CN110494554A

CN110494554A - 用于生产生物产物变体的方法

Info

Publication number: CN110494554A
Application number: CN201880024307.1A
Authority: CN
Inventors: R.贝里
Original assignee: Long Zha Co Ltd
Current assignee: Long Zha Co Ltd; Lonza AG
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-16
Publication date: 2019-11-22
Also published as: US20240067923A1; JP7252896B2; JP2020507336A; WO2018151819A1; IL268602B1; EP3571289A1; KR102701102B1; US20190382718A1; IL268602B2; IL268602A; KR20190117624A

Abstract

公开了使用多个培养条件和灌注生产来生产蛋白质变体的方法。

Description

用于生产生物产物变体的方法

相关申请

本申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请62/460,387的权益，其通过引用完整并入本文。

发明领域

本公开内容涉及使用在多个不同培养条件下操作的培养系统生产生物产物，例如蛋白质，例如蛋白质变体的方法、组合物和装置。

发明背景

包括治疗性蛋白质和单抗在内的得到批准的治疗性产物通常仅在一部分治疗群体中是有效的。根本原因并不总是充分了解的，但是可以是由于患者之间的遗传、表观遗传、代谢、生活方式和其他差异所致。因此，越来越有趋势来了解疾病自身和患者两者的根本原因并且开发出更特制的疗法。现在公认的另一种并发症是即使每位患者可表现出相同的疾病症状，疾病自身也可能因患者而异，例如，现在公认有11种不同形式的血液癌(E.Papaemmanuil et.al.,N Engl J Med 2016；374:2209-2221)。朝向精确且个性化的治疗的此种增长趋势预计依赖于产物质量属性差异较小的治疗产物。每种在产物质量属性上各自具有较低异质性(即较小差异)的治疗产物的多个变体也可能会有助于有效治疗疾病异质性和患者异质性两者。

当前用于生产生物产物如重组蛋白和单克隆抗体(单抗)的方法通常导致产物在产物质量属性如糖基化、唾液酸化和电荷变异方面具有高度可变性(Paciset.al.Biotechnol Bioeng 2011；108:2348-2358)。这些方法通常依赖于在1到14天的任何地方培养的微生物或动物细胞的补料分批培养。使用补料分批培养产生的产物通常是异质混合物，例如，哺乳动物细胞产生的单抗在培养中点(第7天)期间可以具有比向培养结束(第11天到第14天)产生的相同单抗更高比例的糖基化蛋白质链。培养结束前不收获产物，因此在培养终止时产物是产物变体的异质混合物。当前使用的纯化技术如层析和过滤步骤不能纯化产物变体并获得更同质的产物。

发明概述

本公开内容部分基于以下发现：通过提供细胞群体，在第一条件下培养细胞群体以获得第一产物变体，并且回收在第一条件下制备的第一产物，然后在第二条件下在培养基中进一步培养细胞群体以获得第二产物变体，并且回收在第二条件下制备的第二产物可以获得那些产物的较多产物变体和较为同质的制剂中的一者或两者。因此，制备不同产物的多个制剂，每种产物针对升高的同质性是优化的。

因此，一方面，本发明的特征在于制备多个变体制剂的方法，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，所述方法包括：在配置成允许细胞培养，即灌注培养的容器中提供细胞群体；

(a-i)在第一条件下在培养基中培养所述细胞群体以形成含有产物变体1的条件化培养基；

(a-ii)从培养物中回收产物变体1，例如通过获得步骤(a-i)中形成的条件化培养基的等分试样；

(a-iii)任选地向所述条件化培养基添加替代培养基；

(a-iv)任选地在所述第一条件下进一步培养所述细胞群体以产生另外的条件化培养基；

(a-v)任选地回收另外的，例如第二批次的产物变体1，例如通过获得步骤(a-iv)中形成的条件化培养基的等分试样；

(a-vi)任选地组合来自(a-ii)和(a-v)的产物变体1，例如来自第一和第二批次；

(b-i)在第二条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有产物变体2的条件化培养基；

(b-ii)从培养物中回收产物变体2，例如通过获得步骤(b-i)中形成的条件化培养基的等分试样；

(b-iii)任选地向条件化培养基添加替代培养基，

(b-iv)任选地在所述第二条件下进一步培养所述细胞群体以产生另外的条件化培养基；

(b-v)任选地回收另外的，例如第二批次的产物变体2，例如通过获得步骤(b-iv)中形成的条件化培养基的等分试样；

(b-vi)任选地组合来自(b-ii)和(b-v)的产物变体2，例如来自第一批次和第二批次；

从一批产物变体1中获得，例如纯化产物变体1；

从一批产物变体2中获得，例如纯化产物变体2；

从而提供多个变体制剂，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，

其中变体1(或变体1的制剂)与变体2(或变体2的制剂)的不同之处在于物理、化学、生物学或药学性质，例如以下中的一项或多项：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向，或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

在另一方面，本发明的特征在于制备多个变体制剂的方法，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，所述方法包括：

(a)在第一条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有产物变体1的条件化培养基；

(b)回收产物变体1，例如一批产物变体1(例如在第一条件下产生)；

(c)在第二条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有产物变体2的条件化培养基；

(d)回收产物变体2，例如一批产物变体2(例如在第二条件下产生)；

其中产物变体1(或产物变体1的制剂)与产物变体2(或产物变体2的制剂)的不同之处在于物理、化学、生物学或药学性质，例如，

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向，或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

