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CN110540592B - 结合axl蛋白的抗体及其应用 - Google Patents

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CN110540592B
CN110540592B CN201810528095.2A CN201810528095A CN110540592B CN 110540592 B CN110540592 B CN 110540592B CN 201810528095 A CN201810528095 A CN 201810528095A CN 110540592 B CN110540592 B CN 110540592B
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Abstract

本申请涉及一种抗体、其抗原结合片段或变体，其具备选自下组的一种或多种性质：1)能够以1×10‑8M或更低的KD值结合AXL蛋白；2)能够特异性识别在细胞表面表达的AXL蛋白；3)结合在细胞表面表达的AXL蛋白后能够介导内化。本申请所述的抗体还可以用于构建免疫缀合物。本申请所述的抗体、免疫缀合物均可以抑制肿瘤细胞的增殖。

Description

结合AXL蛋白的抗体及其应用
技术领域
本申请涉及一种结合AXL蛋白的抗体及其应用。所述抗体可以特异性地识别和结合AXL蛋白，并且在结合细胞表面表达的AXL蛋白后介导内化。所述抗体可以抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或增殖。
背景技术
AXL(受体酪氨酸激酶)是激酶的Tyro-3家族的成员，其可通过配体Gas6(与抗凝血因子蛋白S同源的70-kDa蛋白)的结合来激活。AXL激活导致通过PI-3-激酶/Akt(Franke等人，Oncogene 22：8983-8998，2003)和其他主要途径如Ras/Erk和β-联蛋白/TCF(Goruppi等人，Mol.Cell Biol.21：902-915，2001)的信号转导。
在肿瘤细胞中，AXL在调节细胞的侵袭和迁移中起重要作用。AXL的过度表达不仅与预后不良相关，也与乳房、结肠、食管癌、肝细胞、胃、神经胶质瘤、肺、黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢、前列腺、横纹肌肉瘤、肾、甲状腺和子宫内膜癌中所报告的各种人癌症的侵袭增加相关(Linger R.M.Adv.Cancer Res.2008,100,35-83以及Verma A.Mol.Cancer Ther.(2011).10,1763-1773)。
鉴于AXL的治疗潜能，需要制备特异性结合AXL蛋白的抗体。
发明内容
本申请提供了一种结合AXL蛋白的抗体及其应用。所述抗体具有下列性质中的一种或多种：1)以较高的亲和力特异性与AXL蛋白相结合；2)特异性识别在细胞表面表达的AXL蛋白；3)在结合细胞表面表达的AXL蛋白后介导该细胞，尤其是肿瘤细胞的内化；4)抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或增殖；5)可用于构建免疫缀合物，且该免疫缀合物也可以抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或增殖。本申请还提供了所述抗体的制备方法和应用。
一方面，本申请提供了一种抗体、其抗原结合片段或变体，其具备选自下组的一种或多种性质：1)能够以1×10-8M或更低的KD值结合AXL蛋白；2)能够特异性识别在细胞表面表达的AXL蛋白；3)结合在细胞表面表达的AXL蛋白后能够介导内化。
在某些实施方式中，所述AXL蛋白为人AXL蛋白。在某些实施方式中，所述AXL蛋白包含细胞外结构域。在某些实施方式中，所述细胞外结构域包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述细胞包括肿瘤细胞。
在某些实施方式中，所述肿瘤为AXL阳性肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
在某些实施方式中，所述细胞包括人的细胞。在某些实施方式中，所述细胞包括选自下组的细胞：人非小细胞肺癌A549细胞、人皮肤鳞癌A431细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞、红白血病K562细胞、急性T细胞白血病Jurkat细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MDA-MB-468细胞、人乳腺癌SKBR3细胞、人卵巢癌SKOV3细胞、淋巴瘤U-937细胞、淋巴瘤Raji细胞、人骨髓瘤U266细胞和人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段选自下组：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2和Fv片段。
在某些实施方式中，所述变体选自下组：1)在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和2)与所述抗体或所述其抗原结合片段具有至少90％序列同源性的蛋白质或多肽。
在某些实施方式中，所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合所述AXL蛋白，其中所述参比抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1-3，所述LCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1-3，且所述HCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
在某些实施方式中，所述参比抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述参比抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述参比抗体的轻链包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；且所述参比抗体的重链包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述参比抗体为抗体6G12和/或抗体C6G12。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体轻链或其片段。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含如SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区。在某些实施方式中，所述人恒定区包括人Igκ恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体重链或其片段。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR2，且所述HCDR2包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区。在某些实施方式中，所述人恒定区包括人IgG恒定区。在某些实施方式中，所述IgG恒定区包含人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体选自：抗体6G12和抗体C6G12。
另一方面，本申请提供了一种分离的一种或多种核酸分子，其编码所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备所述的抗体、其抗原结合片段或变体的方法，所述方法包括在使得所述抗体、其抗原结合片段或变体表达的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
在某些实施方式中，所述的免疫缀合物还包含选自下组的至少一种其他试剂：化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂。在某些实施方式中，所述的免疫缀合物中所述抗体、其抗原结合片段或变体与所述至少一种其他试剂通过连接分子相连。在某些实施方式中，所述的免疫缀合物中所述抗体、其抗原结合片段或变体及所述至少一种其他试剂分别与所述连接分子共价相连。
在某些实施方式中，所述至少一种其他试剂包括美登素或其衍生物。在某些实施方式中，所述美登素衍生物包括美登素衍生物DM1。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述的免疫缀合物，或者所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或者所述的免疫缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括AXL阳性肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或者所述的免疫缀合物，其用于预防或治疗肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括AXL阳性肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防或治疗有需要的受试者中的肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述的免疫缀合物，或者所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括AXL阳性肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了根据所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其用于诊断与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况。
另一方面，本申请提供了根据所述的抗体、其抗原结合片段或变体用于制备诊断剂的用途，其中所述诊断剂用于诊断与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况。
另一方面，本申请提供了一种诊断受试者中与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况的方法，所述方法包括：使源自所述受试者的样品与所述的抗体、其抗原结合片段或变体接触，以及判断所述样品中能够特异性结合所述抗体、其抗原结合片段或变体的物质的存在和/或含量。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述单克隆抗体特异性结合AXL-Fc的结合能力。
图2显示的是本申请制备嵌合抗体所构建的载体的物理图谱。
图3显示的是本申请所述嵌合抗体特异性结合AXL-Fc的结合能力。
图4显示的是本申请所述嵌合抗体特异性识别抗原AXL的结果。
图5A-5B显示的是本申请所述嵌合抗体识别肿瘤细胞表面抗原AXL的结果。
图6显示的是本申请所述嵌合抗体对肿瘤细胞的内化活性的结果。
图7显示的是本申请所述嵌合抗体构建的免疫缀合物抑制肿瘤细胞增殖的结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含重(H)链和/或轻(L)链(例如，可以为免疫球蛋白，可以包含2条重链和/或轻链)，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下来实现：包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重链，或者，包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的轻链。(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(2)F(ab’)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的CDR的组合。此外，还可包括由VL和VH配对形成的一价单链分子Fv(scFv)(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。所述“抗原结合部分”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；和(3)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
