子中显示出最低的MIC。然而，白色念珠菌的MIC仍然很高，表明PEI和PEI-癸烷显示出较差的抗真菌活性。癸烷基团的引入也没有提高其有效性。这可能归因于白色念珠菌细胞与溶液中聚合物之间的不良相互作用。因此，基于MIC结果，选择PEI-癸烷(1:10)作为骨架材料进行进一步研究或优化。
PEI-癸烷-PEGMA的抗菌活性
为了确定PEGMA是否会影响PEI-癸烷的抗菌活性，研究了PEI-癸烷-PEGMA的MIC。发现接枝有PEGMA之后MIC增加(表2)。
表2 PEI-癸烷-PEGMA的MIC
Figure BDA0002203409020000251
隐形眼镜上的PEI-癸烷-PEGMA涂层
已经证明在隐形眼镜上形成有PEI-癸烷-PEGMA涂层，然后研究涂层是否表现出抗菌活性。因此，用细菌和真菌评估PEI-癸烷-PEGMA的抗菌活性。如图4所示，与对照组相比，在涂层上未观察到病原体，表明细菌通过与涂层接触而被杀死。此外，计算细菌和真菌细胞数的对数减少和杀死％。如表3中所列出的，涂层显示出细菌和真菌的对数减少大，超过4，杀死％大于99.99％。结果表明，PEI-癸烷-PEGMA涂层对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌具有高效和广谱性。还发现PEI-癸烷-PEGMA涂层的抗菌活性不受PEGMA接枝的影响。
表3　隐形眼镜上PEI-癸烷-PEGMA涂层对革兰氏阴性/阳性菌和真菌的抗菌活性
Figure BDA0002203409020000261
为了获得关于涂层上的细菌的更直接的信息，进行FESEM观察以在孵育1小时后观察涂层上的细菌。如图5所示，与对照相比，PEI-癸烷-PEGMA涂层上的病原体表现出明显的形态变化。对照表面上的细菌表面看起来光滑且圆润，而PEI-癸烷-PEGMA涂层上的细菌表现出有皱褶且枯萎的表面。由于PEI-癸烷-PEGMA是一种具有正电荷和癸烷疏水段的阳离子聚合物，因此可以预期这些结果。PEI-癸烷-PEGMA能够与阴离子表面和疏水细胞膜有效地相互作用，从而通过吸附到微生物细胞表面并扰乱细胞外膜来杀死微生物，这导致细胞质的异常分布和对微生物的损害。
结论
选择PEI作为骨架以开发一种耐久的抗菌水凝胶涂层。通过疏水性癸烷基团进行PEI改性以改善其抗菌性能。优化的PEI-癸烷(1:10)显示出对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的抗菌活性。进行进一步改性以通过用PEGMA接枝给予PEI-癸烷可交联能力，形成PEI-癸烷-PEGMA。使用合成的PEI-癸烷-PEGMA以通过等离子体-UV方法在隐形眼镜上制备涂层。该PEI-癸烷-PEGMA涂层显示出优异的广谱抗菌活性，杀死％和对数减少分别高于99.99％和4。本文提出的涂层可能为在其他植入物(例如导管)上形成涂层开辟了一条途径。
实施例2
在该实施例中，通过等离子体处理和聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEI-PEGMA)及添加癸烷基团的其烷基化形式(PEI-癸烷-PEGMA)的UV光聚合的组合，开发了一种用于生物医学装置的耐久抗菌水凝胶涂层。这些PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA涂层对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌以及真菌均显示出优异的广谱抗菌活性。水凝胶的杀死％和对数减少分别高于99.99％和7.0。水凝胶与人细胞是生物相容的，因为当在体外针对人真皮成纤维细胞(HDF)细胞进行测试时，水凝胶显示出具有超过95％的细胞活力。
材料和方法
材料
在使用前将支化聚乙烯亚胺(PEI,Sigma-Aldrich,Mn＝104,Mw/Mn＝2.5)冻干至干燥。1-溴癸烷、氢氧化钠、碳酸钾、异丙醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA，Mn＝360)和Irgacure 2959购自Sigma-Aldrich公司，并按原样使用。氯乙酰氯、无水乙醇、甲苯和二氯甲烷购自Merck Pte Ltd(新加坡)，使用无需进一步纯化。聚乙二醇(1000)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)购自PolySciences,Inc.。
表征
在Bruker AV 300NMR光谱仪上记录25℃、300MHz下的1H NMR谱。参考四甲基硅烷(TMS)的内标质子，化学位移(δ)以ppm报告。FESEM观察在JSM-6701F(日本JEOL)上进行。用Tecan Infinite 200酶标仪测量细菌悬浮液的光密度和MTT。
氯官能化聚乙二醇甲基丙烯酸酯(Cl-PEGMA)的制备
首先将11.8mL(35.3mmol)PEGMA溶解于100mL甲苯中，向溶液中加入11.25mL(141.2mmol)氯乙酰氯，然后在120℃下搅拌并回流24小时。反应后，将溶液进行溶剂蒸发，随后向浓缩物中加入二氯甲烷(100mL)进行溶解。然后加入碳酸钾并将混合物搅拌10分钟。过滤并对滤液进行溶剂蒸发后获得产物。
接枝有PEGMA(PEI-PEGMA)的聚乙烯亚胺的制备
PEI用各种比例的PEGMA接枝，该方法简要描述如下。为了简单起见，描述PEI-PEGMA(1:5)作为示例。首先将1g PEI溶解于10mL去离子水中，并加入0.4mL NaOH溶液(1M)。然后，以逐滴方式将Cl-PEGMA(0.2g)异丙醇(1mL)溶液加入到溶液中。将混合物在室温下搅拌反应3小时，然后进行透析(MWCO 10344)。通过冻干获得最终产物。
烷基化聚乙烯亚胺的制备
通过改变1-溴癸烷/PEI的进料比，经烷基化反应制备具有不同烷基的PEI(方案1，表1)。
聚合物名称的数字表示1-溴癸烷与PEI的进料比。制备PEI-癸烷(1:10)的典型方法如下：将PEI(2.0g，0.2mmol)溶解于50mL无水乙醇中，并在回流条件下用0.442g的1-溴辛烷(2mmol)烷基化24小时。在相同条件下在另外的24小时用0.2g氢氧化钠中和所生成的HBr。除去溶剂后，将所得残余物溶解于水中并用蒸馏水透析4天。将所获得的产物冷冻干燥24小时，得到聚合物PEI-癸烷(1:10)。其他具有各种接枝率的聚合物通过类似的方法制备，详细的表征结果在图1中给出。PEI-癸烷(10:1)的1H NMR(300MHz,D2O)：δ＝0.75-0.96ppm(癸烷基团中的CH3)、δ＝0.96-1.6ppm(癸烷基团中的CH2)、δ＝2.1-3.18ppm(PEI中的CH2)。
接枝有PEGMA的PEI-癸烷(PEI-癸烷-PEGMA)的制备的如下简要描述进行PEI-癸烷与各种比例的PEGMA的接枝。为了简单起见，描述PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)作为示例。首先将1g PEI-癸烷(1:10)溶解于10mL去离子水中，然后加入0.4mL NaOH溶液(1M)。接着以逐滴方式将Cl-PEGMA(0.16g)的异丙醇(1mL)溶液加入到溶液中。将混合物在室温下搅拌反应3小时，然后进行透析(MWCO 10344)。通过冻干获得最终产物。
最低抑菌浓度(MIC)
针对抗菌聚合物的抗菌敏感性，评估MIC。在MIC测试中使用细菌物种诸如大肠杆菌(K12)、金黄色葡萄球菌(newman)、铜绿假单胞菌(PA01)和白色念珠菌(ATCC10231)。将细菌接种并在5mL Mueller-Hinton肉汤(MHB，Fluka，对MIC测试为分析级)中37℃下在200rpm连续摇动下生长至对数中期。然后，将对数中期细菌培养基用于制备细菌稀释悬浮液以进行抗菌敏感性试验。所使用的抗菌聚合物的起始浓度为1000μg/mL。然后，对于无菌96孔平底微量滴定板的每个孔，在100μL MHB中制备12个连续两倍稀释的抗菌聚合物溶液。MHB中抗菌剂的稀释范围在1000μg/mL至8μg/mL之间。之后，每个孔用100μL光密度为0.0002的细菌稀释悬浮液接种，并且每个孔的最终接种物为5×105CFU/mL。将微量滴定板在培养箱中于37℃孵育18小时。通过用Biorad微孔板分光光度计(Benchmarkplus)测量每个孔中悬浮液的600nm光密度来确定每个孔中的微生物生长。针对每种细菌和抗菌剂的浓度进行重复测量。在该实验中应用不含抗菌剂的阳性对照样品和不含细菌悬浮液的阴性对照样品。根据孵育18小时后抑制细菌生长所需的抗菌剂的最低浓度来评估MIC。
PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶的形成
使用对前体水凝胶溶液进行的UV照射形成PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶。首先将UV引发剂Irgacure 2959溶解于乙醇中以制备10％储备溶液。将含有聚合物、交联剂(PEGDMA)和UV引发剂(Irgacure 2959)的水凝胶溶液混合并在1.5mL微管中完全溶解于去离子水中。将0.5mL水凝胶溶液转移到24孔板的孔中。然后，用UV光(波长365nm，强度10mWcm-2)照射水凝胶溶液15分钟从而发生交联形成水凝胶。将水凝胶在乙醇中洗涤三次并用去离子水超声洗涤三次以除去所有未反应的前体。
水凝胶的体外抗菌测定
(I)细菌培养基的制备
