CN110546158A - 可溶性和免疫反应性黄病毒ns1多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及适合于检测分离的生物样品中的针对黄病毒的抗体的多肽，其包含黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列，其中没有来自所述黄病毒的NS1 β‑梯结构域的氨基酸序列存在于所述多肽中。在一个实施方案中，所述黄病毒选自寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒1‑4型(DENV1‑4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、黄热病病毒(YFV)和日本脑炎病毒(JEV)。还公开了用于产生所述黄病毒NS1侧翼结构域特异性多肽的方法，用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，所述黄病毒NS1侧翼结构域特异性多肽用于检测抗体的用途以及用于检测所述黄病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包含黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
Description
根据世界卫生组织，由黄病毒(诸如寨卡病毒、登革病毒和其他)传播的热带病继续在全球传播(Olliaro等人.PLOS Neglected Tropical Diseases Feb 1，2018，1-13)。黄病毒是黄病毒科的属，包括例如寨卡病毒、登革病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病病毒和日本脑炎病毒。黄病毒通过节肢动物载体诸如昆虫、蚊子或蜱、例如埃及和亚洲蚊子品系埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播，且因此被归类为虫媒病毒(节肢动物运载的病毒)。
用黄病毒感染否则健康的人可能导致轻微症状，如发烧、疲劳、皮疹和身体疼痛。然而，根据人的总体健康状况和免疫状况，感染也可导致严重和有时甚至致命的后遗症。尽管轻度症状共有一些相似性，但严重的并发症非常不同，这取决于各自的黄病毒。
寨卡病毒可以从孕妇传播至其出生前的胎儿，并且被怀疑引起未出生的孩子中的严重的脑畸形和缺陷诸如小头畸形。小头畸形(源自“小头”的希腊语)是其中婴儿的脑无法正常发育且因此其头部的尺寸小于正常的病况。成人中的感染可导致所谓的Guillan-Barré综合征(由攻击周围神经系统的免疫系统引起的肌无力)。
登革病毒的感染可导致医学并发症如出血热和死亡，尤其是如果未及时识别感染、随后立即进行支持疗法。迄今为止，已知四种类型的登革病毒(登革病毒1-4)，一种类型的登革感染不赋予对剩余类型的免疫力。通常，继发性登革感染比第一次感染打击更大，并且接种疫苗的人(尤其是小孩)在登革感染后经常面临严重的医学并发症。
西尼罗病毒的感染可影响中枢神经系统，导致脑炎(大脑发炎)或脑膜炎(大脑和脊髓周围的膜发炎)，并且也可导致类似于脊髓灰质炎的长期持续的麻痹。
有几种黄病毒感染的疫苗可用，例如用于登革、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病病毒和日本脑炎病毒，但不用于寨卡病毒。然而，疫苗接种并不总是有效，或者可导致严重的并发症，如例如继发性登革感染(对于综述，参见Collins和Metz，Clin Therap，2017第39卷，8p.1519-1536)。感染后的有效医学治疗是缺乏的。为了接受及时的支持治疗，至关重要的是知道患者是否已感染黄病毒，尤其是哪种特定种类的黄病毒。因此，需要开发高度灵敏和特异性的血清学诊断法，以可靠地证实或排除患者被黄病毒、尤其是寨卡病毒、登革病毒或西尼罗病毒中的任一种感染。具体而言，在多种黄病毒感染的高流行区域绝对需要高度特异性的免疫测定法。理所当然的是，可靠地诊断，例如，在过去已经历其他黄病毒感染(诸如登革热或黄热病)且其血清特征在于针对登革病毒和黄热病毒的主要免疫原的多克隆抗体的个体中的最近的寨卡感染是使人畏缩的任务。
自2016年以来，几种检测针对寨卡病毒NS1抗原的抗体的基于ELISA的免疫测定法是市售的(例如，Huzly等人，Euro Surveill.2016；21(16)pii＝30203，1-4)。然而，这些测定法被怀疑与最初已针对相关病毒(诸如登革病毒和属于黄病毒科的其他虫媒病毒，如西尼罗病毒、黄热病毒、蜱传脑炎病毒(FSME)或日本脑炎病毒)产生的抗体交叉反应。该交叉反应性会导致假阳性结果和患者的免疫状态的错误解释，并且似乎是由于寨卡NS1(非结构抗原1)与其在其他黄病毒(诸如西尼罗病毒和登革病毒)中的对应物的结构和序列同源性(Hilgenfeld2016年10月27日，Embo J.1-3)。可想象的是，由于当时已经使用的免疫测定法的特异性有限，在2015/2016年对于巴西的寨卡流行病报道的发病率和流行率数据具有夸大趋势的缺陷。为了评估流行率和发病率数据并评价出现的流行病的客观风险，明确的诊断是必不可少的先决条件。具有差特异性的血清学测定法会过分强调流行病的程度，且因此导致不仅由当局、而且由不安和受惊吓的个体的恐慌驱动的决定。例如，已经报道，随着关于真实或表面的寨卡流行病的中间报道，巴西的堕胎数量已显著增加。
基于ELISA原理的登革病毒和西尼罗病毒IgG和IgM免疫测定是市售可得的。然而，已知的免疫测定显然使用全长NS1抗原，所述全长NS1抗原一方面是高度免疫反应性的(即，其在黄病毒感染中作为免疫原是高度反应性的，并且其非常适合作为用于检测已在免疫应答的过程中产生的免疫球蛋白的抗原)，但另一方面容易与最初针对其他黄病毒产生的抗体发生交叉反应。
来自西尼罗病毒和登革病毒的全长、糖基化NS1的晶体结构已经被以高分辨率解析，并且揭示独特的结构域和相当复杂的蛋白质拓扑学(Akey等人，Science(2014；343(6173)：881-885)。近来，已经公开了寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)的C-末端片段(氨基酸残基172-352)的晶体结构，揭示头对头二聚体并证实NS1的寡聚特征(Song等人.NatureStruct.Mol.Biol.2016(23)5，456-459)。此外，Brown等人，Nature Struct.Mol.Biol.2016(23)9，865-868已经公开了全长寨卡病毒NS1的完整三维结构，其更详细地描述NS1结构。因此，NS1由于其寡聚状态、其糖基化模式以及其富含半胱氨酸残基而被证明是高度错综复杂的蛋白。然而，关于尤其用于寨卡、登革和西尼罗病毒的专用黄病毒抗原的出版物很少，并且迄今为止，尚无关于个别黄病毒抗原中独特且允许明确区分设想的病毒和相关黄病毒的线性或构象B-细胞表位的可靠信息。
国际专利申请WO2017/144173和WO2017/144173描述了352个氨基酸的全长寨卡NS1抗原的变体，其列出几个基本表位，其中NS1抗原的C-末端部分的β-梯结构域表位(位置322至326)被认为对于反应性至关重要。
因此，本发明的基本问题是迄今检测针对特定黄病毒、尤其是寨卡病毒、登革病毒和西尼罗病毒的抗体的可用的免疫测定法的特异性有限。通过如权利要求中指定的本发明解决了该问题。
发明概述：
本发明涉及适合于检测分离的生物样品中的针对黄病毒的抗体的多肽，其包含黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列，其中没有来自所述黄病毒的NS1 β-梯结构域的氨基酸序列存在于所述多肽中。在一个实施方案中，没有所述黄病毒的另外的氨基酸序列存在于所述多肽中。在一个实施方案中，所述黄病毒选自寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒1-4型(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、黄热病病毒(YFV)和日本脑炎病毒(JEV)。本发明还涉及用于产生所述黄病毒NS1侧翼结构域特异性多肽的方法，用于检测对黄病毒特异性的抗体，尤其是用于在针对至少第二或多种黄病毒物种的抗体存在的情况下检测第一黄病毒物种的方法，所述黄病毒NS1侧翼结构域特异性多肽用于检测抗体的用途以及用于检测所述黄病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包含黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
公开的氨基酸序列的说明：
成熟的NS1蛋白包含352个氨基酸残基(NS1，1-352)。在NS1蛋白内，侧翼结构域包含151个氨基酸残基，并且跨越NS1氨基酸区域30-180。因此，通过添加29个氨基酸位置，侧翼结构域位置(1-151)容易转化为NS1编号。反之亦然，通过减去多达29个氨基酸位置，NS1氨基酸位置容易转化为侧翼结构域编号；aa 1(侧翼)＝aa 30(NS1)，aa 2(侧翼)＝aa 31(NS1)，aa 3(侧翼)＝aa 32(NS1)，等等。以类似的方式，通过添加190个氨基酸位置，β-梯结构域位置(1-162)容易转化为NS1编号，因为NS1位置191-352对应于β-梯结构域。
SEQ ID NO：1，寨卡病毒NS1侧翼结构域aa 30-180，其中位置179X＝A或S或C
SEQ ID NO：2，寨卡病毒NS1侧翼结构域aa 30-180，其具有C55、C143、C179A
SEQ ID NO：3，寨卡病毒NS1全长aa 1-352；该序列也被公开为品系MR 766，UniProt ID W8Q7Q3；全长寨卡前体多蛋白内的对应编号为aa 795-1146
SEQ ID NO：4，寨卡病毒NS1 β-梯结构域aa 191-352
SEQ ID NO：5，根据UniProt ID P14336的蜱传脑炎(FSME)病毒NS1侧翼结构域aa30-180；欧洲亚型品系Neudoerfl；X＝A或C或S
SEQ ID NO：6：蜱传脑炎(FSME)病毒NS1全长aa 1-352；该序列也被公开为欧洲亚型品系Neudoerfl，UniProt ID P14336；全长前体内的对应编号为aa 777-1128。