在一些实施方案中，方法包括例如在获得条件化培养基的等分试样之后，向该条件化培养基添加替代培养基。

在一些实施方案中，取出的等分试样的体积、添加的替代培养基或两者独立地占整个培养物体积或反应器容器容量的5至100、10至100、40至100、60至100、80至100、5至10、5至20、5至40、5至60、5至80、20至80、20至60、20至40、或20至80％。在一些实施方案中，取出的量、添加的替代培养基或两者独立地是每天反应器运行的反应器体积的0.1至5、0.5至5.0.3至5、0.4至5、0.1至4、0.3至4、或0.5至4、1至2、或1至3倍。

在一些实施方案中，将细胞群体在第一条件下培养1天或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多天)。

在一些实施方案中，例如，在达到参数的目标值之后，在第二条件下培养细胞群体。

在一些实施方案中，方法包括操作培养基或其他条件以达到第二条件。

在一些实施方案中，方法包括改变以下中的一项或多项：pH；dO₂水平；搅动；温度；体积；细胞群体密度；培养基成分的浓度；营养物、药物、抑制剂或其他成分的存在或含量。

在一些实施方案中，培养基的成分、营养物、药物、抑制剂或其他化学成分包含以下中的一种或多种：培养基化合物(例如，PBS、MEM DMEM、血清等)、多肽、非肽信号分子(例如，Ca⁺²、cAMP、葡萄糖、ATP等)、氨基酸(例如赖氨酸)、糖(例如半乳糖或N-乙酰甘露糖胺)和水溶性金属化合物(例如铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)、锰化合物(例如氯化锰)、锌化合物(例如氯化锌)和铁化合物(例如硫酸亚铁))。

在一些实施方案中，细胞群体的培养物是灌注生产培养物，例如如本文所述的灌注生产培养物，例如其中连续或以设定的时间间隔定期收获条件化培养基。

在一些实施方案中，方法包括当容器，例如反应器，例如生物反应器中的培养基转变为第二条件时中断灌注，例如当培养基转变为第二条件时不会收集灌注物并在达到第二条件时恢复收集，例如在将产物变体1基本上被产物变体2替换前或者在培养基转变为后续条件时不会收集灌注物。在一些实施方案中，方法包括当培养基转变为第二条件时将灌注物转移至例如废物，例如当培养基转变为第二条件时将灌注物转移至废物，并在达到第二条件后恢复收集。例如，将灌注物转移到第一目的地，例如废物，直到满足第一条件，例如产物变体1基本上被产物变体2替换，或者在培养基转变为后续条件时。

在一些实施方案中，从下游单元操作除去产物变体1，例如用液体，例如缓冲液冲洗，例如在后续产物变体，例如产物变体2的生产期间，或者在后续产物变体，例如产物变体2的生产后。

在一些实施方案中，方法包括培养细胞直到达到参数的目标值，例如与稳定操作有关的参数，例如培养持续时间、培养存活力、活细胞浓度、pH、dO2、温度或培养体积。

在一些实施方案中，(a)，(c)或(a)和(c)两者的培养基中的细胞群体包含在容器，例如反应器、反应器容器或类似物中。在一些实施方案中，(a)的培养基中的细胞群体和(c)的培养基中的细胞群体包含在同一容器中。在一些实施方案中，(a)的培养基中的细胞群体和(c)的培养基中的细胞群体包含在两个或更多个不同的容器中。

在一些实施方案中，取出的等分试样、添加的替代培养基或两者的体积独立地占整个培养物的体积或容器(例如反应器)容量的5至100、10至100、40至100、60至100、80至100、5至10、5至20、5至40、5至60、5至80、20至80、20至60、20至40、或20至80％。在一些实施方案中，取出的量、添加的替代培养基或两者独立是容器，例如反应器，每天容器(例如反应器)操作体积的0.1至5、0.5至5.0.3至5、0.4至5、0.1至4、0.3至4、或0.5至4、1至2、或1至3倍。

在一些实施方案中，替代培养基的体积小于，等于或大于取出的等分试样的体积。

在一些实施方案中，将细胞群体在第二条件下培养1天或更多(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或更多天)。

在一些实施方案中，例如，在达到参数的目标值之后，在第三条件下培养细胞群体。

在一些实施方案中，方法包括当容器，例如反应器，例如生物反应器中的培养基转变为第三条件时中断灌注，例如当培养基转变为第三条件时不会收集灌注物并在达到第三条件时恢复收集，例如在将产物变体2基本上被产物变体3替换前或者在培养基转变为后续条件时不会收集灌注物。在一些实施方案中，方法包括当培养基转变为第三条件时将灌注物转移至例如废物，例如当培养基转变为第三条件时将灌注物转移至废物，并在达到第三条件后恢复收集，例如，将灌注物转移到废物，直到产物变体2基本上被产物变体3替换，或者在培养基转变为后续条件时。

在一些实施方案中，从下游单元操作除去产物变体2，例如用液体，例如缓冲液冲洗，例如在后续产物变体，例如产物变体3的生产期间，或者在后续产物变体，例如产物变体3的生产后。

在一些实施方案中，多个包括在第三条件下制备的第三变体的制剂，例如，通过本文所述的用于制备第一或第二变体的步骤制备的在第三条件下制备的第三变体的制剂。

在一些实施方案中，多个包括在第四条件下制备的第四变体的制剂，例如，通过本文所述的用于制备第一或第二变体的步骤制备的在第四条件下制备的第四变体的制剂。

在一些实施方案中，多个包括在第五条件下制备的第五变体的制剂，例如，通过本文所述的用于制备第一或第二变体的步骤制备的在第五条件下制备的第五变体的制剂。

在一些实施方案中，多个包括在第N个条件下制备的第N个变体的制剂，例如，通过本文所述的用于制备第一或第二变体的制剂步骤在第N个条件下制得的第N个变体的制剂，其中N等于或大于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。