将细菌菌株接种并分散在4mL MHB培养基中，37℃下以220rpm连续摇动至对数中期。将1mL细菌悬浮液加入到无菌微管中，通过离心除去MHB培养基，然后倾去上清液。用1mLPBS洗涤细菌三次，并用1mL PBS制备最终的细菌悬浮液。
(2)在水凝胶上接种细菌
将10μL含有约107CFU的细菌悬浮液的PBS溶液接种到置于小组织培养皮氏培养皿上的水凝胶表面上。然后将细菌悬浮液均匀铺开以覆盖水凝胶的整个表面。通过直接在小皮氏培养皿上接种细菌来进行对照。将皮氏培养皿在37℃下孵育2小时，相对湿度为90％。
(3)细菌计数的计算
在孵育后将1mL PBS加入到每个组织培养皮氏培养皿中。将0.9mL PBS加入到24孔板的每个孔中。然后，制备一系列10倍稀释的细菌悬浮液，并在LB琼脂(具有琼脂的LB肉汤，Sigma)上铺板。将平板在培养箱中于37℃孵育18h并计算细菌菌落。
对数减少和杀死％结果评估如下。
对数减少＝Log(对照的总CFU)-Log(水凝胶上的总CFU)
Figure BDA0002203409020000311
水凝胶的体外生物相容性测定
用人真皮成纤维细胞(HDF)进行生物相容性研究。使用的细胞培养基为完全DMEM，其由10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素(青霉素-链霉素)组成。
(I)Transwell MTT测定
将HDF细胞在24孔板中从初始接种物为每孔有5×104个细胞起培养，并在CO2培养箱中于37℃孵育24小时以进行细胞附着。在与HDF细胞一起于37℃孵育24小时之前，切出直径约5mm的水凝胶并置于transwell嵌套中(Falcon，1μm孔隙)。然后，除去水凝胶并用MTT溶液(1mg/mL)更换培养基，在37℃下孵育4小时以使活细胞染色。除去MTT溶液，加入二甲基亚砜(DMSO)并将板以150rpm摇动15分钟。细胞活力根据每个孔的570nm吸光度来测量，并与仅有细胞的对照孔(作为100％细胞活力对照)进行比较。
(2)接触式MTT测定
将HDF细胞在96孔板中从初始接种物为每孔有1×104个细胞起培养，并在CO2培养箱中于37℃孵育24小时以进行细胞附着。切出直径约5mm的水凝胶且浸入细胞培养物中并在37℃孵育24小时。然后，除去水凝胶并用MTT溶液(1mg/mL)更换培养基，在37℃孵育4小时以使活细胞染色。除去MTT溶液，加入DMSO并将板以150rpm摇动15分钟。细胞活力通过每个孔的570nm吸光度来测量，并与仅有细胞的对照孔(作为100％细胞活力对照)进行比较。
结果评估如下：
Figure BDA0002203409020000321
隐形眼镜上的PEI-癸烷-PEGMA表面涂层
隐形眼镜A由Clearlab公司提供。首先用氩等离子体(March PX-500TM，条件为100W，400mTorr和120s)活化隐形眼镜，然后暴露于空气15分钟以产生表面过氧基。接着，将预处理的隐形眼镜浸入含有PEI-癸烷-PEGMA(10wt％)和PEGDMA(5％)的0.49mL溶液中，然后用UV光(波长365nm，强度10mW cm-2)照射15min。UV照射后，取出样品并用去离子水洗涤以除去未接枝的反应物和吸附的均聚物。
PEI-癸烷-PEGMA表面涂层的抗菌测定
(1)细菌培养基的制备
将细菌菌株接种并分散于4mL MHB培养基中，37℃下以220rpm连续摇动至对数中期。将1mL细菌悬浮液加入到无菌微管中，通过离心除去MHB培养基，然后倾去上清液。用1mLPBS洗涤细菌三次，并用1mL PBS制备最终的细菌悬浮液。
(2)在经涂覆的隐形眼镜上接种细菌
用抗菌聚合物涂覆隐形眼镜。涂覆后，用去离子水洗涤经涂覆的隐形眼镜5次。将10μL细菌悬浮液(5×108CFU/mL)的PBS溶液分布到经涂覆的隐形眼镜的表面上，隐形眼镜置于组织培养板内。将不含样品的细菌悬浮液用作对照。将板在37℃孵育1小时，相对湿度为90％。
(3)细菌的平板计数
在孵育后将2mL PBS加入到每个组织培养板中。将900μL PBS注入24孔板的每个孔中。然后，制备一系列10倍稀释的细菌悬浮液，并在LB琼脂培养基(具有琼脂的LB肉汤，Sigma)中准备铺板。将平板在培养箱中于37℃孵育18h并计算CFU。
如实施例1中所述评估对数减少和杀死％结果。
微生物形态研究
将每种病原体的10μL接种物(5×108CFU/mL)铺开在隐形眼镜表面上，并在37℃和相对湿度不低于90％下孵育1h，然后立即用戊二醛(4.0％，3mL)溶液固定4h。通过加入梯度系列(20％-100％)的含水乙醇使膜脱水，然后通过氮气流干燥。通过FESEM观察隐形眼镜上的微生物。
耐擦拭抗菌涂层的制剂
为了改善涂层制剂以抵抗由使用者的手指施加的正常负荷引起的失效，将交联剂(聚乙二醇二丙烯酸酯-PEGDA-分子量-700，Sigma-Aldrich)和单体(甲基丙烯酸2-羟乙酯，98％，分子量-130.14，ACROS有机物)加入到抗菌聚合物PEI-癸烷-PEGMA中。制剂的组成如下：表4。
表4配制的水凝胶组合物
Figure BDA0002203409020000331
将隐形眼镜用氩等离子体在200W下处理2min，气体流速为140cc/min，以在隐形眼镜上形成化学反应性官能度。处理后，将经等离子体处理的隐形眼镜在空气中暴露10min，以在隐形眼镜的表面上形成过氧化物。然后，将隐形眼镜浸入涂层溶液中并用UV完成10min照射以形成经涂覆的隐形眼镜。
体内伤口感染小鼠模型
(1)水凝胶伤口敷料的制备
根据上文所述并稍作修改形成水凝胶。将50μL水凝胶前体溶液加入到96孔板中并用UV光(波长365nm，强度10mW cm-2)照射15分钟从而发生交联形成水凝胶。将水凝胶在乙醇中洗涤三次，并用去离子水洗涤三次，以除去所有未反应的前体。然后，使用刮刀将水凝胶小心地从孔中舀出并置于透明的商业粘合剂膜(Opsite Flexifix，Smith&Nephew)上。
(2)伤口感染小鼠模型
在小鼠模型中使用6周龄且重约20g的雌性Swiss Albino小鼠。在第1天制造小鼠伤口。首先使用氯胺酮:赛拉嗪混合物通过腹膜内注射麻醉小鼠。刮干净小鼠背部的毛。然后，使用镊子和解剖剪刀从小鼠的背部切下一个直径约为6毫米的圆形皮肤切块以产生伤口。之后，将20μL约107CFU的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌BAA-40(MRSA)的PBS溶液接种在小鼠的受伤皮肤上以模拟伤口感染。然后，将伤口敷料施用到感染小鼠的皮肤上并观察3天，每天更换敷料。仅用透明的商业敷料(Opsite Flexifix，Smith&Nephew)处理对照小鼠，而用PEI-PEGMA水凝胶敷料处理水凝胶处理小鼠。每组使用5只小鼠进行实验。
(3)受伤皮肤上的细菌负荷的计算
在第4天，使用过量的麻醉剂然后进行颈椎脱臼，通过安乐死处死所有小鼠。切下每块受伤的皮肤并通过超声处理在1mL PBS中匀浆15分钟，接着涡旋5分钟。然后，在PBS中制备一系列10倍稀释的细菌悬浮液，并将其接种到LB琼脂(具有琼脂的LB肉汤，Sigma)上。将平板在培养箱中于37℃孵育18h并计算细菌菌落。
对数减少和杀死％结果评估如下。
对数减少＝Log(对照的总CFU)-Log(水凝胶上的总CFU)
Figure BDA0002203409020000351
结果和讨论
合成
固定化阳离子聚合物的抗菌作用可能是由于它们与带负电荷的磷脂强烈相互作用的能力，允许静电相互作用控制与靶细胞膜的初始结合，然后聚合物上的疏水部分与细菌膜的内部疏水核相互作用，导致完整性破坏和随后的细胞死亡。因此，表面电荷密度和疏水性是影响表面涂层抗菌活性的主要因素。由于亚氨基的pKa值约为10至11，因此PEI是生理环境溶液(pH值约7.2)中的带正电荷的分子。
为了进一步改善其抗菌性能，将疏水基团如烷基部分引入到聚合物骨架中。借助于1-溴癸烷与PEI骨架上的氨基之间的烷基化反应，通过改变溴癸烷/PEI的比例制备接枝有各种癸烷基团的PEI。使用1H NMR表征PEI-癸烷。如图1所示，在1H NMR谱中发现了PEI和癸烷基团的质子信号。此外，基于癸烷质子的积分面积(约0.7至0.9ppm)，发现接枝癸烷基团的程度随着进料比的增加而增加，表明获得了一系列具有各种癸烷基团的PEI-癸烷。
为了在隐形眼镜表面形成稳定的涂层，需要将PEI-癸烷共价接枝到隐形眼镜上。隐形眼镜表面的等离子体处理和光聚合的组合表明是在隐形眼镜上形成稳定涂层的合适策略。为了进行光聚合，需要在PEI-癸烷中引入双键基团。考虑到生物相容性，通过Cl-PEGMA与PEI-癸烷的氨基之间的烷基化反应将PEGMA引入PEI-癸烷中，形成PEI-癸烷-PEGM。
为了探讨PEGMA含量对涂层形成的影响，制备了具有不同密度的PEGMA官能团的PEI-癸烷-PEGMA。使用1H NMR表征PEI-癸烷-PEGMA。如图2所示，观察到PEI-癸烷和PEGMA的信号，特别是在5.58ppm和6.14ppm的双键质子，表明制备了PEI癸烷-PEGMA。此外，接枝PEGMA的程度随着其进料比的增加而增加。
第一部分：隐形眼镜涂层
隐形眼镜上的涂层形成
为了形成涂层，首先对隐形眼镜进行氩等离子体处理，以在隐形眼镜的表面上产生过氧基。这些过氧基在UV引发的表面接枝聚合中用作表面引发剂(方案2)。
使用PEI-癸烷-PEGMA在Clearlab隐形眼镜(A镜片)上制备表面涂层。为了确认涂层形成，进行FESEM观察(未示出)，因为FESEM观察是表征表面形态的典型技术。未涂覆的隐形眼镜表现出光滑的表面。然而，涂覆有PEI-癸烷-PEGMA的隐形眼镜显示出皱褶表面，表明在隐形眼镜的表面上固定有PEI-癸烷-PEGM薄层。
