CN110499242A - 一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置及其模拟方法 - Google Patents

Abstract

一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置及其模拟方法，属于畜牧业技术领域，通过分析反刍动物瘤胃的内环境，通过本装置可测定瘤胃上皮组织对VFA的吸收情况，装置结构新颖，模拟原理清晰，本发明成本低，为组织体外培养提供新思路，可有效提高试验周期，本发明与其他试验模拟装置相比，可以进行大批量试验，更加简单可行，能够控制环境条件，为体外试验提供试验基础与理论指导，从而促进动物生产，提高畜牧业经济效益。

Description

一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置及其模拟方法

技术领域

本发明属于畜牧业技术领域，涉及一种反刍动物瘤胃发酵试验装置及使用方法，具体的说是涉及一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置及其模拟方法。

背景技术

反刍动物的胃是复胃，分为瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃四个胃，其中瘤胃是反刍动物消化代谢的重要场所，也是吸收营养物质的的重要器官。瘤胃是反刍动物对饲料消化代谢和营养吸收的第一场所，具有“搅拌器”和“发酵罐”的功能。瘤胃上皮的物质吸收、转运以及能量代谢功能直接影响反当动物生长、发育以及正常生产性能的发挥。合理的加快瘤胃上皮发育和正常功能的维持可促进动物整体生长，提高动物对环境的适应，增强抗病能力。反刍动物利用饲料中碳水化合物的方式与单胃动物不同，主要通过瘤胃微生物发酵产生挥发性脂肪酸(VFA)来提供可消化能。在正常饲喂条件下，瘤胃发酵产生的VFA过瘤胃进入后消化道消化。其中，瘤胃上皮具有强大吸收VFA的能力，瘤胃产生的VFA约80％能被瘤胃上皮迅速吸收入血，从而以供给宿主能量代谢。瘤胃上皮不仅是瘤胃微生物附着、生长并进行消化和代谢的主要部位，也是营养物质吸收、转运、代谢的主要场所，同时也是瘤胃内环境与血液循环系统之间的一道重要生理屏障。因此，维持瘤胃上皮结构和功能的完整性对保持反刍动物健康和生产性能具有重要意义。体内测定VFA吸收速率的难度较大，也存在很大的局限性，所以，有必要设计一种简易的模拟体外吸收装置，并对其密闭性能、可操作性进行检测从而减少瘤胃吸收速率的测定难度，为体内试验和动物生产提供一定的参考依据。

近年来，国内外的科学家都非常重视反刍动物体外培养的研究试验进展，从而更好的研究瘤胃发酵以及对饲料特别是粗饲料价值的评定。自20世纪40年代末期至50年代初期丹麦学者Hans Ussing首次利用尤斯灌流系统(Ussing chamber)方法研究上皮组织的离子转运，目前它是研究上皮离子转运有效技术之一。随着在工艺设计方面的不断改良，其应用范围也愈来愈广泛，这一技术己被应用于所有的上皮组织研究中。然而尤斯灌流系统结构较为复杂，成本高。

目前主要的瘤胃发酵技术包括体内法、尼龙袋法、体外法。体内法是利用反刍动物如牛羊等进行活体内瘤胃发酵试验。但是体内发酵试验成本高、周期长、环境不易控制，且需要试验动物数量多，动物个体间存在差异，试验结果不稳定。尼龙袋法是将装有被测饲料样品的尼龙袋通过瘤胃瘘管放置于瘤胃中，此法成本低，简单易行，试验周期短，但其测定结果收多种因素影响且需要装有瘘管的活体动物。体外法是指采集新鲜瘤胃食糜或瘤胃液，在模拟瘤胃条件的装置中进行微生物培养。此法操作简单，省时省力，受试验动物限制少，反应易于控制，适合于实验室研究，并且能够短时间内测定大量饲料样品，但目前缺乏成熟的反刍动物瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置及其使用方法。因此，设计出一种瘤胃体外培养模拟装置对于试验研究以及饲料工业生产都尤为重要。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术中的存在的不足，提出一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置及其使用方法，通过实验检验其装置的密闭性与可行性，再测定瘤胃上皮组织对VFA的吸收情况，可有效提高试验周期，可进行大批量试验，能够控制环境条件，为体外试验提供试验基础与理论指导，从而促进动物生产，提高畜牧业经济效益。

