CN110551731A - 一种白鳍鲨的MsrA基因、蛋白质与基因提取的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种白鳍鲨的MsrA基因、蛋白质与基因提取的方法，所述MsrA基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No：1所示。本发明在不需要对白鳍鲨基因全测序的条件下便能提供具有针对性的MsrA基因序列，提高了非模式生物基因克隆的效率；同时，本发明的白鳍鲨MsrA蛋白酶表达量及纯化度高，且在后续的研究中发现其在体内亦或是在体外都具有显著的修复甲硫氨酸氧化受损的功能。

Description

一种白鳍鲨的MsrA基因、蛋白质与基因提取的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种白鳍鲨的MsrA基因、蛋白质与基因提取的方法。

背景技术

蛋白质中的含硫氨基酸甲硫氨酸是很容易被氧化的氨基酸之一，甲硫氨酸被氧化之后产生S型和R型两种甲硫氨酸亚砜，前者可以特异地被甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)还原为甲硫氨酸。MsrA一般定位于线粒体中，因其重要的抵抗氧化应激和蛋白修复作用而成为生物体抗氧化系统中的重要成员。MsrA出现于30亿年前，在进化上非常原始。鲨鱼是一种原始的海洋生物，在进化上高度保守，健康鲨鱼终生游动，推测其可能具有更强大的抗氧化系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白鳍鲨的MsrA基因、蛋白质与基因提取的方法，以解决现有存在的由于白鳍鲨全基因序列还未被测定而无法获取其MsrA基因序列、蛋白序列及蛋白表达的问题。

本发明的技术方案如下：

一种白鳍鲨的MsrA基因，其中，所述MsrA基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNo：1所示。

所述的白鳍鲨的MsrA基因，其中，所述白鳍鲨的MsrA cDNA全长为1207bp。

所述的白鳍鲨的MsrA基因，其中，所述白鳍鲨的MsrA基因中，5’UTR为20bp，带有Ploy A尾巴的3’UTR长503bp，ORF为684bp。

所述的白鳍鲨的MsrA基因，其中，所述白鳍鲨的MsrA基因编码227个氨基酸。

一种表达本发明所述白鳍鲨的MsrA基因的蛋白质，其中，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示。

一种白鳍鲨的MsrA基因提取方法，其中，包括步骤：根据白鳍鲨肝脏总蛋白质谱分析所得的肽段，设计上下游简并引物，进行cDNA克隆，通过3’RACE和5’RACE法来获得两末端序列，并将得到的序列进行拼接，得到白鳍鲨的MsrA基因。

所述的白鳍鲨的MsrA基因提取方法，其中，具体包括步骤：

从白鳍鲨的肝脏组织中提取总RNA；

以所述总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

设计上下游简并引物，以获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；

将得到的扩增产物进行序列测定，将测定结果进行核酸BLAST比对，得到白鳍鲨的MsrA基因片段；

通过3’RACE和5’RACE法获得MsrA基因的两末端序列，将得到的序列进行拼接，得到白鳍鲨的MsrA基因。

有益效果：本发明在不需要对白鳍鲨基因全测序的条件下便能提供具有针对性的MsrA基因序列，提高了非模式生物基因克隆的效率；同时，本发明的白鳍鲨MsrA蛋白酶表达量及纯化度高，且在后续的研究中发现其在体内亦或是在体外都具有显著的修复甲硫氨酸氧化受损的功能。

附图说明

图1为白鳍鲨肝组织提取的总RNA图。

图2为菌液鉴定PCR电泳图。

图3为MsrA的多序列比对图。

图4为总蛋白SDS-PAGE图。

图5为纯化蛋白的SDS-PAGE图。

具体实施方式

本发明提供一种白鳍鲨的MsrA基因、蛋白质与基因提取的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的一种白鳍鲨的MsrA基因，其中，所述MsrA基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No：1所示。

本发明中，所述白鳍鲨的MsrA基因全长为1207bp，其中，5’UTR为20bp，带有Ploy A尾巴的3’UTR长503bp，ORF为684bp。所述白鳍鲨的MsrA基因编码227个氨基酸。