在一些实施方案中，步骤(a)和步骤(b)在相同的容器例如生产培养容器中进行。

在一些实施方案中，步骤(a)至(d)在同一容器例如生产培养容器中进行。

在一些实施方案中，容器配置为允许以灌注模式操作。

在一些实施方案中，容器配置为允许在培养期间例如在步骤(a)和(c)之一或两者期间除去培养基和添加培养基。

在一些实施方案中，方法包括纯化产物变体1。

在一些实施方案中，方法包括纯化产物变体2。

在一些实施方案中，产物变体在培养细胞群体的容器下游的单元操作中纯化。

在一些实施方案中，方法包括提供多个制剂，例如纯化的制剂，例如提供2、3、4、5、6、7、8 9 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多不同的产物变体的制剂，例如纯化的制剂。

在另一方面，本发明的特征在于本文所述，或通过本文所述的任何方法制备或可制备的变体产物的制备。

在另一方面，本发明的特征在于多个变体制剂，所述多个至少包含本文所述或通过本文中所述的任何方法制备或可制备的产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂。

在另一方面，本发明的特征在于装载有本文所述的细胞混合物的容器，例如生物反应器，例如可变直径生物反应器。

在另一方面，本发明的特征在于评估用于制备多个产物变体制剂的方法的进展的方法，其包括：

(a)在第一条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有第一产物变体(产物变体1)的条件化培养基；

(b)获取用于制备多个产物变体制剂的方法朝着一个或多个目标参数的进展的值，所述目标参数选自：生产的产物变体1的量、在所述第一条件下的培养持续时间或培养物的存活力；

(c)响应该值，测定制备多个产物变体制剂的方法朝着所述一个或多个目标参数的进展；并且

(d)任选地，响应于已经达到一个或多个目标参数的测定，操作所述培养基或其他条件以达到第二条件，

从而评估用于制备多个产物变体的方法的进展。

在另一方面，本发明的特征在于修改用于生产产物变体的方法的方法，其包括：

(a)在第一条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有产物变体(产物变体1)的条件化培养基；

(b)评估生产产物变体的方法朝着一个或多个目标参数的进展，所述目标参数选自：生产的产物变体1的量、在所述第一条件下的培养时间或培养物的存活力；

(c)响应于朝着所述一个或多个目标参数的进展的评估，操作所述培养基或其他条件以达到第二条件；并且

(d)任选地，在所述第二条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有第二产物变体(产物变体2)的条件化培养基，

从而修改所述生产产物变体的方法。

在另一方面，本发明的特征在于包含本文所述制剂的药物组合物。

在另一方面，本发明的特征在于试剂盒，其包含本文所述的多个变体制剂。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。另外，材料，方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。标题，副标题或带编号或字母的元素(例如，(a)，(b)，(i)等)仅出于易于阅读的目的而给出，并非限制性的。在本文件中使用标题或带编号或字母的元素不需要步骤或元素以字母顺序执行，或步骤或元素必须彼此分离。通过说明书和附图以及权利要求书，本发明的其他特征，目的和优点将变得显而易见。

附图简述

图1是可变直径生物反应器(VDB)的侧视图；

图2是可变直径生物反应器(VDB)的侧视图；

图3是可变直径生物反应器(VDB)的侧视图；

图4是可变直径生物反应器(VDB)的示意图；

图5是可变直径生物反应器(VDB)的示意图；

图6是具有均匀直径的典型生物反应器的示意图；

图7是示例性可变直径生物反应器(VDB)的示意图；

图8是示例性可变直径生物反应器(VDB)的示意图；

图9是示例性可变直径生物反应器(VDB)的示意图；

图10是示例性可变直径生物反应器(VDB)的示意图；和

图11是示例性可变直径生物反应器(VDB)生物反应器的示意图。

图12是设计为连续搅拌罐反应器(CSTR)的示例性灌注生物反应器的示意图。

图13A-13C的图显示了如通过活细胞密度测量，变化浓度的CuSO₄(A)、赖氨酸(B)和N-乙酰精氨酸(C)对细胞生长的影响。

图14A-14C的图显示了赖氨酸(A)、CuSO₄(B)和N-乙酰精氨酸(C)对产物(单克隆抗体)的电荷变异的影响。

图15A-15E的图显示了将CuSO₄浓度增加2.0μM调节产物电荷变异。显示了酸性峰(A)，主峰(B)和碱性峰(C)的面积百分比变化，以及转换前和转换后电荷变异(D和E)之间的变化。*，p<0.05；***，p<0.0001

图16A-16C的图显示了单个灌注反应器中电荷变异的双向调节。显示了在第4天到第62天之间酸性峰(A)、碱性峰(B)和平均峰(C)的面积百分比变化。指示了营养物输入(CuSO₄、基础或赖氨酸)之间转换的时机。

图17A-17E的图显示了将CuSO₄浓度增加2.0μM可逆地调节产物电荷变异。显示了酸性峰(A)、主峰(B)和碱性峰(C)的面积百分比变化，以及初始转换前基础输入条件，在CuSO₄输入期间，和转换回到基础后之间的电荷变异的变化(D)。图17E显示了基础和CuSO₄期间电荷变异的变化。****，p<0.0001

图18A-18E的图显示了将赖氨酸的浓度增加10mM调节电荷变异。显示了酸性峰(A)、主峰(B)和碱性峰(C)的面积百分比变化，以及基础条件CuSO₄输入和增加的赖氨酸条件(D和E)之间的电荷变异变化。**，p<0.01；****，p<0.0001