SEQ ID NO：7，登革病毒1型NS1侧翼结构域aa 30-180；X＝A或C或S
SEQ ID NO：8，登革病毒1型NS1全长aa 1-352；该序列也在UniProt ID W8FUV0下公开；全长前体内的对应编号为aa 776-1127。
SEQ ID NO：9，登革病毒2型NS1侧翼结构域aa 30-180；X＝A或C或S
SEQ ID NO：10，登革病毒2型NS1全长aa 1-352；该序列也公开为根据UniProt IDP29990的品系Thailand/16881/1984；全长前体内的对应编号为aa 776-1127。
SEQ ID NO：11，登革病毒3型NS1侧翼结构域aa 30-180；X＝A或C或S)
SEQ ID NO：12，登革病毒3型NS1全长aa 1-352；该序列也在UniProt ID W8FRG8下公开；全长前体内的对应编号为aa 774-1125。
SEQ ID NO：13，登革病毒4型NS1侧翼结构域aa 30-180；X＝A或C或S)
SEQ ID NO：14，登革病毒4型NS1全长aa 1-352；该序列也公开为品系Philippines/H241/1956，UniProt ID Q58HT7；全长前体内的对应编号为aa 775-1126。
SEQ ID NO：15，西尼罗病毒NS1侧翼结构域aa 30-180；X＝A或C或S
SEQ ID NO：16，西尼罗病毒NS1全长aa 1-352；该序列也在UniProt ID P06935下公开；全长前体内的对应编号为aa 788-1139。
SEQ ID NO：17，黄热病病毒NS1侧翼结构域aa 30-180；X＝A或C或S
SEQ ID NO：18，黄热病病毒NS1全长aa 1-352；该序列也公开为品系17D疫苗，UniProt ID P03314；全长前体内的对应编号为aa 779-1130。
SEQ ID NO：19，日本脑炎病毒NS1侧翼结构域aa 30-180；X＝A或C或S
SEQ ID NO：20，日本脑炎病毒NS1全长aa 1-352；该序列也在UniProt ID Q9YJ16下公开；全长前体内的对应编号为aa 795-1146。
SEQ ID NO：21，串联的大肠杆菌SlyD与寨卡病毒NS1侧翼结构域aa 30-180的融合蛋白
SEQ ID NO：22，串联的大肠杆菌SlyD与寨卡病毒NS1 β-梯结构域(aa 191-352，品系Mr766)的融合蛋白
SEQ ID NO：23，大肠杆菌SlyD与寨卡病毒NS1 β-梯结构域(aa 191-352，品系Mr766)的融合蛋白
SEQ ID NO：24，登革病毒1型NS1 β-梯结构域aa 191-352
SEQ ID NO：25，登革病毒2型NS1 β-梯结构域aa 191-352
SEQ ID NO：26，登革病毒3型NS1 β-梯结构域aa 191-352
SEQ ID NO：27，登革病毒4型NS1 β-梯结构域aa 191-352
SEQ ID NO：28-35的序列显示于电子序列表中。氨基酸X表示该位置可以由丙氨酸、半胱氨酸或丝氨酸填充(X＝A或C或S)。
SEQ ID NO：28，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒1型NS1侧翼结构域aa 30-180的融合蛋白
SEQ ID NO：29，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒2型NS1侧翼结构域aa 30-180的融合蛋白
SEQ ID NO：30，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒3型NS1侧翼结构域aa 30-180的融合蛋白
SEQ ID NO：31，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒4型NS1侧翼结构域aa 30-180的融合蛋白
SEQ ID NO：32，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒1型NS1 β-梯结构域aa 191-352的融合蛋白
SEQ ID NO：33，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒2型NS1 β-梯结构域aa 191-352的融合蛋白
SEQ ID NO：34，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒3型NS1 β-梯结构域aa 191-352的融合蛋白
SEQ ID NO：35，串联的大肠杆菌SlyD与登革病毒4型NS1 β-梯结构域aa 191-352的融合蛋白
发明详述
用于检测黄病毒抗体(诸如针对寨卡病毒、登革病毒和西尼罗病毒的抗体)的市售免疫测定法(IgG和IgM免疫测定法两者)基于ELISA原理。然而，已知的免疫测定法显然使用全长NS1抗原，其一方面是高度免疫反应的，但另一方面显示与针对寨卡病毒、登革病毒和其他黄病毒(如西尼罗病毒)、黄热病病毒或其他黄病毒的NS1同源物产生的抗体的高免疫交叉反应性。另外，由于其复杂的四级结构，不可能以可溶且稳定的单体形式提供NS1，这将是设计用于以双抗原夹心形式特异性IgG检测的免疫测定法的先决条件。在现有技术中尚未描述满足这些要求且能够实现适合于自动化的高度特异性免疫测定的专用黄病毒NS1抗原。令人惊讶地，通过将黄病毒NS1抗原限制于其侧翼结构域并除去NS1抗原的所谓的β-梯结构域序列，获得能够特异性检测针对特定种类的黄病毒的抗体的可溶性和稳定的NS1抗原变体。
当用寨卡的NS1抗原的两种不同片段(即用所谓的“侧翼”结构域抗原和所谓的“β梯”结构域抗原)测试抗寨卡病毒抗体阳性的样品时，很明显两种抗原均能够检测抗寨卡抗体。然而，我们发现侧翼结构域抗原不与登革热抗体阳性样品交叉反应，而寨卡NS1 β-梯结构域抗原与登革热抗体阳性样品交叉反应，导致假阳性结果和错误结论。用抗寨卡阳性血清和相关虫媒病毒的NS1抗原的额外阻断实验最终显示，这些相关虫媒病毒NS1抗原几乎无法淬灭寨卡NS1侧翼结构域抗原信号，而寨卡NS1 β-梯结构域信号则被明显淬灭。我们推断竞争相关的虫媒病毒NS1抗原显著阻断β-梯抗原与免疫球蛋白的结合。因此，我们能够显示寨卡NS1侧翼结构域抗原较不易受与其他虫媒病毒NS1同源物免疫交叉反应性的影响。作为结果，寨卡NS1侧翼结构域使得能够以优异的特异性对抗寨卡抗体进行免疫测定，所述免疫测定能够在其他(近来或过去)虫媒病毒感染存在的情况下诊断寨卡病毒感染，在一个实施方案中，区分寨卡病毒感染与登革病毒感染。
类似地，对于登革病毒抗体检测，我们能够鉴定来自所有四种登革病毒血清型的NS1侧翼结构域抗原，我们将其在大肠杆菌中以高产率过表达，并且在纯化和功能增溶后重新折叠成免疫反应形式。我们发现证据证明，DENV 1-4的单个登革侧翼结构域与DENV阳性血清的预先表征的商业组非常不同地反应。结果表明，使用登革NS1侧翼结构域作为免疫测定中的抗原，四种不同的登革病毒血清型的免疫学区分是可行的。总体而言，缺乏NS1的β-梯结构域的登革NS1侧翼结构域是适合于特异性登革抗体检测的抗原。
在针对西尼罗病毒的平行方法中，我们还能够过量生产(在大肠杆菌中)以纯化和功能性折叠NS1侧翼结构域抗原，其允许特异性检测针对西尼罗病毒的抗体。
基于我们的实验发现，我们得出结论，不含NS1 β-梯结构域的氨基酸序列的黄病毒NS1侧翼结构域充当用于特异性检测针对对应于所使用的NS1侧翼结构域氨基酸序列的黄病毒的抗体的优异抗原，由此将其与其他黄病毒区分。具体而言，该结论适用于寨卡、登革和西尼罗病毒抗体的特异性检测。
本发明因此涉及适合于检测分离的生物样品中的针对黄病毒的抗体的多肽，其包含黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列，其中没有来自所述黄病毒的NS1 β-梯结构域的氨基酸序列存在于所述多肽中。在一个实施方案中，没有所述黄病毒的另外的氨基酸序列存在于所述多肽中。在另一个实施方案中，所述黄病毒选自寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒1-4型(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)，在一个实施方案中，所述黄病毒是登革病毒1-4型。
在一个实施方案中，所述NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列基本上由多肽组成，所述多肽选自SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17和19，一个实施方案中，选自SEQ ID NO.7、9、11、13和15，一个实施方案中，选自SEQ ID NO.7、9、11和13(登革病毒1-4型的NS1结构域)。
术语“NS1”、“NS1抗原”、“NS1多肽”同义使用，并且是指病毒前体多蛋白内的第一非结构抗原(NS1)，并且涉及(除非另有说明)全长抗原NS1。对于西尼罗病毒和登革病毒2，该蛋白的结构已经描述于Akey等人，同上中。对于寨卡NS1，Song等人(同上)已经描述了C-末端结构域的结构(氨基酸残基172-352)，并且Brown等人(同上)已经进一步详细描述了完整NS1三维结构。寨卡NS1序列包含352个氨基酸且显示于SEQ ID NO：3中，蜱传脑炎病毒NS1显示于SEQ ID NO：5中，登革病毒1型NS1显示于SEQ ID NO：8中，登革病毒2型NS1显示于SEQID NO：10中，登革病毒3型NS1显示于SEQ ID NO：12中，登革病毒4型NS1显示于SEQ ID NO：14中，西尼罗病毒NS1显示于SEQ ID NO：16中，黄热病病毒NS1显示于SEQ ID NO：18中，日本热病毒NS1显示于SEQ ID NO：20中。术语“NS1侧翼”或“NS1侧翼结构域”、“NS1侧翼的变体”或“NS1侧翼区域”是指NS1多肽内的结构域，并且因此是NS1的部分序列。对于寨卡NS1侧翼结构域，这例举于SEQ ID NO：1和2中，对于其他黄病毒的NS1侧翼结构域，例举于SEQ IDNO：5(TBEV)、NO：7(DENV1)、NO：9(DENV2)、NO：11(DENV3)、NO：13(DENV4)、NO：15(WNV)、NO：17(YEV)和NO：19(JEV)中。而且，术语“多肽(polypeptide)”、“多肽(polypeptides)”、“抗原(antigen)”和“抗原(antigens)”应理解为同义词，除非另外指出。
