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CN110507598A - 乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用及用其制成的护肤品 - Google Patents

乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用及用其制成的护肤品 Download PDF

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CN110507598A
CN110507598A CN201910853475.8A CN201910853475A CN110507598A CN 110507598 A CN110507598 A CN 110507598A CN 201910853475 A CN201910853475 A CN 201910853475A CN 110507598 A CN110507598 A CN 110507598A
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fermentation liquid
parts
supernatant
tmc3115
lactic acid
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CN201910853475.8A
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贾晓蒙
赵永娇
路江浩
孙新凯
鄢梦洁
刘明月
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HEBEI INATURAL BIOTECH CO Ltd
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Abstract

乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用及用其制成的护肤品，属于乳酸菌的的技术领域，本发明提供了可有效应用于抑制痤疮丙酸杆菌的乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物，并提供了用乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物制成的祛痘面膜、祛痘霜和护肤精华液，该乳酸菌和/或乳酸菌衍生物在抑制痤疮丙酸杆菌的同时可保护原有的皮肤屏障。LP45、TMC3115和LR863的发酵液、上清液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著；LR519的发酵液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著；BAL531的上清液和菌体对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著，可进一步加工后用于护肤产品；LR863的死菌具有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度降低而变差，可根据需要直接选取合适浓度用于面膜等护肤品。

Description

乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用及用其制成的护肤品
技术领域
本发明属于乳酸菌的技术领域，涉及乳酸菌抑制细菌的应用，具体涉及乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用及用其制成的护肤品。
背景技术
痤疮是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，发病率70％-87％，好发于青春期，临床表现主要以颜面部及胸背部黑头、白头粉刺，炎症性丘疹、脓疱为主。雄激素作用下的皮脂腺快速发育和脂质大量分泌是痤疮发生的病理生理基础；毛囊皮脂腺导管异常角化是痤疮发生另一重要因素和主要病理现象，上皮细胞角化使毛囊皮脂腺导管堵塞、皮脂排出障碍，最终形成显微镜下可见的微粉刺及临床肉眼可见的粉刺，而微粉刺及粉刺的形成为具有厌氧生长特性的痤疮丙酸杆菌增殖创造了良好的局部环境。痤疮发生恰恰与痤疮丙酸杆菌密切相关，目前认为，痤疮丙酸杆菌可能通过天然免疫、获得性免疫及直接诱导参与了痤疮炎症的发生发展。痤疮早期炎症可能是Toll样受(TLR)介导的天然免疫反应所致，诱导促炎症因子尤其是IL-1α释放；随着疾病发展，获得性免疫反应放大了炎症过程，进一步导致炎症因子释放及中性粒细胞聚集；痤疮丙酸杆菌还可产生多肽类物质，直接诱发或加重炎症。在疾病后期，毛囊壁断裂，毛囊中的脂质、毛发等物质进入真皮，进一步加重了炎症反应。
部分痤疮患者皮肤屏障受损，且长期口服或外用抗痤疮药物如维A酸，往往会加重皮肤屏障的破坏，导致皮肤敏感。因此，如何有效抑制痤疮丙酸杆菌，同时保护原有的皮肤屏障是目前我们研发的重点。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了可有效应用于抑制痤疮丙酸杆菌的乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物，并提供了用乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物制成的护肤品，该乳酸菌和/或乳酸菌衍生物在抑制痤疮丙酸杆菌的同时可保护原有的皮肤屏障。
本发明为实现其目的采用的技术方案是：乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，关键在于，所述乳酸菌为乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物；