图19A-19D是代表性电泳图，其显示了所指示的处理对产物电荷变异概况的影响。显示了初始基本稳态条件(第8天；图19A)，CuSO₄稳态条件(第21天；图19B；箭头指示主峰的碱性侧)，第二基本稳态条件(第28天；图19C)和赖氨酸稳态条件(第38天；图19D；箭头指示等电点或pI 7.5的碱性峰的面积百分比增加)的电荷变异概况。

图20是代表性的电泳图，其显示带注释的峰分组(酸性峰、主峰或碱性峰)。计算酸性峰、主峰和碱性峰的总和以确定这些组的％面积。酸性峰对碱性峰的确定基于相对于主峰(最丰富，pI 7.2)在哪侧解析变体。

图21的图显示了响应于灌注反应器中的半乳糖浓度的逐步操作的半乳糖基化百分比变化。

图22的图显示了在图21所示的实验中响应于半乳糖浓度的逐步操作，半乳糖基化百分数和反应器半乳糖浓度的变化两者。

发明详述

定义

在本文中使用冠词“一个”和“一种”指该冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法对象。举例而言，“细胞”可以指一个/种或超过一个/种细胞。

如本文所用，术语“等分试样”是指溶液的体积，例如培养基或条件化培养基的体积。在一个实施方案中，每个等分试样满足关于体积的条件，例如，每个等分试样具有：最小体积，例如预先设置的最小值；落入最小值和最大值之间的范围内，例如预先设置的最小值和/或最大值；近似相等的数值，例如预先设置的数值；或相同的体积，例如预先设置的数值。当较大量的液体(例如条件化培养基)分成多个等分试样时，多个等分试样可以等于整个较大量，或者小于整个较大量。在一个实施方案中，等分试样可以超出生物反应器的体积，例如培养物体积，这是由于等分试样可以在添加替代培养基时除去。在一个实施方案中，等分试样是0.1-5,0.2-5,0.3-5,0.4-5,0.5-5,0.5-4或0.5-3个培养物体积，其中培养物体积对应于生物反应器中的培养物体积(例如含有40L培养物的50L生物反应器具有40L的培养物体积，并且所述培养物的0.5培养物体积会是20L)。

如本文所用，术语“多个等分试样”指超过一个(例如，两个或更多个)等分试样。

如本文所用，术语“内源”指来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内部天然产生的任何材料。

如本文所用，术语“外源”指导入生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。因此，“外源核酸”指导入生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的核酸。在一个实施方案中，外源核酸的序列不是在导入有外源核酸的生物体、细胞、组织或系统内部天然产生的，或者不能在导入有外源核酸的生物体、细胞、组织或系统内部天然找到的。类似地，“外源多肽”指不是在导入有外源多肽(例如通过从外源核酸序列表达)的生物体、细胞、组织或系统内部天然产生的，或者不能在导入有该外源多肽的生物体、细胞、组织或系统内部天然找到的多肽。

如本文所用，术语“异源”指当导入来自不同物种的生物体、细胞、组织或系统时来自一种物种的任何物质。

如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可互换使用，并且指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、或其DNA或RNA的组合、和其聚合物。术语“核酸”包括但不限于基因、cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如，化学合成的或人工的)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖含有具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然或非天然存在的核苷酸相似的方式代谢的天然核苷酸的类似物或衍生物的分子。除非另有指示，否则特定核酸序列还隐含涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指由通过肽键或通过肽键以外的手段共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质或肽序列的最大氨基酸数目没有限制。在一个实施方案中，蛋白质可以包含超过一种，例如，两种、三种、四种、五种或更多个多肽，其中每种多肽通过共价或非共价键/相互作用与另一种多肽结合。多肽包括任何肽或蛋白质，其包含两个或多个通过肽键或通过肽键以外的手段彼此连接的氨基酸。如本文所用，该术语指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其通常在本领域中称为蛋白质，其中存在有多个类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽，衍生物、类似物，融合蛋白等。

“产物”当该术语在本文中使用时指由细胞(例如经修饰或工程化改造以产生产物的细胞)产生(例如表达)的分子，例如多肽，例如蛋白质，例如糖蛋白、核酸、脂质、糖、多糖或其任何杂合体。在一个实施方案中，产物包含天然存在的产物。在一个实施方案中，产物包含非天然存在的产物。在一个实施方案中，产物的一部分是天然存在的，而产物的另一部分是非天然存在的。在一个实施方案中，产物是多肽，例如重组多肽。在一个实施方案中，产物适用于诊断或临床前使用。在另一个实施方案中，产物适用于治疗用途，例如用于治疗疾病。在一个实施方案中，本文中所述的细胞，例如经修饰的细胞或工程化细胞包含控制表达或编码产物的外源核酸。在其它实施方案中，本文中所述的细胞，例如经修饰的细胞或工程化细胞包含控制细胞中产物表达或构建的其它分子，例如其不是核酸。

如本文所用，“产物的变体”、“变体”、“产物变体”或类似术语是指与参考产物不同的产物种类。例如，具有与在第二组条件下制备的第二产物不同的结构或功能性质的在第一组条件下制备的第一产物是变体。通常，变体是从相同的细胞或相同的编码序列表达的。例如，产物的第一变体可以是糖基化的，而产物的第二变体可以是不同地糖基化的(例如，在更大或更小程度上糖基化，或附加有至少一个不同的糖部分)。区分产物变体的特性包括物理、化学、生物学或药学特性，包括但不限于：糖基化(例如半乳糖基化)、唾液酸化、电荷(例如pI)、序列(例如N端或C端序列))、治疗功效、聚集倾向或聚集的倾向或活性。区分产物变体的特性也称为产物质量属性。就特定的产物质量属性而言与参考产物不同的产物变体可以称为这样(例如，就电荷(例如pI)而言不同的产物变体可以称为电荷变体)。变体也可以因“制剂”或体积性质而不同，例如，第一产物变体的制剂可以就同质性、纯度、聚集量、无活性变体的量、澄清性或货架期而言不同于第二产物变体。