同义术语“β-梯”、“β-梯结构域”或“梯尖端抗原”或“梯尖端”、“梯尖端结构域”、“梯尖端多肽”、“梯尖端抗原”是指位于C-末端相邻侧翼结构域的NS1结构域。对于西尼罗病毒和登革病毒2，该结构域已经描述于Akey等人，同上中。对于寨卡病毒，该NS1结构域已经由Song等人(同上)和Brown等人(同上)描述。对于寨卡NS1 β-梯结构域，氨基酸序列例举于SEQ ID NO：4中，对于登革病毒1-4型，氨基酸序列例举于SEQ ID NO：24-27中。其他黄病毒的β-梯结构域可见于对应于每种病毒的全长NS1序列的C-末端部分(aa191-352)中。
这些定义适用于本说明书内的所有虫媒病毒。属于黄病毒科的以下虫媒病毒可以如下缩写：西尼罗病毒(西尼罗，WNV)、蜱传脑炎病毒(TBEV或FSME)、登革病毒1-4(登革热，登革热的四种病毒株：DENV 1-4)、黄热病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)。
根据本发明，黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列是这样的氨基酸序列，其中没有来自所述黄病毒的NS1 β-梯结构域的氨基酸序列存在于所述多肽中。在一个实施方案中，没有所述黄病毒的另外的氨基酸序列存在于所述多肽中。例如，寨卡NS1侧翼结构域多肽仅含有侧翼结构域序列，在一个实施方案中含有SEQ ID NO.1或2。没有另外的寨卡病毒，在一个实施方案中，没有寨卡病毒NS1特异性氨基酸序列存在于该序列中，在一个实施方案中，SEQ ID NO：4不存在于所述多肽序列中。在一个进一步实例中，DENV1 NS1侧翼结构域含有SEQ ID NO：7，但不含SEQ ID NO：24(β-梯)。其他实例是DENV2NS1侧翼(SEQ ID NO：9)，其中不存在SEQ ID NO：25；DENV3NS1侧翼(SEQ ID NO：11)，其中不存在SEQ ID NO：26；DENV4NS1侧翼(SEQ ID NO：13)，其中不存在SEQ ID NO：27；WNV NS1侧翼(SEQ ID NO：15)，其中不存在WNV β-梯结构域。不存在NS1 β-梯结构域特异性序列，且在一个实施方案中，不存在另外的黄病毒NS1特异性序列或另外的黄病毒特异性序列，支持减少或完全避免与针对其他虫媒病毒产生的抗体的交叉反应性的目的。
然而，同样涵盖黄病毒NS1侧翼结构域多肽的变体。这些变体可以由本领域技术人员通过保守或同源取代公开的氨基酸序列(诸如例如用丙氨酸或丝氨酸取代半胱氨酸，或用缬氨酸取代异亮氨酸，或反之亦然)而容易地生成。在该上下文中的术语“变体”还涉及与所述蛋白基本上类似的蛋白或蛋白片段(即，多肽或肽)。例如，修饰诸如在一个末端或两个末端处的C-或N-末端截短1至10个氨基酸、在一个实施方案中1至5个氨基酸在请求保护的黄病毒NS1侧翼结构域抗原的范围内。具体而言，变体可以是与最普遍的蛋白同种型的氨基酸序列相比显示氨基酸交换、缺失或插入的同种型。在一个实施方案中，这样基本上类似的蛋白与蛋白最普遍的同种型具有至少80％，在另一个实施方案中至少85％或至少90％，在又另一个实施方案中至少95％的序列相似性。术语“变体”还涉及翻译后修饰的蛋白诸如糖基化或磷酸化的蛋白。根据本发明，变体分类为黄病毒NS1侧翼结构域变体，只要体外诊断免疫测定法中的免疫反应性不变或基本上得到维持，即变体仍然能够结合并检测分离的样品中存在的抗黄病毒抗体，同时针对其他虫媒病毒产生的抗体未检测到或在低得多的程度上检测到。另外，所述黄病毒多肽的整体三维结构保持不变，使得在变体中仍存在可接近的先前(即在野生型中)存在且可接近的用于结合抗体的表位。
“变体”也是这样的蛋白或抗原，其已经例如通过将标记物或载体部分共价或非共价附接至蛋白或抗原而被修饰。可能的标记物是放射性的、荧光的、化学发光的、电化学发光的、酶或其他例如像地高辛(digoxin)、地高辛配基(digoxigenin)或生物素。这些标记物是本领域技术人员已知的。
当以SEQ ID NO的形式指定的提供的多肽序列信息通过术语“基本上由...组成”(即，所述序列)描述时，这意味着该序列如字面上所列出地存在，但也可以作为在与抗体的免疫结合的方面实质上不影响该多肽的基本特征的变体存在。其一个实例是在该肽的N-和/或C-末端仅缺失或添加很少的氨基酸，以及类似氨基酸的交换，如例如丙氨酸交换为丝氨酸，异亮氨酸交换为缬氨酸，且反之亦然。
本发明的黄病毒NS1侧翼结构域抗原是可溶的、稳定的和免疫反应的，即，它们适合作为抗原用于免疫学测定法中。这意味着根据本发明的抗原在生理缓冲剂条件下，例如在没有添加去污剂的情况下在环境温度在磷酸盐缓冲系统中，是可溶的。所述抗原也能够结合对于黄病毒NS1侧翼结构域特异性的抗体(如例如分离的样品诸如人血清中存在的抗寨卡或抗登革抗体)或被其识别和结合。
在一个实施方案中，向黄病毒NS1侧翼结构域多肽添加非黄病毒特异性接头或肽融合氨基酸序列是可以的，因为这些序列对于抗黄病毒抗体不是特异性的并且不会干扰体外诊断免疫测定法。
在一个实施方案中，所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原可以与蛋白伴侣融合。术语“融合蛋白”、“融合多肽”或“融合抗原”是指这样的蛋白，其包含黄病毒NS1侧翼结构域多肽和至少一个提供融合伴侣的作用的源自蛋白伴侣的蛋白部分。
蛋白伴侣是众所周知的折叠辅助蛋白，其辅助其他蛋白的折叠和结构完整性的维持。折叠辅助物的实例详细描述于WO 03/000877中。根据本发明，肽基脯氨酰异构酶类别的蛋白伴侣诸如FKBP家族的蛋白伴侣可用于与黄病毒NS1侧翼结构域抗原变体融合。适合作为融合伴侣的FKBP蛋白伴侣的实例是FkpA、SlyD和SlpA。适合作为黄病毒NS1侧翼抗原的融合伴侣的其他蛋白伴侣是Skp，来自大肠杆菌的周质的三聚体蛋白伴侣，其不属于FKBP家族。并不总是必须使用蛋白伴侣的完整序列。也可以使用仍然具有所需能力和功能的蛋白伴侣的功能片段(所谓的能够结合的组件或多肽结合基序)(参照WO 98/13496)。
在本发明的进一步实施方案中，FKBP蛋白伴侣(诸如例如大肠杆菌SlyD、SlpA或FkpA)中的至少一个或至少两个组件被用作用于表达黄病毒NS1侧翼结构域抗原的融合部分。蛋白伴侣Skp同样可用作融合伴侣。两个FKBP-蛋白伴侣结构域的融合导致所得融合多肽的溶解性提高。融合部分可位于黄病毒NS1侧翼结构域抗原的N-末端或C-末端或同时两个末端处(夹心样)。
在一个实施方案中，黄病毒NS1侧翼结构域抗原融合至寡聚蛋白伴侣。寡聚蛋白伴侣是这样的蛋白伴侣，其天然形成二聚体、三聚体或更高阶多聚体，使得多个单体亚基通过特异性非共价相互作用组装成良好定义的功能四级结构。由此，共价融合的抗原同样被强制为更高的表位密度。优选的寡聚蛋白伴侣是FkpA和Skp。多聚化抗原尤其可用于检测IgM抗体以及因此感染后立即发生的早期免疫应答。
在一个实施方案中，所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽与一个、两个或更多个细菌的蛋白伴侣分子SlyD、SlpA、FkpA或Skp、在一个实施方案中大肠杆菌的蛋白伴侣分子SlyD、SlpA、FkpA或Skp融合。在进一步实施方案中，所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽由SEQ ID NO：21(寨卡)、28(DENV1)、29(DENV2)、30(DENV3)或31(DENV4)组成。
本发明的另一个实施方案是黄病毒NS1侧翼结构域抗原，其不与针对来自其他黄病毒的结构相关抗原产生的抗体发生免疫交叉反应。在一个实例中，寨卡NS1侧翼结构域抗原不与针对来自包含SEQ ID NO：5或6中任一个的蜱传脑炎病毒和/或来自包含SEQ ID NO：7至14中任一个的登革病毒1-4和/或来自包含SEQ ID NO：15或16中任一个的西尼罗病毒和/或来自包含SEQ ID NO：17或18中任一个的黄热病病毒和/或来自包含SEQ ID NO：19至20中任一个的日本脑炎病毒的结构相关抗原产生的抗体发生免疫交叉反应，但与针对根据SEQ ID NO：3的全长寨卡病毒NS1抗原产生的抗体免疫反应。在进一步实施方案中，所述寨卡NS1抗原是寨卡NS1侧翼结构域抗原，其中寨卡特异性序列基本上由SEQ ID NO：1或2组成，在一个实施方案中由SEQ ID NO：1或2组成。根据寨卡NS1，还有其他黄病毒NS1抗原，如例如登革1-4型的NS1不与针对来自其他黄病毒的结构相关抗原产生的抗体发生免疫交叉反应，即在登革实例中，不与寨卡、TBEV、WNV、YEV和JEV的NS1侧翼结构域免疫交叉反应。
术语“不发生免疫交叉反应”表示强烈降低或完全消除的不期望的免疫反应性。已创造术语“免疫学交叉反应性”以举例说明免疫球蛋白的不想要的结合，这是由于抗原的序列或结构与最初已针对其建立抗体的免疫原的相似性导致。在一个实施方案中，与全长寨卡病毒NS1多肽相比，寨卡病毒NS1侧翼结构域多肽显示朝向针对上文命名的同源或相关的虫媒病毒NS1抗原产生的抗体或抗体子集的免疫反应性性完全消除或强烈降低。在又另一个实施方案中，寨卡病毒NS1侧翼结构域多肽显示朝向针对登革病毒产生的抗体或抗体子集、在一个实施方案中朝向针对登革病毒1、2、3、4型产生的抗体的强烈降低的免疫交叉反应性。在进一步实施方案中，寨卡病毒NS1侧翼结构域多肽的强烈降低的免疫交叉反应性也适用于针对黄热病病毒产生的抗体或抗体子集。在又另一个实施方案中，登革病毒1-4型病毒NS1侧翼结构域多肽显示朝向针对寨卡病毒产生的抗体或抗体子集的免疫交叉反应性强烈降低。
