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CN110540933B - 一种循环稀有细胞集成微流控分离装置及方法 - Google Patents

一种循环稀有细胞集成微流控分离装置及方法 Download PDF

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CN110540933B
CN110540933B CN201910813083.9A CN201910813083A CN110540933B CN 110540933 B CN110540933 B CN 110540933B CN 201910813083 A CN201910813083 A CN 201910813083A CN 110540933 B CN110540933 B CN 110540933B
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Abstract

本发明公开了一种结构设计简单、合理、处理通量高，分离效率高、分离纯度高的非抗体依赖的循环稀有细胞集成微流控分离装置及方法，用细胞标记磁珠磁负向分选结合螺旋流道流体惯性力正向分选原理，集成了一种循环稀有细胞集成微流控分离装置，包括样本反应管、与样本反应管的微流控芯片、承载固定微流控芯片的夹持载具以及安装在夹持载具内的移动磁体；样本反应管包括：样本管支架、设置在样本管支架上的微振荡器、设置在所述微振荡器上的样本磁反应区以及用于连接的样本管；微流控芯片包括基底层以及设置在基底层上的芯片层，芯片层依次包含进样口、单螺旋型流道初级分离区、磁分离二级分离区和出口。

Description

一种循环稀有细胞集成微流控分离装置及方法
技术领域
本发明涉及循环稀有细胞的分选技术领域，具体涉及一种循环稀有细胞集成微流控分离装置及方法。
背景技术
循环稀有细胞(Circulating Rare Cells，CRCs)包括三个亚型，分别是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)，循环干细胞(Circulating Stem Cells,CSCs)，及循环胎儿细胞(Circulating Fetal Cells,CFCs)，其中CTCs为研究应用最为广泛主要的CRCs亚型。CRCs的分离富集主要在宏观尺度下进行，如密度梯度离心分选、基于荧光或磁珠的抗体标记分选等。上述技术存在分选出的CRCs的回收率较低，样本耗用量大且处理通量低。微流控技术，将生物、医学和化学领域所涉及的反应、分离与检测等基本操作单元集成到平方厘米级的芯片上，由微流道形成流体网络，通过微米级别的流道操控微升、毫升级别的样品，不仅样本耗用量小，且可以连续高通量地获取CRCs。
常见的CRCs微流控分离技术主要有微结构过滤微流控分离、介电泳微流控分离、亲和性微流控分离等。单纯微结构过滤依据细胞尺寸差异通过改变微结构孔径，实现CRCs的筛选，但该方法处理通量低、易堵塞、分离效率低。介电泳微流控分离是在CRCs周围施加非均匀电场，使其产生偶极子而移动分离CRCs的方法，该方法操作繁琐、工艺复杂、处理通量低下，且电场产生的电解效应与焦耳热效应极容易对细胞活性及其生理特性产生不利影响，不利于临床应用。亲和性微流控分离基于CRCs细胞生物学特性差异，通过固定在微流控装置内的特异性抗体免疫亲和分离方法实现CRCs的分离，该虽然提高了特定抗原表达CRCs的分离效率，可以直接捕获CRCs，可以保持较高的细胞活性，但仍然局限于对细胞抗原表位的识别，存在对非抗原表达或表达较弱CRCs的漏检问题。
中国专利文献1(CN 106076441A，申请号为201610398852.X)公开了一种基于尺寸检测循环肿瘤细胞的微流控装置，该装置包括：依次连接的溶液存储室，微流控芯片，废液收集针筒以及动力系统。该装置仍然是由不同间距的柱子阵列形成的多级团块过滤区域来实现单个CTCs的分离，血液样本处理通量仅为10mL/h～18mL/h，虽然解决了易堵塞的问题，但仍然存在分离效率低、检测通量低的缺陷，且基于细胞尺寸的方法会漏检小尺寸的CTCs。