如本文所用，术语“多个变体”、“多个变体制剂”、“多个产物变体”等是指超过一种(例如，两种或更多种)变体、变体制剂、产物变体等。

如本文所用，“条件”是指可以影响细胞培养物中的生长和/或基因表达的一种或多种培养或环境参数的值。第一条件可以有利于第一产物变体的表达，例如形成含有第一产物变体的条件化培养基。而第二条件可以有助于第二产物变体的表达，例如，形成含有第二产物变体的条件化培养基。培养或环境参数包括但不限于培养基类型(例如，PBS、MEMDMEM、血清、含血清的培养基等)、一种或多种多肽、化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖成分、氨基己糖、n-乙酰氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原剂/氧化剂的水平、非肽信号传导分子(例如Ca⁺²、cAMP、葡萄糖、ATP等)的水平、温度、pH、培养物的细胞密度和营养物的利用度。稳态条件(也称为稳态)是指细胞密度和一种或多种产物质量属性保持恒定的条件。

生物生产方法

在一些实施方案中，微生物(例如大肠杆菌)、动物(例如哺乳动物(例如CHO或NSO)、真菌(例如巴斯德毕赤酵母)或昆虫或植物细胞的分批、补料分批或灌注培养物中生产生物制品，如重组蛋白和单抗。细胞群体用于生产产物并且培养群体的培养基是生产培养物。

在一些实施方案中，通过在受控的条件，例如温度、pH、溶解氧和搅拌下，在包含碳水化合物、氨基酸、蛋白质、脂质、维生素、核苷和/或化学盐的培养基中培养先前冷冻的细胞的小群体来开始生产。在这些条件下，将培养物在越来越大的体积中扩大，直到产生足够的细胞群体，并且可以在通常体积范围为50L至20,000升的生产培养物中开始治疗产物蛋白的生产。对于动物细胞培养物，此种培养生长阶段的持续时间可以持续数小时(微生物培养)-约30天。

当前有两种主要的生产产物的方法：分批或者补料分批生产和灌注生产。在分批或者补料分批生产中，整个生产培养物通常在起始起的1天-21天之间的规定日期收获。在分批生产中，生产所需要的所有营养物和底物从培养开始就存在于培养基中，而在补料分批生产中，在培养过程中将营养物和/或底物添加或补料到培养物中。

在灌注生产培养中，在一段时间内连续或以规定的间隔收获生产培养物。在一个实施方案中，每天收获约0.5至3个培养体积。可以从收获的培养物中纯化产物变体。在一些实施方案中，在一段时间内连续或以一定间隔，用替代培养基，例如新鲜的培养基补充生产培养基。在一个实施方案中，用等体积的新鲜培养基代替培养物。在一些实施方案中，培养持续时间可以在培养开始后持续30天至150天的任何时间(例如40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或140天)。

通过灌注培养生产同质产物变体

本文公开了制备一种或多种产物的方法，其通过使用培养系统，例如灌注生产培养系统来生产一种或多种产物变体进行。在一个实施方案中，与例如通过分批或补料分批生产培养物生产的产物相比，产物变体的制剂就特性，例如糖基化、活性或同质性而言具有优化的同质性。尽管不希望受到理论的束缚，但认为从分批补料生产和分批生产培养物中生产的产物的异质性源于包含在一段时间内制备的产物变体的制剂，涵盖明显不同的培养条件，例如生产培养的整个持续时间。因此，最终收获的培养基中存在超过一种形式的产物。从本文描述的系统收获的较小的定期等分试样包括具有增加的同质性的产物变体，这可能是由于生产来自于灌注培养的产物变体的潜在更同质的细胞和环境条件所致。

本文公开了制备两种或更多种产物的方法，其通过使用本文所述的培养系统，例如灌注生产培养系统来生产两种或更多种产物变体制剂，每种具有优化的同质性，例如与通过分批或补料分批生产培养生产的产物相比就特性而言增加的同质性。在一些实施方案中，通过在第一条件下培养生产培养物来生产第一产物变体。在第一条件下从生产培养物中回收的产物的批次(例如，一个或多个批次)包括第一产物变体。通过在第二条件下培养生产培养物来生产第二产物变体。在第二条件下从生产培养物中回收的产物的批次(例如，一个或多个批次)包含第二产物变体。

在一些实施方案中，条件包括培养和/或环境参数，包括但不限于培养基类型(例如，PBS、MEM DMEM、血清、含血清的培养基等)、一种或多种多肽、化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖成分、氨基己糖、n-乙酰氨基己糖、维生素、脂质，多胺，还原剂/氧化剂的水平，非肽信号传导分子(例如Ca⁺²、cAMP、葡萄糖、ATP等)、温度、pH、培养物的细胞密度和营养物利用度。在一些实施方案中，条件包括以下中的一种或多种的水平(例如浓度或相对水平，例如相对于先前条件增加或降低的水平)：氨基酸(例如赖氨酸)、糖(例如半乳糖或N-乙酰甘露糖胺)或水溶性金属化合物。用于创建或维持条件的氨基酸和糖可以包含多个共价修饰(例如，乙酰化)。可用于创造或维持条件的水溶性金属化合物包括但不限于铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)、锰化合物(例如氯化锰)、锌化合物(例如氯化锌)和铁化合物(例如硫酸亚铁)。