表述“不发生免疫交叉反应”还指这样的情况，其中在用于检测抗体的双抗原夹心形式的免疫测定法中，样品抗体(即，分析物抗体)被两种特异性抗原结合：一种能够与固相结合，且另一种携带标记物，样品抗体被夹在两种抗原之间。在分析物抗体存在的情况下，标记的抗原-在所得的三元免疫复合物内-吸收至固相并产生信号。在目前情况下，标记黄病毒NS1侧翼结构域多肽，诸如例如寨卡NS1侧翼，并且将测量的信号设定为100％。在平行或随后的实验中，用相同(阳性)样品的另一等分试样进行相同的测定法，且此外，将具有怀疑与标记的抗原竞争的氨基酸序列的非标记的抗原添加至混合物中。在目前情况下，添加TBEV、DENV1-4、WNV、YFV或JEV的全长NS1多肽。在另一个实施方案中，添加仅由TBEV、DENV1-4、WNV、YFV或JEV的NS1侧翼结构域组成或仅包含TBEV、DENV1-4、WNV、YFV或JEV的NS1侧翼结构域的NS1多肽。当测量后获得的信号维持在原始信号的约至少70％信号回收率、在一个实施方案中至少80％信号回收率、在一个实施方案中至少85％信号回收率、在一个实施方案中至少90％信号回收率时，黄病毒(本实施例中：寨卡)NS1多肽不易于信号淬灭。其不被添加的抗原所竞争超出，且因此抵抗住潜在交叉反应物质。为了举例说明，在实施例2(表2)中描述了此类阻断实验。
在一个实施方案中，在上述阻断实验中添加来自包含SEQ ID NO：5或6中任一个的蜱传脑炎病毒和/或来自包含SEQ ID NO：7至14中任一个的登革病毒1-4和/或来自包含SEQID NO：15或16中任一个的西尼罗病毒和/或来自包含SEQ ID NO：17或18中任一个的黄热病病毒和/或来自包含SEQ ID NO：19至20中任一个的日本脑炎病毒的NS1全长或NS1侧翼结构域肽。
在另一个实施方案中，所述寨卡NS1侧翼结构域多肽与针对如SEQ ID NO：3中所示的全长NS1抗原产生的抗体或抗体子集免疫反应。这意味着在上面公开的测定方案中，在添加全长寨卡NS1多肽后，寨卡NS1侧翼结构域多肽的信号应被完全淬灭(100％)。
如何确定与寨卡相关病毒的免疫学交叉反应性的方法在实施例2中进一步描述，并且可以类似的方式转移至用其他黄病毒进行的阻断实验。
可以借助本领域已知的重组DNA技术和蛋白纯化技术来生成和制备黄病毒NS1多肽(侧翼结构域和β-梯结构域)以及用于实施例2的阻断实验的多肽。本发明的另一个方面因此是编码黄病毒NS1侧翼结构域抗原、在一个实施方案中如上进一步定义的根据SEQ IDNO 1、2、21、5、7、9、11、13、15、17、19、28、29、30和31的抗原及其变体的重组DNA分子。
术语“重组DNA分子”是指这样的分子，其通过组合两个以其他方式分离的DNA序列区段而制成，所述组合由通过遗传工程改造技术或通过化学合成人工操作多核苷酸的分离的区段而完成。这样做时，可以将具有期望功能的多核苷酸区段接合在一起以生成期望的功能组合。用于在原核或低等或高等真核宿主细胞中表达蛋白的重组DNA技术是本领域中众所周知的。它们已经例如由Sambrook等人，(1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual)描述。
根据本发明的重组DNA分子也可以含有这样的序列，所述序列编码在黄病毒NS1侧翼结构域抗原和融合部分之间和还在几个融合部分之间的5至100个氨基酸残基的接头肽。这样的接头序列可以例如携带蛋白水解切割位点。
本发明的进一步方面是表达载体，其包含可操作连接的根据本发明的重组DNA分子，即编码黄病毒NS1侧翼结构域抗原和任选肽基脯氨酰异构酶蛋白伴侣诸如FKBP-蛋白伴侣的重组DNA分子，其中FKBP-蛋白伴侣选自FkpA、SlyD和SlpA。在一个替代实施方案中，所述重组DNA分子编码包含黄病毒NS1侧翼结构域抗原和Skp的融合蛋白。根据本领域众所周知的方法，包含根据本发明的重组DNA的表达载体可用于在无细胞翻译系统中表达黄病毒NS1侧翼结构域抗原或可用于转化宿主细胞用于表达黄病毒NS1侧翼结构域抗原。本发明的另一个方面因此涉及用根据本发明的表达载体转化的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，在大肠杆菌细胞中产生重组黄病毒NS1侧翼结构域抗原。
一个额外方面是用于产生可溶的、稳定的和免疫反应性的黄病毒NS1侧翼结构域抗原的方法。所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原可以作为含有黄病毒NS1侧翼结构域抗原和蛋白伴侣的融合蛋白产生。优选地，使用蛋白伴侣，诸如Skp或肽基脯氨酰异构酶类别蛋白伴侣如FKBP蛋白伴侣。在本发明的进一步实施方案中，所述FKBP蛋白伴侣选自SlyD、FkpA和SlpA。
该方法包括以下步骤：
a)培养用含有编码黄病毒NS1侧翼结构域抗原的基因的上述表达载体转化的宿主细胞
b)表达编码所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原的基因
c)纯化所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原。
任选地，作为额外的步骤d)，需要实施功能性增溶，使得借助本领域已知的重折叠技术使黄病毒NS1侧翼结构域抗原成为可溶和免疫反应性的构象。
又另一个实施方案是用于在无细胞体外翻译系统中产生可溶的、稳定和免疫反应性的黄病毒NS1侧翼结构域抗原的方法。
本发明的一个额外方面涉及用于检测分离的人样品中的抗黄病毒抗体的方法，其中使用根据本发明的黄病毒NS1侧翼结构域抗原作为抗体的结合配偶体。本发明因此涵盖用于检测分离的样品中的对于黄病毒、尤其对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，所述方法包括a)通过混合体液样品与根据本发明的黄病毒NS1侧翼结构域抗原来形成免疫反应混合物，b)维持所述免疫反应混合物一定时间段，所述时间段足以允许所述体液样品中存在的针对所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原的抗体与所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原免疫反应，以形成免疫反应产物；和c)检测所述免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。
在整个说明书中，术语“第一黄病毒”或“第一黄病毒物种”意味着在针对至少第二或多种黄病毒物种的抗体存在的情况下检测对于一种黄病毒物种特异性的抗体。经常，患者样品不仅含有一种黄病毒抗体，而且还含有来自过去可能已发生的感染的抗体。例如，如果第一黄病毒物种是登革病毒，则通过免疫测定法没有检测到针对第二物种(像例如寨卡或西尼罗病毒或两种(多种)病毒)的抗体。
在一个实施方案中，所述方法涉及检测抗登革抗体，应用登革病毒1-4型NS1侧翼结构域抗原(单独或全部四种抗原类型)作为样品抗体的结合配偶体。在一个实施方案中，登革NS1侧翼结构域抗原是选自SEQ ID NO.7、9、11、13、28、29、30和31的多肽。
在进一步的方面，所述方法适合于在相同免疫测定法中检测IgG和IgM亚类或两种类别的黄病毒抗体。在一个实施方案中，所述黄病毒抗体是抗登革病毒1-4型抗体。
用于检测抗体的免疫测定法是本领域中众所周知的，并且用于实施这样的测定法的方法和实际应用和程序也是本领域中众所周知的。根据本发明的黄病毒NS1抗原可用于不依赖于使用的标记物并且不依赖于检测模式(例如，放射性同位素测定法，酶免疫测定法，电化学发光测定法等)或测定法原理(例如测试条测定法、夹心测定法、间接测试概念或均质测定法等)而改进用于检测抗黄病毒抗体的测定法。
在本发明的一个实施方案中，所述免疫测定法是应用微粒作为固相的基于微粒的免疫测定法。如本文所用的“颗粒”意指可以归于物理特性诸如体积、质量或平均尺寸的小的、局部化物体。微粒因此可以是对称的、球状的、基本上球状的或球形的形状，或者是不规则的、不对称的形状或形式。本发明设想的颗粒的尺寸可以变化。在一个实施方案中，使用的微粒是球状的形状，例如直径在纳米和微米范围内的微粒。在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的微粒具有50纳米至20微米的直径。在进一步实施方案中，所述微粒具有100nm至10μm的直径。在一个实施方案中，在根据本公开的方法中使用的微粒具有200nm至5μm或750nm至5μm的直径。
如上文所定义的微粒可以包含本领域技术人员已知的任何合适的材料或由其组成，例如它们可以包含无机或有机材料或由其组成或基本上由其组成。通常，它们可以包含金属或金属的合金或有机材料或由其组成或基本上由其组成，或者包含碳水化合物成分(carbohydrate elements)或由其组成或基本上由其组成。设想的微粒材料的实例包括琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳、聚乙烯醇、二氧化硅和铁磁金属、合金或组合材料。在一个实施方案中，所述微粒是磁性或铁磁性金属、合金或组合物。在进一步实施方案中，所述材料可以具有特定特性，并且例如是疏水的或亲水的。此类微粒通常分散在水溶液中并且保留小的负表面电荷，保持微粒分离并避免非特异性聚集。
在本发明的一个实施方案中，所述微粒是顺磁性微粒，并且在根据本公开的测量方法中通过磁力帮助此类颗粒的分离。施加磁力以将顺磁性或磁性颗粒从溶液/悬浮液中拉出并如期望地保留它们，同时可以移除溶液/悬浮液的液体，并且可以例如洗涤颗粒。
专家已知的所有生物学液体都可以用作用于检测抗黄病毒抗体、在一个实施方案中抗登革抗体的分离的样品。通常使用的样品是体液，像全血、血清、血浆、尿或唾液，在一个实施方案中是血清或血浆。
本发明的进一步实施方案是根据所谓的双抗原夹心概念(DAGS)进行的用于检测分离的样品中的抗寨卡抗体的免疫测定法。有时，该测定法概念也称为双抗原桥概念，因为两个抗原通过抗体分析物桥接。在这样的测定法中，需要和利用抗体用其两个(IgG、IgE)、四个(IgA)或十个(IgM)互补位结合给定抗原的至少两个不同分子的能力。
更详细地，通过孵育含有抗黄病毒抗体的样品与相同黄病毒的两种不同的黄病毒NS1侧翼结构域抗原，即，第一(“固相”或“捕获”)黄病毒NS1侧翼结构域抗原和第二黄病毒NS1侧翼结构域抗原(“检测”或“报告”)抗原，实施根据双抗原桥形式的用于测定抗黄病毒抗体的免疫测定法，其中所述抗原各自与所述抗黄病毒抗体特异性结合。第一抗原可以直接或间接结合至固相并且通常携带效应基团，所述效应基团是生物亲和(bioaffine)结合对的部分。在一个实施方案中，抗黄病毒抗体是抗登革抗体，并且两种不同的黄病毒NS1侧翼结构域抗原来自相同的登革病毒类型。
