CN110563802B - 一组含n-甲基化氨基酸及n端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组含N‑甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物，是在天然抗菌肽Anoplin上引入多个N‑甲基化氨基酸，在结构的N端引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化获得。通过对抗菌肽体外抑菌和酶解稳定性实验，表明本发明合成的抗菌肽类似物随脂肪酸碳链的增长抗菌活性增加，且活性优于母肽Anoplin；同时在高浓度酶环境中仍能保持抗菌活性，这表明本发明合成的抗菌肽类似物在胰蛋白酶和糜蛋白酶环境中具有良好的稳定性。因此，该含N‑甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一组含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物及其合成方法和应用，主要用于制备临床抗菌药物。
背景技术
抗生素作为治疗感染性疾病的一线药物得到广泛应用，挽救了无数的生命。但是，对于抗生素的滥用最终导致了抗生素耐药菌的出现，多药耐药菌的不断进化威胁着人类的健康安全，因此，急需发展新的抗菌药物来解决这一问题。抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMPs），又称宿主防御肽，是先天性免疫系统的重要组成部分，在自然界分布广泛，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫、免疫调节等多种生物活性。不同于传统抗生素主要作用于细菌特异性靶点，抗菌肽独特的非特异性膜破坏机制使其能够有效对抗多药耐药菌，并不易诱导产生耐药性，能够作为具有发展潜力的抗生素替代物。
天然抗菌肽提取工艺复杂，并且由于其组成多为L型氨基酸，易被蛋白酶降解，稳定性差，限制了它的进一步临床应用。N-甲基化氨基酸替换是一种广泛应用于多种生物活性肽的修饰方法，N-甲基化氨基酸的引入能够有效改善多肽的稳定性，增强其抵抗蛋白酶水解的能力。Blake等人在合成[2-N-Methylphenylalanine]- α-ACTH中首次应用N-甲基化氨基酸以提高对外肽酶降解的抵抗力(InternationalJournal of Peptide and ProteinResearch, 1972,4: 343-345.)。此外，含N-甲基化氨基酸的生物活性天然产物也具有显著的治疗作用，环孢菌素是含有7个N-甲基化氨基酸的环肽，具有免疫抑制作用，同时还具有良好的口服生物利用度。有报道将抗菌肽oncocin序列C端酶切位点的Arg替换为N-Me-Arg后，在25%小鼠血清中半衰期延长，并且保留了原有的抗菌活性(International Journalof Antimicrobial Agents,2011,37(2).)。在多肽R1骨架中引入单个或多个N-甲基化氨基酸，显著改善了多肽抵抗血清蛋白降解的的稳定性(Journalof Biological Chemistry,2009,284(14).)。
多粘菌素B是一种能够有效对抗革兰氏阴性菌的多肽类抗生素，移除其脂肪酸部分后抗菌活性几乎丧失，说明在抗菌肽序列中连接脂肪酸能够改善抗菌肽的抗菌活性，促进抗菌肽与细菌细胞膜的相互作用。有研究表明，在多肽树枝状大分子G2KL中引入不同长度的脂肪酸链，抗菌活性呈“U型”增加，连接C10/C12后具有最佳的抗菌活性，其中TNS18对多药耐药菌和MRSA具有广谱抗菌活性，并且血浆半衰期延长(Journal of the AmericanChemical Society,2018,140(1).)。
发明内容
本发明的目的之一是提供一组含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物。
本发明的目的之二是提供一组含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物的合成方法。
本发明的目的之三是提供一组含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物在制备抗菌药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一、一组含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物的结构和合成方法：
本发明具有高抗菌活性和高酶解稳定性的含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物，是在天然抗菌肽Anoplin的3位Leu，5位Arg，6位Ile，4位和7位Lys分别进行N-甲基化氨基酸修饰，并对筛选出的具有较高稳定性类似物在其N端进行不同长度的脂肪酸碳链（C10-C14）修饰，具体如下：
在天然抗菌肽Anoplin上分别引入N-甲基化氨基酸，引入位点分别为3和6位，然后在结构的N端分别引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化，即得含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物，命名为Cn-M3.6，其结构式为：Cn-Gly-Leu-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2，其中n=8-14。
在天然抗菌肽Anoplin上分别引入N-甲基化氨基酸，引入位点分别为4和7位，然后在结构的N端分别引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化，即得含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物，命名为Cn-M4.7，其结构式为：Cn-Gly-Leu-Leu-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-NH2，其中n=8-14。
在天然抗菌肽Anoplin上分别引入N-甲基化氨基酸，引入位点分别为5和7位，然后在结构的N端分别引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化，即得含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物，命名为Cn-M5.7，其结构式为：Cn-Gly-Leu-Leu-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-NH2，其中n=8-14。
本发明含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰抗菌肽类似物的合成方法，是采用多肽固相合成方法，在多肽合成过程中以HOAt/HATU替代HOBt/HBTU作为缩合剂进行氨基酸与N-甲基化氨基酸的耦合，采用氯醌法检定二级胺，合成含有N-甲基化氨基酸且连有MBHA树脂的多肽，在其N末端分别连接不同长度的脂肪酸碳链（C8-C14）进行修饰，多肽切割及纯化后，得到含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物。