同时，研究了由具有不同PEGMA密度的聚合物形成的涂层。发现随着PEI-癸烷-PEGM中PEGMA含量的增加，皱褶涂层变得越来越均匀。当PEGMA的接枝度为4时，即PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)时，观察到均匀的涂层。如果PEGMA接枝度进一步增加时，则涂层变得致密，这归因于更高的交联度。
为了进一步观察涂层在水中的形态，通过液氮将经涂覆的镜片固定，然后冷冻干燥。类似于在烘箱中干燥的未涂覆的隐形眼镜，未涂覆的隐形眼镜也显示出光滑的表面(图3(a))。对于用PEI-癸烷-PEGMA(1:10:1)涂覆的隐形眼镜，表面表现出衬套结构(图3(b))，因为聚合物被设计和合成为每条链仅具有一个PEGMA基团，使其从表面形成刷子。随着PEGMA含量的增加，清楚地观察到作为典型特征的网络结构(图3(c-f))，表明涂层由聚合物交联产生的水凝胶形成。与PEI-癸烷-PEGMA(1:10:2)涂层相比，PEI-癸烷-PEGMA(1:10:4)的网络更加均匀，这与烘箱下干燥的样品的结果一致。涂层的网络结构将根据由交联的增加引起的PEGMA含量的进一步增加而消失，例如，PEI-癸烷-PEGMA(1:10:8)和PEI-癸烷-PEGMA(1:10:16)涂层(图3(e-f))。
PEI-癸烷的抗菌活性
如前所述，疏水部分通过插入病原体膜的内部疏水核而在杀死病原体中起重要作用，导致细胞死亡。因此，通过将疏水基团引入PEI骨架可以改善抗菌活性。为了确认接枝有癸烷基团的PEI的抗菌活性是否得到改善，研究了MIC。MIC值汇总在表1中。如表1所示，与原始PEI相比，细菌的MIC随着癸烷基团的引入而降低，PEI-癸烷(1:10)在所有分子中显示出最低的MIC。然而，白色念珠菌的MIC仍然很高，表明PEI和PEI-癸烷显示出较差的抗真菌活性。癸烷基团的引入也没有提高其有效性。这可能归因于白色念珠菌细胞与溶液中聚合物之间的不良相互作用。因此，基于MIC结果，选择PEI-癸烷(1:10)作为骨架材料进行进一步研究或优化。
PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA的抗菌活性
为了检查PEGMA是否会影响PEI和PEI-癸烷的抗菌活性，测试了PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA的MIC。发现接枝有PEGMA之后MIC增加(表5)。
表5 PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA的MIC
Figure BDA0002203409020000381
已经证明在隐形眼镜上形成有PEI-癸烷-PEGMA涂层，然后研究涂层是否表现出抗菌活性。因此，用细菌和真菌评估PEI-癸烷-PEGMA的抗菌活性。如图4所示，与对照相比，在涂层上不能观察到细菌，表明细菌在与涂层接触时被杀死。此外，计算细菌和真菌细胞数的对数减少和杀死％。如表4中所列出的，涂层显示出细菌和真菌的对数减少大，超过4，杀死％大于99.99％。结果表明，PEI-癸烷-PEGMA涂层对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌具有高效和广谱性。还发现涂层的抗菌活性不受PEGMA接枝的影响。
为了获得关于涂层上的细菌的更直接的信息，进行FESEM观察以在孵育1小时后观察涂层上的细菌。如图5所示，与对照相比，PEI-癸烷-PEGMA涂层上的病原体表现出明显的形态变化。对照表面上的细菌表面看起来光滑且圆润，而PEI-癸烷-PEGMA涂层上的细菌表现出有皱褶且枯萎的表面。由于PEI-癸烷-PEGMA是一种具有正电荷和癸烷疏水段的阳离子聚合物，因此可以预期这些结果。PEI-癸烷-PEGMA能够与阴离子表面和疏水细胞膜有效地相互作用，从而通过吸附到微生物细胞表面并扰乱细胞外膜来杀死微生物，这导致细胞质的异常分布和对微生物的损害。
耐擦拭涂层制剂A和B
为了改善涂层制剂以抵抗由使用者的手指施加的正常负荷引起的失效，将交联剂(聚乙二醇二丙烯酸酯-PEGDA-分子量-700，Sigma-Aldrich)和单体(甲基丙烯酸2-羟乙酯，98％，分子量-130.14，ACROS有机物)加入到抗菌聚合物PEI-癸烷-PEGMA中。
制剂A的组成示于表3中。将隐形眼镜用氩等离子体在200W下处理2min，气体流速为140cc/min，以在隐形眼镜上形成化学反应性官能度。处理后，将经等离子体处理的隐形眼镜在空气中暴露10min，以在隐形眼镜的表面上形成过氧化物。然后，将隐形眼镜浸入涂层溶液中并用UV完成10min照射以形成经涂覆的隐形眼镜。用1×107CFU的大肠杆菌测试经涂覆的隐形眼镜的抗菌活性。观察到对照组(未涂覆的隐形眼镜)在表面上具有1.17×107CFU的大肠杆菌。具有制剂A的经涂覆的隐形眼镜似乎对抗菌活性有效，杀死率超过99.99999％，对数减少约7。因此，可以断定在制剂中交联剂PEGDA和单体HEMA的并入也可能对抗菌活性有效。
首先将经涂覆的隐形眼镜浸入置于市售隐形眼镜盒中的标准市售隐形眼镜消毒液。然后，将隐形眼镜从盒中取出并根据制造商的说明擦拭10秒。擦拭后，隐形眼镜更换为带有新鲜消毒液的隐形眼镜盒。擦拭循环重复5次并评估抗菌效果。用1×107CFU的大肠杆菌测试5次擦拭循环后经涂覆的隐形眼镜的抗菌活性。观察到对照组(未涂覆的隐形眼镜)在表面上具有1.55×107CFU的大肠杆菌。观察到用表3中所示制剂涂覆的隐形眼镜在表面上具有5×103CFU。在擦拭期间，涂层似乎从隐形眼镜的表面崩解，因为对数减少从7减少到3.49尽管其良好的对数减少为3.49。此外，在擦拭期间，观察到涂层的柔软性。因此，在下一种制剂B中使用三甲基丙烯酰胺丙基氯化铵代替HEMA。
用1×107CFU的大肠杆菌测试经涂覆的隐形眼镜的抗菌活性。观察到对照组(未涂覆的隐形眼镜)在表面上具有8×106CFU的大肠杆菌。具有制剂B的经涂覆的隐形眼镜似乎对抗菌活性有效，杀死率超过99.99999％，对数减少为6.90。对于涂覆有表3中所示制剂的隐形眼镜，未检测到活细胞。这些观察结果表明，PEI-癸烷-PEGMA、PEGDA(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵对隐形眼镜的作用可能是对大肠杆菌粘附的抑制。图3显示了涂覆有不同制剂的隐形眼镜的SEM照片。这些照片证实了隐形眼镜的表面上有水凝胶多孔网络。
用1×107CFU的大肠杆菌测试经涂覆的隐形眼镜的抗菌活性。在未涂覆的隐形眼镜的表面上检测到8×106CFU的大肠杆菌。在5个擦拭循环之后，用表3所示制剂涂覆的隐形眼镜似乎保持相同的抗菌活性，杀死率超过99.9999％，对数减少为6.90。在5个擦拭循环之后，涂覆有表3中所示制剂的隐形眼镜未检测到活细胞。这些观察结果表明，PEI-癸烷-PEGMA、PEGDA(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵改善了官能化聚合物对施加的手指负荷的敏感性。图3显示了涂覆有表3所示制剂的隐形眼镜的SEM照片。这些照片证实在5个擦拭测试后，水凝胶层在隐形眼镜表面上是稳定的。
在10个擦拭循环后，经涂覆的抗菌隐形眼镜在暴露后对活大肠杆菌中造成超过99.9999％的杀死率，完全抑制细菌生长并且对数减少超过6。涂层材料的这种高抗菌功效可能反映了这些材料抵抗来自隐形眼镜基底的涂层失效的能力。由于在未涂覆的隐形眼镜表面上观察到3.98×106CFU的大肠杆菌，并且在10个擦拭测试循环后没有在经涂覆的镜片上检测到细菌，因此经涂覆的镜片实现了显著的细菌减少。此外，经过10个擦拭循环后经涂覆的隐形眼镜导致表面具有复杂的多孔形态。十个擦拭循环不会改变涂层的形态和附着。
第二部分：抗菌伤口敷料
PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶的交联
PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶均使用UV照射来进行交联，因为与热交联和化学交联相比，UV照射是快速且有效的方法。研究了在凝胶化过程中使用的不同重量百分比的单体和交联剂，以选择最佳制剂用于进一步研究。使用聚乙二醇(1000)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)作为交联剂。水凝胶的制剂如表6所示。
表6 PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶的制剂
Figure BDA0002203409020000411
通常，使用5-10％重量百分比的单体和交联剂来形成水凝胶。在暴露于UV光之后，制剂1和2(5％单体，5％PEGDMA)完全不形成水凝胶。制剂3(10％PEI-PEGMA，5％交联剂)形成在浸入水中后易于崩解的非常软的水凝胶。制剂4(10％PEI-癸烷-PEGMA，5％PEGDMA)产生良好的水凝胶。对于PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA二者，制剂5和6(10％单体，10％PEGDMA)产生最佳的水凝胶，因为该水凝胶在长时间浸入水中时是稳定的。选择制剂5和6用于进一步研究，因为其他制剂未形成合适的水凝胶，并且对于PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGM，单体和交联剂的重量百分比都是一致的。
水凝胶的体外抗菌活性