乳酸菌菌体包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP45，CGMCC No.8072，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La28，CGMCC No.11506，乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)BAL531，CGMCC No.17329，两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)TMC3115，CGMCC No.8462，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)LR519，CGMCC No.15969，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR863，CGMCC No.14410中的一种或两种以上；
所述乳酸菌衍生物包括上述LP45的发酵液、LP45的灭活发酵液、LP45的上清液、LP45的灭活上清液、LP45的溶胞产物、La28的发酵液、La28的灭活发酵液、La28的上清液、La28的灭活上清液、BAL531的发酵液、BAL531的上清液、BAL531的灭活上清液、BAL531的溶胞产物、TMC3115的发酵液、TMC3115的灭活发酵液、TMC3115的上清液、TMC3115的灭活上清液、TMC3115的溶胞产物、LR519的发酵液、LR519的灭活发酵液、LR519的上清液、LR519的溶胞产物、LR863的发酵液、LR863的灭活发酵液、LR863的上清液、LR863的灭活上清液、LR863的溶胞产物或LR863的死菌中的一种或两种以上。
如上述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，所述LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液由如下步骤制备：LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519或LR863由液体培养基培养到对数期后与20％-30％的甘油等比混合均匀，于-60℃～-80℃冻存得种子液；
取种子液按2％-10％的接种量接种到10ml液体培养基，震荡混匀，30℃-40℃培养24h-48h，依次连续活化三代，再按2％-10％的接种量接种到250ml液体培养基中扩大培养，即得LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液；
上述BAL531的发酵液或TMC3115的发酵液的制备为厌氧条件；
LP45的发酵液、La28的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液在110-130℃加热10-20min，即得LP45的灭活发酵液、La28的灭活发酵液、TMC3115的灭活发酵液、LR519的灭活发酵液或LR863的灭活发酵液。
如上述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，所述LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液7000-9000r/min离心10-15min后，收集上清液，即得LP45的上清液、La28的上清液、BAL531的上清液、TMC3115的上清液、LR519的上清液或LR863的上清液；
LP45的上清液、La28的上清液、BAL531的上清液、TMC3115的上清液或LR863的上清液在110-130℃加热10-20min，即得LP45的灭活上清液、La28的灭活上清液、TMC3115的灭活上清液或LR863的灭活上清液；
所述LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液离心所得菌泥以0.9％氯化钠溶液充分重悬后，重复7000-9000r/min离心10-15min三次，即得LP45的菌体、La28的菌体、BAL531的菌体、TMC3115的菌体、LR519的菌体或LR863的菌体；
所述LR863的发酵液以60-80℃灭菌2-4h经7000-9000r/min离心乳化10-15min后冷冻干燥，即得LR863的死菌。
如上述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，所述LP45的菌体、BAL531的菌体、TMC3115的菌体、LR519的菌体或LR863的菌体与保护剂按照1:2混合并搅拌均匀后巴氏灭菌，即得LP45的溶胞产物、BAL531的溶胞产物、TMC3115的溶胞产物、LR519的溶胞产物或LR863的溶胞产物。
如上述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，进一步地，按质量份数计，所述保护剂包括10-15份脱脂乳，2-6份海藻糖，1.5-2份维生素C，1-3份谷氨酸钠，60-80份蒸馏水。
如上述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，进一步地，按质量份数计，所述液体培养基包括10-20份葡萄糖，5-10份蛋白胨，2-5份乙酸钠和65-83份蒸馏水。
如上述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，进一步地，按质量份数计，所述液体培养基包括10-20份葡萄糖，5-10份蛋白胨，2-6.5份牛肉粉，1-5份酵母浸粉，2-5份乙酸钠，0.5-2份柠檬酸氢二铵，0.8-2份磷酸氢二钾，0.32-0.58份MgSO4·7H2O，0.25-1份MnSO4·H2O，0.1-0.5份半胱氨酸盐酸盐，0.01-0.1份吐温80，800-1000份蒸馏水。
一种利用上述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用制成的祛痘面膜，祛痘面膜由面膜精华液和面膜材料组成，按质量份数计，面膜精华液包括0.3份-0.6份乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物，10-13份甘油，0.04-0.08份透明质酸钠和86.32-89.45份蒸馏水，面膜材料包括无纺布、蚕丝、生物纤维或天丝纤维中的一种或两种以上。
一种利用上述益生菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用制成的祛痘霜，按质量份数计，祛痘霜包括0.4-0.7份益生菌菌体和/或益生菌衍生物，4.8-5.5份凡士林，3.3-3.84份十八醇，1.44-2.5份单甘脂，2.72-2.98份石腊油，0.31-0.54份十二烷基硫酸钠，2.4-3.53份甘油，81.68-83份蒸馏水。