在一些实施方案中，本发明的制备方法生产超过两种产物的制剂，例如超过两种产物变体。在一些实施方案中，可以在第三、第四、第五或进一步的条件下进一步培养培养物。在第三、第四、第五或进一步的条件下从生产培养物中回收的产物的批次(例如，一个或多个批次)会包第三、第四、第五或进一步的产物变体。

在一个实施方案中，方法提供了第一变体的制剂和第二变体的制剂。在一个实施方案中，方法提供了第三变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第四变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第五变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第六变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第七变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第八变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第九变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十一变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十二变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十三变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十四变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十五变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十六变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十七变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十八变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第十九变体的制剂。

在一个实施方案中，方法提供了第二十变体的制剂。

在一些实施方案中，在完成期望的产物变体生产之后，在接着的条件下培养生产培养物。在一些实施方案中，在转变为接着的条件之后，对将生物反应器的组分或生物反应器下游的组分清除前面的产物变体。在一些实施方案中，在此清洁期间，不收集灌注物或将灌注物收集并弃去。一旦生物反应器达到稳定运行，就可以恢复收集和纯化灌注物，例如包含接着的产物变体的灌注物。

在一个实施方案中，分析产物变体或其制剂中的一个或多个，例如分析变体之间不同的参数(例如糖基化)的存在，例如水平。

用于生产的应用

可以使用本文中公开的制备产物，例如产物变体的方法来产生多个产物，评估各种细胞系或评估生物反应器或加工容器或罐或更一般地在任何补料来源的情况下使用的各种细胞系的生产。本文描述的装置、设施和方法适合于培养任何期望的细胞系，包含原核和/或真核细胞系。此外，在实施方案中，装置、设施和方法适合于培养悬浮细胞或贴壁依赖性(贴壁)细胞，并且适合于配置用于生产药物和生物制药产物，如多肽产物、核酸产物(例如DNA或RNA)、或细胞和/或病毒，如用于细胞和/或病毒治疗的细胞和/或病毒的生产操作。

在实施方案中，细胞表达或生产产物，如重组治疗或诊断产物。如下文更详细描述的，由细胞生产的产物的实例包含但不限于抗体分子(例如，单克隆抗体，双特异性抗体)、抗体模拟物(与抗原特异性结合但与抗体在结构上不相关的多肽分子，例如DARPins、亲和体(affibodies)、adnectin或IgNARs)、融合蛋白(例如，Fc融合蛋白，嵌合细胞因子)、其他重组蛋白(例如，糖基化蛋白、酶、激素)、病毒治疗剂(例如，抗癌溶瘤性病毒、用于基因疗法的病毒载体和病毒免疫疗法)、细胞治疗剂(例如多能干细胞、间充质干细胞和成体干细胞)、疫苗或脂质包囊的颗粒(例如，外来体，病毒样颗粒)、RNA(诸如例如siRNA)或DNA(诸如例如质粒DNA)、抗生素或氨基酸。在实施方案中，装置、设施和方法可以用于生产生物仿制药。

如提及，在实施方案中，装置、设施和方法允许生产真核细胞，例如哺乳动物细胞或低等真核细胞，诸如例如酵母细胞或丝状真菌细胞，或原核细胞，例如革兰氏阳性细胞或革兰氏阴性细胞和/或真核细胞或原核细胞的产物，例如蛋白质、肽、抗生素、氨基酸、核酸(例如DNA或RNA)，其由真核细胞以大规模方式合成。除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包含任何期望的体积或生产能力，包含但不限于实验室规模、中试规模(pilot-scale)和完全生产规模能力。

此外，除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包含任何合适的反应器，包含但不限于搅拌罐、空气升液器(airlift)、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文所用，“反应器”可以包含发酵罐或发酵单元，或任何其他反应容器，并且术语“反应器”可与“发酵罐”互换使用。例如，在一些方面，生物反应器单元可以进行以下中的一个或多个或者全部：营养物和/或碳源的进料、合适气体(例如氧气)的注射、发酵或细胞培养基的入口和出口流动、气相和液相的分离、温度的维持、氧气和CO2水平的维持、pH水平的维持、搅拌(例如搅动)和/或清洁/灭菌。示例性反应器单元如发酵单元可以在单元内包含多个反应器，例如单元可以在每个单元中具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或更多个生物反应器和/或设施可以含有设施内具有单个或多个反应器的多个单元。在各个实施方案中，生物反应器可以适合于分批、半补料-分批、补料-分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施方案中，生物反应器可以具有约100mL至约50,000L的体积。非限制性实例包含100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升、和/或50,000升的体积。另外，合适的反应器可以是多次使用、单次使用、一次性或非一次性，并且可以由任何合适的材料形成，所述材料包含金属合金，例如不锈钢(例如316L或任何其它合适的不锈钢)和Inconel、塑料和/或玻璃。

在实施方案中并且除非本文另有说明，否则与生成制备物的方法一起使用的本文所述的装置、设施和方法还可以包含未另外提及的任何合适的单元操作和/或设备，如用于分离、纯化和分离此类产物的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境，如传统的棒式建筑设施、模块、移动和临时设施、或任何其他合适的结构、设施和/或布局。例如，在一些实施方案中，可以使用模块清洁室。另外并且除非另有说明，否则本文描述的装置、系统和方法可以在单个位置或设施中容纳和/或进行，或者备选地在分开的位置和/或设施或多个位置和/或设施处容纳和/或进行。