二、含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物为活性成分在制备抗菌药物中的应用——抗菌肽体外抑菌实验：
采用常见的微量连续二倍稀释法测定药物对不同的革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度，即MIC值。结果重复三次以上的平行实验。结果见表1。
表1的结果表明，N端酯化修饰的抗菌肽类似物随脂肪酸碳链的增长抗菌活性增加，其中，C12-M3.6/M4.7/M5.7，C14-M3.6/M4.7/M5.7具有最佳的抗菌活性，且活性优于母肽Anoplin。
三、酶解稳定性实验：
为了考察本发明合成的抗菌肽类似物在酶环境中的稳定程度，对母肽Anoplin及抗菌肽Cn-M3.6/M4.7/M5.7（n=8-14）与不同浓度胰蛋白酶、糜蛋白酶分别共孵育6h时对铜绿假单胞菌的抗菌活性进行了测定（见图1-2）。
结果显示，母肽Anoplin在低浓度胰蛋白酶和糜蛋白酶存在的环境中丧失了抗菌活性，而含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物在高浓度酶环境中仍能保持抗菌活性。说明发明合成的抗菌肽类似物在胰蛋白酶和糜蛋白酶环境中具有良好的稳定性。
附图说明
图1为抗菌肽与不同浓度胰蛋白酶共孵育6h时对铜绿假单胞菌的抑杀能力分析图；
图2为抗菌肽与不同浓度糜蛋白酶共孵育6h时对铜绿假单胞菌的抑杀能力分析图；
图3为C8-M3.6的质谱图；
图4为C8-M4.7的质谱图；
图5为C8-M5.7的质谱图；
图6为C10-M3.6的质谱图；
图7为C10-M4.7的质谱图；
图8为C10-M5.7的质谱图；
图9为C12-M3.6的质谱图；
图10为C12-M4.7的质谱图；
图11为C12-M5.7的质谱图；
图12为C14-M3.6的质谱图；
图13为C14-M4.7的质谱图；
图14为C14-M5.7的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物的结构和合成方法做进一步说明。
实施例1、抗菌肽Cn-M3.6的合成
（1）树脂的活化及预处理
准确称取计算量的MBHA树脂（0.43mmol/g），加入多肽固相合成仪中，加入DCM搅拌30min，抽干。DMF洗涤，茚三酮显色法鉴定树脂呈无色透明，表明树脂正常，可使用。
（2）Cn-M3.6-MBHA的合成
a、Leu的耦合：溶胀后的树脂用20%哌啶/DMF溶液洗涤，抽干，重蒸DMF洗涤，茚检树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基团已脱，可接氨基酸。称取3倍过量的氨基酸、3倍过量的HOBt、HBTU，用重蒸DMF溶解，加入6倍过量的DIEA启动反应，加入到合成仪中，在氩气保护的条件下反应搅拌1h，反应时间到后抽干，用重蒸DMF洗涤，茚检树脂呈无色透明，表明反应完成，Leu耦合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA；
b、Leu的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Leu-Leu-MBHA；
c、Thr的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Thr-Leu-Leu-MBHA；
d、Lys的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA；
e、N-Me-Ile的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA；
f、Arg的耦合：20%哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护1h，用氯醌法检定Fmoc保护基是否脱去：若为无色，Fmoc保护基未脱除，重复上述步骤；若为蓝色，Fmoc保护基脱除成功。称取3倍过量的氨基酸、3倍过量的HOAt、HATU，6倍过量的DIEA，加入到合成仪中，在氩气保护的条件下反应搅拌2h，反应时间到后抽干，用重蒸DMF洗涤，氯醌法检定，若树脂为蓝色，说明偶合不完全，重复以上步骤；若树脂为无色，Arg耦合成功，得到Fmoc-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA；
g、Lys的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA；
h、N-Me-Leu的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA；
i、Leu的耦合：方法同步骤f，得到Fmoc-Leu-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA；
j、Gly的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Gly-Leu-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA；
k、N端酰化：20%哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护，用DMF洗涤，茚检为蓝紫色，得到Gly-Leu-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA。分别将脂肪酸、HOBt、HBTU、DIEA与DMF混匀，在氩气保护的条件下反应搅拌1.5h，抽干，DMF洗涤，茚检无色，得到Cn-Gly-Leu-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA，其中n=8-14；
（3）多肽切割
将上述过程所得Cn-Gly-Leu-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-MBHA（n=8-14）依次用重蒸DCM、重蒸甲醇洗涤，用胶塞密封合成仪后彻底抽干至树脂全部呈粉末状。加入切割试剂（TFA:Tris:水=9.5:0.25:0.25(v:v:v)）进行切割，旋蒸，乙醚萃取，冻干。
（4）多肽纯化
RP-HPLC纯化：流动相A为0.1%TFA/水，流动相B为0.1%TFA/乙腈，线性梯度洗脱，收集目标峰流出液，冻干，质谱鉴定，见图3、6、9和12。
实施例2、抗菌肽Cn-M4.7的合成
（1）树脂的活化及预处理
方法同实施例1。
（2）Cn-M4.7-MBHA的合成
a、Leu的耦合：溶胀后的树脂用20%哌啶/DMF溶液洗涤，抽干，重蒸DMF洗涤，茚检树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基团已脱，可接氨基酸。称取3倍过量的氨基酸、3倍过量的HOBt、HBTU，用重蒸DMF溶解，加入6倍过量的DIEA启动反应，加入到合成仪中，在氩气保护的条件下反应搅拌1h，反应时间到后抽干，用重蒸DMF洗涤，茚检树脂呈无色透明，表明反应完成，Leu耦合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA；