一种利用上述益生菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用制成的护肤精华液，按质量份数计，护肤精华液包括9-12份益生菌菌体和/或益生菌衍生物，10-13.4份甘油，0.05-0.09份透明质酸钠，0.04-0.06份烟酰胺，1-2份甘油三酯，0.05-0.08份EDTA二钠。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP45，商业编号植物乳杆菌LP45，保藏编号为YMC1005，保藏号是CGMCC No.8072，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2013年8月26日。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La28，保藏号是CGMCC No.11506，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2015年10月15日。
乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)BAL531，保藏号是CGMCCNo.17329，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2019年3月13日。
两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)TMC3115，保藏号是CGMCC No.8462，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2013年11月11日。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR519，保藏号是CGMCC No.15969，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2018年6月20日。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)LR863，保藏号是CGMCC No.14410，保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2017年7月12日。
本发明的有益效果是：乳酸菌和/或乳酸菌衍生物可作为一种温和抑菌剂在抑制痤疮丙酸杆菌的同时保护原有的皮肤屏障。
LP45、TMC3115和LR863的发酵液、上清液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著；
并且LR519的发酵液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著；
以及BAL531的上清液和菌体对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著，可进一步加工后用于护肤产品；
同样的LR863的死菌具有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度降低而变差，可根据需要直接选取合适浓度用于面膜等护肤品。
附图说明
图1是实施例1乳酸菌发酵液抑菌效果图。
图2是实施例1乳酸菌灭活发酵液抑菌效果图。
图3是实施例1乳酸菌上清液抑菌效果图。
图4是实施例1乳酸菌灭活上清液抑菌效果图。
图5是实施例1乳酸菌菌体抑菌效果图。
图6是实施例1乳酸菌灭活菌体抑菌效果图。
图7是实施例1乳酸菌溶胞产物抑菌效果图。
图8是实施例1乳酸菌死菌抑菌效果图。
A1-F1依次为LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的发酵液抑菌效果图；A11—F11依次为LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的灭活发酵液抑菌效果图；A2—F2依次为LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的上清液抑菌效果图；A22—F22依次为LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的灭活上清液抑菌效果图；A3—F3依次为LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的菌体抑菌效果图；A33—F33依次为LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的灭活菌体抑菌效果图；A4、C4-F4依次为LP45、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的溶胞产物抑菌效果图；E、F分别为LR519、LR863的死菌抑菌效果图，其中1x109CFU/ml、5x109CFU/ml表示死菌的浓度；图中“1”表示原液，“10”表示10倍稀释液，“100”表示100倍稀释液，“+”表示阳性对照，“-”表示阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的说明。
一、筛选
实施例1
1.1备料
痤疮丙酸杆菌：购买自北纳生物，编号BNCC336649。
保护剂：按质量分数计，包括脱脂乳15g，海藻糖4g，维生素C 1g，谷氨酸钠1.5g，纯水78.5g。
改良MRS液体培养基：包括葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉粉6.5g，酵母浸粉5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，MgSO4·7H2O0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，吐温80 1ml，蒸馏水1000mL。
硫乙醇酸盐培养基：包括酪胨15.0g,酵母浸出粉5.0g，葡萄糖5.0g，硫乙醇酸钠0.5g，L-胱氨酸0.5g，刃天青0.001g，氯化钠2.5g，琼脂0.75g，蒸馏水1000mL，培养基的pH值为6.8-7.3。
