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CN110540577A - 一种具有降血压作用的鸭源多肽及其应用 - Google Patents

一种具有降血压作用的鸭源多肽及其应用 Download PDF

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CN110540577A CN201910863613.0A CN201910863613A CN110540577A CN 110540577 A CN110540577 A CN 110540577A CN 201910863613 A CN201910863613 A CN 201910863613A CN 110540577 A CN110540577 A CN 110540577A
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张玉
王君虹
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Abstract

本发明提供了一种具有降血压作用的鸭源多肽及其应用，属于生物技术领域。具有降血压作用的鸭源多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。所述多肽具有较强的ACE酶抑制活性，因此，可以作为ACE抑制剂在抑制血管紧张素转换酶活性中的应用，同时基于ACE酶参与多种疾病的发生和发展，因此，所述鸭源多肽在制备治疗高血压、心血管疾病、心力衰竭或肾衰竭的药物中的应用。

Description

一种具有降血压作用的鸭源多肽及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有降血压作用的鸭源多肽及其应用。
背景技术
血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE,EC3.4.15.1，文献中曾用名有kininaseIl,dipeptidyl carboxypeptidase I等)是一种二羧肽酶，是导致高血压的一个关键酶，它通过水解作用把血管紧张肽Ⅰ转化成血管紧张肽Ⅱ。与此同时，ACE还可钝化血管舒缓激肽，这两种作用均可导致血管收缩，从而引起高血压。因此ACE被认为是引起高血压的一个重要因素。经研究发现血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，可通过抑制ACE的活性而达到降血压的作用。ACE抑制剂广泛用于治疗心血管、高血压、心力衰竭、肾衰竭等疾病。常见降血压的药物有利尿剂、片受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、a-受体阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等，这些药物对降血压的效果参差不齐。
ACE抑制剂最初是从蛇毒中发现的，随后人们发现从食物原料中提取的ACE抑制肽，如明胶、酪蛋白、鱼、无花果树胶、α-玉米蛋白等都可作为制备ACE抑制肽的原料。不同的肽段序列中蕴含的潜在特定目标活性肽不同、在同一种酶或不同种酶的作用下所得到的肽序列不同。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有ACE抑制活性的鸭源多肽及其应用。
本发明提供了一种具有降血压作用的鸭源多肽，所述鸭源多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种血管紧张素转换酶抑制剂，包括所述鸭源多肽。
本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在抑制血管紧张素转换酶活性中的应用。
优选的，所述鸭源多肽的浓度≥1.0mg/mL。
优选的，所述鸭源多肽的浓度为2.0～3.0mg/mL。
本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗高血压的药物中的应用。
本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在降血压的保健品中的应用。
本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗心血管疾病、心力衰竭疾病或肾衰竭疾病的药物中的应用。
本发明提供了一种具有降血压作用的鸭源多肽，所述鸭源多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。该多肽为12肽序列，针对ACE靶标具有抑制活性。由ACE抑制活性实验结果可知，在1.0mg/mL时的ACE抑制活性为78.16％，在2.0mg/mL时的ACE抑制活性为86.13％，说明本发明提供的多肽具有较强的ACE酶抑制活性，该多肽为首次报道，属于新的具ACE抑制活性功能肽，为后续研究由ACE酶参与的疾病提供新的治疗手段。
具体实施方式