b、Leu的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Leu-Leu-MBHA；
c、Thr的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Thr-Leu-Leu-MBHA；
d、N-Me-Lys的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
e、Ile的耦合：20%哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护1h，用氯醌法检定Fmoc保护基是否脱去：若为无色，Fmoc保护基未脱除，重复上述步骤；若为蓝色，Fmoc保护基脱除成功。称取3倍过量的氨基酸、3倍过量的HOAt、HATU，6倍过量的DIEA，加入到合成仪中，在氩气保护的条件下反应搅拌2h，反应时间到后抽干，用重蒸DMF洗涤，氯醌法检定，若树脂为蓝色，说明偶合不完全，重复以上步骤；若树脂为无色，Ile耦合成功，得到Fmoc- Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
f、Arg的耦合：方法同步骤e，得到Fmoc-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
g、N-Me-Lys的耦合：方法同步骤e，得到Fmoc-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
h、Leu的耦合：方法同步骤e，得到Fmoc-Leu-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
i、Leu的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Leu-Leu-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
j、Gly的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
k、N端酰化：20%哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护，用DMF洗涤，茚检为蓝紫色，得到Gly-Leu-Leu-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA。分别将脂肪酸、HOBt、HBTU、DIEA与DMF混匀，在氩气保护的条件下反应搅拌1.5h，抽干，DMF洗涤，茚检无色，得到Cn-Gly-Leu-Leu-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA，其中n=8-14；
（3）多肽切割
方法同实施例1。
（4）多肽纯化
方法同实施例1，质谱鉴定，见图4、7、10和13。
实施例3、抗菌肽Cn-M5.7的合成
（1）树脂的活化及预处理
同实施例1。
（2）Cn-M5.7-MBHA的合成
a、Leu的耦合：溶胀后的树脂用20%哌啶/DMF溶液洗涤，抽干，重蒸DMF洗涤，茚检树脂呈蓝紫色，表明Fmoc保护基团已脱，可接氨基酸。称取3倍过量的氨基酸、3倍过量的HOBt、HBTU，用重蒸DMF溶解，加入6倍过量的DIEA启动反应，加入到合成仪中，在氩气保护的条件下反应搅拌1h，反应时间到后抽干，用重蒸DMF洗涤，茚检树脂呈无色透明，表明反应完成，Leu耦合成功，得到Fmoc-Leu-MBHA；
b、Leu的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Leu-Leu-MBHA；
c、Thr的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Thr-Leu-Leu-MBHA；
d、N-Me-Lys的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
e、Ile的耦合：20%哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护1h，用氯醌法检定Fmoc保护基是否脱去：若为无色，Fmoc保护基未脱除，重复上述步骤；若为蓝色，Fmoc保护基脱除成功。称取3倍过量的氨基酸、3倍过量的HOAt、HATU，6倍过量的DIEA，加入到合成仪中，在氩气保护的条件下反应搅拌2h，反应时间到后抽干，用重蒸DMF洗涤，氯醌法检定，若树脂为蓝色，说明偶合不完全，重复以上步骤；若树脂为无色，Ile耦合成功，得到Fmoc- Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
f、N-Me-Arg的耦合：方法同步骤e，得到Fmoc-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
g、Lys的耦合：方法同步骤e，得到Fmoc-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
h、Leu的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Leu-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
i、Leu的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Leu-Leu-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
j、Gly的耦合：方法同步骤a，得到Fmoc-Gly-Leu-Leu-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA；
k、N端酰化：20%哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护，用DMF洗涤，茚检为蓝紫色，得到Gly-Leu-Leu-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA。分别将脂肪酸、HOBt、HBTU、DIEA与DMF混匀，在氩气保护的条件下反应搅拌1.5h，抽干，DMF洗涤，茚检无色，得到Cn-Gly-Leu-Leu-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-MBHA，其中n=8-14；
（3）多肽切割
方法同实施例1。
（4）多肽纯化
方法同实施例1，质谱鉴定，见图5、8、11和14。
Claims (6)
1.一组含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物，其结构如下：
Cn-Gly-Leu-(N-Me-Leu)-Lys-Arg-(N-Me-Ile)-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2，标记为Cn-M3.6；
Cn-Gly-Leu-Leu-(N-Me-Lys)-Arg-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-NH2，标记为Cn-M4.7；