乳酸菌种子液：从酸奶或婴儿肠道中分离纯化得到原始菌种(植物乳杆菌LP45，嗜酸乳杆菌La28，乳双歧杆菌BAL531，两歧双歧杆菌TMC3115，鼠李糖乳杆菌LR519，鼠李糖乳杆菌LR863)，原始菌种经改良MRS液体培养基培养到对数期后与30％的甘油等比混合均匀，于-80℃冻存即得种子液，乳酸菌种子液由河北一然生物科技有限公司菌种库提供。
还包括0.9％的氯化钠溶液、30μg/ml的盐酸四环素、34μg/ml的盐酸四环素。
(1)发酵液：取乳酸菌种子液按3％的接种量接种到10ml改良MRS液体培养基，震荡混匀，37℃培养24h，依次连续活化三代，再按3％的接种量接种到250ml改良MRS液体培养基中扩大培养，其中乳双歧杆菌BAL531、两歧双歧杆菌TMC3115须厌氧培养，其他培养步骤相同；
培养好的发酵液取100ml，即得发酵液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(2)灭活发酵液：发酵液121℃加热15min，得灭活发酵液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品；
(3)上清液：发酵液8000r/min离心10min收集上清液，即得上清液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(4)灭活上清液：上清液121℃加热15min，得灭活上清液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品；
(5)菌体：离心所得菌泥以0.9％氯化钠溶液充分重悬后离心，重复三次即得菌体原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(6)灭活菌体：菌体原液样品121℃加热15min，得灭活菌体原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品；
(7)溶胞产物：菌体与保护剂按照1:2混合并搅拌均匀后巴氏灭菌，即得溶胞产物样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品；
(8)死菌：发酵液以70℃灭菌3h经8000r/min离心乳化10min后冷冻干燥即得死菌样品，用0.9％的氯化钠溶液与死菌分别配制成5x108CFU/ml、1x109CFU/ml、5x109CFU/ml浓度的液体样品。
(9)痤疮丙酸杆菌的培养：取痤疮丙酸杆菌种子液按3％的接种量接种到10ml液体硫乙醇酸盐培养基，震荡混匀，37℃厌氧培养48h，依次连续活化三代后备用。
1.2处理
(1)含有2.0％素琼脂培养基冷至50℃左右，取10mL倾倒在无菌平皿中，洁净工作台中晾干；
(2)无菌镊子取灭菌牛津杯放在倒有素琼脂的平皿中，静置10min；
(3)将1mL痤疮丙酸杆菌加入到100mL冷却至50℃的液体硫乙醇酸盐培养基中并充分混匀；
(4)在放好牛津杯的平板上倾倒10mL上述液体硫乙醇酸盐培养基，待凝固后将牛津杯夹出，形成牛津杯孔；
(5)在各牛津杯孔中注入0.1mL各样品，于37℃静置厌氧培养48h。并且以0.9％的氯化钠溶液为阴性对照；发酵液、灭火发酵液、上清液和灭活上清液以30μg/ml盐酸四环素为阳性对照，菌体、灭活菌体、溶胞产物和死菌是以34μg/ml盐酸四环素为阳性对照，如图1-8是乳酸菌的抑菌效果图。
1.3后处理
表1
1.4分析
用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小，测量结果如表1，其中评价指标为：抑菌圈直径＝0，则不具备抑菌效果；抑菌圈直径＞0，则具备抑菌效果；0＜抑菌圈直径＜18，抑菌效果一般；18≤抑菌圈直径＜27mm，抑菌效果良好；抑菌圈直径≥27mm，抑菌效果显著；“--”表示未做试验。筛选结果如下：
(1)发酵液的牛津杯抑菌试验表明：LP45、TMC3115、LR519和LR863的抑菌圈直径大于30mm，抑菌效果显著，La28、BAL531的抑菌效果良好；经过灭活后LP45、La28、TMC3115、LR519和LR863只有原液具备抑菌效果，效果一般，BAL531的灭活发酵液不具备抑菌效果。
(2)上清液的牛津杯抑菌试验表明：LP45、BAL531、TMC3115和LR863的上清液抑菌圈直径约30mm，抑菌效果显著，La28的抑菌效果良好，上述五种菌株灭活后只有原液具备抑菌效果,效果一般；LR519只有原液具备抑菌效果，效果一般。
(3)菌体的牛津杯抑菌试验表明：LP45、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的抑菌效果显著，La28只有原液具备良好的抑菌效果；灭活后六种菌株均不具备抑菌效果。
(3)溶胞产物的牛津杯抑菌试验表明：LP45、TMC3115、LR519和LR863的抑菌效果显著，其中LR863溶胞产物抑菌效果最好，BAL531只有原液具备一定的抑菌效果，La28溶胞产物无抑菌效果。
(4)死菌的牛津杯抑菌试验表明：LR519和LR863中，仅LR863有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度升高而升高，其中浓度为50亿时抑菌效果良好，10亿抑菌圈直径为17.24mm，抑菌效果一般。
综上，LP45、TMC3115和LR863的发酵液、上清液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著；并且LR519的发酵液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果也十分显著；还有BAL531的上清液和菌体对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著，可进一步加工后用于护肤产品；
LR863的死菌具有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度降低而变差，可根据需要直接选取合适浓度用于面膜等护肤品。
1.5对照例
对照例1
与上述备料到处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基1，按质量份数计，液体培养基1包括10份葡萄糖，5份蛋白胨，2份乙酸钠和83份蒸馏水。
对照例2
与上述备料到处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基2，按质量份数计，液体培养基2包括15份葡萄糖，8份蛋白胨，4份乙酸钠和73份蒸馏水。