适合于根据本发明的方法的一种类型的生物亲和结合对是半抗原和抗半抗原抗体结合对。半抗原是分子量为100-2000道尔顿、优选150-1000道尔顿的有机分子。此类小分子可以通过将其与载体分子偶联而赋予免疫原性，并且可以根据标准程序产生抗半抗原抗体。所述半抗原可以选自甾醇类、胆汁酸类、性激素类、皮质激素类、强心苷类、强心苷-糖苷类、蟾蜍二烯羟酸内酯类、甾类-皂角苷元类(steroid-sapogenines)和类固醇生物碱类、强心苷类和强心苷-糖苷类。这些物质类别的代表是地高辛配基(digoxigenin)、洋地黄毒苷配基(digitoxigenin)、羟基洋地黄毒苷配基(gitoxigenin)、毒毛旋花苷配基(strophanthidin)、地高辛(digoxin)、洋地黄毒苷(digitoxin)、ditoxin和毒毛旋花苷(strophanthin)。另一种合适的半抗原是例如荧光素。在一个实施方案中，生物亲和结合对包含生物素和抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白或地高辛和抗地高辛。
在又另一个实施方案中，第一抗原缀合至生物素，且用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被互补的固相。第二抗原携带单独地或与其他分子复合赋予该抗原分子特异性可检测能力的标记物。因此，形成包含第一抗原、样品抗体和第二抗原的免疫反应混合物。由夹在两个抗原分子之间的分析物抗体组成的该三元复合物被称为免疫复合物或免疫反应产物。在向所述抗原添加样品之前，或在形成免疫反应混合物之后，添加第一抗原可以结合的固相。维持该免疫反应混合物一定时间段，所述时间段足以允许所述体液样品中的针对所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原的抗黄病毒抗体与所述黄病毒NS1侧翼结构域抗原免疫反应，以形成免疫反应产物。下一步是分离步骤，其中将液相与固相分离。最后，在所述固相或液相或两者中检测所述免疫反应产物中的任一种的存在。
在所述DAGS免疫测定法中，“固相抗原”和“检测抗原”的基础结构是基本上相同的。在双抗原桥测定法中，也可以使用来自相同黄病毒的相似、但不同的黄病毒NS1侧翼结构域抗原，其是免疫学交叉反应性的。进行这样的测定法的本质要求是相关的一个或多个表位存在于两个抗原上。根据本发明，可以对每个黄病毒NS1侧翼结构域抗原使用相同或不同的融合部分(例如，融合至固相侧上的登革病毒1型NS1侧翼结构域抗原的SlyD和，例如，融合至检测侧上的登革病毒1型NS1侧翼结构域抗原的FkpA)，因为这样的变化显著减轻非特异性结合的问题，并因此降低假阳性结果的风险。
进一步实施方案是用于检测M类的抗黄病毒病毒抗体(即免疫球蛋白)(IgM检测)的方法。在该方法的一个实施方案中，以使得样品中存在的多价IgM抗体特异性结合黄病毒NS1侧翼结构域抗原的方式应用如上进一步公开的黄病毒NS1侧翼结构域多肽。在一个实施方案中，通过化学交联抗原或通过将抗原融合至寡聚分子诸如寡聚蛋白伴侣、在一个实施方案中FkpA或Skp来以多聚体形式提供黄病毒NS1侧翼结构域抗原。在另一个实施方案中，通过将彼此相邻的个别抗原串联连接，黄病毒侧翼结构域抗原以多种形式存在。这些个别抗原部分也可以被非黄病毒特异性的接头分子分开。在进一步实施方案中，串联连接的多个黄病毒抗原可以另外通过寡聚化分子诸如寡聚蛋白伴侣、像例如FkpA或Skp进行多聚化。在又另一个实施方案中，黄病毒NS1侧翼结构域多肽以多聚体形式使用，其中每个多肽至少以双倍体形式存在，在一个实施方案中，其以三倍体至十倍体存在。
在黄病毒-抗体的IgM检测方法的又另一个实施方案中，样品中存在的IgM类抗体通过所谓的μ-捕获组分与固相结合，所述μ-捕获组分通常是特异性结合人IgM分子的Fc部分、与IgM分子的特异性无关的结合配偶体或抗体或抗体片段。所述μ-捕获组分携带效应基团(诸如生物素)，其为具有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的生物亲和对的部分。在一个实施方案中，还可以使用其他生物亲和对，诸如例如，如上面进一步描述的地高辛和抗地高辛或另外的半抗原和抗半抗原。在一个实施方案中，用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白覆盖的固相然后吸引并结合μ-捕获组分。为了特异性检测黄病毒-特异性抗体，将如所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽以标记形式用于检测IgM类的抗黄病毒抗体。
另一个实施方案是如上所详述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽在体外诊断测试、在一个实施方案中如上所定义的免疫测定方法中用于检测抗黄病毒病毒抗体的用途。
作为进一步实施方案，用于检测黄病毒抗体的免疫测定方法的最大总持续时间为小于1小时，即小于60分钟，在一个实施方案中小于30分钟，在进一步实施方案中小于20分钟，在一个实施方案中在15和30分钟之间，在一个实施方案中在15和20分钟之间。所述持续时间包括吸取实施测定法所需的样品和试剂以及孵育时间，任选洗涤步骤，检测步骤以及还有最终输出结果。
本发明的一个额外主题是用于检测抗黄病毒的抗体的试剂盒，其包含上面公开的黄病毒NS1侧翼结构域多肽。在一个实施方案中，试剂盒在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的微粒，和如前详述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽。在另一个实施方案中，所述微粒用如上进一步描述的其他生物亲和对(诸如例如地高辛和抗地高辛、半抗原和抗半抗原)的一种配偶体包被。在一个实施方案中，所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽与生物素共价偶联。在一个实施方案中，所述黄病毒NS1侧翼结构域共价偶联至其他生物亲和对(诸如例如地高辛和抗地高辛、半抗原和抗半抗原)的第二配偶体。在另一个实施方案中，所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽共价偶联至可检测标记物，在一个实施方案中偶联至电化学发光复合物。在进一步实施方案中，化学发光标记物，诸如例如，吖啶酯或放射性或荧光化合物或酶也可以用作标记物。在又另一个实施方案中，所述试剂盒在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的微粒，与生物素共价偶联的第一黄病毒NS1侧翼结构域多肽和共价偶联至可检测标记物、例如电化学发光的钌络合物或电化学发光的铱络合物的第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽。在一个实施方案中，第一和第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽的肽序列是相同的。
进一步实施方案是用于检测IgM类的抗黄病毒抗体的试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的微粒，和与生物素共价偶联的μ-捕获结合配偶体。在进一步实施方案中，所述IgM检测试剂盒额外含有共价偶联至可检测标记物、在一个实施方案中偶联至电化学发光复合物的黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
术语单个容器单元涉及这样的事实：对于许多自动化分析仪，像来自Rochediagnostics的分析仪系列，测量某种分析物所需的试剂以“试剂包”的形式提供，即作为安装在分析仪上并且在不同的隔室中含有测量目标分析物所需的所有关键试剂的一个容器单元。
此外，以上定义的试剂盒含有对照和标准溶液以及一种或多种溶液中的试剂与如本领域普通技术人员所使用的普通添加剂、缓冲剂、盐、去污剂等，连同使用说明书。
在又另一个方面，本发明涉及用于检测分离的生物样品中的抗第一黄病毒(或第一黄病毒物种)的抗体的方法，所述生物样品假定含有针对至少另一种其他、即在抗体检测的范围内与所述病毒不同的至少一种第二黄病毒(或第二黄病毒物种)的抗体。例如，分析物是针对登革病毒(“第一黄病毒物种”)的抗体。在该方法中，将包含β-梯结构域的完整或部分序列的登革病毒NS1多肽用作特异性结合配偶体，即不仅NS1侧翼结构域，而是完全NS1抗原。在该实验方案中，由于在特异性结合配偶体中存在高度保守的β-梯结构域肽序列，预期针对其他非登革黄病毒的交叉反应性。为了消除该干扰，以未标记的形式添加仅包含所述第一黄病毒(在该实验中，登革)的NS1 β-梯结构域的多肽，使得非登革来源(至少一种第二黄病毒物种)的交叉反应抗体被结合并淬灭。在一个实施方案中，添加β-梯结构域作为淬灭剂，在进一步实施方案中，所述β-梯结构域多肽基本上由SEQ ID NO：24、25、26和17中的至少一种组成，在一个实施方案中由SEQ ID NO：24、25、26和17中的至少一种组成。
通常，不能通过血清学的方式将登革病毒1-4型彼此区分。作为结果，登革1-4被认为是一种“黄病毒物种”，即登革。
以下实施方案也是本发明的一部分：
实施方案
1.适合于检测分离的生物样品中的针对黄病毒的抗体的多肽，其包含黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列，其中没有来自所述黄病毒的NS1 β-梯结构域的氨基酸序列存在于所述多肽中。
2.根据实施方案1所述的多肽，其中没有所述黄病毒的另外的氨基酸序列存在于所述多肽中。