中国专利文献2(CN 107084916A，申请号为201710195836.5)公开了一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，该装置包括微流控芯片和芯片夹具，微流控芯片包括芯片入口、单螺旋芯片、稀有细胞收集管道和白细胞出口。该方法基于流体惯性力与循环肿瘤细胞和血细胞核质比和表面电荷上的差异，通过单螺旋形微流控通道末端的3个出口收集不同粒径大小稀有细胞。该方法的本质还是利用CTCs与其他细胞的尺寸不同辅以电荷差异，在螺旋流道流体惯性力(流体惯性升力与Dean流拽力)的作用下迁移汇聚至特定的流体平衡位置而分离的方法，虽然处理通量较高，生物样本处理通量可达60-200ml/h，但是存在分离CTCs纯度较低的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构设计简单、合理、处理通量高，分离效率高、分离纯度高的非抗体依赖的循环稀有细胞集成微流控分离装置及方法，克服现有CRCs分离技术处理通量小、分离纯度低、依赖抗体、集成程度低的缺陷。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：利用细胞标记磁珠磁负向分选结合螺旋流道流体惯性力正向分选原理，集成了一种循环稀有细胞集成微流控分离装置，包括样本反应管(2)、与所述样本反应管(2)的微流控芯片(3)、承载固定所述微流控芯片(3)夹持载具(4)以及安装在所述夹持载具(4)内的移动磁体(6)；
所述的样本反应管(2)包括：样本管支架(9)、设置在所述样本管支架(9)上的微型振荡器(8)、设置在所述微型振荡器(8)上的样本磁反应区以及用于连接的样本管(5)；
所述的微流控芯片(3)包括基底层(34)以及设置在所述基底层(34)上的芯片层(33)，所述的芯片层依次包含进样口(31)、单螺旋型流道初级分离区、磁分离二级分离区和出口(32)；
所述的夹持载具(4)可以承载固定微流控芯片(3)，包括含有磁体适配器(42)和弹性卡扣(47)的芯片基座(41)以及与所述芯片基座(41)相连的载具上盖(43)，所述载具上盖(43)有软塞插孔(45)和嵌入载具上盖(43)的弹性卡合件(46)，所述的弹性卡合件(46)与弹性卡扣(47)配合，合上载具上盖(43)，所述软塞插孔(45)与所述微流控芯片的进样口(31)和出口(32)分别吻合对应；所述的移动磁体(6)卡入所述芯片基座(41)的磁体适配器(42)，与所述微流控芯片的磁分离二级分离区对应，可以磁吸附与磁珠结合的细胞。
本发明所述的样本磁反应区包括一个样本入口(51)、一个磁珠悬液进口(52)、反应腔体(21)与样本管线出口(53)，所述的样本管线出口(53)与样本管(5)相连，所述的样本磁反应区容量为0.5ml～5ml，用于处理后样本与含有CD45抗体的磁珠的免疫磁结合反应。所述样本入口(51)和磁珠悬液进口(52)通过样本管(5)连接的微流泵(1)连通到所述反应腔体(21)，所述样本入口(51)和磁珠悬液进口(52)通过样本管(5)连接的微流泵(1)将生物样本与磁珠悬液注入反应腔体(21)，优选的，所述微流泵流速范围为0.03ml/min～8.2ml/min。优选的，所述磁珠为超顺磁、大小一致、表面均一的聚合物磁珠，更优选为磁性聚苯乙烯(PS)磁珠。
本发明所述样本管(5)采用软性、表面张力小、摩擦系数极低、无粘附性、不亲水、无毒、生物相容性好的塑料管，优选为含有聚四氟乙烯(PTFE)的塑料管。
本发明所述的微型振荡器(8)为样本磁反应区提供混合振荡力，所述的微型振荡器(8)包括样本磁反应区接头(81)和样本管支架卡槽(82)，所述样本磁反应区接头(81)用于稳定连接固定反应腔体(21)，所述样本磁反应区接头(81)上设有样本管线出口(53)，所述样本管线出口(53)连接有所述样本管(5)，所述样本磁反应区接头(81)与所述样本管线出口(53)对应，使样本管(5)穿过微型振荡器(8)，样本磁反应区接头(81)内设有电磁控制器(83)，所述的电磁控制器(83)包括电磁铁(833)、与所述电磁铁(833)配合的衔铁(831)以及设置在所述电磁铁(833)和衔铁(831)之间的弹簧(832)，所述的样本管线出口(53)处的样本管(5)卡在所述弹簧(832)上，当电磁铁(833)通电后，电磁铁(833)会将衔铁(831)吸合，弹簧(832)就会被压缩，弹簧(832)会就卡住样本管线出口(53)处的样本管(5)，以截断管线内的流体防止样本磁反应区未反应完成的液体流出，当微型振荡器(8)停止振动时，电磁铁(833)断电，电磁控制器(83)的弹簧(832)就会复位回弹，样本管线出口(53)处的样本管(5)就可以打开，打开流体通路，让反应完成的液体流入微流控芯片(3)进样口(31)；所述样本管支架卡槽(82)可卡入样本管支架(9)中，以固定连接微型振荡器(8)与样本管支架(9)，所述样本管支架卡槽(82)上包含两个金属触点(84)，可与样本管支架(9)中的两个金属电极(91)连接，以形成电流通路为微型振荡器供电。