对照例3
与上述备料到后处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基3，按质量份数计，液体培养基3包括20份葡萄糖，10份蛋白胨，5份乙酸钠和65份蒸馏水。
上述对照例1-3所述培养基与改良MRS液体培养基相比，改良MRS液体培养基使菌株生长更迅速，代谢产物更多，抑菌圈直径更大，对痤疮丙酸杆菌的抑制效果更好。
实施例2
2.1备料
痤疮丙酸杆菌、硫乙醇酸盐培养基、0.9％的氯化钠溶液、30μg/ml的盐酸四环素、34μg/ml的盐酸四环素均与实施例1相同，区别仅在于改良MRS液体培养基和乳酸菌种子液；
保护剂：包括10份脱脂乳，2份海藻糖，1.5份维生素C，1份谷氨酸钠，80份蒸馏水。
改良MRS液体培养基：包括葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉粉2g，酵母浸粉1g，乙酸钠2g，柠檬酸氢二铵0.5g，磷酸氢二钾0.8g，MgSO4·7H2O 0.32g，MnSO4·H2O 1g，半胱氨酸盐酸盐0.1g，吐温80 0.01ml，蒸馏水800mL。
乳酸菌种子液：从酸奶或婴儿肠道中分离纯化得到原始菌种(植物乳杆菌LP45，嗜酸乳杆菌La28，乳双歧杆菌BAL531，两歧双歧杆菌TMC3115，鼠李糖乳杆菌LR519，鼠李糖乳杆菌LR863)，原始菌种经上述改良MRS液体培养基培养到对数期后与20％的甘油等比混合均匀，于-80℃冻存即得种子液，乳酸菌种子液由河北一然生物科技有限公司菌种库提供。
(1)发酵液：取乳酸菌种子液按2％的接种量接种到10ml改良MRS液体培养基，震荡混匀，30℃培养48h，依次连续活化三代，再按10％的接种量接种到250ml改良MRS液体培养基中扩大培养，其中乳双歧杆菌BAL531、两歧双歧杆菌TMC3115须厌氧培养，其他培养步骤相同；
培养好的发酵液取100ml，即得发酵液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(2)灭活发酵液：发酵液110℃加热10min，得灭活发酵液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品；
(3)上清液：发酵液7000r/min离心20min收集上清液，即得上清液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(4)灭活上清液：上清液110℃加热10min，得灭活上清液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品；
(5)菌体：离心所得菌泥以0.9％氯化钠溶液充分重悬后离心，重复三次即得菌体原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(6)灭活菌体：菌体原液样品130℃加热10min，得灭活菌体原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品；
(7)溶胞产物：菌体与保护剂按照1:2混合并搅拌均匀后巴氏灭菌，即得溶胞产物样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品；
(8)死菌：发酵液以60℃灭菌4h经9000r/min离心乳化15min后冷冻干燥即得死菌样品，用0.9％的氯化钠溶液与死菌分别配制成5x108CFU/ml、1x109CFU/ml、5x109CFU/ml浓度的液体样品。
(9)痤疮丙酸杆菌的培养：取痤疮丙酸杆菌种子液按3％的接种量接种到10ml液体硫乙醇酸盐培养基，震荡混匀，37℃厌氧培养48h，依次连续活化三代后备用。
2.2处理
(1)含有2.0％素琼脂培养基冷至50℃左右，取10mL倾倒在无菌平皿中，洁净工作台中晾干；
(2)无菌镊子取灭菌牛津杯放在倒有素琼脂的平皿中，静置10min；
(3)将1mL痤疮丙酸杆菌加入到100mL冷却至50℃的液体硫乙醇酸盐培养基中并充分混匀；
(4)在放好牛津杯的平板上倾倒10mL上述液体硫乙醇酸盐培养基，待凝固后将牛津杯夹出，形成牛津杯孔；
(5)在各牛津杯孔中注入0.1mL各样品，于37℃静置厌氧培养72h。并且以0.9％的氯化钠溶液为阴性对照；发酵液、灭火发酵液、上清液和灭活上清液以30μg/ml盐酸四环素为阳性对照，菌体、灭活菌体、溶胞产物和死菌是以34μg/ml盐酸四环素为阳性对照。
2.3后处理
表2
2.4分析
用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小，测量结果如表1，其中评价指标为：抑菌圈直径＝0，则不具备抑菌效果；抑菌圈直径＞0，则具备抑菌效果；0＜抑菌圈直径＜18，抑菌效果一般；18≤抑菌圈直径＜27mm，抑菌效果良好；抑菌圈直径≥27mm，抑菌效果显著；“-”表示未做试验。筛选结果如下：
(1)发酵液的牛津杯抑菌试验表明：LP45、TMC3115、LR519和LR863的抑菌圈直径大于30mm，抑菌效果显著，La28、BAL531的抑菌效果良好；经过灭活后LP45、La28、TMC3115、LR519和LR863只有原液具备抑菌效果，效果一般，BAL531的灭活发酵液不具备抑菌效果。
(2)上清液的牛津杯抑菌试验表明：LP45、BAL531、TMC3115和LR863的上清液抑菌圈直径约30mm，抑菌效果显著，La28的抑菌效果良好，上述五种菌株灭活后只有原液具备抑菌效果,效果一般；LR519只有原液具备抑菌效果，效果一般。
(3)菌体的牛津杯抑菌试验表明：LP45、TMC3115、LR519和LR863的抑菌效果显著，BAL531抑菌效果良好；La28只有原液具备良好的抑菌效果；灭活后六种菌株均不具备抑菌效果。
(3)溶胞产物的牛津杯抑菌试验表明：LP45、TMC3115和LR863的抑菌效果显著，其中LR863溶胞产物抑菌效果最好，LR519抑菌效果良好，BAL531只有原液具备一定的抑菌效果，La28溶胞产物无抑菌效果。
(4)死菌的牛津杯抑菌试验表明：LR519和LR863中，仅LR863有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度升高而升高，其中浓度为50亿时抑菌效果良好，浓度为10亿抑菌效果一般，如图8。