作为非限制性实例而非限制性地，美国公开文本No.2013/0280797；2012/0077429；2011/0280797；2009/0305626；和美国专利No.8,298,054；7,629,167；和5,656,491(其通过引用在此完整并入)描述了可能合适的示例性设施、设备和/或系统。

本文中所述的生成制备物的方法可以使用一大批细胞。实施方案中，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是例如人或啮齿类或牛细胞系或细胞株。此类细胞、细胞系或细胞株的实例是例如小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、NIH3T3、PC12、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS(例如COS1和COS7)、QC1-3、HEK-293、VERO、PER.C6、HeLA、EBl、EB2、EB3、溶瘤或杂交瘤细胞系。优选地，哺乳动物细胞是CHO细胞系。在一个实施方案中，细胞是CHO细胞。在一个实施方案中，细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN、或CHO衍生的细胞。CHO GS敲除细胞(例如GSKO细胞)是例如CHO-K1 SV GS敲除细胞。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1 SV(Lonza Biologics、Inc.)。真核细胞也可以是禽细胞、细胞系或细胞株，诸如例如细胞、EB14、EB24、EB26、EB66或EBv13。

在一个实施方案中，真核细胞是干细胞。干细胞可以是例如多能干细胞，包含胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、组织特异性干细胞(例如，造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。

在一个实施方案中，细胞是本文描述的任何细胞的分化形式。在一个实施方案中，细胞是源自培养中的任何原代细胞的细胞。

在实施方案中，细胞是肝细胞，如人肝细胞、动物肝细胞或非实质细胞。例如，细胞可以是可铺板的代谢合格的人肝细胞(plateable metabolism qualified humanhepatocyte)、可铺板的诱导合格的人肝细胞(plateable induction qualified humanhepatocyte)、可铺板的Qualyst Transporter Certified^TM人肝细胞、悬浮合格的人肝细胞(包含10个供体和20个供体合并的肝细胞)、人肝库弗细胞、人肝星状细胞、狗肝细胞(包含单一和合并的Beagle肝细胞)、小鼠肝细胞(包含CD-1和C57BI/6肝细胞)、大鼠肝细胞(包含Sprague-Dawley、Wistar Han和Wistar肝细胞)、猴肝细胞(包含食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus)肝细胞)、猫肝细胞(包含Domestic Shorthair肝细胞)和兔肝细胞(包含NewZealand White肝细胞)。示例性肝细胞可购自Triangle Research Labs,LLC,6 DavisDrive Research Triangle Park,North Carolina,USA 27709。

在一个实施方案中，真核细胞是低等真核细胞，诸如例如酵母细胞(例如毕赤酵母(Pichia)属(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)和安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta))、Komagataella属(例如Komagataella pastoris、Komagataellapseudopastoris或Komagataella phaffii)、酵母属(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)、酿酒酵母(cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))、假丝酵母属(Candida)(例如实用假丝酵母(Candida utilis)、Candida cacaoi、博伊丁假(丝酵母Candida boidinii))、地丝菌属(Geotrichum)(例如发酵地丝菌(Geotrichumfermentans))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选巴斯德毕赤酵母。巴斯德毕赤酵母菌株的实例是X33、GS115、KM71、KM71H；和CBS7435。

在一个实施方案中，真核细胞是真菌细胞(例如曲霉属(Aspergillus)(例如黑曲霉(A.niger)、烟曲霉(A.fumigates)、米曲霉(A.orzyae)、构巢曲霉(A.nidula))、支顶孢属(Acremonium)(例如嗜热支顶孢(A.thermophilum))、黑毛菌属(Chaetomium)(例如嗜热黑毛菌(C.thermophilum))、金小孢子属(Chrysosporium)(如嗜热金小孢子(C.thermophile))、冬虫夏草(Cordyceps)(如北冬虫夏草(C.militaris))、棒囊壳属(Corynascus)、栉霉属(Ctenomyces)、镰刀菌属(Fusarium)(如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))、小丛壳属(Glomerella)(如禾生小丛壳(G.graminicola))、肉座菌属(Hypocrea)(如红褐肉座菌(H.jecorina))、稻瘟病菌(Magnaporthe)(如稻瘟病菌(M.orzyae))、毁丝霉属(Myceliophthora)(如嗜热毁丝霉(M.thermophile))、丛赤壳属(Nectria)(如赤球丛赤壳(N.heamatococca))、链孢霉属(Neurospora)(如粗糙链孢霉(N.crassa))、青霉属(Penicillium)、侧孢霉属(Sporotrichum)(如嗜热侧孢霉(S.thermophile))、梭孢壳属(Thielavia)(如陆地梭孢壳(T.terrestris)，T.heterothallica)、木霉属(Trichoderma)(如里氏木霉)或轮枝孢属(Verticillium)(如大丽轮枝孢(V.dahlia))。

在一个实施方案中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9、Mimic^TM Sf9、Sf21、HighFive^TM(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞)、藻类细胞(例如，双眉藻属(Amphora)、硅藻纲(Bacillariophyceae)、杜氏藻属(Dunaliella)、小球藻属(Chlorella)、衣藻属(Chlamydomonas)、蓝藻门(Cyanophyta)(蓝细菌)、微拟球藻属(Nannochloropsis)，螺旋藻属(Spirulina)或棕鞭藻属(Ochromonas)的细胞)、或植物细胞(如来自单子叶植物细胞(如玉米、稻、小麦或狗尾草(Setaria))，或来自双子叶植物(例如，木薯、马铃薯、大豆、番茄、烟草、苜蓿、小立碗藓(Physcomitrella patens)或拟南芥(Arabidopsis)的细胞)。