测试水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌BAA-40(MRSA)的接触活性杀菌作用。PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶均显示出对两种细菌菌株的杀菌作用非常好，杀死了接种在水凝胶表面上的所有细菌。由于对照由1.16×107CFU的大肠杆菌和1.30×107CFU的MRSA组成，对于两种水凝胶，大肠杆菌的细菌的对数减少可计算为7.06，MRSA的细菌的对数减少可计算为7.11。因此，对于两种水凝胶，确定两种细菌的杀死％大于99.99999％。
表7显示了当用PEI-PEGMA水凝胶和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶孵育时PA01、CR-PA、鲍曼不动杆菌、CR-AB、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和MRSA的体外细菌对数减少。在孵育2h后，对照中有大约107CFU的细菌存活，但用当用PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶孵育时无一存活。这相当于与对照相比，通过两种水凝胶细菌对数减少超过7或杀死超过99.99999％的细菌。
Figure BDA0002203409020000421
表7显示了当用PEI-PEGMA水凝胶和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶孵育时PA01、CR-PA、鲍曼不动杆菌、CR-AB、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和MRSA的体外细菌对数减少。
该结果表明，两种水凝胶在接触模式下在杀死细菌中都非常有效。据推测，因由水凝胶网络中的许多阳离子氨基组成的PEI的高度支化性质，水凝胶能够杀死所有细菌。水凝胶网络中的阳离子基团能够通过静电相互作用“吸附”在细菌中，随后破坏细菌细胞壁以杀死细菌。
水凝胶的体外生物相容性
测试了水凝胶与HDF细胞的生物相容性。使用Transwell MTT测定法作为水凝胶浸出的量度，因为水凝胶通常是有毒的并且会降低细胞的活力。使用接触式MTT测定法来确定水凝胶与细胞的接触相容性。对于Transwell MTT，两种水凝胶(PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA)均显示HDF细胞的细胞活力在95％以上(图6)。这意味着水凝胶的内容物没有太多的浸出，并且可以断定水凝胶是稳定且适当交联的。对于接触式MTT，两种水凝胶均显示出HDF细胞的细胞活力在85％以上。这意味着水凝胶在与细胞接触时是相容的，并且不会对细胞产生任何接触毒性。这些结果证明水凝胶与HDF细胞是非常生物相容的，并且可以用作生物医学装置中的涂层。
水凝胶的溶胀动力学
研究水凝胶的溶胀动力学以确定水凝胶能够溶胀的速度和程度。在浸入大量水后，在零点时间以及不同时间点对水凝胶进行称重。在测量其质量之前，用滤纸适当地干燥水凝胶。根据下式确定某些时间点的溶胀比。
Figure BDA0002203409020000431
然后将数据绘制成线图，如图7所示。可以看出，两种水凝胶均非常快速地溶胀，仅10min后达到最大溶胀，这是第一个时间点。这是水凝胶的优异品质，因为它们可以非常快速地吸收水。水凝胶快速溶胀也重要的，因为水凝胶能够快速吸收伤口渗出液并保持伤口区域湿润，这在伤口愈合过程中至关重要。据推测，水凝胶因由PEI的许多氨基基团造成的高阳离子电荷，而能够如此迅速地溶胀，其非常快地吸引水。此外，水凝胶能够溶胀至高达其原始质量的十倍以上。
体内伤口感染小鼠模型
由于PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶在杀菌能力，体外生物相容性和溶胀动力学等方面存在许多相似性，因此选择PEI-PEGMA水凝胶用于体内研究，因为PEI-PEGMA水凝胶需要更少和更简单的合成步骤。将大约107CFU的MRSA接种在每只小鼠的受伤皮肤上。将细菌铺板并确定含有1.60×107CFU的MRSA。接下来，将对照和水凝胶敷料施用于小鼠上并每日更换，持续三天。在第4天，使所有小鼠安乐死，并计算受伤的皮肤的CFU计数。确定对照小鼠的MRSA平均计数为1.93×107CFU(图8)，略高于第1天受伤皮肤上感染的初始接种物。在铺板后，经PEI-PEGMA水凝胶处理的小鼠的MRSA平均计数为0。这意味着与对照敷料相比，PEI-PEGMA水凝胶敷料能够使活菌计数减少7.28个数量级。这相当于有效杀死超过99.999999％的MRSA。体内对数减少结果与体外试验相似，在体外试验中所有细菌均被水凝胶杀死。此外，三天后，经水凝胶处理的小鼠的伤口较比对照小鼠更清洁并略小(图9)。
结论
由于PEI的高度支化性质并含有许多阳离子胺基，选择PEI作为骨架以开发抗菌水凝胶。PEI通过接枝PEGMA基团而改性并且能够交联形成水凝胶。进行PEI与疏水性癸烷基团的进一步烷基化以改善其抗菌性能。然而，对于体外抗菌测试，PEI-PEGMA水凝胶能够表现得与PEI-癸烷-PEGMA水凝胶一样好，杀死接种在表面上的所有细菌。两种水凝胶的transwell和接触式MTT也非常相似，表明水凝胶非常生物相容并且适合在生物医学应用中使用。使用合成的PEI-癸烷-PEGMA以通过等离子体-UV方法在隐形眼镜上制备涂层。该PEI-癸烷-PEGMA涂层显示出优异的广谱抗菌活性，其杀死％和对数减少分别高于99.99％和4。对于伤口敷料，小鼠模型结果与体外结果一致，PEI-PEGMA水凝胶杀死接种在受伤皮肤上的所有细菌。本文提出的抗菌水凝胶被证明非常有效地用作感染伤口的抗菌剂。在其他生物医学应用(例如形成水凝胶涂层以对抗许多种植体相关的感染)中也可以对水凝胶进行探索。
实施例3
在该实施例中，通过聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEI-PEGMA)的UV光聚合，然后在乙醇和水中超声2h以除去残余单体，从而开发一种用于控制伤口感染的不可浸出的基于阳离子聚合物的水凝胶。UV-可见吸光度测试支持不可浸出的结论，因为水凝胶浸泡24小时的溶液(5mL水中有100mg水凝胶)中未检测到信号，而即使在1μg/mL的低浓度的水凝胶聚合物中也可以在200nm处观察到峰。
在生物膜感染模型中，比较水凝胶与商用抗菌伤口辅料(Allevyn Ag和AlgisiteAg，Smith&Nephew)的功效，PEI水凝胶表现更好，杀死4个对数级(超过99.99％)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA USA300)，而商业抗菌敷料仅将细菌数减少一个对数级(超过90％)。此外，在预防性小鼠模型中，水凝胶显示在受感染的(107CFU)全切除皮肤伤口中杀死6+级(超过99.9999％)的MRSA USA300和4+级(超过99.99％)的铜绿假单胞菌(PA01)。水凝胶也是非炎性的和无热原的，因为水凝胶将感染小鼠的皮肤中的炎性细胞数量显著地减少到未感染的受伤水平。水凝胶与人细胞是生物相容性的，因为当在体外针对人真皮成纤维细胞(HDF)测试时，水凝胶显示细胞活力超过95％。水凝胶还具有非常快的溶胀动力学，这在伤口处理中是重要的，因为水凝胶快速吸收伤口渗出液并保持伤口区域湿润。水凝胶的体外和体内功能特性突出了水凝胶作为感染伤口(这是发病率和死亡率的重要原因)的伤口敷料的优越性。
材料和方法
材料
在使用前将支化聚乙烯亚胺(PEI,Sigma-Aldrich,Mw＝800,25000和750000)冻干至干燥。1-溴癸烷、氢氧化钠、碳酸钾、异丙醇、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA，Mn＝360)和2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure 2959)购自Sigma-Aldrich，并按原样使用。氯乙酰氯、无水乙醇、甲苯和二氯甲烷购自Merck Pte Ltd(新加坡)，使用无需进一步纯化。聚乙二醇(1000)二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)购自PolySciences,Inc。
表征
在Bruker AV 300 NMR光谱仪上记录25℃、300MHz下的1H NMR谱。参考四甲基硅烷(TMS)的内标质子，化学位移(δ)以百万分率(ppm)报告。用Tecan Infinite 200酶标仪测量细菌悬浮液的光密度和MTT测定。用Malvern Nano-ZS颗粒分析仪取得Zeta电位读数。用JEOL JSM-6701 FE-SEM拍摄SEM图像。用ZEISS LSM 800拍摄共聚焦图像。用Instron 5543拉伸计测试水凝胶的抗压强度。用FTA200接触角分析仪测量接触角。用Thermo Evolution600 BB测量UV-可见吸光度。
氯官能化聚乙二醇甲基丙烯酸酯(Cl-PEGMA)的制备
首先将11.8mL(35.3mmol)聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)溶解于100mL甲苯中，向溶液中加入11.25mL(141.2mmol)氯乙酰氯，然后在120℃下搅拌并回流24小时。反应后，使溶液进行溶剂蒸发，随后向浓缩物中加入二氯甲烷(100mL)进行溶解。然后加入碳酸钾并将混合物搅拌10分钟。过滤并对滤液进行溶剂蒸发后获得产物。