3.根据实施方案1或2中任一项所述的多肽，其中所述黄病毒选自寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒1-4型(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的多肽，其中所述黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列基本上由多肽组成，所述多肽选自SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17和19，在一个实施方案中，所述多肽选自SEQ ID NO.7、9、11、13和15，在一个实施方案中，所述多肽选自SEQ ID NO.7、9、11和13(登革病毒1-4型的NS1结构域)。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽与蛋白伴侣融合。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的多肽，其中所述蛋白伴侣选自SlyD、SlpA、FkpA和Skp。
7.根据实施方案6所述的多肽，其选自SEQ ID NO：21(寨卡)、28(DENV1)、29(DENV2)、30(DENV3)和31(DENV4)。
8.产生可溶性和免疫反应性黄病毒NS1侧翼结构域多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含可操作连接的重组DNA分子，所述重组DNA分子编码根据实施方案1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽，
b)表达所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽，和
c)纯化所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
9.用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中将根据权利要求1至7中任一项所述的所述第一黄病毒物种的黄病毒NS1侧翼结构域多肽用作所述抗黄病毒抗体的捕获试剂和/或结合配偶体。
10.用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，所述方法包括
a)通过将体液样品与根据实施方案1至7中任一项所述的所述第一黄病毒物种的黄病毒NS1侧翼结构域多肽混合来形成免疫反应混合物
b)将所述免疫反应混合物保持足以使体液样品中存在的针对所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽的抗体与所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽免疫反应以形成免疫反应产物的时间段；和
c)检测所述免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。
11.根据实施方案9或10中任一项所述的用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中检测的抗体是IgG抗体。
12.根据实施方案9至11所述的用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中以双抗原夹心形式实施所述免疫反应，所述方法包括
a)向所述样品中添加根据实施方案1至7中任一项所述的第一黄病毒物种的第一黄病毒NS1侧翼结构域多肽和根据实施方案1至7中任一项所述的所述第一黄病毒物种的第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽，所述第一黄病毒NS1侧翼结构域多肽可以与固相直接或间接结合，且所述第一黄病毒NS1侧翼结构域多肽携带作为生物亲和结合对的一部分的效应基团，且所述第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽携带可检测标记物，其中所述第一和第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽特异性结合所述抗黄病毒抗体，
b)形成包含所述第一黄病毒NS1侧翼结构域多肽、所述样品抗体和所述第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽的免疫反应混合物，其中在形成免疫反应混合物之前、期间或之后添加携带所述生物亲和结合对的相应效应基团的固相，
c)将所述免疫反应混合物保持足以使体液样品中针对所述第一和第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽的黄病毒抗体与所述第一和第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽免疫反应以形成免疫反应产物的时间段，
d)将液相与固相分离
e)检测固相或液相或两者中所述免疫反应产物中的任一种的存在。
13.根据实施方案9至12中任一项所述的用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中未检测针对不同于所述第一黄病毒物种的黄病毒物种的抗体。
14.根据实施方案9至13中任一项所述的用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述第一黄病毒物种是登革病毒，在一个实施方案中是每种单独的登革病毒1-4型，在一个实施方案中是全部登革病毒1-4型。
15.根据实施方案9至13中任一项所述的用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述第一黄病毒物种是西尼罗病毒(WNV)。
16.根据实施方案9至13中任一项所述的用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述第一黄病毒物种是蜱传脑炎病毒(TBEV)。
17.根据实施方案9至13中任一项所述的用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述第一黄病毒物种是黄热病病毒(YFV)。
18.根据实施方案9至13中任一项所述的用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述第一黄病毒物种是日本脑炎病毒(JEV)。
19.根据实施方案12至18中任一项所述的用于检测对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述第一黄病毒NS1侧翼结构域多肽携带生物素部分，且所述第二黄病毒NS1侧翼结构域多肽用电化学发光部分标记，在一个实施方案中用钌或铱络合物标记。
20.根据实施方案9至10中任一项所述的用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中检测的抗体是IgM抗体。
21.根据实施方案20所述的用于检测IgM类的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽以多聚体形式使用，在一个实施方案中，其中所述多肽至少以双倍体形式存在，在一个实施方案中，以三倍至十倍体形式存在。
22.根据实施方案9至10中任一项所述的方法，其中所述检测的抗体是IgM抗体，且其中所述IgM抗体通过μ-捕获结合配偶体被捕获在固相上。
23.根据实施方案20至22中任一项所述的用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的IgM抗体的方法，其中所述免疫反应以μ-捕获形式实施，所述方法包括：
a)向所述样品中添加可以与固相直接或间接结合的μ-捕获结合配偶体且所述μ-捕获结合配偶体携带作为生物亲和结合对的一部分的效应基团，
和根据实施方案1至6中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽，且所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽携带可检测标记物，
其中所述μ-捕获结合配偶体特异性结合人IgM抗体的Fc部分，且所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽特异性结合所述抗黄病毒抗体，
b)形成包含所述μ-捕获结合配偶体、所述样品抗体和所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽的免疫反应混合物，其中在形成免疫反应混合物之前、期间或之后添加携带所述生物亲和结合对的相应效应基团的固相，
c)将所述免疫反应混合物保持足以使体液样品中的针对所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽的IgM抗体与所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽免疫反应以形成免疫反应产物的时间段，
d)将液相与固相分离，
e)检测所述固相或液相或两者中所述免疫反应产物中的任一种的存在。
24.根据实施方案9至23中任一项所述的方法，其中所述方法不使用来自β-梯结构域的黄病毒NS1多肽，在一个实施方案中不使用包含根据SEQ ID NO：4、24、25、26、27中任一个的氨基酸序列的多肽。
25.根据实施方案1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽在用于检测抗黄病毒抗体的体外诊断测试中的用途。
26.根据实施方案1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽在用于根据实施方案8至23所述的方法中任一种检测抗黄病毒抗体的体外诊断测试中的用途。
27.根据实施方案25至26中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽的用途，其中所述黄病毒选自寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒1-4型(DENV1-
4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)，在一个实施方案中，选自登革病毒1-4型(DENV1-4)和西尼罗病毒(WNV)，在一个实施方案中，其中所述黄病毒是登革病毒1-4型(DENV1-4)。