综上，LP45、TMC3115和LR863的发酵液、上清液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著；并且LR519的发酵液、菌体对痤疮丙酸杆菌抑菌效果也十分显著；还有BAL531的上清液对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著，可进一步加工后用于护肤产品；
LR863的死菌具有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度降低而变差，可根据需要直接选取合适浓度用于面膜等护肤品。
2.5对照例
对照例1
与上述备料到处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基1，按质量份数计，液体培养基1包括10份葡萄糖，5份蛋白胨，2份乙酸钠和83份蒸馏水。
对照例2
与上述备料到处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基2，按质量份数计，液体培养基2包括15份葡萄糖，8份蛋白胨，4份乙酸钠和73份蒸馏水。
对照例3
与上述备料到后处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基3，按质量份数计，液体培养基3包括20份葡萄糖，10份蛋白胨，5份乙酸钠和65份蒸馏水。
上述对照例1-3所述培养基与改良MRS液体培养基相比，改良MRS液体培养基使菌株生长更迅速，代谢产物更多，抑菌圈直径更大，对痤疮丙酸杆菌的抑制效果更好。
实施例3
3.1备料
痤疮丙酸杆菌、硫乙醇酸盐培养基、0.9％的氯化钠溶液、30μg/ml的盐酸四环素、34μg/ml的盐酸四环素均与实施例1相同，区别仅在于改良MRS液体培养基和乳酸菌种子液；
保护剂：包括20份脱脂乳，6份海藻糖，2份维生素C，3份谷氨酸钠，60份蒸馏水。
改良MRS液体培养基：包括葡萄糖15g，蛋白胨8g，牛肉粉4g，酵母浸粉3g，乙酸钠4g，柠檬酸氢二铵1g，磷酸氢二钾1.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.6g，半胱氨酸盐酸盐0.3g，吐温80 0.08ml，蒸馏水900mL。
乳酸菌种子液：从酸奶或婴儿肠道中分离纯化得到原始菌种(植物乳杆菌LP45，嗜酸乳杆菌La28，乳双歧杆菌BAL531，两歧双歧杆菌TMC3115，鼠李糖乳杆菌LR519，鼠李糖乳杆菌LR863)，原始菌种经上述改良MRS液体培养基培养到对数期后与25％的甘油等比混合均匀，于-70℃冻存即得种子液，乳酸菌种子液由河北一然生物科技有限公司菌种库提供。
(1)发酵液：取乳酸菌种子液按10％的接种量接种到10ml改良MRS液体培养基，震荡混匀，40℃培养36h，依次连续活化三代，再按2％的接种量接种到250ml改良MRS液体培养基中扩大培养，其中乳双歧杆菌BAL531、两歧双歧杆菌TMC3115须厌氧培养，其他培养步骤相同；
培养好的发酵液取100ml，即得发酵液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(2)灭活发酵液：发酵液130℃加热20min，得灭活发酵液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品；
(3)上清液：发酵液9000r/min离心15min收集上清液，即得上清液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(4)灭活上清液：上清液130℃加热20min，得灭活上清液原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品；
(5)菌体：离心所得菌泥以0.9％氯化钠溶液充分重悬后离心，重复三次即得菌体原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品，于4℃冷藏备用；
(6)灭活菌体：菌体原液样品110℃加热20min，得灭活菌体原液样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品；
(7)溶胞产物：菌体与保护剂按照1:2混合并搅拌均匀后巴氏灭菌，即得溶胞产物样品，用0.9％氯化钠溶液稀释原液，得10倍稀释液样品，100倍稀释液样品；
(8)死菌：发酵液以80℃灭菌2h经7000r/min离心乳化15min后冷冻干燥即得死菌样品，用0.9％的氯化钠溶液与死菌分别配制成5x108CFU/ml、1x109CFU/ml、5x109CFU/ml浓度的液体样品。
(9)痤疮丙酸杆菌的培养：取痤疮丙酸杆菌种子液按3％的接种量接种到10ml液体硫乙醇酸盐培养基，震荡混匀，37℃厌氧培养48h，依次连续活化三代后备用。
3.2处理
(1)含有2.0％素琼脂培养基冷至50℃左右，取10mL倾倒在无菌平皿中，洁净工作台中晾干；
(2)无菌镊子取灭菌牛津杯放在倒有素琼脂的平皿中，静置10min；
(3)将1mL痤疮丙酸杆菌加入到100mL冷却至50℃的液体硫乙醇酸盐培养基中并充分混匀；
(4)在放好牛津杯的平板上倾倒10mL上述液体硫乙醇酸盐培养基，待凝固后将牛津杯夹出，形成牛津杯孔；
(5)在各牛津杯孔中注入0.1mL各样品，于37℃静置厌氧培养60h。并且以0.9％的氯化钠溶液为阴性对照；发酵液、灭火发酵液、上清液和灭活上清液以30μg/ml盐酸四环素为阳性对照，菌体、灭活菌体、溶胞产物和死菌是以34μg/ml盐酸四环素为阳性对照。
3.3后处理
表3
3.4分析
用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小，测量结果如表1，其中评价指标为：抑菌圈直径＝0，则不具备抑菌效果；抑菌圈直径＞0，则具备抑菌效果；0＜抑菌圈直径＜18，抑菌效果一般；18≤抑菌圈直径＜27mm，抑菌效果良好；抑菌圈直径≥27mm，抑菌效果显著；“-”表示未做试验。筛选结果如下：
(1)发酵液的牛津杯抑菌试验表明：LP45、TMC3115、LR519和LR863的抑菌圈直径大于30mm，抑菌效果显著，La28、BAL531的抑菌效果良好；经过灭活后LP45、La28、TMC3115、LR519和LR863只有原液具备抑菌效果，效果一般，BAL531的灭活发酵液不具备抑菌效果。
(2)上清液的牛津杯抑菌试验表明：LP45、BAL531、TMC3115和LR863的上清液抑菌圈直径约30mm，抑菌效果显著，La28的抑菌效果良好，上述五种菌株灭活后只有原液具备抑菌效果,效果一般；LR519只有原液具备抑菌效果，效果一般。