本发明的技术方案是：一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，其特征在于：所述模拟装置由瓶体、瓶颈和橡皮塞组成；所述瓶体为中空的锥台状结构，所述瓶体的外部设有导气管，所述导气管与瓶体的外表面形成朝上的夹角，所述瓶体的顶部设有喇叭口，所述瓶颈为中空圆柱状结构，瓶颈的顶部设有喇叭口，瓶颈的圆柱部分置入所述瓶体内，所述瓶颈架设在所述瓶体上后形成紧密贴合，所述橡皮塞塞入至所述瓶颈中，所述橡皮塞上设有导气孔。

所述导气管倾斜朝上设置，导气管与瓶体的倾斜角度小于60°。

所述瓶颈的圆柱部分的外径小于瓶体顶部的直径，瓶颈的圆柱部分的高度小于瓶体的高度。

所述瓶颈上的喇叭口略大于瓶体上的喇叭口，两喇叭口在各自的圆弧过渡处形成紧密贴合。

所述导气孔的数量为2个。

一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置的模拟方法如下：

(1)取新鲜瘤胃上皮组织，冲洗干净后包裹在所述瓶颈的底部；

(2)将瓶颈架设在瓶体中，乳头方向朝向瓶体底部；

(3)在在瓶体中加入培养液，瓶颈中加入缓冲液或瘤胃液；

(4)在瓶颈上端用橡皮塞塞住，在瓶体上的导气管中插入导管进行充氧。

本发明的有益效果为：本发明提出的一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置及其模拟方法，通过分析反刍动物瘤胃的内环境，通过本装置可测定瘤胃上皮组织对VFA的吸收情况，装置结构新颖，模拟原理清晰，本发明成本低，为组织体外培养提供新思路，可有效提高试验周期，本发明与其他试验模拟装置相比，可以进行大批量试验，更加简单可行，能够控制环境条件，为体外试验提供试验基础与理论指导，从而促进动物生产，提高畜牧业经济效益。

附图说明

图1为本发明试验系统的结构示意图。

图2为本发明试验系统操作流程图。

图中：橡皮塞1、瓶颈2、导气管3、瓶体4、导气孔5。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

如图1所示，一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，所述装置为玻璃装置，模拟瘤胃内环境，补充氧气和二氧化碳。

本发明所述瘤胃上皮组织来自2只1.5月龄波尔山羊。

实施例1

选用2只1.5月龄健康状况良好的波尔山羊，体重为16.5±0.6kg，饲喂常规日粮以提供瘤胃组织。另在试验动物房选取一只健康状况良好的并安装有瘤胃瘘管的羊以取瘤胃液。模拟山羊日粮制备培养底物，进行体外培养试验。

内溶液(缓冲液或者瘤胃液)分为8组，对照组(汉斯夜)(汉)、汉斯液+乙酸组(汉乙)、汉斯液+丙酸组(汉丙)、汉斯液+丁酸组(汉丁)、汉斯液+瘤胃液组(汉瘤)、汉斯液+瘤胃液+乙酸组(汉瘤乙)、汉斯液+瘤胃液+丙酸组(汉瘤丙)、汉斯液+瘤胃液+丁酸组(汉瘤丁)。(见表1)

表1

注：内溶液中汉斯液和瘤胃液比例为1:1，乙酸、丙酸、丁酸的添加量为15mmol/L。

在培养开始后0h、3h、6h、24h采集培养液(内、外溶液)样品，用于分析培养液的pH、色度、氨氮浓度、挥发性脂肪酸浓度等。取培养0h和24h后的组织样品，置于甲醛中固定，用于制作石蜡切片观察组织形态学变化。

体外培养模拟装置内外溶液OD值的变化如表2所示：

表2

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，无字母或相同字母时表示差异不显著(P＞0.05)。

结果表明：内溶液中OD值在时间轴上无显著差异(P＞0.05)；内溶液中OD值在对照组中显著低于汉瘤组、汉瘤乙组、汉瘤丙组和汉瘤丁组，显著高于汉乙组、汉丙组以及汉丁组(P＜0.05)；OD值在外溶液组间差异不显著(P＞0.05)，但数值上OD值在汉瘤组最高；OD值在外溶液24点显著低于0、3、6点(P＜0.05)。内外溶液OD值均在一定范围内浮动，内外交叉甚小。