该微型振荡器(8)可以通过微振动使样本磁反应区内的白细胞与CD45抗体磁珠充分混合反应，便于两者间的均匀结合，且不会损伤细胞与目的CRCs。所述的电磁控制器(83)带有两个电源连接触点(834)、(835)，两个电源连接触点(834)、(835)与样本管支架卡槽(82)两个金属触点(84)连接。
本发明所述样本管支架(9)为中空结构，样本管(5)可以从中穿出，支架外部有两根金属电极(91)，可以与微型振荡器(8)的样本管支架卡槽金属触点(84)以及夹持载具(4)软塞插孔处的触点连接，起到支撑样本管(5)与桥接样本磁反应区和夹持载具(4)的作用，以形成电流与流体通路。
优选的，本发明所述样本磁反应区、微型振荡器(8)与样本管支架(9)，为3个独立结构，通过组合拼接形成一体，其中样本磁反应区为1次性使用部件，可以有效防止不同样本间的交叉污染。
本发明所述微流控芯片(3)的基底层(34)材料优选为玻璃载片，所述芯片层(33)材料优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，所述单螺旋型流道初级分离区由完整螺旋数为4个或以上(20个以下)、螺旋型流道末端有至少有3个分支(10个以下)的单螺旋型微流道(10)组成，优选的，所述单螺旋型微流道(10)，高度为40μm～110μm，流道宽度为150μm～600μm，流道间间距为450μm～500μm；所述芯片层进样口(31)位于单螺旋型微流道(10)中部，距离单螺旋流道的第一内螺旋半径(R)范围为2.5mm～4.5mm。
本发明所述磁分离二级分离区由3个或以上(10个以下)的磁分离池(35)组成，每个磁分离池(35)与单螺旋型流道初级分离区的单螺旋型微流道(10)末端分支相连，单个磁分离池(35)的容量为0.2ml～2ml。优选的，磁分离池(35)为圆形或椭圆形，可最大限度地磁分离CRCs，有效防止堵塞。所述出口(32)位于磁分离二级分离区尾端，有3个或以上(10个以下)的出口(32)与磁分离池(35)对应，出口(32)处有对应数量的细胞收集管(7)收集CRCs和其他细胞。当有移动磁体(6)存在时可以收集高纯度的CRCs，当移除移动磁体(6)时可以收集与磁珠连接的细胞。
本发明所述夹持载具芯片基座(41)上的磁体适配器(42)根据磁分离池(35)的形状和数量适配设置为相应数量的圆槽或椭圆槽，所述圆槽深度与放入其中的移动磁体的高度相等，可以固定移动磁体(6)；所述载具上盖(43)通过活动连接座(44)与芯片基座(41)相连。
本发明所述软塞(11)内部管道为1字型通孔结构，分为入口塞和出口塞，所述入口塞可与芯片进样口紧密对接形成流体通路，有效防止漏液；所述出口塞与芯片出口紧密对接，出口塞出口处连接样本管，可接入细胞收集管中，便于相应细胞流入收集。所述软塞可精准插入夹持载具载具上盖的软塞插孔(45)中，以紧密衔接联通芯片进样口(31)、出口(32)与夹持载具(4)，形成流体通路。优选的，所述软塞(11)材料采用摩擦系数极低、无粘附性、不亲水、无毒、生物相容性好、密封性好的塑料制成，所述塑料更优选为PTFE。为避免生物交叉污染，软赛为1次性使用，每分样本对应一对软塞。
本发明所述移动磁体(6)为半圆环形或半椭圆环形结构，与芯片基座(41)上的磁体适配器(42)匹配良好，可以使带有磁珠的白细胞形成环形或半椭圆环形聚落，而不在磁分离池入口与出口(32)处聚集，留出缺口，很好地避免了因细胞聚集引起的出入口阻塞。所述移动磁体(6)可以根据细胞收集需要放入或取出，当移动磁体(6)放入磁体适配器(42)时，可以收集高纯度的CRCs，收集完成CRCs后，移除移动磁体(6)，可以回收连有磁珠的白细胞。
一种循环稀有细胞集成微流控分离方法，采用循环稀有细胞集成微流控分离装置，包括以下步骤：
1)将微流控芯片(3)放入夹持载具(4)中；