接枝有PEGMA的聚乙烯亚胺(PEI-PEGMA)的制备
用各种比例的PEGMA接枝分子量为800、25000和750000的聚乙烯亚胺(PEI)(方案3)。
Figure BDA0002203409020000471
方案3PEI-PEGMA的合成策略。根据PEGMA基团的接枝率，即n的值，将聚合物标记为PEI-PEGMA(1:n)。
为了简单起见，描述PE(25K)-PEGMA(1:5)作为示例。首先将1g PEI溶解于10mL去离子水中，并加入0.4mL NaOH溶液(1M)。然后，以逐滴方式将Cl-PEGMA(0.2g)的异丙醇(1mL)溶液加入到溶液中。将混合物在室温下搅拌反应3小时，然后进行透析(MWCO 10344)3天。通过冻干获得最终产物。
烷基化聚乙烯亚胺(PEI-癸烷)的制备
如实施例1所述，通过烷基化反应制备具有癸烷基团的PEI(Mw＝25,000)。将PEI(2.0g，0.2mmol)溶解于50mL无水乙醇中，并在85℃在回流条件下用0.442g 1-溴辛烷(2mmol)烷基化24小时。在相同条件下在另外的24小时用0.2g氢氧化钠中和所生成的HBr。除去溶剂后，将所得残余物溶解于水中并用蒸馏水透析三天。将所获得的产物冷冻干燥24小时，得到聚合物聚合物癸烷-PEI。
接枝有PEGMA的PEI-癸烷(PEI-癸烷-PEGMA)的制备
首先将1g PEI-癸烷溶解于10mL去离子水中，并加入0.4mL NaOH溶液(1M)。然后以逐滴方式将Cl-PEGMA(0.16g)的异丙醇(1mL)溶液加入到溶液中。将混合物在室温下搅拌反应3小时，然后进行透析(MWCO 10344)3天。通过冻干获得最终产物。
PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶的形成
使用对前体水凝胶溶液进行的UV照射形成PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA水凝胶。首先将UV引发剂Irgacure 2959溶解于乙醇中以制备10％w/v储备溶液。将含有聚合物、交联剂(PEGDMA)和UV引发剂(Irgacure 2959)的水凝胶溶液混合并在1.5mL微管中完全溶解于去离子水中。将50μL水凝胶溶液转移到24孔板的每个孔中。然后，用UV光(波长365nm，强度10mW/cm2)照射水凝胶溶液10分钟从而发生交联形成水凝胶。将水凝胶在乙醇中洗涤三次并用去离子水超声洗涤三次以除去所有未反应的前体。表8中给出了水凝胶的制剂。似乎需要10％w/v的聚合物和PEGDMA以形成稳定的水凝胶。任何较低百分比的聚合物或PEGDMA可能产生容易降解的不稳定的水凝胶。
制剂 聚合物(w/v) PEGDMA(w/v) Irgacure 2959(w/v) 凝胶化
1 5％ 5％ 0.1％ 无
2 10％ 5％ 0.1％ 差凝胶
3 10％ 10％ 0.1％ 稳定凝胶
表8水凝胶组合物的制剂。PEGDMA＝聚乙二醇二甲基丙烯酸酯。
最低抑菌浓度(MIC)
针对抗菌聚合物的抗菌敏感性，评估MIC。在MIC测试中使用细菌物种诸如大肠杆菌(ATCC8739)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA USA300)。将细菌接种并分散在4mL Mueller-Hinton肉汤(MHB，Fluka，对MIC测试为分析级)中在37℃下在220rpm连续摇动下至对数中期。然后，将对数中期的细菌悬浮液稀释在新鲜MHB中以进行抗菌测试。所使用的抗菌聚合物的起始浓度为512μg/mL。然后，对于无菌96孔平底微量滴定板的每个孔，在50μL MHB中制备十个连续两倍稀释的抗菌聚合物溶液。MHB中抗菌剂的稀释范围在512μg/mL至1μg/mL之间。之后，每个孔用50μL光密度为0.0002的细菌稀释悬浮液接种，并且每个孔的最终接种物含有约为5×105CFU/mL的细菌。将微量滴定板在37℃下孵育18小时。通过用微孔板分光光度计(Tecan Infine200)测量每个孔中悬浮液的600nm光密度(OD)来确定每个孔中的微生物生长。针对每种细菌和抗菌聚合物的浓度进行重复测量。在该实验中应用不含抗菌剂的阳性对照和不含细菌悬浮液的阴性对照。根据孵育18小时后抑制细菌生长所需的抗菌聚合物的最低浓度来评估MIC。
水凝胶的体外抗菌测定
(I)细菌培养基的制备
将细菌菌株(大肠杆菌8379；金黄色葡萄球菌29213、PA01、MRSA USA300；肺炎克雷伯菌13883；和鲍曼不动杆菌19606)接种并分散在4mL MHB培养基中，37℃下以220rpm连续摇动至对数中期。将1mL细菌悬浮液加入到无菌微管中，通过离心除去MHB培养基，然后倾去上清液。用1mL PBS洗涤细菌三次，并用1mL PBS制备最终的细菌悬浮液。
(II)在水凝胶上接种细菌
将10μL含有约107CFU的细菌悬浮液的PBS溶液接种到置于小组织培养皮氏培养皿上的水凝胶表面上。然后将细菌悬浮液均匀铺开以覆盖水凝胶的整个表面。通过直接在小皮氏培养皿上接种细菌来进行对照。将皮氏培养皿在37℃下孵育1小时，相对湿度为90％。
(III)细菌计数的计算
在孵育后将1mL PBS加入到每个组织培养皮氏培养皿中并彻底洗涤。将水凝胶浸入PBS中并涡旋以释放细菌。将0.9mL PBS加入到24孔板的每个孔中。然后，制备一系列10倍稀释的细菌悬浮液，并在LB琼脂(具有琼脂的LB肉汤，Sigma)上铺板。将平板在培养箱中于37℃孵育18h并计算细菌菌落。
对数减少和杀死％结果评估如下。
对数减少＝Log(对照的总CFU)-Log(水凝胶上的总CFU)
Figure BDA0002203409020000501
水凝胶-细菌相互作用的扫描电子显微镜观察
制备细菌(MRSA USA300和PA01，1×109CFU/mL)的PBS悬浮液，接着接种在水凝胶上(10μL，细菌计数＝1×107CFU)，此后将其在37℃下孵育1h。孵育后，通过滴加少量戊二醛固定剂将细菌固定在水凝胶上。然后在切片前将水凝胶冷冻干燥过夜，并送去以使用JEOLJSM-6701FE-SEM进行SEM成像。通过对没有细菌的水凝胶进行成像来进行对照。
LIVE/DEAD测定以检测细菌活力和膜渗透性
使用水凝胶与PA01和MRSA USA300进行LIVE/DEAD测定。制备细菌(1×109CFU/mL)的PBS悬浮液，接着接种在水凝胶上(10μL，细菌计数＝1×107CFU)，此后将其在37℃下孵育1h。孵育后，将水凝胶用BacLight细菌活力试剂盒L13152(Invitrogen)在室温下染色15分钟。绿色SYTO9染料进入完整细胞和膜受损细胞，而红色碘化丙啶染料只能进入膜受损细胞，在膜受损细胞中红色碘化丙啶染料会使绿色SYTO9染料减少。然后用共聚焦显微镜(ZEISS LSM 800)使水凝胶在接种细菌的表面成像。通过使活细菌染色进行对照。
水凝胶的溶胶含量
将水凝胶前体溶液用UV光照射不同的时间点(2、4、6、8、10min)以进行交联。接着，将水凝胶冷冻干燥过夜并测量其干重。然后如上所述彻底洗涤水凝胶并再次冷冻干燥过夜，然后在洗涤后测量其干重。使用如下公式计算水凝胶的溶胶含量。
Figure BDA0002203409020000511
水凝胶的溶胀动力学
以下列方式研究水凝胶的溶胀动力学。如上所述洗涤新制备的水凝胶并冻干至干燥。在零时刻称量完全干燥的水凝胶的质量。然后，向水凝胶中加入大量的去离子水以引起溶胀。在用滤纸干燥后，在5、10、15、20、25和30分钟时间点取得溶胀的水凝胶的质量。
使用如下公式计算计算溶胀率。
Figure BDA0002203409020000512
压缩测试
水凝胶的机械性能还通过压缩应力-应变测量来表征，该压缩应力-应变测量使用Instron 5543单柱测试系统对溶胀的凝胶进行。将直径为6mm、厚度为2mm的圆柱形凝胶样品置于下板上，并通过连接到测力传感器的上板来压缩，应变速率为0.1mm/min。每次测量对四个平行样品进行，将获得的值平均化并绘制在图中。
水凝胶的表面Zeta电位
使用Malvern Nano-ZS颗粒分析仪对水凝胶的表面Zeta电位进行表征。简言之，使用研钵和研杵将水凝胶粉碎并冷冻干燥过夜。然后将干燥的水凝胶再次粉碎成粉末形式并分散在水中。然后将分散体送去进行zeta电位测量。
水凝胶浸出测试
在测试水凝胶的可浸出性之前，如前所述彻底洗涤水凝胶。接着将洗涤过的水凝胶浸入5mL去离子水中24小时，然后使用Thermo Evolution 600 BB UV-可见分光光度计测量溶液的UV-可见吸光度。通过测量各聚合物在100、10和1μg/mL浓度下的紫外-可见吸光度来进行对照。测量的波长为190-400nm。
体内伤口感染小鼠模型
(I)伤口实验和FACs分析
使用约7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠。通过在开始实验前两周使动物背部脱毛来使每只小鼠的毛囊周期同步。对小鼠进行麻醉、脱毛，并在背部皮肤和下面的肉膜上施加两个直径6mm的全层切除伤口。然后，将20μL的1×107个指示菌(MRSA USA300和PA01)的PBS溶液局部接种到伤口上并静置10min以模拟感染。将水凝胶施加在伤口上并用Tegaderm(3M)透明敷料固定。以未经处理的感染和未感染的伤口作为对照。伤后48h，切除包括5mm外周区域的伤口。根据制造商的方案(Miltenyi Biotec)使用温和的MACS分离器获得来自伤口样品的单细胞悬浮液。用CD11b和Ly6G(Biolegend)对细胞进行免疫标记，并使用Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)实施流式细胞术。使用Flowjo软件版本7.6.5(Tree Star)进行数据分析。针对每个处理，绘制平均百分比值(n＝4-6)±SEM。使用双尾学生t检验进行比较。所有动物研究均按照南洋理工大学动物护理和使用机构委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee of Nanyang Technological University)的规定进行批准和执行。