本发明的一种表达本发明所述白鳍鲨的MsrA基因的蛋白质，其中，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示。

本发明在不需要对白鳍鲨基因全测序的条件下便能提供具有针对性的MsrA基因序列，提高了非模式生物基因克隆的效率；同时，本发明的白鳍鲨MsrA蛋白酶表达量及纯化度高，且在后续的研究中发现其在体内亦或是在体外都具有显著的修复甲硫氨酸氧化受损的功能。

本发明的一种白鳍鲨的MsrA基因提取方法，其中，包括步骤：根据白鳍鲨肝脏总蛋白质谱分析所得的肽段，设计上下游简并引物，进行cDNA克隆，通过3’RACE和5’RACE法来获得两末端序列，并将得到的序列进行拼接，得到白鳍鲨的MsrA基因。

本发明以白鳍鲨的MsrA为研究对象进行相关研究。由于白鳍鲨基因组尚未测序，从白鳍鲨肝脏总蛋白质谱分析所得的肽段信息入手，设计简并引物进行cDNA克隆，并通过3’RACE和5’RACE法来获得其两末端序列。拼接得白鳍鲨MsrA的cDNA全长为1207bp，其中5’UTR为20bp，含Ploy A尾巴的3’UTR为503bp，CDS为684bp，共编码227个氨基酸。预测蛋白分子量为25.74kDa(文中表达的去信号肽融合蛋白25.37kDa)，等电点(pI)值为8.46。系统进化树分析发现白鳍鲨MsrA与哺乳动物、鱼类、部分鸟类和两栖类同源性较高(68％-74％)，由于其进化上的保守性，其MsrA与一些藻类和细菌也存在较高的同源性(62％-67％)。通过圆二色谱测定在pH为7.5，该蛋白含有α螺旋30％，β折叠16％，无规则卷曲结构54％。

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明。

实验用白鳍鲨(白鳍鲨，Triaenodon obesus)购于深圳市盐田区(活体，白鳍鲨，真鲨目)，解剖取肝脏组织，剪小块装入EP管，液氮速冻后置于-80℃冰箱储存待用。

用TRIZOL试剂提取总RNA(图1)，提取方法如下：

(1)提前一天，将勺子、镊子、研钵置于180℃烤箱烘烤2h，并配置0.1％DEPC水；

(2)先用液氮将研钵预冷，镊子夹取约2g鲨鱼肝组织块放入研钵，液氮研磨；

(3)用勺子刮取粉末使集中，加入2mL TRIZOL试剂并完全覆盖粉末，移至超净工作台静置5min；

(4)待融化后将匀浆液分两支移至RNase-free的EP管，12500rpm，4℃离心5min；

(5)将上清液分别转移至新的EP管，加入氯仿200μL并剧烈震荡15s，至溶液完全乳化无分相，室温静置5min，4℃下12500rpm离心15min；

(6)将上清液分别移至新EP管，加入等体积异丙醇混匀，室温静置10min后，4℃下12500rpm离心10min；

(7)弃上清液，分别加入-20℃预冷的75％乙醇1mL，4℃下12500rpm离心10min；

(8)弃上清液并敞口使酒精充分挥发，分别加入0.1％DEPC水20μL溶解RNA；

(9)各取2μL所提取的RNA溶液进行琼脂糖凝胶(0.8％)电泳，以检测RNA的质量。

然后按照pimeScript^TMRT-PCR Kit说明书进行RT-PCR反应，获得白鳍鲨肝脏总RNA。通过质谱获得白鳍鲨肝脏总蛋白肽段信息，并进一步分析得到肽段序列ELLKVFWESHDPTQGMR、EVCTGMTGHAEVVR、LQEALASK和LQEALASK，同时依据NCBI数据库中Anoplopoma fimbria(BT082637)，Nothobranchius furzeri(EU400617)，Homo sapiens(BC054033)和Xenopus laevis(BC053804)四个物种中MsrA在这些肽段中对应的核酸序列，设计上下游简并引物，扩增白鳍鲨MsrA基因的中游序列，将该段序列连接T-载体并转入大肠杆菌TOP10菌株，培育单克隆菌落并挑取菌落悬浮培养后进行菌液PCR(图2)，得到的阳性条带对应的单克隆菌液提取质粒后进行序列测定，将测序结果在GenBank数据库进行核酸BLAST比对，确定该序列为白鳍鲨基因的其中一段序列。再通过RACE技术获得MsrA 3′和5′末端序列，最后拼接成白鳍鲨MsrA全长序列。