在本申请中，术语“AXL蛋白”通常是指axl基因所编码的蛋白质受体酪氨酸激酶，AXL(Ark、UFO、Tyro-7)是激酶的Tyro-3家族的成员。其可通过配体Gas6(与抗凝血因子蛋白S同源的70-kDa蛋白)的结合来激活。AXL在细胞粘着和趋化性中起着重要作用。此外，研究表明，不同癌症类型例如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、肝细胞癌、甲状腺癌、食管癌、骨肉瘤、黑素瘤和头颈鳞状细胞癌中存在AXL蛋白的过表达。同时，与非侵袭性细胞相比，AXL被鉴定为在侵袭性乳腺癌细胞系中上调的转移相关基因(参见PCT国际公布文本WO04008147)。目前已有结合AXL并且具有生物学活性的抗体，其可以减少AXL介导的细胞侵袭。人AXL蛋白是894个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；其中第1-25位氨基酸残基为信号肽；第26-442位为AXL蛋白的细胞外结构域(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)。
在本申请中，术语“细胞外结构域”通常是指位于细胞外的多肽或蛋白结构域。例如，其可以为AXL蛋白的细胞外结构域，其氨基酸序列可如SEQ ID NO:2所示。AXL蛋白的细胞外结构域具有接近细胞粘附分子所需的结构，其是两个免疫球蛋白样结构域的组合物，能够结合Gas6配体(Sasaki T等人，EMBO J.(2006).25,80-87)。
在本申请中，术语“KD”可与“KD”互换使用，通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，单位为M(mol/L)。KD可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算：KD＝c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知，KD值越大，说明解离越多，代表物质A、B之间的亲和力越弱；反之，KD值越小，说明解离越少，代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中，术语“内化”通常是指抗体或多肽链与细胞表面的受体特异性结合，形成受体-抗体复合物，然后通过该受体介导的胞吞作用进入到细胞内的过程。此时这样的抗体或抗体片段(如Fab片段)成为内化抗体。所述内化抗体可以作为定向运载药物、酶或DNA的载体。在一些实施方式中，所述内化可抑制肿瘤细胞的增殖。例如，所述内化抗体可用于偶联抗肿瘤的化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂，并作为肿瘤生物治疗的候选分子。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指典型特征在于细胞增殖或存活失调的生理状况。所述肿瘤包括所有已知的癌症和肿瘤状况，无论其特征为恶性，良性，软组织或实性，以及包括转移前和转移后癌症在内的所有阶段和等级的癌症。所述肿瘤还可以包括一种或多种肿瘤细胞。
在本申请中，术语“AXL阳性肿瘤”通常是指与AXL蛋白的表达相关，或者AXL蛋白的表达量显著提高的肿瘤。所述AXL阳性肿瘤可以选自以下组：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。或者，可以选自以下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。所述AXL阳性肿瘤可以包括一种或多种肿瘤细胞。例如，所述肿瘤细胞可以选自以下组：人非小细胞肺癌A549细胞、人皮肤鳞癌A431细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人胰腺癌MIAPaCa-2细胞、红白血病K562细胞、急性T细胞白血病Jurkat细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MDA-MB-468细胞、人乳腺癌SKBR3细胞、人卵巢癌SKOV3细胞、淋巴瘤U-937细胞、淋巴瘤Raji细胞、人骨髓瘤U266细胞和人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指一群基本同源的抗体，即包含在该群内的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述的技术进行。
在本申请中，术语“单链抗体”(scFv)通常是指由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接子(linker)连接而成的分子。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合抗体在注射时引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指一种抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321:522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988 Science 239:1534-1536；Riechmann,et al.,1988 Nature 332:323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol 1991 9:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033；Co,et al.,1991 ProcNatl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co,et al.,1992 J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanizedand veneered anti-CD18 antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellularadhesion:molecular definition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)、表面重建(美国专利US5639641)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指全人抗体，即抗体的恒定区和可变区均来源于人。所述全人源抗体可以通过噬菌体抗体库技术、转基因小鼠制备人源性抗体、核糖体展示技术、EBV转化B细胞克隆技术、单个B细胞克隆等技术来实现。
在本申请中，术语“多特异性抗体”通常是指可以同时识别两个或两个以上抗原或者表位的抗体分子。所述多特异性抗体可以通过化学偶联法、杂交-杂交瘤法、基因工程抗体制备法等方法在真核表达系统或者在原核表达系统中获得。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指所述其他试剂(例如，化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述抗体、其抗原结合片段或变体缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述抗体、其抗原结合片段或变体与靶细胞上的抗原的特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。然后所述免疫缀合物经所述内化，最终进入靶细胞内部(例如，进入溶酶体等泡囊体)，此时所述免疫缀合物中的连接分子可以裂解，释放所述其他试剂从而发挥其细胞毒性效应。此外，所述抗原也可以由所述靶细胞分泌，并位于所述靶细胞外的间隙。
在本申请中，术语“化疗剂”通常是指可以抑制肿瘤和/或肿瘤细胞增殖的化疗用试剂。所述化疗剂可以选自以下组：有丝分裂抑制剂、激酶抑制剂、烷基化试剂、抗代谢药、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、抗存活剂、生物学应答调节剂、抗激素例如抗雄激素和抗血管生成剂。例如，所述化疗剂可以选自以下组：卡培他滨、柔红霉素、道诺霉素、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双氯乙基亚硝脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨喋呤(MTX)、秋水仙碱、泰素(taxol)、长春新碱、长春碱、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷和己烯雌酚(DES)。
在本申请中，术语“放射性元素”通常是指可以抑制肿瘤和/或肿瘤细胞增殖的放疗用元素。所述放射性元素可以选自以下组：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I和131I。
在本申请中，术语“细胞生长抑制剂”通常是指通过抑制促进肿瘤细胞生长和复制的生长因子从而抑制肿瘤的试剂。生长因子与在细胞表面的受体结合后激活了细胞内的信号通路，复杂的通路可能促使细胞失控生长，从而导致细胞过度的分裂并发展为肿瘤。所述细胞生长抑制剂能够抑制这些生长因子的作用。所述细胞生长抑制剂可以选自以下组：血管生成抑制因子、脱乙酰化酶(HDAC)抑制因子、Hedgehog信号通路阻滞剂、mTOR抑制剂、p53/mdm2抑制剂、PARP抑制剂、蛋白酶体抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
在本申请中，术语“细胞毒性剂”通常是指通过对作用的细胞产生毒素，抑制肿瘤和/或肿瘤细胞增殖的试剂。所述细胞毒性剂可以选自以下组：烷化剂，如白消安、六甲蜜胺、噻替派、环磷酰胺、氮芥、乌拉莫司汀、美法仑、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、替莫唑胺、异环磷酰胺等；抗肿瘤剂，如丝裂霉素C等；抗代谢物，如甲氨蝶呤、咪唑硫嘌呤、巯基嘌呤、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶等；含铂的抗癌剂，如顺铂、卡铂等；蒽环霉素，如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌等；植物生物碱和萜类化合物，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、多西他赛等；拓扑异构酶抑制剂，如伊立替康、安吖啶、托泊替康、依托泊苷、替尼泊苷等；抗体类，如利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、厄洛替尼、更生霉素等；非那雄胺；芳香化酶抑制剂；他莫昔芬；戈舍瑞林；紫杉醇和甲磺酸伊马替尼。所述细胞毒性剂可以通过口服、注射等方式施用。
在本申请中，术语“连接分子”通常是指连接或联接两个分子的功能分子。例如，所述连接分子可以连接一个分子和另一个分子(例如，一个分子为蛋白质分子，另一个分子也为蛋白质分子，或者可以为小分子药物)。所述连接分子可以用于所述免疫缀合物的构建中。在所述免疫缀合物中，所述连接分子可以具备两个功能特征：1、具有循环系统稳定性，在所述免疫缀合物到达靶细胞前在循环系统中不能发生裂解释放所述其他试剂，避免产生毒性作用；2、在进入靶细胞过后，所述连接分子需要快速有效地断裂，使所述其他试剂有效释放发挥应有的药理活性。所述连接分子可以由极性或非极性氨基酸组成。所述连接分子也可以为包含杂原子(如氮原子、硫原子等)的碳链。所述连接分子的长度可以为2至100个原子，例如为2至50个原子之间，也可以为3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个原子；又例如，所述连接子的长度可以为20至26个(20、21、22、23、24、25或26个)原子。所述连接分子可以包括选自以下组的取代基取代：氢原子、烷基、烯基、炔基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三烷基氨基、羟基、烷氧基、卤素、芳基、杂环、芳香族杂环、氰基、酰胺、氨基甲酰基、羧酸、酯、硫醚、烷基硫醚、巯基和脲基。此外，所述连接分子可以选自以下组：pH敏感连接分子、蛋白酶可切割连接分子、核酸酶敏感连接分子、脂肪酶敏感连接分子、糖苷酶连接分子、缺氧连接分子、光切割连接分子、热不稳定连接分子和超声敏感连接分子。