2)将样本磁反应区装载在微型振荡器(8)的样本磁反应区接头(81)，再将样本管支架卡槽(82)与样本管支架(9)连接，连接时须将样本管支架(9)上的金属电极(91)与金属触点(84)对接，最后接入夹持载具(4)并启动电源，微型振荡器(8)开始振动，电磁控制器(83)通电后，电磁铁(833)会将衔铁(831)吸合，弹簧(832)就会被压缩，弹簧(832)会就卡住样本管线出口(53)处的样本管(5)，以截断管线内的流体防止样本磁反应区未反应完成的液体流出；
3)微流泵(1)将密度梯度离心处理好的单核细胞层(PBMCs)通过样本入口(51)，加入样本磁反应区的反应腔体(21)内，同时将磁珠悬液通过磁珠悬液进口(52)注入反应腔体(21)内，二者混合结合反应10～30min(优选为20min)；
4)关闭微型振荡器(8)，电磁控制器(83)的电磁铁(833)断电，电磁控制器(83)的弹簧(832)就会复位回弹，样本管线出口(53)处的样本管(5)打开，反应完成液通过样本管线出口(53)进入微流控芯片(3)，进行细胞分离；
5)反应完成液在微流泵(1)的作用下，进入单螺旋型流道初级分离区的单螺旋型微流道(10)中进行流体惯性力分离，经过流体惯性分离开的细胞直径大于20μm的细胞从内测流道进入第一磁分离池中，细胞直径在15±5μm的中等粒径的细胞从中间流道进入第二磁分离池中，细胞直径小于等于7μm的细胞从外侧流道进入第三磁分离池中，在位于磁分离池下方的移动磁体的磁场作用下，连接有磁珠的白细胞在各个磁分离池中聚集与CRCs分离，所用移动磁体(6)为半环形，白细胞也会形成半环形聚集，CRCs经过出口(32)顺样本管(5)流入细胞收集管(7)中收集；
6)CRCs收集完成后，关闭微流泵(1)，打开夹持载具(4)，将微流控芯片(3)取出，移除夹持载具芯片基座(41)中的移动磁体(6)，再将取出的微流控芯片(3)放回夹持载具(4)中，启动微流泵(1)，用新的细胞收集管(7)收集连有磁珠的白细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
本发明将螺旋流道流体惯性力(流体惯性升力与Dean流拽力)正向分选芯片与细胞标记磁珠磁负向分选芯片有效集成，构建了循环稀有细胞集成微流控分离装置，大大提高了循环稀有细胞检测通量和纯度。本发明利用单螺旋型微流道一级分离区高通量粗分选出较低纯度的CRCs，再通过白细胞标记磁珠大大提高白细胞对磁场的敏感性，在二级分离区磁场作用下，进一步有效去除白细胞，获得了高纯度的活性CRCs。本装置结构设计简单、合理，制造加工方便，很好地保留了单螺旋型微流道芯片处理通量高的优势，同时通过集成磁负向分选捕进一步去除白细胞提纯了CRCs，很好解决了单螺旋型微流道获取CRCs纯度较低的问题。此外，本集成微流控分离装置为非抗体依赖CRCs分离系统，很好地保持了CRCs细胞完整性与细胞活性，便于将获取的CRCs应用于下游蛋白质表征、基因分析、细胞培养和细胞检测研究。总之，根据本发明，提供了一种结构设计简单、合理、处理通量高，分离率高、分离纯度高的非抗体依赖的循环稀有细胞集成微流控分离装置。
附图说明
图1是循环稀有细胞集成微流控分离装置的整体结构示意图。
图2是本发明样本反应管及其部分组件的结构示意图。
图3是本发明微流控芯片的结构示意图。
图4是本发明夹持载具的结构示意图。
图5是软塞结构示意图；
图6为本发明中电磁控制器的结构示意图；
图中：微流泵1，样本反应管2，微流控芯片3，夹持载具4，样本管5，移动磁体6，细胞收集管7，微型振荡器8，样本管支架9，单螺旋型微流道10，内测流道10-1，中间流道10-2，外侧流道10-3；软塞11，反应腔体21，进样口31，出口32，芯片层33，基底层34，磁分离池35，芯片基座41，磁体适配器42，载具上盖43，活动连接座44，软塞插孔45，弹性卡合件46，弹性卡扣47，样本入口51，磁珠悬液进口52，样本管线出口53，样本磁反应区接头81，样本管支架卡槽82，电磁控制器83，衔铁831，弹簧832，电磁铁833，电源连接触点834，电源连接触点835，金属触点84，金属电极91。
具体实施方式