(3)菌体的牛津杯抑菌试验表明：LP45、BAL531、TMC3115、LR519和LR863的抑菌效果显著，La28只有原液具备良好的抑菌效果；灭活后六种菌株均不具备抑菌效果。
(3)溶胞产物的牛津杯抑菌试验表明：LP45、TMC3115、LR519和LR863的抑菌效果显著，其中LR863溶胞产物抑菌效果最好，BAL531只有原液具备一定的抑菌效果，La28溶胞产物无抑菌效果。
(4)死菌的牛津杯抑菌试验表明：LR519和LR863中，仅LR863有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度升高而升高，其中浓度为50亿时抑菌效果良好，10亿抑菌圈直径为17.24mm，抑菌效果一般。
综上，LP45、TMC3115和LR863的发酵液、上清液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著；并且LR519的发酵液、菌体和溶胞产物对痤疮丙酸杆菌抑菌效果也十分显著；还有BAL531的上清液和菌体对痤疮丙酸杆菌抑菌效果显著，可进一步加工后用于护肤产品；
LR863的死菌具有抑菌效果，且抑菌效果随LR863浓度降低而变差，可根据需要直接选取合适浓度用于面膜等护肤品。
3.5对照例
对照例1
与上述备料到处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基1，按质量份数计，液体培养基1包括10份葡萄糖，5份蛋白胨，2份乙酸钠和83份蒸馏水。
对照例2
与上述备料到处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基2，按质量份数计，液体培养基2包括15份葡萄糖，8份蛋白胨，4份乙酸钠和73份蒸馏水。
对照例3
与上述备料到后处理过程相同，区别仅在于将改良MRS液体培养基替换为液体培养基3，按质量份数计，液体培养基3包括20份葡萄糖，10份蛋白胨，5份乙酸钠和65份蒸馏水。
上述对照例1-3所述培养基与改良MRS液体培养基相比，改良MRS液体培养基使菌株生长更迅速，代谢产物更多，抑菌圈直径更大，对痤疮丙酸杆菌的抑制效果更好。
二、应用实施例
例1
按质量份数计，面膜精华液由0.5份鼠李糖乳杆菌LR863的死菌，10份甘油，0.05份透明质酸钠和89.45份蒸馏水配合组成，祛痘面膜载体选取无纺布；
其中对鼠李糖乳杆菌LR863的死菌过滤除菌，使细菌数为900CFU/ml。
例2
按质量份数计，面膜精华液由0.3份植物乳杆菌LP45的菌体，0.3份鼠李糖乳杆菌LR519的溶胞产物，13份甘油，0.08份透明质酸钠和86.32份蒸馏水配合组成，祛痘面膜载体选取蚕丝；
其中对植物乳杆菌LP45的菌体过滤除菌，使细菌数为500CFU/ml，对鼠李糖乳杆菌LR519的溶胞产物过滤除菌，使细菌数为400CFU/ml。
例3
按质量份数计，面膜精华液由0.3份乳双歧杆菌BAL531的菌体，11份甘油，0.04份透明质酸钠和88.66份蒸馏水配合组成，祛痘面膜载体选取生物纤维和天丝纤维；
其中对乳双歧杆菌BAL531的菌体过滤除菌，使细菌数为800CFU/ml。
例4
按质量份数计，祛痘霜包括0.5份鼠李糖乳杆菌LR863的死菌，4.8份凡士林，3.84份十八醇，1.44份单甘脂，2.88份石腊油，0.48份十二烷基硫酸钠，2.4份甘油，83.66份蒸馏水；
其中对鼠李糖乳杆菌LR863的死菌过滤除菌，使细菌数为700CFU/ml。
例5
按质量份数计，祛痘霜包括0.4份两歧双歧杆菌TMC3115的菌体，5.2份凡士林，3.34份十八醇，1.5份单甘脂，2.72份石腊油，0.31份十二烷基硫酸钠，3.53份甘油，83份蒸馏水；
其中对两歧双歧杆菌TMC3115的菌体过滤除菌，使细菌数为600CFU/ml。
例6
按质量份数计，祛痘霜包括0.2份两歧双歧杆菌TMC3115的发酵液，0.5份鼠李糖乳杆菌LR863的菌体，5.5份凡士林，3.3份十八醇，2.5份单甘脂，2.98份石腊油，0.54份十二烷基硫酸钠，2.8份甘油，81.68份蒸馏水；
其中对两歧双歧杆菌TMC3115的发酵液灭活脱盐处理，使细菌数为300CFU/ml，对鼠李糖乳杆菌LR863的菌体过滤除菌，使细菌数为500CFU/ml。
例7
按质量份数计，嗜酸乳杆菌La28的上清液取5份，乳双歧杆菌BAL531的菌体取5份，与10份甘油，0.08份透明质酸钠，0.06份烟酰胺，1份甘油三酯，0.07份EDTA二钠配合组成护肤精华液；
其中嗜酸乳杆菌La28的上清液灭活脱盐处理，使细菌数为500CFU/ml，乳双歧杆菌BAL531的菌体过滤除菌，使细菌数为200CFU/ml。
例8
按质量份数计，取9份鼠李糖乳杆菌LR863上清液与11.5份甘油，0.05份透明质酸钠，0.05份烟酰胺，2份甘油三酯，0.05份EDTA二钠配合组成护肤精华液；
其中鼠李糖乳杆菌LR863上清液灭活脱盐处理，使细菌数为850CFU/ml。
例9
按质量份数计，12份鼠李糖乳杆菌LR863的菌体与13.4份甘油，0.09份透明质酸钠，0.04份烟酰胺，1.5份甘油三酯，0.08份EDTA二钠配合组成护肤精华液；
其中鼠李糖乳杆菌LR863的菌体过滤除菌，使细菌数为350CFU/ml。

Claims (10)

1.乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物；
乳酸菌菌体包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP45，CGMCC No.8072，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La28，CGMCC No.11506，乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)BAL531，CGMCC No.17329，两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)TMC3115，CGMCC No.8462，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)LR519，CGMCC No.15969，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LR863，CGMCC No.14410中的一种或两种以上；