在本申请中，术语“共价”通常是指共价键，即两个或多个原子存在共用电子对，达到电子饱和的状态从而形成比较稳定的化学结构。共价键的形成是相邻两个原子之间自旋方向相反的电子相互配对，此时原子轨道相互重叠，两核间的电子云密度相对地增大，从而增加对两核的引力。共价键有饱和性与方向性。共价键可以分为非极性共价键、极性共价键和配价键。只含有共价键的化合物可称为共价化合物。
在本申请中，术语“美登素”通常是指从美登木属植物分离得到(参见美国专利US3896111)的化合物，其属于一种抗有丝分裂细胞毒素，结构式为：
Figure GDA0003081979910000111
CAS号为35846-53-8。美登素对各种肿瘤，如L-1210、P-388白血病、S-180、W-256、路易斯肺癌和体外鼻咽癌均有显著疗效。所述美登素衍生物可以包括具有美登素的环结构且其环上具有一个或一个以上取代基修饰的化合物，例如美登素衍生物DM1、DM4。
在本申请中，术语“美登素衍生物DM1”通常是指具备以下结构式的化合物：
Figure GDA0003081979910000112
CAS号为139504-50-0。其属于一种抗有丝分裂细胞毒素。
在本申请中，术语“与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况”通常是指与AXL蛋白的表达相关，或者AXL蛋白的表达上调会导致的疾病或病况。所述疾病或病况可以选自以下组：寨卡病毒感染、系统性红斑狼疮、血压升高、蛋白尿、甲状腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤(例如，急性粒细胞白血病)、乳腺癌(例如，ER阳性乳腺癌)、卵巢癌(例如，I型和II型上皮性卵巢癌)、淋巴瘤和骨髓瘤。或者，可以选自以下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中，术语“重组宿主细胞”通常指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
抗体、其抗体结合片段或变体
在一个方面，本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段或变体，其以1×10-8M以下(例如，所述KD值不高于约1×10-8M、不高于约1×10-9M、不高于约5×10-10M、不高于约4×10-10M、不高于约3×10-10M、不高于约2×10-10M、不高于1.6×10-10M、不高于1.5×10-10M、不高于1.4×10-10M、不高于1.3×10-10M、不高于1.2×10-10M、不高于1.1×10-10M、不高于约1×10-10M或不高于约1x10-11M或以下)的KD值与AXL蛋白相结合。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体，可特异性识别在细胞表面表达的AXL蛋白。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体，可结合在细胞表面表达的AXL蛋白后能够介导内化。例如，所述内化可以包括以下的步骤：当所述的抗体、其抗原结合片段或变体可以结合到细胞(例如肿瘤细胞)的质膜上，或者，可以响应于细胞微环境(例如肿瘤细胞微环境)中的蛋白水解活性后在细胞内释放。从而，所述的抗体、其抗原结合片段或变体可以被细胞膜吞没，并吸入该细胞中。在某些实施方式中，所述免疫缀合物中的所述抗体、其抗原结合片段或变体，和/或与之缀合的所述其他试剂，也可以在所述抗体、其抗原结合片段或变体结合到细胞的质膜上后，被细胞膜吞没，并吸入该细胞中。
在本申请中，所述AXL蛋白可以为人AXL蛋白(AAH32229.1)；也可以为食蟹猴AXL蛋白(Genbank登录号HB387229.1)。例如，所述AXL蛋白可以为人AXL蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
所述AXL蛋白可以包括AXL蛋白的变体。例如，所述变体可以为：1)在所述AXL蛋白的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和2)与所述AXL蛋白具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
所述AXL蛋白还可以包括AXL蛋白的片段。例如，所述AXL蛋白可以为人AXL蛋白的细胞外结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本申请中，所述细胞可以包括肿瘤细胞。例如，所述肿瘤可以为AXL阳性肿瘤。例如，所述肿瘤可以选自下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
在本申请中，所述细胞可以包括人的细胞。例如，所述细胞可以包括选自下组的细胞：人非小细胞肺癌A549细胞、人皮肤鳞癌A431细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞、红白血病K562细胞、急性T细胞白血病Jurkat细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MDA-MB-468细胞、人乳腺癌SKBR3细胞、人卵巢癌SKOV3细胞、淋巴瘤U-937细胞、淋巴瘤Raji细胞、人骨髓瘤U266细胞和人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞。
本申请所述的抗体可选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体和全人源抗体。
本申请所述的抗原结合片段可选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
本申请所述的变体可选自下组：1)在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和2)与所述抗体或所述其抗原结合片段具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体，可以与参比抗体竞争结合所述AXL蛋白。所述参比抗体可以包含轻链可变区和重链可变区。例如，所述参比抗体的轻链可变区可包含LCDR1-3，所述LCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。所述参比抗体的重链可变区可包含HCDR1-3，所述HCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
在本申请中，所述竞争性结合的能力可以通过测定所述抗体、其抗原结合片段或变体的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数来衡量。检测所述解离平衡常数的方法可以选自以下组：酶联免疫吸附法、表面等离振子共振(SRP)法、电位滴定法、分光光度法、细管电泳法、荧光法和薄层色谱pH法。例如，所述抗体、其抗原结合片段或变体可以经SRP法(例如，使用生物大分子相互作用仪)检测。检测发现，本申请所述的抗体、其结合片段或变体可以以1×10-8M或更低的KD值结合AXL蛋白。
例如，所述参比抗体的轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:10所示，且所述参比抗体的重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:11所示。又例如，所述参比抗体的轻链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:12所示；且所述参比抗体的重链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:13所示。
例如，本申请所述的抗体或其抗原结合片段与参比抗体竞争结合AXL蛋白。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:4或其变体所示；LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:5或其变体所示；LCDR3的氨基酸序列可以如SEQID NO:6或其变体所示；其HCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:7或其变体所示；HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:8或其变体所示；HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:9或其变体所示。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体6G12、C6G12或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。又例如，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:10或其变体所示；且所述重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:11或其变体所示。在某些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体6G12、C6G12或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。又例如，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:12或其变体所示；且所述重链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:13或其变体所示。在某些实施方式中，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体C6G12或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在本申请中，所述抗体、其抗原结合片段或变体具备结合特异性。例如，所述抗体、其抗原结合片段或变体特异性地识别抗原——所述AXL蛋白，而不识别其他蛋白。例如，所述其他蛋白可以选自以下组：源自动物的蛋白质混合物、免疫细胞表面抗原分子CD家族、肿瘤标志物和TAM受体等。例如，所述其他蛋白可以包括：牛奶、BSA、CD19、TROP2、BCMA、CD47、CD38和Gas6。在本申请中，所述抗体、其抗原结合片段或变体的结合特异性可以通过ELISA法进行检测。例如，本申请所述抗体、其抗原结合片段或变体对所述AXL蛋白在450nm波长下的吸光度OD值可以大于3，而对所述其他蛋白同一波长下的吸光度OD值在0.5以下。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含抗体轻链或其片段。
例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR1，且所述LCDR1的氨基酸序列可以如SEQID NO:4所示。所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2，且所述LCDR2的氨基酸序列可以如SEQID NO:5所示。所述抗体轻链或其片段可包含LCDR3，且所述LCDR3的氨基酸序列可以如SEQID NO:6所示。所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL蛋白)，且与其具有至少约90％(例如，具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL蛋白)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。
本申请所述抗体的轻链或其片段可包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:10所示。