如图1、图2、图3、图4所示，一种循环稀有细胞集成微流控分离装置，该装置包括样本反应管2、微流控芯片3、夹持载具4与移动磁体6，样本反应管2主要由样本磁反应区、微型振荡器8、样本管5与样本管支架9组成；微流控芯片3由基底层34和以及设置在基底层34上的芯片层33组合而成，芯片层33包含进样口31、单螺旋型微流道10初级分离区、磁分离二级分离区和出口32；夹持载具4可以承载固定微流控芯片3，夹持载具4包括含有磁体适配器42和弹性卡扣47的芯片基座41、与芯片基座41相连的载具上盖43，载具上盖43有软塞插孔45和嵌入载具上盖43的弹性卡合件46，合上载具上盖43，软塞插孔45与微流控芯片3的进样口31和出口32分别吻合对应；移动磁体6可以精准卡入芯片基座41的磁体适配器42，与微流控芯片3的磁分离二级分离区对应，可以磁吸附与磁珠结合的细胞。
如图1、图2所示，本发明中，样本磁反应区包括一个样本入口51、一个磁珠悬液进口52、反应腔体21与样本管线出口53，样本管线出口53与样本管5相连，样本磁反应区容量为0.5ml～5ml，用于处理后样本与含有CD45抗体的磁珠的免疫磁结合反应。样本入口51和磁珠悬液进口52通过样本管5连接的微流泵1将生物样本与磁珠悬液注入反应腔体21，微流泵流速范围为0.03ml/min～8.2ml/min。磁珠为超顺磁、大小一致、表面均一的聚合物磁珠，更优选为磁性聚苯乙烯(PS)磁珠。
本发明样本管5采用软性、表面张力小、摩擦系数极低、无粘附性、不亲水、无毒、生物相容性好的塑料管，优选为含有聚四氟乙烯(PTFE)的塑料管。
如图1、图2、图6所示，本发明微型振荡器8为样本磁反应区提供混合振荡力，其包括样本磁反应区接头81和样本管支架卡槽82，样本磁反应区接头81用于稳定连接固定反应腔体21，所述样本磁反应区接头81上设有样本管线出口53，所述样本管线出口53连接有所述样本管5，所述样本磁反应区接头81与所述样本管线出口53对应，使样本管5穿过微型振荡器8，样本磁反应区接头81内设有电磁控制器83，如图6所示，电磁控制器83包括电磁铁833、与所述电磁铁833配合的衔铁831、设置在电磁铁833和衔铁831之间的弹簧832以及与电源连接触点834、835(电源连接触点834、835与样本管支架卡槽82内两个金属触点84连接)，样本管线出口53处的样本管5卡在弹簧832上，当电磁铁833通电后，电磁铁833会将衔铁831吸合，弹簧832就会被压缩，弹簧832会就卡住样本管线出口53处的样本管5，以截断管线内的流体防止样本磁反应区未反应完成的液体流出，当微型振荡器8停止振动时，电磁铁833断电，电磁控制器83的弹簧832就会复位回弹，样本管线出口53处的样本管5就可以打开，打开流体通路，让反应完成的液体流入微流控芯片进样口；样本管支架卡槽82可卡入样本管支架9中，以固定连接微型振荡器8与样本管支架9，样本管支架卡槽82上包含两个金属触点84，可与样本管支架9中的两个金属电极91连接，以形成电流通路为微型振荡器8供电。该微型振荡器8可以通过微振动使样本磁反应区内的白细胞与CD45抗体磁珠充分混合反应，便于两者间的均匀结合，且不会损伤细胞与目的CRCs。
如图1、图2所示，本发明样本管支架9为中空结构，样本管5可以从中穿出，支架外部有两根金属电极91，可以与微型振荡器8的样本管支架卡槽金属触点84以及夹持载具4软塞插孔处的触点连接，起到支撑样本管5与桥接样本磁反应区和夹持载具4的作用，以形成电流与流体通路。
本发明样本磁反应区、微型振荡器8与样本管支架9，为3个独立结构，通过组合拼接形成一体，其中样本磁反应区为1次性使用部件，可以有效防止不同样本间的交叉污染。
如图1、图3所示，本发明微流控芯片3的基底层34材料为玻璃载片，芯片层33材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，单螺旋型流道初级分离区由完整螺旋数为4个或以上、螺旋型流道末端有至少有3个分支的单螺旋型微流道10组成，优选的，单螺旋型微流道10，高度为40μm～110μm，流道宽度为150μm～600μm，流道间间距为450μm～500μm；芯片层33的进样口31位于单螺旋型微流道10中部，距离单螺旋型微流道10的第一内螺旋半径R范围为2.5mm～4.5mm。
如图3所示，本发明磁分离二级分离区由3个或以上的磁分离池35组成，每个磁分离池35与单螺旋型流道初级分离区的单螺旋型微流道10末端分支相连，单个磁分离池35的容量为0.2ml～2ml。磁分离池35为圆形或椭圆形，可最大限度地磁分离CRCs，有效防止堵塞。出口32位于磁分离二级分离区尾端，有3个或以上的出口32与磁分离池35对应，出口32处有对应数量的细胞收集管7收集CRCs和其他细胞。当有移动磁体6存在时可以收集高纯度的CRCs，当移除移动磁体6时可以收集与磁珠连接的细胞。