白鳍鲨MsrA的cDNA全长为1207bp，其中5’UTR(非翻译区)为20bp，带有Ploy A尾巴的3’UTR长503bp，其ORF为684bp，共编码227个氨基酸。预测蛋白分子量为25.74kDa，等电点(pI)值为8.46。

将白鳍鲨(Triaenodon obesus)MsrA相关序列信息提交到NCBI GenBank(Accession number:)。通过蛋白序列BLAST分析发现，白鳍鲨MsrA与原鸡、牛、家兔、人等哺乳动物MsrA序列同源性高达70％-74％，与非洲齿鲤、斑马鱼、非洲爪蟾等鱼类和两栖动物类同源性高达68％-72％，由于其在进化上的保守性，与一些藻类和细菌的MsrA序列的同源性也达到了62％-67％(表1)。

将白鳍鲨MsrA的蛋白序列同其它物种如牛(Bos taurus)、线虫(Caenorhabditiselegans)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌(Pseudomonas)和蓝藻(Oscillatoriales cyanobacterium)进行多序列比对，其中白鳍鲨MsrA与线虫MsrA的序列一致性为35％，与酵母的为37％，与大肠杆菌的为56％(图3)。

与其它物种的MsrA一样，白鳍鲨的MsrA含有三个保守性的半胱氨酸即在N端的Cys-66，和在C端的Cys-212和Cys-221，除此之外，该蛋白结构中还含有3个半胱氨酸，其半胱氨酸总数多于其它物种，这是否与其抗氧化能力相关还需要进一步实验验证。随后构建pet28a-MsrA表达载体并成功转入BL21大肠杆菌菌株中，加入终浓度1mMIPTG诱导白鳍鲨MsrA融合蛋白大量表达(图4)，提取蛋白并纯化(图5)，与预测分子量一致。

表1.白鳍鲨MsrA与其它物种的同源性比对结果

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种白鳍鲨的MsrA基因、蛋白质与基因提取的方法

<160> 2

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 1

gaaagatatt cttgccggag atgagaacct ggcagcggtt cctactcggc aggatcgggc ttgcaatggc 60

tttccgagtt caaatgctat cgaaggagca agcctgtccc gggaggaccg agactatgaa agtttcagca 120

agacatcatg tcaatggaaa taggacagtc ggtccattcc ctgaaggact acagatggtg atgtttggca 180

tgggctgttt ctggggtgct gagagaaaat tctgggttca aaaaggtatc tattccactc aggttgggta 240

tgctggtgga tttactccaa acccaaccta taaggaggtc tgttcaggaa tgagtggcca cgcagaagta 300

gtgagagttg tgtaccatcc agacaaaatc tgctttgaaa aactgctcaa ggtcttctgg gagagccatg 360

acccaacaca aggtatgcgg caaggcaatg atattggcac acagtaccgc tcggtcattt acccatacac 420

acaggagcag atggctgcag ctctgaaatc caaagaggcc tatcaggagg aattgaacag gaatgggtat 480

ggtcaaatta caacagagat ccgtgagggt caagtattct actatgctga agattaccat caacaatact 540

tggataagaa cccaggcggt tattgtggat tgggtggcac tggggtatct tgcccaattg atattcagaa 600

ttaagacaca gcactgatat tatggcgaga aatgtcagat ttgccttaat tgacctgttt cgctgatcac 660

agatgagact gtttttgact gtgccagaat actggaggga gtagattggt ggctagttgt gcacatcttt 720

tctaaaaaag tggaaaccta tcccaatata ttgaaaatag ttgaataaaa ctctgcattt gattctggaa 780

ccctgttaag cattaagttg cagcaaaaga tgtaataatt tttaaatgtt tgctcttaca acattctcat 840

ctaaaatatg tgtaaatgtc aattgttgag aataaggcac aaaaaatata ttttcatatg tgtatatgtt 900

tctatatata tacatatata tttactgact gttttgttcc catagtcagt gccattggta caaagtgaat 960

tgcattattc tgaaaaagca ggaaaataaa tgaaagccat tacaatttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaa 1035