所述乳酸菌衍生物包括上述LP45的发酵液、LP45的灭活发酵液、LP45的上清液、LP45的灭活上清液、LP45的溶胞产物、La28的发酵液、La28的灭活发酵液、La28的上清液、La28的灭活上清液、BAL531的发酵液、BAL531的上清液、BAL531的灭活上清液、BAL531的溶胞产物、TMC3115的发酵液、TMC3115的灭活发酵液、TMC3115的上清液、TMC3115的灭活上清液、TMC3115的溶胞产物、LR519的发酵液、LR519的灭活发酵液、LR519的上清液、LR519的溶胞产物、LR863的发酵液、LR863的灭活发酵液、LR863的上清液、LR863的灭活上清液、LR863的溶胞产物或LR863的死菌中的一种或两种以上。
2.如权利要求1所述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，其特征在于，所述LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液由如下步骤制备：LP45、La28、BAL531、TMC3115、LR519或LR863由液体培养基培养到对数期后与20％-30％的甘油等比混合均匀，于-60℃～-80℃冻存得种子液；
取种子液按2％-10％的接种量接种到10ml液体培养基，震荡混匀，30℃-40℃培养24h-48h，依次连续活化三代，再按2％-10％的接种量接种到250ml液体培养基中扩大培养，即得LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液；
上述BAL531的发酵液或TMC3115的发酵液的制备为厌氧条件；
LP45的发酵液、La28的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液在110-130℃加热10-20min，即得LP45的灭活发酵液、La28的灭活发酵液、TMC3115的灭活发酵液、LR519的灭活发酵液或LR863的灭活发酵液。
3.如权利要求2所述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，其特征在于，所述LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液7000-9000r/min离心10-15min后，收集上清液，即得LP45的上清液、La28的上清液、BAL531的上清液、TMC3115的上清液、LR519的上清液或LR863的上清液；
LP45的上清液、La28的上清液、BAL531的上清液、TMC3115的上清液或LR863的上清液在110-130℃加热10-20min，即得LP45的灭活上清液、La28的灭活上清液、TMC3115的灭活上清液或LR863的灭活上清液；
所述LP45的发酵液、La28的发酵液、BAL531的发酵液、TMC3115的发酵液、LR519的发酵液或LR863的发酵液离心所得菌泥以0.9％氯化钠溶液充分重悬后，重复7000-9000r/min离心10-15min三次，即得LP45的菌体、La28的菌体、BAL531的菌体、TMC3115的菌体、LR519的菌体或LR863的菌体；
所述LR863的发酵液以60-80℃灭菌2-4h经7000-9000r/min离心10-15min后冷冻干燥，即得LR863的死菌。
4.如权利要求2所述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，其特征在于，所述LP45的菌体、BAL531的菌体、TMC3115的菌体、LR519的菌体或LR863的菌体与保护剂按照1:2混合并搅拌均匀后巴氏灭菌，即得LP45的溶胞产物、BAL531的溶胞产物、TMC3115的溶胞产物、LR519的溶胞产物或LR863的溶胞产物。
5.如权利要求4所述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，其特征在于，按质量份数计，所述保护剂包括10-15份脱脂乳，2-6份海藻糖，1.5-2份维生素C，1-3份谷氨酸钠，60-80份蒸馏水。
6.如权利要求2所述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，其特征在于，按质量份数计，所述液体培养基包括10-20份葡萄糖，5-10份蛋白胨，2-5份乙酸钠和65-83份蒸馏水。
7.如权利要求2所述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用，其特征在于，按质量份数计，所述液体培养基包括10-20份葡萄糖，5-10份蛋白胨，2-6.5份牛肉粉，1-5份酵母浸粉，2-5份乙酸钠，0.5-2份柠檬酸氢二铵，0.8-2份磷酸氢二钾，0.32-0.58份MgSO4·7H2O，0.25-1份MnSO4·H2O，0.1-0.5份半胱氨酸盐酸盐，0.01-0.1份吐温80，800-1000份蒸馏水。
8.一种利用如权利要求1所述乳酸菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用制成的祛痘面膜，祛痘面膜由面膜精华液和面膜材料组成，其特征在于，按质量份数计，面膜精华液包括0.3份-0.6份乳酸菌菌体和/或乳酸菌衍生物，10-13份甘油，0.04-0.08份透明质酸钠和86.32-89.45份蒸馏水，面膜材料包括无纺布、蚕丝、生物纤维或天丝纤维中的一种或两种以上。
9.一种利用如权利要求1所述益生菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用制成的祛痘霜，其特征在于，按质量份数计，祛痘霜包括0.4-0.7份益生菌菌体和/或益生菌衍生物，4.8-5.5份凡士林，3.3-3.84份十八醇，1.44-2.5份单甘脂，2.72-2.98份石腊油，0.31-0.54份十二烷基硫酸钠，2.4-3.53份甘油，81.68-83份蒸馏水。
10.一种利用如权利要求1所述益生菌在抑制痤疮丙酸杆菌中的应用制成的护肤精华液，其特征在于，按质量份数计，包括9-12份益生菌菌体和/或益生菌衍生物，10-13.4份甘油，0.05-0.09份透明质酸钠，0.04-0.06份烟酰胺，1-2份甘油三酯，0.05-0.08份EDTA二钠。
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