(II)受伤皮肤上的细菌负荷的计数
伤后48h，切除包括5mm外周区域的伤口。将每个伤口在1mL PBS中匀浆以释放细菌(n＝4)。然后，在PBS中制备一系列10倍稀释的细菌悬浮液，并在LB琼脂(具有琼脂的LB肉汤，Sigma)上铺板。将平板在培养箱中于37℃孵育18h并计算细菌菌落。
绘制对数减少和杀死％结果并评估如下。
对数减少＝Log(对照的总CFU)-Log(水凝胶上的总CFU)
Figure BDA0002203409020000531
(III)与商业银敷料的比较
使用与上述相同的程序制造伤口和感染，并且持续时间略有不同。在用细菌感染24h后，将小鼠放置24小时而不进行处理以模拟生物膜感染，之后将它们用各自的处理法处理24小时。使用的商业抗菌伤口敷料是来自Smith&Nephew的Allevyn Ag和Algisite Ag。然后，切除包括5mm外周区域的伤口。将每个伤口在1mL PBS中匀浆以释放细菌(n＝6)。然后，在PBS中制备一系列10倍稀释的细菌悬浮液，并在LB琼脂(具有琼脂的LB肉汤，Sigma)上铺板。将平板在培养箱中于37℃孵育18h并计算细菌菌落。
绘制对数减少和杀死％结果并评估如下。
对数减少＝Log(对照的总CFU)-Log(水凝胶上的总CFU)
Figure BDA0002203409020000532
(IV)全伤口愈合研究
选择PEI水凝胶和MRSA USA300细菌进行该研究。在第0天，使小鼠受伤并感染细菌。受伤和感染的程序与上述相同。未处理的伤口用Tegaderm固定，而经处理的伤口施加有PEI水凝胶，然后用Tegaderm固定。在第0、1、3、5、7、9、12和14天拍摄伤口的照片，在第0、1、3、5、7、9、12和14天还更换新鲜水凝胶。在相同时间点，使小鼠安乐死并处死，收获它们的伤口用于细菌计数(n＝4)。测定每个时间点的细菌计数和伤口大小。伤口大小使用如下公式来计算：
Figure BDA0002203409020000541
水凝胶的体外生物相容性测定
用人真皮成纤维细胞(NHDF-Ad-Der成纤维细胞，CC 2511，Lonza)进行生物相容性研究。使用的细胞培养基为完全DMEM，其由10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素(青霉素-链霉素)组成。
(I)Transwell MTT测定
将HDF细胞在24孔板中从初始接种物为每孔有5×104个细胞起培养，并在CO2培养箱中于37℃孵育24小时以进行细胞附着。在与HDF细胞一起于37℃孵育24小时之前，切出5mm的水凝胶圆盘并置于transwell嵌套中(Falcon，1μm孔隙)。然后，除去水凝胶并用MTT溶液(DEME中1mg/mL)更换培养基，在37℃下孵育4小时以使活细胞染色。除去MTT溶液，加入二甲基亚砜(DMSO)并将板以150rpm摇动15分钟。细胞活力根据每个孔的570nm吸光度来测量，并与仅有细胞的对照孔(作为100％细胞活力对照)进行比较。
(2)接触式MTT测定
将HDF细胞在96孔板中从初始接种物为每孔有1×104个细胞起培养，并在CO2培养箱中于37℃孵育24小时以进行细胞附着。切出约3mm水凝胶圆盘且浸入细胞培养物中并在37℃孵育24小时。然后，除去水凝胶并用MTT溶液(DMEM中1mg/mL)更换培养基，在37℃孵育4小时以使活细胞染色。除去MTT溶液，加入DMSO并将板以150rpm摇动15分钟。细胞活力通过每个孔的570nm吸光度来测量，并与仅有细胞的对照孔(作为100％细胞活力对照)进行比较。
结果评估如下：
Figure BDA0002203409020000551
结果和讨论
在该实例中，合成了衍生物PEI共聚物两家族，具体为聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEI-PEGMA)和聚乙烯亚胺-接枝-癸烷-接枝-聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEI-癸烷-PEGMA)，然后用交联剂(聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，PEGDMA)配制并经UV聚合成微孔阳离子水凝胶。用PEGMA接枝阳离子PEI以使PEI-PEGMA变成可UV聚合的。PEGMA不仅在PEI上赋予修饰后特性，而且还可以改善与哺乳动物细胞的生物相容性。还研究了PEI-癸烷-PEGMA对水凝胶疏水性的影响。优化的水凝胶使各种ESKAPE细菌的体外实现了超过7个数量级的对数减少(表9)。
Figure BDA0002203409020000552
Figure BDA0002203409020000561
表9不同版本的PEI水凝胶对6种细菌菌株的体外对数减少。*表示在铺板18小时后在皮氏培养皿上未观察到细菌菌落。
对于与伤口感染临床相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA USA300)和铜绿假单胞菌(PA01)，预防性伤口感染小鼠模型的体内对数减少分别超过6和4(图10)，表明水凝胶具有优异的体内广谱抗菌活性。此外，用PEI水凝胶处理的小鼠在皮肤中显示出比感染的对照小鼠更轻微的炎症。此外，水凝胶不含任何可浸出成分，也不含有当今抗菌伤口敷料中常用的银。目前的技术基于一种高度微孔的阳离子水凝胶，该阳离子水凝胶破坏了与水凝胶接触的细菌的细胞膜。
对于PEI-PEGMA共聚物系列，使用分子量(Mw)为25K的PEI，PEI与PEGMA的摩尔比在1:5、1:10和1:20之间变化；制备具有不同摩尔比的x摩尔PEI与y摩尔的PEGMA的五种PEI(Mw)-PEGMA(x:y)共聚物：(1)PEI(25K)-PEGMA(1:5)、(2)PEI(25K)-PEGMA(1:10)、(3)PEI(25K)-PEGMA(1:20)、(4)PEI(800)-PEGMA(1:5)和(5)PEI(750K)-PEGMA(1:5)。制备PEI(25K)-癸烷-PEGMA(1:10:16)的癸烷衍生物以研究疏水性的影响。使用1H NMR(未示出)来验证组成。5.58ppm和6.14ppm的双峰是由于甲基丙烯酸酯基团中的质子引起的，表明PEGMA成功地接枝到PEI和癸烷-PEI上分别形成PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA。约0.7-0.9ppm的质子是由于癸烷引起的，表明成功制备了PEI-癸烷-PEGM。
测量各种PEI-PEGMA和PEI-癸烷-PEGMA共聚物溶液对革兰氏阴性大肠杆菌和铜绿假单胞菌，以及革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA USA300)的最低抑菌浓度(MIC)(表10)，并且它们通常相似，革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度为64-512μg/mL，革兰氏阳性菌的最低抑菌浓度为32-64μg/mL，表明效力中等。PEGMA和癸烷在PEI上的不同比例的接枝在其溶液形式中不会对MIC产生太大影响。
Figure BDA0002203409020000571
表10原始PEI聚合物和改性PEI水凝胶聚合物的最低抑菌浓度(MIC)。
所有单位均为μg/mL。
水凝胶由10％聚合物与10％交联剂(PEGDMA)和少量(0.1％)光引发剂(Irgacure2959)在水中的优化制剂制成。在UV照射后，溶液凝固成具有良好机械完整性的水凝胶。溶胶含量数据(图12)显示10分钟的UV暴露足以使水凝胶交联，因为水凝胶在8分钟时达到最小溶胶含量。
测试水凝胶的实验室菌株大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以及许多ESKAPE细菌的体外接触活性杀死作用。将细菌接种在水凝胶的表面上1小时，然后铺板以确定它们的活力。PEI(25K)-PEGMA(1:5)、PEI(750K)-PEGMA(1:5)和PEI(25K)-癸烷-PEGMA(1:10:16)水凝胶更有效，因为它们杀死了所有细菌，表明较高Mw的PEI和较小部分的交联剂增加杀菌性能。PEI(25K)-PEGMA(1:5)、PEI(750K)-PEGMA(1:5)和PEI(25K)-癸烷-PEGMA(1:10:16)水凝胶对MRSA的细菌体外对数减少为7.52，对PA01的细菌体外对数减少为7.31。对于其他测试的细菌菌株，它们还实现了对数减少为7以上。该结果表明，较高Mw的PEI水凝胶在接触模式中非常有效地杀死细菌，这是由于由水凝胶网络中的许多阳离子氨基组成的PEI的高度支化性质。水凝胶网络中的阳离子基团能够通过静电相互作用“吸附”在细菌中，随后破坏细菌细胞壁，杀死细菌。PEI(800)-PEGMA(1:5)水凝胶实现了细菌的最低对数减少，对于ESKAPE菌株减少少于一个量级。