例如，所述抗体轻链或其片段可包括Igκ恒定区，例如可包含人Igκ恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:12所示。所述氨基酸序列的变体可以为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL)，且与其具有至少约90％(例如，具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL蛋白)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段可包含抗体重链或其片段。
例如，所述抗体重链或其片段可包含HCDR1，且所述HCDR1的氨基酸序列可以如SEQID NO:7所示。所述抗体重链或其片段可包含HCDR2，且所述HCDR2的氨基酸序列可以如SEQID NO:8所示。又例如，所述抗体重链或其片段可包含HCDR3，且所述HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:9所示。所述氨基酸序列的变体可为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL蛋白)，且与其具有至少约90％(例如，具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL蛋白)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。
所述抗体重链或其片段可包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:11所示。
例如，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区。其中，所述人恒定区可包括人IgG恒定区。例如，所述人IgG恒定区可包含人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:13所示。所述氨基酸序列的变体可为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL蛋白)，且与其具有至少约90％(例如，具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合AXL蛋白)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:4或其变体所示；LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:5或其变体所示；LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:6或其变体所示；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQID NO:7或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8或其变体；HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:9或其变体所示。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体6G12或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:10或其变体所示；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ IDNO:11或其变体所示。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体6G12或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体可以为6G12。抗体6G12的LCDR1-3的氨基酸序列可以依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，且HCDR1-3的氨基酸序列可以依次如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；VL的氨基酸序列可以如SEQ IDNO:10所示，且VH的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:11所示。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段中LCDR1的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:4或其变体所示；LCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:5或其变体所示；LCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:6或其变体所示；且HCDR1的氨基酸序列可以如SEQID NO:7或其变体所示；HCDR2的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:8或其变体所示；HCDR3的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:9或其变体所示。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体C6G12或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可以如SEQ IDNO:10或其变体所示；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:11或其变体所示。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体C6G12或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:12所示且所述重链氨基酸序列可以如SEQ ID NO:13所示。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体C6G12或与其具有相同的轻链及重链氨基酸序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体可以为C6G12。抗体C6G12的LCDR1-3的氨基酸序列可以依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，且HCDR1-3的氨基酸序列可以依次如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；VL的氨基酸序列可以如SEQID NO:10所示，且VH的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:11所示；轻链的氨基酸序列可以如SEQID NO:12所示且重链的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:13所示。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子。所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗体、其抗原结合片段或变体，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子中的至少一种所述核酸分子可经密码子优化。例如，所述密码子优化的方法包括但不限于：消除稀有密码子、调整GC含量、增加mRNA的稳定性、调整mRNA的二级结构、合理设计接头和调整起始密码子环境。
在本申请中，所述核酸分子包含一个或多个选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。其中，SEQ ID NO:14可编码本申请所述抗体C6G12的轻链；SEQ ID NO:15可编码本申请所述抗体C6G12的重链。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述的抗体、其抗原结合片段或变体的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。例如，所述表达载体可以为T-easy。
在另一个方面，本申请提供了细胞，所述细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。例如，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。例如，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述细胞可以为CHO-S。
在另一个方面，本申请提供了制备所述的抗体、其抗原结合片段或变体的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗体、其抗原结合片段或变体表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
在某些情形中，所述方法还可包括分离和/或纯化所述抗体或其抗原结合片段的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述的抗体或其抗原结合片段。例如，还可以使用Protein A亲和纯化。
免疫缀合物、药物组合物、应用
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
例如，所述的免疫缀合物可以包含选自下组的至少一种其他试剂：化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂。在某些实施方式中，所述的免疫缀合物中所述抗体、其抗原结合片段或变体与所述至少一种其他试剂可以通过连接分子相连。例如，所述的免疫缀合物中所述抗体、其抗原结合片段或变体及所述至少一种其他试剂可以分别与所述连接分子共价相连。
在本申请中，所述至少一种其他试剂可以包括美登素(maytansine)或其衍生物。例如，所述美登素衍生物可以包括美登素衍生物DM1。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述的免疫缀合物，或者所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述药物组合物可以用于抑制肿瘤(例如，AXL阳性肿瘤)生长。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以减小肿瘤大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
本申请所述的药物组合物可以包含治疗有效量的所述抗体或其抗原结合片段。所述治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的病症或病症(例如癌症)和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请提供了所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或者所述的免疫缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括AXL阳性肿瘤。例如，所述肿瘤可以包括选自下组的肿瘤：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。又例如，所述肿瘤可以包括选自下组的肿瘤：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或者所述的免疫缀合物，其用于预防或治疗肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括AXL阳性肿瘤。例如，所述肿瘤可以包括选自下组的肿瘤：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。又例如，所述肿瘤可以包括选自下组的肿瘤：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了一种预防或治疗有需要的受试者中的肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述的免疫缀合物，或者所述的药物组合物。