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列（rengongxulie）

<400> 2

Met Arg Thr Trp Gln Arg Phe Leu Leu Gly Arg Ile Gly Leu Ala Met

1 5 10 15

Ala Phe Arg Val Gln Met Leu Ser Lys Glu Gln Ala Cys Pro Gly Arg

20 25 30

Thr Glu Thr Met Lys Val Ser Ala Arg His His Val Asn Gly Asn Arg

35 40 45

Thr Val Gly Pro Phe Pro Glu Gly Leu Gln Met Val Met Phe Gly Met

50 55 60

Gly Cys Phe Trp Gly Ala Glu Arg Lys Phe Trp Val Gln Lys Gly Ile

65 70 75 80

Tyr Ser Thr Gln Val Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Thr Pro Asn Pro Thr

85 90 95

Tyr Lys Glu Val Cys Ser Gly Met Ser Gly His Ala Glu Val Val Arg

100 105 110

Val Val Tyr His Pro Asp Lys Ile Cys Phe Glu Lys Leu Leu Lys Val

115 120 125

Phe Trp Glu Ser His Asp Pro Thr Gln Gly Met Arg Gln Gly Asn Asp

130 135 140

Ile Gly Thr Gln Tyr Arg Ser Val Ile Tyr Pro Tyr Thr Gln Glu Gln

145 150 155 160

Met Ala Ala Ala Leu Lys Ser Lys Glu Ala Tyr Gln Glu Glu Leu Asn

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Gln Ile Thr Thr Glu Ile Arg Glu Gly Gln Val

180 185 190

Phe Tyr Tyr Ala Glu Asp Tyr His Gln Gln Tyr Leu Asp Lys Asn Pro

195 200 205

Gly Gly Tyr Cys Gly Leu Gly Gly Thr Gly Val Ser Cys Pro Ile Asp

210 215 220

Ile Gln Asn

225

Claims (7)

1.一种白鳍鲨的MsrA基因，其特征在于，所述MsrA基因的核苷酸序列如序列表中的SEQID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的白鳍鲨的MsrA基因，其特征在于，所述白鳍鲨的MsrA cDNA全长为1207bp。

3.根据权利要求1所述的白鳍鲨的MsrA基因，其特征在于，所述白鳍鲨的MsrA基因中，5’UTR为20bp，带有Ploy A尾巴的3’UTR长503bp，ORF为684bp。

4.根据权利要求1所述的白鳍鲨的MsrA基因，其特征在于，所述白鳍鲨的MsrA基因编码227个氨基酸。

5.一种表达权利要求1所述白鳍鲨的MsrA基因的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示。

6.一种白鳍鲨的MsrA基因提取方法，其特征在于，包括步骤：根据白鳍鲨肝脏总蛋白质谱分析所得的肽段，设计上下游简并引物，进行cDNA克隆，通过3’RACE和5’RACE法来获得两末端序列，并将得到的序列进行拼接，得到白鳍鲨的MsrA基因。

7.根据权利要求6所述的白鳍鲨的MsrA基因提取方法，其特征在于，具体包括步骤：

从白鳍鲨的肝脏组织中提取总RNA；

以所述总RNA为模板进行反转录获得cDNA；

设计上下游简并引物，以获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；

将得到的扩增产物进行序列测定，将测定结果进行核酸BLAST比对，得到白鳍鲨的MsrA基因片段；

通过3’RACE和5’RACE法获得MsrA基因的两末端序列，将得到的序列进行拼接，得到白鳍鲨的MsrA基因。