还对水凝胶和细菌进行了扫描电子显微镜(SEM)和LIVE/DEAD测定以进一步研究和证实结果。从图12中可以看出，PEI(25K)-PEGMA(1:5)水凝胶具有微孔结构，其孔隙大于10μm。当接种细菌时，细菌全部粘附在水凝胶的壁上，可以看到细菌碎片粘附在水凝胶上，表示细菌裂解释放出细胞内容物。对于MRSA和PA01都观察到相同的情况。当将细菌接种在水凝胶上并用LIVE/DEAD染料染色时(图17)，接种在水凝胶上的所有细菌都染成红色，这意味着红色染料碘化丙啶已进入细菌细胞质。由于碘化丙啶只能进入渗透性膜，因此表明细菌全部死亡并且其膜被破坏。对照的细菌全部染成绿色，表明它们都是活着的。MRSA和PA01的结果一致。疏水性PEI(25K)-癸烷-PEGMA(1:10:16)水凝胶具有略微不同的结构，但杀死机制与其他水凝胶相同(图13)。
测试了水凝胶与人真皮成纤维细胞(HDF)的生物相容性。使用Transwell MTT测定法作为水凝胶的毒性浸出量的量度，因为水凝胶将降低细胞的活力。使用接触式MTT测试来确定水凝胶与细胞的接触生物相容性。对于Transwell MTT，HDF细胞的细胞活力接近100％，这意味着水凝胶没有毒性可浸出物。对于接触MTT，HDF细胞的细胞活力高于90％，这意味着水凝胶在与细胞接触时是相对具有生物相容性的并且不会对细胞产生很大的接触毒性。这些结果证明水凝胶与存在于人体皮肤上的HDF细胞非常生物相容，更重要的是没有毒性可浸出物，因此适合用作伤口敷料中的抗菌剂形式。
选择两种最佳的水凝胶制剂进行进一步表征，一种是PEI-PEGMA水凝胶，一种是PEI-癸烷-PEGMA水凝胶。PEI(25K)-PEGMA(1:5)和PEI(25K)-癸烷-PEGMA(1:10:16)水凝胶因其优异的体外抗菌活性和相似的PEI Mw而获选，。在以下段落中，它们分别表示为PEI和PDP水凝胶。研究水凝胶的溶胀动力学以确定水凝胶能够溶胀的速度以及程度。将水凝胶冷冻干燥过夜，在浸入大量水中后，在零点时间以及不同时间点(0、5、10、15、20、25和30min)将水凝胶称重。在测量水凝胶的质量之前，用滤纸适当地干燥水凝胶。
在某些时间点的溶胀率由方法部分的公式确定。然后将数据绘制成线图，如图14所示。结果显示水凝胶非常迅速地溶胀，10分钟后溶胀超过90％，并且在15分钟后达到最大溶胀。这是水凝胶的优异品质，因为它们可以非常快速地吸收水分。水凝胶快速溶胀也是重要的，因为它将能够快速吸收伤口渗出液并保持伤口区域湿润，这在伤口愈合过程中至关重要。据推测，水凝胶因由PEI的许多氨基引起的高阳离子电荷以及其随后的非常快速地吸引水的高亲水性，而能够如此迅速地溶胀。而且，水凝胶的大孔隙允许水快速进入。测量水凝胶的表面zeta电位，水凝胶在其表面上显示出高阳离子电荷。特别地，PEI水凝胶在其表面上具有+64.5mV电荷，略高于疏水性PDP水凝胶上的表面电荷(+54.7mV)。这种高正电荷允许水凝胶将带负电荷的细菌吸引到其表面上，然后通过接触杀死它们。此外，水凝胶具有良好的抗压强度，因为它们可以承受50％以上的压缩而不会破裂。
接触角测量结果(图15)显示，PDP水凝胶确实比PEI水凝胶更疏水，因PDP水凝胶在0分钟时(PDP为50.57°，PEI为21.82°)和2分钟(PDP为30.64°，PEI为11.42°)的水的接触角高得多。
通过测量水凝胶浸泡溶液的吸光度在两种水凝胶上进行的浸出实验显示，水凝胶没有浸出组分，因为与在100、10和1μg/mL下测量时具有200nm吸收峰的原始聚合物相比，它们未显示任何吸光度(图14)。
由于其优异的体外抗菌活性和生物相容性，用皮肤伤口受感染的小鼠模型测试PEI和PDP凝胶。在体内研究中使用MRSA USA300和PA01。这两种细菌菌株在伤口感染中具有临床相关性，并且对目前的许多抗生素耐药，因此研究它们是非常重要的。将约1×107CFU的细菌接种于小鼠的每块受伤皮肤上。将细菌铺板，计数为含有3.73×107CFU的MRSA和1.22×107CFU的PA01。用对照(Tegaderm)、PEI和PDP水凝胶处理小鼠。在第二天，使所有小鼠安乐死，并将受伤的皮肤组织分离用于FACS并匀浆，进行细菌负荷计数。FACS分析显示，与未感染对照的两种细菌菌株相比，PEI水凝胶处理的皮肤的CD11b+信号的百分比无显著性差异。有趣的是，对于MRSA和PA01，经PDP水凝胶处理的皮肤显示CD11b+信号增加，这与感染的对照皮肤的值相当(图10)。由于CD11b+是一种白细胞特异性受体，因此CD11b+被认为是巨噬细胞和粒细胞的标志。这些是引起炎症的免疫应答细胞。因此，PEI水凝胶能够杀死细菌并减少皮肤炎症，而PDP水凝胶只能杀死细菌。
对照伤口上的MRSA和PA01的平均计数分别确定为1.60×109CFU和2.23×108，比在第0天时接种于伤口上的初始计数高约1-2个数量级。对于PEI和PDP水凝胶，经水凝胶处理的伤口上的MRSA的平均计数分别为3.17×102和2.66×102，PA01的平均计数分别为3.83×103和1.78×104。这意味着水凝胶敷料能够使MRSA的活菌计数减少6个对数量级以上，使PA01的活菌计数减少4个对数量级以上。这相当于有效杀死超过99.9999％的MRSA和超过99.99％的PA01。水凝胶在感染模型中表现令人印象深刻，显著根除了大部分细菌，并且PEI水凝胶甚至降低了感染小鼠的皮肤中的炎症水平。还进行体内时间杀死实验以量化水凝胶杀死细菌的速度。确定了水凝胶能够在快至1小时内杀死超过99.99％的细菌。
将生物膜细菌的杀菌与商业伤口敷料进行比较，作为水凝胶敷料在临床环境中的功效的指示。将小鼠伤口用MRSA和PA01感染24h以模拟生物膜感染，然后用相应的敷料再处理24h。使用的商业抗菌伤口敷料是来自Smith&Nephew的Allevyn Ag和Algisite Ag，Allevyn Ag和Algisite Ag在其敷料中含有银作为抗菌剂。在实验结束时，对照伤口的细菌计数增加了约一个数量级。Allevyn Ag和Algisite Ag都使MRSA的细菌计数减少1个对数数量级，PA01的细菌计数减少1到2个对数量级，而经PEI水凝胶处理的伤口，MRSA和PA01的细菌减少都为4个对数数量级(图10)。证明与测试的两种商业抗菌伤口敷料相比，PEI水凝胶的体内生物膜杀菌更好。
对小鼠进行为期两周的伤口愈合研究以研究水凝胶对皮肤伤口愈合速率的影响。PEI水凝胶因其优异的体内抗菌功效和非炎性作用而被选定用于该研究，并且与未处理的对照(Tegaderm)进行比较，在该实验中使用MRSA USA300。在所有的日期点，经PEI水凝胶处理的伤口的愈合速率比对照伤口快，因为伤口大小占初始大小的百分比较小(图16)。此外，经PEI水凝胶处理的伤口比对照伤口更清洁，因为在对照伤口上可以观察到更多的脓液。此外，在对照伤口上可以看到继发性伤口部位，并且最有可能是由于感染扩散到附近的皮肤区域引起的。在第7天，六种不同对照和经PEI水凝胶处理的伤口之间的比较(未示出)显示，6个对照伤口中有5个有继发性伤口部位，而经PEI水凝胶处理的伤口无一有继发性伤口部位。当用PEI水凝胶处理时，MRSA在3天后完全消失，而对照组伤口上的细菌被小鼠免疫系统缓慢杀死，并且在14天后仍然大量存在。
固定化阳离子聚合物的抗菌作用可能是由于它们与带负电荷的磷脂强烈相互作用的能力，允许静电相互作用控制与靶细胞膜的初始结合，然后聚合物上的疏水部分与细菌膜的内部疏水核相互作用，导致完整性破坏和随后的细胞死亡。因此，表面电荷密度和疏水性是影响表面涂层抗菌活性的主要因素。由于亚氨基的pKa值约为10至11，因此PEI是生理环境溶液(pH值约7.2)中的带正电荷的分子。
为了进一步改善其抗菌性能，将疏水基团如烷基部分引入到聚合物骨架中。研究了使用烷基化和非烷基化PEI的PEI水凝胶的抗菌活性，以及具有不同分子量的PEI。非烷基化PEI水凝胶与烷基化版本同样表现良好，并且与烷基化版本不同，非烷基化PEI水凝胶不会诱导皮肤炎症。此外，与疏水性对应物相比，它具有优异性能，如更高的机械强度、更大的孔径、更高的溶胀，并且因其亲水性而与哺乳动物细胞更具生物相容性。在体内伤口感染模型中，与商业抗菌伤口敷料(Allevyn Ag和Algisite Ag)相比，它通过杀死4个对数数量级的测试细菌(MRSA和PA01)对比商业抗菌伤口敷料杀死1个对数数量级的测试细菌而表现出优于商业抗菌伤口敷料。与填充有脓液并且甚至在感染伤口附近有继发性伤口部位的对照伤口不同，用PEI水凝胶处理还留下没有太多脓液的清洁伤口。因此，目前的水凝胶技术有希望在生物医学领域中作为感染相关伤口的潜在治疗方法。
结论
聚乙烯亚胺(PEI)因其高度支化性质并含有许多阳离子胺基而被选定作为骨架以开发抗菌水凝胶。PEI通过接枝PEGMA基团而改性并且能够交联形成水凝胶。进行PEI与疏水性癸烷基团的进一步烷基化以改善其抗菌性能。然而，对于体外抗菌测试，PEI水凝胶能够表现得与PDP水凝胶一样好，杀死接种在表面上的所有细菌。两种水凝胶的transwell和接触式MTT也非常相似，表明水凝胶是非常有生物相容性的并且适合用于伤口敷料中。小鼠模型证明，水凝胶能够根除伤口表面上的大多数的细菌，甚至有助于伤口愈合。本文提出的抗菌水凝胶被证明非常有效地用作感染伤口的抗菌剂。该技术对于许多商品是有利的，因为它避免了使用许多抗菌伤口敷料中常见的银，银可能对身体有毒且致癌。将用于临床环境的当前水凝胶技术还有许多其他优点。如所讨论的，水凝胶只需要两步合成和快速的UV聚合过程。水凝胶具有高且快速的溶胀，这有利于管理伤口渗出液，并且是透明的，因此能够在不除去敷料的情况下看到伤口状况。此外，水凝胶是稳定的，在处理时不会破裂或降解，并且在处理完成时留下清洁的伤口。在其他生物医学应用(例如形成水凝胶涂层以对抗许多与植体相关的感染)中还能潜在地对该水凝胶进行探索。