在本申请中，所述肿瘤可以包括AXL阳性肿瘤。例如，所述肿瘤可以包括选自下组的肿瘤：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。又例如，所述肿瘤可以包括选自下组的肿瘤：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了根据所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其用于诊断与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况。
在本申请中，所述与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况可以选自以下组：寨卡病毒感染、系统性红斑狼疮、血压升高、蛋白尿、甲状腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤(例如，急性粒细胞白血病)、乳腺癌(例如，ER阳性乳腺癌)、卵巢癌(例如，I型和II型上皮性卵巢癌)、淋巴瘤和骨髓瘤。或者，可以选自以下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了根据所述的抗体、其抗原结合片段或变体用于制备诊断剂的用途，其中所述诊断剂用于诊断与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况。
在本申请中，所述诊断剂可以单独使用或者可以与仪器、器具、设备或系统组合使用。在疾病的预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中，可以使用所述诊断剂对人体样本(例如，各种体液、细胞、组织样本等)进行体外检测。所述诊断剂可以选自以下组：试剂、试剂盒、校准品和质控品。
所述体外检测的方法可以选自以下组：Western Blot、ELISA和免疫组化法。例如，所述试剂可以包括能够测量所述AXL蛋白表达量的试剂。例如，所述试剂可以选自以下组：用以实施Western Blot的试剂、用以实施ELISA的试剂和用以实施免疫组化法的试剂。
在本申请中，所述与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况可以选自以下组：寨卡病毒感染、系统性红斑狼疮、血压升高、蛋白尿、甲状腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤(例如，急性粒细胞白血病)、乳腺癌(例如，ER阳性乳腺癌)、卵巢癌(例如，I型和II型上皮性卵巢癌)、淋巴瘤和骨髓瘤。或者，可以选自以下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了一种诊断受试者中与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况的方法，所述方法包括：使源自所述受试者的样品与所述的抗体、其抗原结合片段或变体接触，以及判断所述样品中能够特异性结合所述抗体、其抗原结合片段或变体的物质的存在和/或含量。
在本申请中，所述与AXL蛋白的表达相关的疾病或病况可以选自以下组：寨卡病毒感染、系统性红斑狼疮、血压升高、蛋白尿、甲状腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤(例如，急性粒细胞白血病)、乳腺癌(例如，ER阳性乳腺癌)、卵巢癌(例如，I型和II型上皮性卵巢癌)、淋巴瘤和骨髓瘤。或者，可以选自以下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的装置、方法和系统的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1杂交瘤技术制备单克隆抗体
用哺乳动物细胞——中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(
Figure GDA0003081979910000211
CCL-61TM)表达的人AXL蛋白(人AXL蛋白细胞外结构域-人IgG1 Fc融合蛋白，命名为AXL-Fc，其中人AXL的序列信息参考AAH32229.1，人IgG1 Fc片段的序列参考AEO21920.1，人AXL蛋白细胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；AXL-Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)常规免疫Balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。
在第0、14和28天，在弗氏完全佐剂(第一次注射)或弗氏不完全佐剂(第二和第三次注射)存在下，用100μg AXL-Fc对Balb/c小鼠进行皮下注射。使用常规的杂交瘤技术方案(Salhi等，Biochem.J.2004)，将来自于小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC)融合。将细胞在含有HAT培养基的板中培养(每个孔105个细胞)用于杂交瘤选择。在12天后，收获上清液，并通过直接酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选对AXL具备结合特异性的克隆(阳性克隆)。将阳性克隆通过有限稀释法获得亚克隆，筛选特异性结合活性最好的克隆，并将其命名为6G12。
将阳性克隆6G12所对应的杂交瘤细胞进行扩增用于抗体的大规模体外生产；收获上清液通过蛋白G亲和层析进行纯化，获得6G12抗体，以便进行后续的实验。
用常规分子生物学方法调取单克隆抗体细胞株中的抗体基因，经Kabat分析，6G12抗体的LCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，HCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
实施例2单克隆抗体识别抗原
将实施例1制备的AXL-Fc包被ELISA板条，1μg/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入10％的胎牛血清，37℃封闭1小时；加入不同浓度的6G12抗体，37℃反应1小时；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗(Goat Anti-mouse IgG HRP，Abcam，)，37℃反应30分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室温(20±5℃)避光放置1.5分钟；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析抗体与AXL-Fc的结合能力。
结果如图1所示，结果说明6G12抗体能特异性识别抗原AXL-Fc；该识别活性呈显著的剂量依赖性，EC50值为669.3ng/mL。
实施例3嵌合抗体制备
将获得的6G12抗体的可变区基因克隆入含有人IgG1恒定区基因的真核表达载体pCMV-163中，构建抗体表达载体，该表达载体的物理图谱如图2所示(真核表达载体pCMV-163的各个组成成分均为本领域已知的成分，按照所示次序重组而成)。该嵌合抗体称为C6G12(Chimeric 6G12)抗体。将上述的抗体表达载体，用ExpiCHOTM Expression System试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，转染至CHO-S细胞中进行表达，收集含有目的蛋白(C6G12抗体)的细胞培养上清，经过ELISA试验利用羊抗人IgG(Affinity PurifiedAntibody To Human IgG(H+L)，KPL)以及辣根酶标记的羊抗人IgG(GOAT Anti human(HRP)，Thermo Fisher Scientific)进行双夹心ELISA法检测上清中C6G12抗体的含量(以未转染上清作为阴性对照，人IgG纯品作为标准品)，收集足够上清，再利用常规的ProteinA亲和纯化C6G12抗体。
C6G12抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，编码其的核苷酸序列如SEQID NO:14所示；C6G12抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
实施例4嵌合抗体亲和力测定
采用BIACORE生物大分子相互作用仪(GE公司)分析抗体亲和力。在芯片上偶联抗人IgG-Fc抗体(购自Abcam)，利用抗人IgG抗体捕获C6G12抗体，抗体浓度定为0.5μg/mL，进样时间为60秒；以AXL(北京义翘神州生物技术有限公司，6×His标签，分子量为65Kda)为流动相，使用6个浓度梯度(1、0.4、0.16、0.064、0.0256、0.01024μg/mL)，结合时间为180秒；解离时间为1200秒。C6G12抗体亲和力的结果如表1所示。
表1C6G12抗体的亲和力测定
抗体 结合常数(1/Ms) 解离常数(1/s) 解离平衡常数(M)
C6G12 2.614×10<sup>6</sup> 4.023×10<sup>-4</sup> 1.539×10<sup>-10</sup>
实施例5嵌合抗体结合抗原
将实施例1制备的AXL-Fc包被ELISA板条，1μg/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入10％的胎牛血清，37℃封闭1小时；加入不同浓度的实施例3制备的C6G12抗体，37℃反应1小时；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人Fab二抗(Goat Anti-human IgG(Fab')2(HRP)，Abcam)，37℃反应30分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室温(20±5℃)避光放置1.5分钟；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析C6G12抗体与AXL-Fc结合能力。
结果如图3所示，结果表明C6G12抗体能识别AXL-Fc；该识别活性呈显著的剂量依赖性，EC50值为19.4ng/mL。
实施例6嵌合抗体特异性识别抗原
将牛奶(北京博迈德生物技术有限公司)、BSA(BOVOGEN)、CD19(北京义翘神州生物技术有限公司)、TROP2(北京义翘神州生物技术有限公司)、BCMA(ACRO Biosystems)、CD47(北京麦格珀尔生物科技有限公司)、CD38(北京义翘神州生物技术有限公司)、Gas6(R&D)等各蛋白以及AXL(ACRO Biosystems)分别包被ELISA板条，1μg/ml，4℃过夜；PBST洗涤后，加入10％的胎牛血清，37℃封闭1小时；加入实施例3制备的C6G12抗体，37℃反应1小时；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗(GOAT Anti human(HRP)，ThermoFisher Scientific，#31412)，室温反应30分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸上尽量拍干残留液滴；每孔加入100μl TMB(eBioscience，#85-00-420)，室温(20±5℃)避光放置1.5分钟；每孔加入100μl 2N H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，分析抗体与蛋白结合能力。
结果如图4所示。结果显示，C6G12抗体能特异性识别靶抗原AXL，但与牛奶、CD19、TROP2、BCMA、BSA、CD47、CD38、Gas6等蛋白均无显著的结合反应。
实施例7嵌合抗体特异性识别细胞表面抗原
利用流式分析技术检测人非小细胞肺癌A549细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞等多株肿瘤细胞(ATCC)表面AXL与C6G12抗体的结合。收集对数生长期细胞，调整细胞密度到5×106个/mL，冰上预冷。含2％FBS预冷的生理盐水稀释C6G12抗体至20μg/ml。取100μl细胞，加入等体积前述稀释C6G12抗体，4℃避光反应30min。结束后，用含2％FBS预冷的生理盐水洗两次(6000rpm，45s)。用含2％FBS预冷的生理盐水按1∶5稀释二抗PE Mouse Anti-Human IgG(BD Pharmingen)，取100μL重悬细胞，4℃避光反应30min。反应结束后，用含2％FBS预冷的生理盐水洗两次(6000rpm，45s)。用400μl 1％多聚甲醛重悬细胞。流式细胞仪(BD Calibur)分析抗体与细胞表面抗原的结合能力。