如图4所示，本发明夹持载具4的芯片基座41上的磁体适配器42根据磁分离池35的形状和数量适配设置为相应数量的圆槽或椭圆槽，圆槽深度与放入其中的移动磁体6的高度相等，可以固定移动磁体6；载具上盖43通过活动连接座44与芯片基座41相连。
如图5所示，本发明软塞11内部管道为1字型通孔结构，分为入口塞和出口塞，入口塞可与与芯片进样口31紧密对接形成流体通路，有效防止漏液；出口塞与芯片出口紧密对接，出口塞出口处连接样本管5，可接入细胞收集管中，便于相应细胞流入收集。软塞11可精准插入夹持载具载具上盖的软塞插孔45中，以紧密衔接联通芯片进样口31、出口32与夹持载具4，形成流体通路。软塞11材料采用摩擦系数极低、无粘附性、不亲水、无毒、生物相容性好、密封性好的塑料制成，塑料为PTFE。为避免生物交叉污染，软塞11为1次性使用，每分样本对应一对软塞。
如图1、图4所示，本发明移动磁体6为半圆环形或半椭圆环形结构，与芯片基座41上的磁体适配器42匹配良好，可以使带有磁珠的白细胞形成环形或半椭圆环形聚落，而不在磁分离池入口与出口32处聚集，留出缺口，很好地避免了因细胞聚集引起的出入口阻塞。移动磁体6可以根据细胞收集需要放入或取出，当移动磁体6放入磁体适配器42时，可以收集高纯度的CRCs，收集完成CRCs后，移除移动磁体6，可以回收连有磁珠的白细胞。
实施例1循环稀有细胞集成微流控分离装置分离CRC
在本实施例中，以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
如图1所示，是根据本发明的一个优选实施例的微流控装置，该装置主要包括：操控流体流量与流速的微流泵1通过样本管5连通样本反应管2，样本反应管2中完成细胞与磁珠结合的反应完成液，通过样本管5与装载好移动磁体6的夹持载具4垂直连通微流控芯片3，进行CRCs分离，分离出的CRCs通过与芯片3出口32相连的样本管5分别流入细胞收集管7中进行收集。完成CRC收集后，从夹持载具4取出移动磁体6，更换新的细胞收集管7，可回收连有CD45磁珠的白细胞。
如图2、图3所示，一种循环稀有细胞集成微流控分离方法，采用循环稀有细胞集成微流控分离装置，包括以下步骤：
1)将微流控芯片3放入夹持载具4中；
2)将样本磁反应区装载在微型振荡器8的样本磁反应区接头81，再将样本管支架卡槽82与样本管支架9连接，连接时须将样本管支架9上的金属电极91与金属触点84对接，最后接入夹持载具4并启动电源，微型振荡器8开始振动，电磁控制器83通电后，电磁铁833会将衔铁831吸合，弹簧832就会被压缩，弹簧832会就卡住样本管线出口53处的样本管5，以截断管线内的流体防止样本磁反应区未反应完成的液体流出；
3)微流泵1将密度梯度离心处理好的单核细胞层(PBMCs)通过样本入口51，加入样本磁反应区的反应腔体21内，同时将CD45磁珠悬液(DynabeadsTMCD45，InvitrogenTM)通过磁珠悬液进口52注入反应腔体21内，二者混合结合反应20min；
4)关闭微型振荡器8，电磁控制器83的电磁铁833断电，电磁控制器83的弹簧832就会复位回弹，样本管线出口53处的样本管5打开，反应完成液通过样本管线出口53进入微流控芯片3，进行细胞分离；
5)反应完成液在微流泵1的作用下，以2ml/min的流速进入单螺旋型流道初级分离区的单螺旋型微流道10中进行流体惯性力分离，经过流体惯性分离开的细胞直径大于等于20μm的细胞从内测流道10-1进入磁分离池35中，细胞直径在15±5μm的中等粒径的细胞从中间流道10-2进入磁分离池35中，细胞直径小于等于7μm的细胞从外侧流道10-3进入磁分离池35中。在位于磁分离池35下方的移动磁体的磁场作用下，连接有CD45磁珠的白细胞在各个磁分离池中聚集与CRCs分离，因所用移动磁体6为半环形，白细胞也会形成半环形聚集，因此有效地避免了因聚集引起的阻塞，CRCs经过出口32顺样本管5流入细胞收集管7中收集。
6)CRCs收集完成后，关闭微流泵1，打开夹持载具4，将微流控芯片3取出，移除夹持载具芯片基座41中的移动磁体6，再将取出的微流控芯片3放回夹持载具4中，启动微流泵1，用新的细胞收集管7收集连有CD45磁珠的白细胞。