体外培养模拟装置内外溶液pH值的变化如表3所示：

表3

结果表明：时间上，pH值在内溶液中无显著差异(P＞0.05)，但数值上pH值在24点最高；内溶液组间中，pH值在汉乙组、汉丙组以及汉丁组最低，汉、汉瘤组最高，汉瘤乙组、汉瘤丙组和汉瘤丁组其次(P＜0.05)；pH值在外溶液组间中无显著差异(P＞0.05)，但在0点和6点显著低于3点pH值，高于24点(P＜0.05)。内外溶液PH值均在一定范围内浮动，内外交叉甚小。

以上结果表明，通过测试样品不同时间段内pH值和OD值，观察其中的变化，结果显示样品不同时间段的内外溶液pH值和OD值均在一定范围内浮动，内外交叉甚小。故可判定本试验设计的瘤胃上皮组织体外培养模拟装置密闭性较为良好，可为后续测定VFA吸收情况提供基础条件。

实施例2

测定该发明体外培养模拟装置对氨氮浓度、VFA吸收情况、瘤胃组织形态结构变化以及常见细菌菌群变化的影响

体外培养模拟装置的氨氮浓度变化如表4所示

表4

结果表明：内溶液中，氨氮浓度在时间和组间差异都不显著，但6点时氨氮浓度最高，汉瘤乙、汉瘤丙、汉瘤丁组氨氮浓度普遍高于其他各组。另外，在汉组、汉乙组、汉丙组和汉丁这四组中，0、3、6点时不含氨氮，但24点时这四组产生了少量氨氮。外溶液中，氨氮浓度组间差异不显著，数值上上下浮动不大；时间上，24点时氨氮浓度最高，显著高于其他各组，0点和3点时氨氮浓度最低，6点时氨氮浓度显著高于0点和3点，又显著低于24点。外溶液中氨氮浓度随着时间显著增加，说明该体外培养模拟装置有实际瘤胃的效果。

体外培养模拟装置VFA内溶液吸收情况如表5所示

表5

结果表明：组间中汉瘤乙组乙酸、汉瘤丙组丙酸、汉瘤丁组丁酸显著高于其他各组，由于瘤胃液中乙酸浓度大于丙酸大于丁酸，所以汉瘤组、汉瘤乙组、汉瘤丙组、汉瘤丁组乙酸浓度明显大于其他各组，而对于汉乙组、汉丙组、汉丁组，这三组添加的汉斯液和酸的浓度相同，但结果显示汉乙组乙酸浓度最高，汉丙组丙酸浓度次之，汉丁组丁酸浓度最小。时间上各乙酸、丙酸、丁酸浓度差异不显著，但随着时间的增加，乙酸、丙酸、丁酸的浓度都呈下降趋势。

Claims (6)

1.一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，其特征在于：所述模拟装置由瓶体(4)、瓶颈(2)和橡皮塞(1)组成；所述瓶体(4)为中空的锥台状结构，所述瓶体(4)的外部设有导气管(3)，所述导气管(3)与瓶体(4)的外表面形成朝上的夹角，所述瓶体(4)的顶部设有喇叭口，所述瓶颈(2)为中空圆柱状结构，瓶颈(2)的顶部设有喇叭口，瓶颈(2)的圆柱部分置入所述瓶体(4)内，所述瓶颈(2)架设在所述瓶体(4)上后形成紧密贴合，所述橡皮塞(1)塞入至所述瓶颈(2)中，所述橡皮塞(1)上设有导气孔(5)。

2.根据权利要求1所述的一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，其特征在于：所述导气管(3)倾斜朝上设置，导气管(3)与瓶体(4)的倾斜角度小于60°。

3.根据权利要求1所述的一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，其特征在于：所述瓶颈(2)的圆柱部分的外径小于瓶体(4)顶部的直径，瓶颈(2)的圆柱部分的高度小于瓶体(4)的高度。

4.根据权利要求1所述的一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，其特征在于：所述瓶颈(2)上的喇叭口略大于瓶体上的喇叭口，两喇叭口在各自的圆弧过渡处形成紧密贴合。

5.根据权利要求1所述的一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，其特征在于：所述导气孔(5)的数量为2个。

6.一种瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置的模拟方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的瘤胃上皮组织体外培养的模拟装置，模拟方法如下：

(1)取新鲜瘤胃上皮组织，冲洗干净后包裹在所述瓶颈(2)的底部；

(2)将瓶颈(2)架设在瓶体(4)中，乳头方向朝向瓶体(4)底部；

(3)在在瓶体(4)中加入培养液，瓶颈(2)中加入缓冲液或瘤胃液；

(4)在瓶颈(2)上端用橡皮塞(1)塞住，在瓶体(4)上的导气管(3)中插入导管进行充氧。