结果如图5A-5B所示。结果显示，C6G12抗体能特异性识别人非小细胞肺癌A549细胞、人皮肤鳞癌A431细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞、红白血病K562细胞、急性T细胞白血病Jurkat细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MDA-MB-468细胞、人乳腺癌SKBR3细胞、人卵巢癌SKOV3细胞、淋巴瘤U-937细胞、淋巴瘤Raji细胞、人骨髓瘤U266细胞和人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的表面AXL。
实施例8嵌合抗体的内化活性
利用流式分析技术检测C6G12抗体在人非小细胞肺癌A549细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞上的内化效率。收集对数生长期细胞，调整细胞密度到5×106个/mL，冰上预冷。含2％FBS预冷的生理盐水稀释C6G12抗体至不同浓度。取100μl细胞，加入等体积前述稀释C6G12抗体，4℃孵育30分钟。结束后，用含2％FBS预冷的生理盐水洗涤细胞三次。将细胞继续放置于4℃或37℃培养2小时后洗涤细胞两次。用含2％FBS预冷的生理盐水按1∶5稀释二抗PE Mouse Anti-Human IgG(BDPharmingen)，取100μL重悬细胞，4℃避光反应30分钟。反应结束后，洗涤细胞三次。用400μl1％多聚甲醛重悬细胞。流式细胞仪(BD Calibur)分析抗体在不同温度下培养细胞表面的荧光强度，并按照以下公式计算出抗体的内化效率。
内化效率＝(4℃表面总MFI-37℃表面总MFI)/4℃表面总MFI×100％。
结果如图6所示。结果显示，C6G12抗体在人非小细胞肺癌A549细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞上可以有效的内化，EC50分别为0.61ng/mL、1.5ng/mL、0.89ng/mL、1.3ng/mL。可见C6G12抗体具备良好的内化活性。
实施例9免疫缀合物抑制肿瘤细胞的增殖
以MMC作为本申请所述免疫缀合物中的所述连接分子；并且以DM1作为本申请所述免疫缀合物中的所述其他试剂，构建免疫缀合物C6G12-MMC-DM1。评价免疫缀合物C6G12-MMC-DM1的生物学活性，从而进一步分析C6G12抗体构建抗体小分子偶联药物(ADC)等免疫缀合物的潜力。
在96孔培养板中接种一定数量的对数生长期细胞(人非小细胞肺癌A549细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞、红白血病K562细胞)，贴壁生长24小时后，加入不同浓度的药物作用72小时。药物作用结束后，将CCK-8(Dojindo，日本同仁化学研究所)以每孔10μl加至培养板，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3-5小时。酶标仪450nm波长下测定OD值，并且根据以下的公式计算细胞生长抑制率：
抑制率＝(OD值对照孔－OD值给药孔)/OD值对照孔×100％
根据各浓度抑制率，再计算半数抑制浓度IC50。
结果如图7所示。结果显示，C6G12抗体偶联美登素衍生物DM1(C6G12-MCC-DM1)后对多株肿瘤细胞(肺癌A549、肾癌786-O、乳腺癌MDA-MB-231、胰腺癌MIA PaCa-2、红白血病K562)显示出显著的增殖抑制作用，IC50分别为52.27nM、3.74nM、4.35nM、18.1nM和39.36nM。利用T-DM1(KadcylaTM)测定，以上细胞的IC50分别为340.9nM、447.6nM、26.72nM、29.23nM和73.97nM。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州尚健生物技术有限公司；尚健单抗（北京）生物技术有限公司
<120> 结合AXL蛋白的抗体及其应用
<130> 0070-PA-003
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 894
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人AXL蛋白
<400> 1
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala
20 25 30
Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg
35 40 45
Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro
50 55 60
Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp
65 70 75 80
Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp
85 90 95
Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr
100 105 110
Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser
115 120 125
Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu
130 135 140
Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys
145 150 155 160
Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp
165 170 175
Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu
180 185 190
His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His
195 200 205
Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu
210 215 220
Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu
225 230 235 240
Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr
245 250 255
His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln
260 265 270
Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser
275 280 285
Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro
290 295 300
Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp
305 310 315 320
Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro
325 330 335
Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His
340 345 350
Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg
355 360 365
Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly
370 375 380
Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser
385 390 395 400
Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro
405 410 415
Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln
420 425 430
Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp
435 440 445
Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val
450 455 460
Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg
465 470 475 480
Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val
485 490 495
Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr
500 505 510
Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp
515 520 525
Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu
530 535 540
Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser
545 550 555 560
Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg
565 570 575
Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe
580 585 590
Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser
595 600 605
Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys
610 615 620
His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln
625 630 635 640
Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile
645 650 655
Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp
660 665 670
Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val
675 680 685
Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg
690 695 700
Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser
705 710 715 720
Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly
725 730 735
Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly
740 745 750
Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Arg Gly Asn Arg Leu
755 760 765
Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg
770 775 780
Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg
785 790 795 800
Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro
805 810 815
Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu
820 825 830
Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro
835 840 845
Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly
850 855 860
Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala
865 870 875 880
Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala
885 890
<210> 2
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人AXL蛋白细胞外结构域
<400> 2
Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln
20 25 30
Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly
35 40 45
Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly
50 55 60
Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr
65 70 75 80
Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu
85 90 95
Gly His Gln Thr Phe Val Ser Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly
100 105 110
Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn
115 120 125
Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val
130 135 140
Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly
145 150 155 160
His Gly Pro Gln Arg Ser Leu His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser
165 170 175
Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg
180 185 190
Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu
195 200 205
Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu
210 215 220
Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser
225 230 235 240
Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu
245 250 255
Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly
260 265 270
Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser
275 280 285
Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro
290 295 300
Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn
305 310 315 320
Gly Ser Gln Ala Phe Val His Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln
325 330 335
Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro
340 345 350
Glu Val Leu Met Asp Ile Gly Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu
355 360 365
Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr
370 375 380
Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala
385 390 395 400
Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro
405 410 415
Ser
<210> 3
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AXL-Fc
<400> 3
Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln
20 25 30
Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly
35 40 45
Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly
50 55 60
Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr
65 70 75 80
Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu
85 90 95
Gly His Gln Thr Phe Val Ser Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly
100 105 110
Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn
115 120 125
Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val
130 135 140
Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly
145 150 155 160
His Gly Pro Gln Arg Ser Leu His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser
165 170 175
Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg
180 185 190
Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu
195 200 205
Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu
210 215 220
Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser
225 230 235 240
Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu
245 250 255
Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly
260 265 270
Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser
275 280 285
Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro
290 295 300
Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn
305 310 315 320
Gly Ser Gln Ala Phe Val His Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln
325 330 335
Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro
340 345 350
Glu Val Leu Met Asp Ile Gly Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu
355 360 365
Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr
370 375 380
Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala
385 390 395 400
Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro
405 410 415
Ser Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
420 425 430
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
435 440 445
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
450 455 460
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
465 470 475 480
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
485 490 495
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
500 505 510
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
515 520 525
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
530 535 540
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
545 550 555 560
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
565 570 575
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
580 585 590
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
595 600 605
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
610 615 620
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
625 630 635 640
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
<400> 4
Arg Ser Ser Arg Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Phe Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR2
<400> 5
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3
<400> 6
Gly Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1
<400> 7
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2
<400> 8