实施例2应用本发明分离人外周血中的循环肿瘤细胞
1血液样本采集与预处理
用采血管采集乳腺癌患者2mL静脉外周血液样本，用1×PBS以体积比1:1的比例将全血样本稀释至4ml，加入含有3ml密度梯度离心液的离心管中，室温1000×g离心10min。
移除上层血浆，将PBMCs层转移至一个新的15mL离心管中，用10mL 原代细胞完全培养基清洗PBMCs后，4℃，300×g离心10min，小心弃除上清液，用1mL />原代细胞完全培养基，轻柔重悬PBMCs沉淀2次，转移至2.5mL离心管中，300×g室温离心10min，小心移去上清液，吸取细胞清洗液重悬PBMCs沉淀至2ml，待循环稀有细胞集成微流控分离装置分离。
2循环肿瘤细胞的分离
启动操控流体流量与流速的微流泵1，将连接样本入口51的样本管5插入1中已完成预处理的PBMCs中，并将连接样本入口51的样本管5插入有2～8℃预冷的CD45磁珠悬液(DynabeadsTMCD45，InvitrogenTM)的离心管中，微流泵1将2ml PBMCs悬液与200μl CD45磁珠悬液一同泵入样本反应管2的反应腔体21中，微型振荡器8振动25min后，白细胞与磁珠结合的反应完成，微型振荡器8自动关闭，电磁控制器83复位。
反应完成液在微流泵1的作用下以2ml/min的流速通过样本管线出口53进入微流控芯片3的单螺旋型流道初级分离区的单螺旋型微流道10中进行流体惯性力分离，经过流体惯性分离开的细胞直径大于等于20μm的细胞从内测流道10-1进入磁分离池35中，细胞直径在15±5μm的中等粒径的细胞从中间流道10-2进入磁分离池35中，细胞直径小于等于7μm的细胞从外侧流道10-3进入磁分离池35中。在位于磁分离池35下方的移动磁体的磁场作用下，连接有CD45磁珠的白细胞在各个磁分离池中聚集与循环肿瘤细胞分离，已完成分离的不同大小的循环肿瘤细胞经过出口32顺样本管5流入细胞收集管7中收集，用于下游多种分析(如免疫化学染色、二代测序(NGS)、荧光原位杂交(FISH)等)。
关闭微流泵1，打开夹持载具4，将微流控芯片3取出，移除夹持载具芯片基座41中的移动磁体6，再将取出的微流控芯片3放回夹持载具4中，启动微流泵1，用新的细胞收集管7回收连有CD45磁珠的白细胞。
本说明书中没有详细描述的部分均采用本领域技术人员所公知的结构和原理，均为现有技术。
通过上述描述，本领域的技术人员已能实施。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，仅是对本发明优选的实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计的前提下，本领域技术只人员凡依本发明构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的权力要求确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种循环稀有细胞集成微流控分离装置，其特征在于，包括样本反应管（2）、与所述样本反应管（2）连接的微流控芯片（3）、承载固定所述微流控芯片（3）的夹持载具（4）以及安装在所述夹持载具（4）内的移动磁体（6）；
所述的样本反应管（2）包括：样本管支架（9）、设置在所述样本管支架（9）上的微型振荡器（8）、设置在所述微型振荡器（8）上的样本磁反应区以及用于连接的样本管（5）；
所述的样本磁反应区包括一个样本入口（51）、一个磁珠悬液进口（52）、反应腔体（21）和样本管线出口（53），所述的样本管线出口（53）与所述样本管（5）相连，所述样本入口（51）和磁珠悬液进口（52）通过样本管（5）连接的微流泵（1）连通到所述反应腔体（21）；
所述的微型振荡器（8）包括样本磁反应区接头（81）和样本管支架卡槽（82），所述样本磁反应区接头（81）连接固定反应腔体（21），所述样本磁反应区接头（81）上设有样本管线出口（53），所述样本管线出口（53）连接有所述样本管（5）；所述的样本磁反应区接头（81）设有电磁控制器（83），所述的电磁控制器（83）包括电磁铁（833）、与所述电磁铁（833）配合的衔铁（831）以及设置在所述电磁铁（833）和衔铁（831）之间的弹簧（832），所述的样本管线出口（53）处的样本管（5）卡在所述弹簧（832）上；