28.根据实施方案27所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽的用途，其中所述NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列由多肽组成，所述多肽选自SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17和19，在一个实施方案中，选自SEQ ID NO.7、9、11、13和15，在一个实施方案中，选自SEQ IDNO.7、9、11和13(登革病毒1-4型的NS1结构域)。
29.用于检测抗黄病毒抗体的试剂盒，其包含根据实施方案1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽，在一个实施方案中，其包含使用所述试剂盒的说明书。
30.根据实施方案29所述的试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的微粒，以及与生物素共价偶联的根据实施方案1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
31.根据实施方案30所述的试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含用生物亲和对诸如半抗原/抗半抗原的一个配偶体包被的微粒，以及根据实施方案1至7中任一项所述的多肽，其中所述生物亲和对是半抗原/抗半抗原，在一个实施方案中是地高辛/抗地高辛。
32.根据实施方案29所述的试剂盒，其另外包含第二根据实施方案1至7中任一项所述的多肽，所述第二多肽携带可检测标记物。
33.根据实施方案29所述的试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的微粒，和与生物素共价偶联的μ-捕获结合配偶体。
34.根据实施方案29所述的试剂盒，其中所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽携带可检测标记物。
35.通过使用包含β-梯结构域的完整或部分序列的黄病毒NS1多肽作为特异性结合配偶体在假定含有针对不同于所述第一黄病毒的至少一种第二黄病毒的抗体的分离的生物样品中检测针对第一黄病毒的抗体的方法，其中针对不同于所述第一黄病毒的至少一种第二黄病毒的交叉反应性通过如下消除：添加呈未标记形式的包含所述黄病毒的NS1 β-梯结构域的多肽作为淬灭剂，在一个实施方案中，添加包含β-梯结构域的所述多肽作为淬灭剂。
36.黄病毒NS1 β-梯结构域多肽作为用于减少用于检测抗黄病毒抗体的免疫测定中的干扰的试剂的用途。
37.根据实施方案36所述的用途，其中所述β-梯结构域多肽选自SEQ ID NO：4、24、25、26和27。
本发明通过实施例进一步举例说明。
实施例1：寨卡IgG免疫测定法中不同的寨卡NS 1抗原变体的免疫反应性(即，抗原性)
基本上如WO2014054990A1或Scholz等人，J.Mol.Biol.(2005)345，1229-1241中所述克隆、表达、纯化和标记NS1抗原和变体。随后将纯化的和增溶的基因产物偶联至生物素或电化学发光钌标记物。
在自动化2010和cobas e411分析仪(Roche Diagnostics GmbH)中评价寨卡NS1抗原的多肽融合变体的免疫反应性(即，抗原性)。是Roche集团的注册商标。以双抗原夹心形式实施测定。
2010和cobas e 411中的信号检测基于电化学发光。将生物素-缀合物(即捕获抗原)固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠的表面上，而检测-抗原具有络合的钌阳离子(在氧化还原态2+和3+之间转换)作为发出信号的部分。在特异性免疫球蛋白分析物存在的情况下，生色钌络合物与固相桥接并在铂电极处激发之后在620nm发光。信号输出以相对光单位计。通常，测定的总持续时间为18分钟。
以双抗原夹心(DAGS)免疫测定法形式评价重组寨卡NS1抗原融合多肽。为此，重组寨卡NS1抗原分别用作生物素和钌缀合物对，以检测人血清中的抗寨卡NS1抗体。
NS1是寨卡病毒的免疫显性抗原之一，并且NS1抗原的可溶性变体-如本专利申请中所公开-是用于检测寨卡病毒感染的非常有价值的工具。在所有测定中，在反应缓冲液中以大过量(～8μg/ml)实施化学聚合的和未标记的SlyD-SlyD作为抗干扰物质以避免经由蛋白伴侣融合和接头单元的免疫学交叉反应。
具体而言，在该研究中仔细研究两种寨卡NS1变体，即寨卡NS1“侧翼”结构域(参见SEQ ID NO：1和2)和寨卡NS1“β-梯”结构域(参见SEQ ID NO：4)。为了检测抗寨卡NS1IgG分子，在R1(试剂缓冲液1)和R2(试剂缓冲液2)中分别使用SlyD-SlyD-寨卡NS1-生物素和SlyD-SlyD-寨卡NS1-钌。R1和R2中的抗原缀合物的浓度分别为各500ng/ml。
与市售的现有技术免疫测定法(应用涂布至微量滴定板的重组NS1抗原的间接ELISA，通过添加酶标记的抗人IgG缀合物检测针对寨卡病毒的样品抗体)(如Huzly等人(同上)所述)相比，用两种寨卡NS1重组抗原(“侧翼”和“β-梯”)测试对寨卡和登革IgG抗体两者均阴性的人血清样品、对寨卡IgG抗体阳性的人血清样品和对登革IgG抗体阳性的人血清样品。
在该实验中，用前述DAGS免疫测定法方案评价上述人样品。
不可避免的系统固有的信号为约500个计数。对寨卡IgG和登革IgG抗体阴性的人血清样品的低背景信号表明相应抗原钌缀合物的高溶解度和通常良性的物理化学特性。疏水的或通常所说的“粘性”抗原-钌缀合物倾向于与珠粒表面相互作用，且由此增加背景信号。我们可以从表1推断，寨卡NS1“侧翼”的物理化学特性是优异的(第1列)。寨卡NS1“β-梯”也是如此(数据第2列)：当寨卡NS1“侧翼”(SEQ ID NO：21)用作DAGS格式的生物素化形式和钌化形式的抗原对或寨卡NS 1“β-梯”(SEQ ID NO：22)用作DAGS格式的生物素化和钌化形式的抗原对时，两个抗原对对于阴性人血清产生～600-900个计数的信号背景，这显然指向抗原缀合物的良好溶解性特性。然而，乍一看变得明显的是，寨卡NS1“侧翼”和寨卡NS1“β-梯”，尽管在其检测抗寨卡抗体的能力方面等同，但它们与抗登革热抗体的交叉反应性大大不同，如表1中所示。更仔细看寨卡IgG阳性样品，我们发现寨卡NS1“侧翼”和寨卡NS1“β-梯”将所有寨卡IgG样品都检测为阳性(＞2000个计数)。重要的是，寨卡NS1“侧翼”不与登革IgG阳性样品交叉反应，因为发现所有登革IgG样品对于寨卡NS1侧翼抗原都是阴性的(＜＜2000个计数)。显著对比的是，寨卡NS1“β-梯”将20个登革IgG样品中的9个检测为反应的(＞2000个计数)，其指向相当高的交叉反应性程度。用Huzly等人(Euro Surveill.2016；21(16)，pii＝30203，1-4)描述的市售的寨卡IgG测定法观察到关于寨卡IgG和登革IgG阳性样品的非常相似的反应模式，表明市售的寨卡IgG测定法具有相当大的关于登革IgG阳性样品的免疫交叉反应性(即，市售的寨卡IgG测定法引发相当多的假阳性寨卡结果)。总之，寨卡NS1抗原的两种工程改造的变体(寨卡NS1“侧翼”和寨卡NS1“β-梯”)均具有杰出的物理化学和抗原性特性。然而，寨卡NS1“侧翼”抗原的表现优于β-梯结构域，因为其对寨卡IgG抗体表现出优异的特异性，并且显著降低与登革阳性血清的免疫交叉反应性。
因此，与如Huzly等人(同上)所述的现有技术的市售的寨卡IgG免疫测定法(其据推测基于全长NS1)相比，工程改造的重组寨卡NS1“侧翼”结构域构成优异的NS1变体用于特异性测定寨卡抗体。
表1显示，与寨卡NS1“β-梯”和市售的现有技术的寨卡IgG测定法相比，寨卡NS1“侧翼”的优异的特异性(即，强烈降低的与抗登革抗体的交叉反应性)。
表1
*信号动力学＝样品计数/((阴性样品平均计数)x3)
NR＝非反应性的
实施例2：证实寨卡NS1“侧翼”抗原与寨卡NS1“β-梯”抗原相比的优异特异性的阻断实验
在自动化2010和cobas e 411分析仪(Roche Diagnostics GmbH)中评价寨卡NS1抗原的多肽融合变体的免疫反应性(即，抗原性)，如实施例1中所述。
用两种工程改造的寨卡NS1重组抗原(“侧翼”和“β-梯”)测试三个对寨卡IgG抗体阳性的人血清样品。平行地，将对寨卡IgG抗体阳性的这些人血清样品个别地掺入TBEV(蜱传脑炎病毒，FSME，SEQ ID NO：6)、或一种DENV1-4抗原(登革病毒1-4，SEQ ID NO：8、10、12、14)、或WNV(西尼罗病毒，SEQ ID NO：16)、或YFV(黄热病病毒，SEQ ID NO：18)、或JEV(日本脑炎病毒，SEQ ID NO：20)、或ZIKV(寨卡病毒，SEQ ID NO：3)的全长黄病毒NS1抗原制备物(表2a和2b)。
在该实验中，用前述DAGS免疫测定方案评价上述人样品(掺入和未掺入的)。
将样品预先稀释至阻断实验所需的反应性水平(滴定度)。该步骤是需要的，因为为阻断实验制备的黄病毒NS-1制备物的浓度和样品中的抗体的量需要在合理的浓度比之内，以便得到清楚的阻断结果。然后，将预先稀释的人抗寨卡IgG阳性样品的反应性与在掺入TBEV、或DENV1-4、或WNV、或YFV、或JEV、或ZIKV的全长黄病毒NS-1时用相同样品获得的信号进行比较。计算由于TBEV、DENV1-4、WNV、YFV、JEV和ZIKV的不同全长黄病毒NS-1制备物的竞争导致的信号降低的程度。信号降低/阻断的程度针对用全长寨卡NS1获得的最大阻断进行归一化，如所预期，所述全长寨卡NS1用两种测定均显示信号的最强淬灭(无论使用寨卡NS1“侧翼”还是寨卡NS1“β-梯”)。对于所有其他全长黄病毒NS1制备物(TBEV、DENV1-4、WNV、YFV、JEV)计算竞争能力的程度。乍一看明显大的是，基于寨卡NS1“侧翼”抗原的测定的信号仅被非-寨卡NS1抗原微弱淬灭，而基于寨卡NS1“β-梯”抗原的测定的信号被TBEV、DENV1-4和JEV显著降低。该发现令人信服地表明，在虫媒病毒NS1同源物间，NS1侧翼结构域和NS1β-梯结构域的结构独特性强烈不同。显然，非-寨卡NS1抗原的侧翼部分无法与工程改造的寨卡侧翼抗原有效竞争与抗寨卡分析物抗体的结合。相反，非-寨卡NS1抗原的β-梯部分完全能够与工程改造的寨卡β-梯抗原有效竞争与抗寨卡分析物抗体的结合。