本发明提供了一种具有降血压作用的鸭源多肽，所述鸭源多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示(Gln-Arg-Thr-Tyr-Ala-Ser-Thr-Lys-Glu-Ala-His-Pro)。所述多肽来源于中国鸭(NCBI Reference Sequence:NP_001297320.1，Molecular cloning oftheperilipin gene and its association with carcass and fattraits in Chineseducks.Genet.Mol.Res.2013,12(2),1582-1592)蛋白，表达该蛋白的基因与鸭肉品质具有相关性。通过计算机辅助虚拟酶解技术，获得了在胃蛋白酶(pH≦1.3)的作用条件下，所得ACE抑制肽。实验证明，所述鸭源多肽具有较强的血管紧张素转换酶抑制活性，血管紧张素转换酶导致高血压的一个关键酶，通过水解作用把血管紧张肽Ⅰ转化成血管紧张肽Ⅱ，与此同时，ACE还可钝化血管舒缓激肽，这两种作用均可导致血管收缩，从而引起高血压，所述鸭源多肽通过抑制ACE活性从而具有降血压的作用。本发明对所述鸭源多肽的来源没有特殊限制，采用本领域常见的多肽合成方法即可。本发明实施例中，所述鸭源多肽委托吉尔生化(上海)有限公司合成。
本发明提供了一种血管紧张素转换酶抑制剂，包括所述鸭源多肽。所述鸭源多肽的质量百分含量优选为80～90％。所述血管紧张素转换酶抑制剂优选还包括抑制剂领域可接受的辅料。本发明对所述血管紧张素转换酶抑制剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶抑制剂的制备方法即可。
基于所述鸭源多肽具有较强的ACE酶抑制活性，本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在抑制血管紧张素转换酶活性中的应用。在本发明中，所述鸭源多肽的浓度优选≥1.0mg/mL，更优选为2.0～3.0mg/mL。溶解鸭源多肽用溶剂优选为含0.3moL/L的NaCl，pH值为8.3的0.1moL/L的硼酸缓冲液。
由于ACE是导致高血压的一个关键酶，ACE的作用可导致血管收缩，从而引起高血压，同时基于所述鸭源多肽具有较强的ACE酶抑制活性，本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗高血压的药物中的应用。本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在降血压的保健品中的应用。
基于ACE抑制剂还广泛用于治疗心血管、心力衰竭、肾衰竭等疾病中，本发明提供了所述鸭源多肽或所述血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗心血管疾病、心力衰竭疾病或肾衰竭疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述鸭源多肽制备的药物的剂型优选为口服剂。在所述药物中，所述鸭源多肽的浓度为1.0～2.0mg/mL，更优选为2.0mg/mL。所述药物的服用方法优选为每次2g，每日2～3次。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有降血压作用的鸭源多肽及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
ACE抑制活性的检测方法
ACE在37℃，pH值为8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸(HA)，该物质在紫外225nm处具有特征吸收峰；当加入ACE抑制剂时ACE对HHL的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少，通过HPLC方法，测定加入抑制剂前后所生成马尿酸的量的变化即可算出抑制活性的大小。
反应体系为：依次分别加入20μL 0.1U/mL的ACE、50μL 1.0mg/mLACE抑制肽溶液在37℃温浴5min，然后加入10μL 5mM的HHL底物启动ACE的催化反应，在37℃振荡水浴30min后加入250μL 1.0moL/L的HCl终止反应。体系溶液过0.45μm滤膜后进行RP-HPLC检测分析马尿酸(HA)的含量。上述同样条件，以50μL 0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)代替ACE抑制剂作为空白反应体系。上述ACE、HHL底物均是以0.1moL/L的硼酸缓冲液(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)为溶剂。ACE抑制肽(KDTISTP)溶解在0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)中得到ACE抑制肽溶液。
HPLC色谱条件：溶剂Ⅰ为0.05％三氟乙酸(TFA)和0.05％的三乙胺(TTA)溶于去离子水中(即每升溶剂Ⅰ中含有0.5mL的三氟乙酸和0.5mL的三乙胺)，溶剂Ⅱ为100％的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70％：30％(体积比)，ultimate3000戴安液相色谱仪，色谱柱为waters Symmetry C185μm4.6×250mm，流速为0.5mL/min，进样量10μL，检测波长为225nm，检测柱温为30℃。
RP-HPLC检测：溶剂Ⅰ为0.05％(V/V)三氟乙酸(TFA)和0.05％(v/v)的三乙胺(TTA)溶于去离子水中，溶剂Ⅱ为100％的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70％：30％(体积比)，流速为0.5mL/min，检测波长为225nm，检测柱温为30℃。
ACE抑制活性根据下式计算：
I％＝(A-B)/A×100％
A：不加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