所述样本管支架卡槽（82）卡入所述样本管支架（9）中，所述样本管支架卡槽（82）上包含两个金属触点（84），与所述样本管支架（9）中的两个金属电极（91）连接；
所述的微流控芯片（3）包括基底层（34）以及设置在所述基底层（34）上的芯片层（33），所述的芯片层依次包含进样口（31）、单螺旋型流道初级分离区、磁分离二级分离区和出口（32）；
所述的移动磁体（6）为半环形，所述的夹持载具（4）包括含有磁体适配器（42）和弹性卡扣（47）的芯片基座（41）以及与所述芯片基座（41）相连的载具上盖（43），所述的移动磁体（6）卡入所述芯片基座（41）的磁体适配器（42），与所述微流控芯片（3）的磁分离二级分离区对应。
2.根据权利要求1所述的循环稀有细胞集成微流控分离装置，其特征在于，所述载具上盖（43）有软塞插孔（45）和嵌入载具上盖（43）的弹性卡合件（46），所述的弹性卡合件（46）与弹性卡扣（47）配合，合上所述载具上盖（43），所述软塞插孔（45）与所述微流控芯片（3）的进样口（31）和出口（32）分别吻合对应。
3.根据权利要求1所述的循环稀有细胞集成微流控分离装置，其特征在于，所述单螺旋型流道初级分离区由完整螺旋数为4个或以上、螺旋型流道末端至少有3个分支的单螺旋型微流道（10）组成。
4.根据权利要求3所述的循环稀有细胞集成微流控分离装置，其特征在于，所述单螺旋型微流道（10），高度为40μm ~110μm，流道宽度为150μm~600μm，流道间间距为450μm~500μm；
所述芯片层进样口（31）位于单螺旋型微流道（10）中部，距离单螺旋型微流道（10）的第一内螺旋半径范围为2.5mm~4.5mm。
5.根据权利要求1所述的循环稀有细胞集成微流控分离装置，其特征在于，所述磁分离二级分离区包括3个或以上的磁分离池（35），每个磁分离池（35）与单螺旋型流道初级分离区的单螺旋型微流道（10）末端分支相连，所述出口（32）位于磁分离二级分离区尾端，有3个或以上的出口（32）与磁分离池（35）对应，出口（32）处有对应数量的细胞收集管（7）收集细胞。
6.一种循环稀有细胞集成微流控分离方法，其特征在于，采用权利要求1~5任一项所述的循环稀有细胞集成微流控分离装置，包括以下步骤：
1）将微流控芯片（3）放入夹持载具（4）中；
2）将样本磁反应区装载在微型振荡器（8）的样本磁反应区接头（81），再将样本管支架卡槽（82）与样本管支架（9）连接，连接时须将样本管支架（9）上的金属电极（91）与金属触点（84）对接，最后接入夹持载具（4）并启动电源，微型振荡器（8）开始振动，电磁控制器（83）通电后，电磁铁（833）会将衔铁（831）吸合，弹簧（832）就会被压缩，弹簧（832）会就卡住样本管线出口（53）处的样本管（5），以截断管线内的流体防止样本磁反应区未反应完成的液体流出；
3）微流泵（1）将密度梯度离心处理好的单核细胞层通过样本入口（51），加入样本磁反应区的反应腔体（21）内，同时将磁珠悬液通过磁珠悬液进口（52）注入反应腔体（21）内，二者混合结合反应10~30min；
4）关闭微型振荡器（8），电磁控制器（83）的电磁铁（833）断电，电磁控制器（83）的弹簧（832）就会复位回弹，样本管线出口（53）处的样本管（5）打开，反应完成液通过样本管线出口（53）进入微流控芯片（3），进行细胞分离；
5）反应完成液在微流泵（1）的作用下，进入单螺旋型流道初级分离区的单螺旋型微流道（10）中进行流体惯性力分离，经过流体惯性分离开的细胞直径大于等于20μm的细胞从内测流道进入第一磁分离池中，细胞直径在15±5μm的中等粒径的细胞从中间流道进入第二磁分离池中，细胞直径小于等于7μm的细胞从外侧流道进入第三磁分离池中，在位于磁分离池下方的移动磁体的磁场作用下，连接有磁珠的白细胞在各个磁分离池中聚集与循环稀有细胞分离，所用移动磁体（6）为半环形，白细胞也会形成半环形聚集，循环稀有细胞经过出口（32）顺样本管（5）流入细胞收集管（7）中收集；
6）循环稀有细胞收集完成后，关闭微流泵（1），打开夹持载具（4），将微流控芯片（3）取出，移除夹持载具芯片基座（41）中的移动磁体（6），再将取出的微流控芯片（3）放回夹持载具（4）中，启动微流泵（1），用新的细胞收集管（7）收集连有磁珠的白细胞。
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