Cn-Gly-Leu-Leu-Lys-(N-Me-Arg)-Ile-(N-Me-Lys)-Thr-Leu-Leu-NH2，标记为Cn-M5.7；
其中n=10-14。
2.如权利要求1所述的含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物为活性成分在制备抗菌药物中的应用，所述抗菌药物包括抗金黄色葡萄球菌药物、抗枯草芽孢杆菌药物、抗大肠杆菌药物、抗肺炎克雷伯菌药物和抗铜绿假单胞菌药物。
3.如权利要求1所述的含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物的合成方法，其特征在于：在天然抗菌肽Anoplin上分别引入N-甲基化氨基酸，然后在结构的N端分别引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化，即得含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物。
4.如权利要求3所述的含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物的合成方法，其特征在于：在天然抗菌肽Anoplin上分别引入N-甲基化氨基酸，引入位点分别为3和6位，然后在结构的N端分别引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化，即得含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物Cn-M3.6。
5.如权利要求3所述的含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物的合成方法，其特征在于：在天然抗菌肽Anoplin上分别引入N-甲基化氨基酸，引入位点分别为4和7位，然后在结构的N端分别引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化，即得含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物Cn-M4.7。
6.如权利要求3所述的含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物的合成方法，其特征在于：在天然抗菌肽Anoplin上分别引入N-甲基化氨基酸，引入位点分别为5和7位，然后在结构的N端分别引入脂肪酸碳链修饰，经多肽切割和纯化，即得含N-甲基化氨基酸及N端脂肪酸修饰的抗菌肽类似物Cn-M5.7。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN111875707B (zh) * | 2020-05-20 | 2022-05-24 | 华南理工大学 | 一种融合多肽及其制备方法与应用 |
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102348723A (zh) * | 2008-12-05 | 2012-02-08 | 安吉奥开米公司 | 肽治疗剂轭合物及其应用 |
| WO2016044683A1 (en) * | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Tensive Controls, Inc. | Anti-microbial peptides |
| CN106632600A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-05-10 | 倪京满 | 含d型非天然氨基酸的抗菌肽类似物及其合成与应用 |
| CN107129520A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-05 | 倪京满 | 含d型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物及其合成与应用 |
| CN109265518A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-25 | 倪京满 | 具有高酶解稳定性和强抗菌活性的n-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102348723A (zh) * | 2008-12-05 | 2012-02-08 | 安吉奥开米公司 | 肽治疗剂轭合物及其应用 |
| WO2016044683A1 (en) * | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Tensive Controls, Inc. | Anti-microbial peptides |
| CN106632600A (zh) * | 2016-10-19 | 2017-05-10 | 倪京满 | 含d型非天然氨基酸的抗菌肽类似物及其合成与应用 |
| CN107129520A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-05 | 倪京满 | 含d型氨基酸的抗菌肽二聚体类似物及其合成与应用 |
| CN109265518A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-25 | 倪京满 | 具有高酶解稳定性和强抗菌活性的n-末端脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 |
| CN110054664A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-07-26 | 倪京满 | 含d型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Effect of N-methylated and fatty acid conjugation on analogs of antimicrobial peptide Anoplin;Tianqi Liu等;《European Journal of Pharmaceutical Sciences》;20200901;第1-18页 * |
| N-Methylation of Peptides: A New Perspective in Medicinal Chemistry;Jayanta Chatterjee等;《Acc. Chem. Res.》;20080718;第1331-1342页 * |
| Synthesis and biological activity of lipophilic analogs of the cationic antimicrobial active peptide anoplin;Kostas Chionis et al;《Journal of peptide science》;20161231;第1-6页 * |
| 新型抗菌肽Anoplin的N--甲基化氨基酸替换和N端脂肪酸修饰类似物的设计及构效关系研究;刘天琪;《万方学位论文数据库》;20201214;摘要，第28-36页 * |
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