B：加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
ACE：1U单位定义为，在标准检测条件下，在37℃，1min时间内催化底物(Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine,HHL)，产生1μM马尿酸所消耗ACE的量。即为ACE的活性单位。
结果：肽KDTISTP在1.0mg/mL时的ACE抑制活性为78.16％。
实施例2
ACE抑制活性的检测方法
ACE在37℃，pH值为8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟物Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸(HA)，该物质在紫外225nm处具有特征吸收峰；当加入ACE抑制剂时ACE对HHL的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少，通过HPLC方法，测定加入抑制剂前后所生成马尿酸的量的变化即可算出抑制活性的大小。
反应体系为：依次分别加入20μL 0.1U/mL的ACE、50μL 2.0mg/mLACE抑制肽溶液在37℃温浴5min，然后加入10μL 5mM的HHL底物启动ACE的催化反应，在37℃振荡水浴30min后加入250μL 1.0moL/L的HCl终止反应。体系溶液过0.45μm滤膜后进行RP-HPLC检测分析马尿酸(HA)的含量。上述同样条件，以50μL 0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)代替ACE抑制剂作为空白反应体系。上述ACE、HHL底物均是以0.1moL/L的硼酸缓冲液(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)为溶剂。ACE抑制肽(KDTISTP)溶解在0.1moL/L的硼酸缓冲液中(含0.3moL/L的NaCl，pH＝8.3)中得到ACE抑制肽溶液。
HPLC色谱条件：溶剂Ⅰ为0.05％三氟乙酸(TFA)和0.05％的三乙胺(TTA)溶于去离子水中(即每升溶剂Ⅰ中含有0.5mL的三氟乙酸和0.5mL的三乙胺)，溶剂Ⅱ为100％的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70％：30％(体积比)，ultimate3000戴安液相色谱仪，色谱柱为waters Symmetry C185μm4.6×250mm，流速为0.5mL/min，进样量10μL，检测波长为225nm，检测柱温为30℃。
RP-HPLC检测：溶剂Ⅰ为0.05％(V/V)三氟乙酸(TFA)和0.05％(v/v)的三乙胺(TTA)溶于去离子水中，溶剂Ⅱ为100％的色谱纯乙睛。溶剂Ⅰ与溶剂Ⅱ的比例为70％：30％(体积比)，流速为0.5mL/min，检测波长为225nm，检测柱温为30℃。
ACE抑制活性根据下式计算：
I％＝(A-B)/A×100％
A：不加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
B：加入短肽抑制剂时的马尿酸的峰面积；
ACE：1U单位定义为，在标准检测条件下，在37℃，1min时间内催化底物(Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine,HHL)，产生1μM马尿酸所消耗ACE的量。即为ACE的活性单位。
结果：肽KDTISTP在1.0mg/mL时的ACE抑制活性为86.13％。
由上述实施例可知，本发明提供的鸭源多肽序列的活性与浓度存在量效关系，所述多肽具有ACE抑制活性未见报道，属于新的具ACE抑制活性功能肽。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种具有降血压作用的鸭源多肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Arg Thr Tyr Ala Ser Thr Lys Glu Ala His Pro
1 5 10

Claims (8)

1.一种具有降血压作用的鸭源多肽，其特征在于，所述鸭源多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.一种血管紧张素转换酶抑制剂，其特征在于，包括权利要求1所述鸭源多肽。
3.权利要求1所述鸭源多肽或权利要求2所述血管紧张素转换酶抑制剂在抑制血管紧张素转换酶活性中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述鸭源多肽的浓度≥1.0mg/mL。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述鸭源多肽的浓度为2.0～3.0mg/mL。
6.权利要求1所述鸭源多肽或权利要求2所述血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗高血压的药物中的应用。
7.权利要求1所述鸭源多肽或权利要求2所述血管紧张素转换酶抑制剂在降血压的保健品中的应用。
8.权利要求1所述鸭源多肽或权利要求2所述血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗心血管疾病、心力衰竭疾病或肾衰竭疾病的药物中的应用。
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