“包括”是指包括但不限于“包括”一词之后的任何内容。因此，术语“包括”的使用表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在。
“由……组成”是指包括并限于短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的并且可以不存在其他要素。
本文说明性地描述的发明可以在缺少本文未具体公开的任何要素，限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”，“包含”，“含有”等应当被广泛地阅读而不受限制。另外，本文所使用的术语和表达式已被用作描述的术语而非限制，并且使用这些术语和表达式无意排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，但应认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解的是，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文在此呈现的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的范围内。
涉及给定数值(例如温度和时间段)的“约”，是指包括在指定值的10％内的数值。
在此广泛和一般地描述了本发明。落入一般公开内容中的每个较窄物种和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，附带条件或否定限制是从该属中去除任何物料，无论是否在本文中具体叙述了去除的材料。
其他实施方案在以下权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也因此在马库什群组的任何单个成员或成员子群的方面进行描述。

Claims (18)

1.一种由抗菌聚合物形成的抗菌水凝胶，所述抗菌聚合物包括式（I）的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PEGMA）的支化聚乙烯亚胺（PEI）或式（II）的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PEGMA）和癸烷的支化聚乙烯亚胺（PEI），
Figure 952034DEST_PATH_IMAGE001
Figure 979375DEST_PATH_IMAGE002
其中：
m是1至20的整数；
n是1至20的整数；
在式（I）中，PEI-PEGMA的接枝率为1:1至1:20；并且
在式（II）中，PEI-癸烷-PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20。
2.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶，其特征在于，在式（I）中，PEI-PEGMA的接枝率为1:5、1:10或1:20。
3.根据权利要求1所述的抗菌水凝胶，其特征在于，在式（II）中，PEI-癸烷的接枝率为1:10。
4.根据权利要求3所述的抗菌水凝胶，其特征在于，在式（II）中，PEI-癸烷-PEGMA的接枝率为1:10:1、1:10:2、1:10:4、1:10:8或1:10:16。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗菌水凝胶，其特征在于，PEI的平均分子量为800至750 K Da。
6.根据权利要求5所述的抗菌水凝胶，其特征在于，PEI的平均分子量为800、25 K或750K Da。
7.一种形成如权利要求1中所述的式（I）的抗菌聚合物的方法，所述方法包括：
将聚乙烯亚胺（PEI）溶解于去离子水中，形成PEI溶液；
将碱溶液加入到所述PEI溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到所述溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析所述最终混合物之前搅拌所述最终混合物；和
将所述最终混合物冻干以获得式（I）的所述抗菌聚合物。
8.一种形成如权利要求1中所述的式（II）的抗菌聚合物的方法，所述方法包括：
将癸烷接枝的聚乙烯亚胺（PEI-癸烷）溶解于去离子水中，形成PEI-癸烷溶液；
将碱溶液加入到所述PEI-癸烷溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到所述溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析所述最终混合物之前搅拌所述最终混合物；和
将所述最终混合物冻干以获得式（II）的所述抗菌聚合物。
9.一种由如权利要求1中所述的式（I）或式（II）的抗菌聚合物形成抗菌水凝胶的方法，所述方法包括：
将式（I）或式（II）的抗菌聚合物、交联剂和UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；和
用UV光照射所述水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶。
10.一种在表面上由如权利要求1中所述的式（I）或式（II）的抗菌聚合物形成抗菌水凝胶涂层的方法，所述方法包括：
将式（I）或式（II）的抗菌聚合物、交联剂和可选的UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；
对表面进行改性处理；
将所述水凝胶溶液沉积在改性表面上；和
用UV光照射所述水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶涂层；
其中，所述改性处理包括等离子体处理、臭氧处理、氧化亚铁处理或在表面上产生自由基的任何其他处理。
11.一种装置，具有涂覆有由如权利要求1中所述的式（I）或式（II）的抗菌聚合物形成的抗菌水凝胶的表面。
12.一种杀死微生物的方法，所述方法包括将由如权利要求1中所述的式（I）或式（II）的抗菌聚合物形成的水凝胶与微生物接触。
13.一种由抗菌聚合物形成的抗菌水凝胶，所述抗菌聚合物包括式（III）的接枝有聚乙二醇甲基丙烯酸酯（PEGMA）和烷基（R）的支化聚乙烯亚胺（PEI），
Figure 843426DEST_PATH_IMAGE003
PEI-烷基-PEGMA
其中：
m是1至20的整数；
n是1至20的整数；
R是取代或未取代的直链或支链C5-C15烷基；并且
PEI-烷基-PEGMA的接枝率为1:1:1至1:20:20。
14.一种形成如权利要求13中所述的式（III）的抗菌聚合物的方法，所述方法包括：
将烷基接枝的聚乙烯亚胺（PEI-烷基）溶解于去离子水中，形成PEI-烷基溶液；
将碱溶液加入到所述PEI-烷基溶液中，形成溶液混合物；
将氯官能化的聚乙二醇甲基丙烯酸酯溶液逐滴加入到所述溶液混合物中，形成最终混合物；
在透析所述最终混合物之前搅拌所述最终混合物；和
将所述最终混合物冻干以获得式（III）的抗菌聚合物。
15.一种由权利要求13中所述的式（III）的抗菌聚合物形成抗菌水凝胶的方法，所述方法包括：
将式（III）的所述抗菌聚合物、交联剂和UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；和
用UV光照射所述水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶。
16.一种在表面上由权利要求13中所述的式（III）的抗菌聚合物形成抗菌水凝胶涂层的方法，所述方法包括：
将式（III）的所述抗菌聚合物、交联剂和可选的UV引发剂溶解于去离子水中，形成水凝胶溶液；
对表面进行改性处理；
将所述水凝胶溶液沉积在改性表面上；和
用UV光照射所述水凝胶溶液，形成抗菌水凝胶涂层；
其中，所述改性处理包括等离子体处理、臭氧处理、氧化亚铁处理或在表面产生自由基的任何其他处理。
17.一种装置，具有涂覆有如权利要求13中所述的由式（III）的抗菌聚合物形成的抗菌水凝胶的表面。
18.一种杀死微生物的方法，所述方法包括将如权利要求13中所述的由式（III）的抗菌聚合物形成的抗菌水凝胶与微生物接触。
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Preparation of amphiphilic glycopolymers with flexible long side chain and their use as stabilizer for emulsion polymerization;Marta Alvárez-Paino等;《Journal of Colloid and Interface Science》;20131124;第417卷;第336-345页 *
Supramolecular polycationic hydrogels with high swelling capacity prepared by partial methacrylation of polyethyleneimine;Antonio Paciello等;《RSC Advances》;20151014;第5卷;第88866-88875页 *
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