总之，该实验与实施例1完全一致，因为其还表明基于寨卡NS 1“侧翼”抗原的测定法主要检测与其他虫媒病毒(TBEV、DENV1-4、WNV、YFV、JEV)的黄病毒NS-1制备物不交叉反应(或易于交叉反应)的那些抗寨卡IgG抗体。相比之下，基于寨卡NS1“β-梯”抗原的测定法结合抗寨卡抗体，所述抗寨卡抗体与TBEV、DENV1-4和JEV部分交叉反应(或易于交叉反应)(即，它们可以被TBEV、DENV1-4和JEVNS-1制备物阻断)。换言之，寨卡NS1抗原的β-梯结构域似乎与相关虫媒病毒的β-梯结构域共享重要的结构和序列同源性，由此在用作抗原时在免疫测定中引发假阳性结果。相反，寨卡NS1抗原的侧翼结构域似乎相当独特，并且似乎与来自其他虫媒病毒的其NS对应物共享很少结构同源性。
我们的数据表明，该原理不仅在区分寨卡病毒感染与其他黄病毒感染中适用，而且在区分其他黄病毒感染与彼此中也同样适用。我们得出结论，甚至在多种黄病毒感染背景下，针对NS1抗原的侧翼结构域的抗体的特异性检测也可以是清楚地区分黄病毒感染的优异方法。我们推理我们的发现有望显著改善当前的血清学，并获得关于黄病毒领域中的流行率和发病率数据的更适当观点。
总之，寨卡NS1“侧翼”抗原展现对寨卡IgG的杰出且优异的特异性，不易与针对来自其他虫媒病毒(此处为：黄病毒科)的NS1同源物产生的抗体免疫交叉反应，且因此对于特异性检测抗寨卡IgG抗体合适得多。
表2a
表2b
缩略词的解释：
ZIKV＝寨卡病毒
DENV1＝登革病毒1型
DENV2＝登革病毒2型
DENV3＝登革病毒3型
DENV4＝登革病毒4型
WNV＝西尼罗病毒
JEV＝日本脑炎病毒
YFV＝黄热病毒
TBEV＝蜱传脑炎病毒(＝FSME病毒)。
实施例3：登革IgG免疫测定中登革病毒NS1抗原变体的免疫反应性
基本上如实施例1中进行登革NS1抗原和变体的克隆、表达、纯化和标记。在自动化cobas e 601分析仪(Roche Diagnostics GmbH)中评价登革NS1抗原的多肽融合变体的免疫反应性(即，抗原性)。是Roche集团的注册商标。以双抗原夹心形式实施测定，也如实施例1中所述。
以双抗原夹心(DAGS)免疫测定形式评价重组登革NS1抗原融合多肽。为此，重组登革NS1抗原用作分别生物素和钌缀合物，以检测人血清中的抗登革NS1抗体。
在所有测定中，化学聚合的和未标记的SlyD-SlyD在反应缓冲液中作为抗干扰物质以大量过量(～8μg/ml)进行，以避免经由蛋白伴侣融合单元的免疫交叉反应。
具体而言，在该研究中检查两种登革NS1变体，即登革NS1“侧翼”结构域(参见SEQID NO：7、9、11和13，对应于DENV1-4)和登革NS1“β-梯”结构域(参见SEQ ID NO：24至27，对应于DENV 1-4)。为了检测抗登革NS1 IgG分子，在R1(试剂缓冲液1)和R2(试剂缓冲液2)中分别使用SlyD-SlyD-登革NS1-生物素和SlyD-SlyD-登革NS1-钌。R1和R2中的抗原缀合物的浓度分别为各500ng/ml。在包含所有四种登革血清型的抗原的制备物中，R1和R2中抗原缀合物的浓度也各自为500ng/ml(总共2μg/ml)。作为对照和参考，使用含有寨卡NS1侧翼结构域作为抗原的实施例1的寨卡IgG测定。
用对于“侧翼”衍生自所有四种登革血清型和对于“β-梯”衍生自DENV2的登革NS1重组抗原测试对寨卡和登革IgG抗体两者均呈阴性的人血清样品、对登革IgG抗体呈阳性的人血清样品和对寨卡IgG抗体呈阳性的人血清样品。
在该实验中，用前述DAGS免疫测定方案评价上述人样品。表3显示结果。
可以显示，所有四种登革病毒血清型的NS1侧翼结构域都可以在大肠杆菌中过表达，并且可以高产率获得这些重组抗原。纯化后可以将抗原重折叠成可溶性的天然样和免疫反应性构象。可以显示，在我们的测定方案中，通过免疫荧光测定法预先测试为登革阳性的血清被正确地鉴定为阳性。DENV1-4侧翼结构域和DENV2 β-梯结构域确实与假定登革-阳性的血清反应。然而，我们发现证据证明，DENV 1-4的单个登革侧翼结构域与预先表征的登革-阳性血清的商业组不同地反应。结果似乎表明，基于登革NS1侧翼结构域作为免疫测定中的抗原，登革病毒血清型的免疫学区分是可能的。
此外，使用寨卡NS1侧翼结构域作为特异性抗原的实施例1的寨卡IgG测定没有显示与预先表征的登革抗体阳性血清的商业组的任何交叉反应性，再一次强调寨卡NS1侧翼结构域的优异特异性。最有趣的是，寨卡阳性血清仅与寨卡病毒NS1侧翼结构域反应，但不与任何登革侧翼结构域抗原交叉反应。换言之，登革侧翼结构域也有望作为在表现出多种黄病毒感染的高流行率的群体中的高度特异性抗原。一件事情是可靠地检测在例如巴西或泰国度假返回的疑似的中欧人中的登革感染。完全不同的事情是可靠地检测具有在高流行率地区的例如先前黄热病和/或寨卡感染的医疗背景的患者中的登革感染。因此，尤其对于具有多种黄病毒感染的高流行率的新兴国家，黄病毒免疫测定的特异性是至关重要的。我们的结果表明，黄病毒NS1侧翼结构域是用于特异性检测针对黄病毒的抗体的优异工具，所述黄病毒的侧翼结构域用作免疫测定中的结合配偶体。
Claims (17)
1.适合于检测分离的生物样品中的针对黄病毒的抗体的多肽，其包含黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列，其中没有来自所述黄病毒的NS1 β-梯结构域的氨基酸序列存在于所述多肽中。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中没有所述黄病毒的另外的氨基酸序列存在于所述多肽中。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的多肽，其中所述黄病毒选自寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗病毒(WNV)、登革病毒1-4型(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、黄热病病毒(YFV)、日本脑炎病毒(JEV)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述黄病毒NS1侧翼结构域特异性氨基酸序列基本上由选自SEQ ID NO.1、2、5、7、9、11、13、15、17和19的多肽组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽与蛋白伴侣融合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述蛋白伴侣选自SlyD、SlpA、FkpA和Skp。
7.根据权利要求6所述的多肽，其选自SEQ ID NO:21 (寨卡)、28 (DENV1)、29(DENV2)、30 (DENV3)和31 (DENV4)。
8.产生可溶性和免疫反应性黄病毒NS1侧翼结构域多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体包含可操作连接的重组DNA分子，所述重组DNA分子编码根据权利要求1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽，
b)表达所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽，和
c)纯化所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
9.用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中将根据权利要求1至7中任一项所述的所述第一黄病毒物种的黄病毒NS1侧翼结构域多肽用作所述抗黄病毒抗体的捕获试剂和/或结合配偶体。
10.用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，所述方法包括
a)通过将体液样品与根据权利要求1至7中任一项所述的所述第一黄病毒物种的黄病毒NS1侧翼结构域多肽混合来形成免疫反应混合物
b)将所述免疫反应混合物保持足以使体液样品中存在的针对所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽的抗体与所述黄病毒NS1侧翼结构域多肽免疫反应以形成免疫反应产物的时间段；和
c)检测所述免疫反应产物中的任一种的存在和/或浓度。
11.根据权利要求9或10中任一项所述的用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中被检测的抗体是IgG或IgM抗体。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的用于检测分离的样品中的对于第一黄病毒物种特异性的抗体的方法，其中所述第一黄病毒物种是登革病毒1-4型。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽在体外诊断测试中用于检测抗黄病毒抗体的用途。
14.用于检测抗黄病毒抗体的试剂盒，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其在单独的容器中或在单个容器单元的分开的隔室中至少包含用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的微粒，以及与生物素共价偶联的根据权利要求1至7中任一项所述的黄病毒NS1侧翼结构域多肽。
16.通过使用包含ß-梯结构域的完整或部分序列的黄病毒NS1多肽作为特异性结合配偶体在假定含有针对不同于所述第一黄病毒的至少一种第二黄病毒的抗体的分离的生物样品中检测针对第一黄病毒的抗体的方法，其中针对不同于所述第一黄病毒的至少一种第二黄病毒的交叉反应性通过如下消除：添加呈未标记形式的包含所述黄病毒的NS1 β-梯结构域的多肽作为淬灭剂，在一个实施方案中，添加包含ß-梯结构域的所述多肽作为淬灭剂。
17.黄病毒NS1 ß-梯结构域多肽作为用于减少用于检测抗黄病毒抗体的免疫测定中的干扰的试剂的用途。
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