Tyr Arg Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3
<400> 9
Gly Trp Leu Leu His Tyr Thr Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL
<400> 10
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Asn Ala Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Phe Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH
<400> 11
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Phe Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Arg Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Leu Leu His Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C6G12 轻链氨基酸序列
<400> 12
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Asn Ala Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Phe Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 13
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C6G12 重链氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Phe Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Arg Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Leu Leu His Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 14
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C6G12 轻链核苷酸序列
<400> 14
gagctcgtga tgacacagtc tccattctcc aatgcagtca ctcttggaac atcagcttcc 60
atctcctgca ggtctagtag gagtctccta catagtaatg gcttcactta tttgtattgg 120
tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgcc 180
tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgtg gtcaaaatct agagcttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
<210> 15
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C6G12 重链核苷酸序列
<400> 15
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgttctg tcactggctt ctccatcagc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120
tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacagaagct acgacggttc caataactac 180
aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac aactgaggac acagctacat attactgtgc aagaggatgg 300
ttactgcatt atactatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagct 360
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1350

Claims (39)

1.抗体或其抗原结合片段，其能够结合AXL蛋白，所述抗体包含抗体轻链或其片段，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO :5所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，且所述抗体包含抗体重链或其片段，所述抗体重链或其片段包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO :8所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO :9所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述AXL蛋白为人AXL蛋白。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述AXL蛋白包含细胞外结构域。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞外结构域如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其具备选自下组的一种或多种性质：
1）能够以1×10-8M或更低的KD值结合AXL蛋白；
2）能够特异性识别在细胞表面表达的AXL蛋白；
3）结合在细胞表面表达的AXL蛋白后能够介导内化。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞包括肿瘤细胞。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤为AXL阳性肿瘤。
8.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述肿瘤选自下组：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
9.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞包括人的细胞。
10.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞包括选自下组的细胞：人非小细胞肺癌A549细胞、人皮肤鳞癌A431细胞、肾透明细胞腺癌786-O细胞、人胰腺癌MIA PaCa-2细胞、红白血病K562细胞、急性T细胞白血病Jurkat细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞、人乳腺癌MDA-MB-468细胞、人乳腺癌SKBR3细胞、人卵巢癌SKOV3细胞、淋巴瘤U-937细胞、淋巴瘤Raji细胞、人骨髓瘤U266细胞和人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、人源化抗体和全人源抗体。
12.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2和Fv片段。
13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO :10所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人恒定区包括人Igκ恒定区。
16.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体轻链或其片段包含如SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO :11所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链或其片段还包含人恒定区。
19.根据权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段，所述人恒定区包括人IgG恒定区。
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG恒定区包含人IgG1恒定区。
21.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体重链包含如SEQ IDNO :13所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，且所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
23.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
24.一种或多种载体，其包含权利要求23所述的核酸分子。
25.细胞，其包含权利要求23所述的核酸分子或权利要求24所述的载体。
26.制备权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在使得所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求25所述的细胞。
27.免疫缀合物，其包含权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
28.根据权利要求27所述的免疫缀合物，其还包含选自下组的至少一种其他试剂：化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂。
29.根据权利要求28所述的免疫缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述至少一种其他试剂通过连接分子相连。
30.根据权利要求28所述的免疫缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段及所述至少一种其他试剂分别与所述连接分子共价相连。
31.根据权利要求28所述的免疫缀合物，其中所述至少一种其他试剂包括美登素或其衍生物。
32.根据权利要求31所述的免疫缀合物，其中所述美登素衍生物包括美登素衍生物DM1。
33.药物组合物，其包含权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求27-32中任一项所述的免疫缀合物，或者权利要求25所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
34.权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或者权利要求27-32中任一项所述的免疫缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肿瘤。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述肿瘤包括AXL阳性肿瘤。
36.根据权利要求34所述的用途，其中所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：肺癌、皮肤癌、肾癌、胰腺癌、血液肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述肿瘤包括选自下组的肿瘤：非小细胞肺癌、皮肤鳞癌、肾透明细胞腺癌、胰腺癌、红白血病、急性T细胞白血病、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
38.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于检测AXL蛋白的表达量。
39.试剂盒，其包含权利要求1-22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体用于检测AXL蛋白的表达量。
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