在一个实施方案中，细胞是细菌或原核细胞。

在实施方案中，原核细胞是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)或乳杆菌(Lactobacillus)。可以使用的芽孢杆菌是例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。在实施方案中，细胞是枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌可从例如芽孢杆菌遗传保藏中心(Bacillus Genetic StockCenter),Biological Sciences 556,484West 12^th Avenue,Columbus OH 43210-1214获得。

在一个实施方案中，原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌属种或大肠杆菌，例如TG1、TG2、W3110、DH1、DHB4、DH5a、HMS 174、HMS174(DE3)、NM533、C600、HB101、JM109、MC4100、XL1-Blue和Origami，以及源自大肠杆菌B-菌株的，诸如例如BL-21或BL21(DE3)，所有这些都是商品化的。

合适的宿主细胞可购自例如培养物保藏中心，例如DSMZ(德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH),Braunschweig,Germany)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

在实施方案中，培养的细胞用于产生用于治疗用途的蛋白质，例如抗体，例如单克隆抗体和/或重组蛋白质。在实施方案中，培养的细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其他有用的生物化学中间体或代谢物。例如，在实施方案中，可以制备具有分子量约4000道尔顿至大于约140,000道尔顿的分子。在实施方案中，这些分子可以具有一系列复杂性并且可以包含翻译后修饰，包含糖基化。

在实施方案中，多肽是例如BOTOX、Myobloc、Neurobloc、Dysport(或其他肉毒杆菌神经毒素血清型)、阿葡糖苷酶α、达托霉素(daptomycin)、YH-16、绒毛膜促性腺激素α、非格司亭(filgrastim)、西曲瑞克(cetrorelix)、白细胞介素-2、阿地白介素(aldesleukin)、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素2(denileukin diftitox)、干扰素α-n3(注射)、干扰素α-nl、DL-8234、干扰素、Suntory(γ-1a)、干扰素γ、胸腺素α1、他索那敏(tasonermin)、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽(nesiritide)、阿巴他塞(abatacept)，阿来法塞(alefacept)、Rebif、依托特明α(eptoterminalfa)、特立帕肽(teriparatide)、降钙素、依那西普，血红蛋白glutamer 250(牛)、替加色罗α(drotrecogin alpha)、胶原酶、卡培立肽(carperitide)、重组人表皮生长因子，DWP401，促红血球生成素α(darbepoetinalpha)、依泊汀(epoetin)omega、依泊汀β、依泊汀α、地西卢定(desirudin)、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、诺那凝血素α(nonacog alpha)、Mononine、依他凝血素α(eptacog alpha)(激活)、重组因子VIII+VWF、Recombinate、重组因子VIII、因子VIII(重组)、Alphnmate、辛凝血素α(octocog alpha)、因子VIII、帕利夫明(palifermin)、Indikinase、替奈普酶(tenecteplase)、阿替普酶(alteplase)、帕米普酶(pamiteplase)、瑞替普酶(reteplase)、那替普酶(nateplase)、孟替普酶(monteplase)、促滤泡素α(follitropin alpha)、rFSH、hpFSH、米卡芬净(micafungin)、培非司亭(pegfilgrastim)、来格司亭(lenograstim)、那托司亭(nartograstim)、舍莫瑞林(sermorelin)、胰高血糖素、依泽那太(exenatide)、普兰林肽(pramlintide)，iniglucerase、半乳糖加硫酶(galsulfase)、Leucotropin、莫拉司亭(molgramostirn)、醋酸曲普瑞林(triptorelinacetate)、组氨瑞林(histrelin)(Hydron)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、那法瑞林(nafarelin)、亮丙瑞林(leuprolide)(ATRIGEL)、亮丙瑞林(DUROS)、戈舍瑞林(goserelin)、Eutropin、生长激素、美卡舍明(mecasermin)、enlfavirtide、Org-33408、甘精胰岛素、谷赖胰岛素、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素(insulinlispro)、地特胰岛素(insulin deternir)、胰岛素(RapidMist)、美卡舍明林菲培(mecasermin rinfabate)、阿那白滞素(anakinra)、西莫白介素(celmoleukin)、99mTc-apcitide、myelopid、重组干扰素β-1b(Betaseron)、醋酸格拉默(glatiramer acetate)、Gepon、沙格司亭(sargramostim)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、人白细胞衍生的α干扰素、Bilive、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、门冬胰岛素、mecasenin、罗扰素(Roferon)-A、干扰素-α2、Alfaferone、干扰素alfacon-1、干扰素α、Avonex重组人黄体生成素、脱氧核糖核酸酶α(dornase alpha)、曲弗明(trafermin)、齐考诺肽(ziconotide)、他替瑞林(taltirelin)、地波特明α(diboterminalfa)、阿托西班(atosiban)、贝卡普勒明(becaplermin)、依替巴肽(eptifibatide)、Zemaira、CTC-111、Shanvac-B、奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanreotide)、ancestirn、agalsidaseβ、agalsidaseα、拉罗尼酶(laronidase)、醋肽铜(prezatide copper acetate)、拉布立酶(rasburicase)、兰尼单抗(ranibizumab)、干扰素γ-1b(Actimmune)、PEG-Intron、Tricomin、重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84、依泊汀δ、转基因抗凝血酶III、Granditropin、透明质酸酶(Vitrase)、重组胰岛素、干扰素-α、GEM-21S、伐普肽(vapreotide)、艾杜硫酸酯酶(idursulfase)、奥马曲拉(omnapatrilat)、重组血清白蛋白、培戈赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、谷卡匹酶(glucarpidase)、人重组C1酯酶抑制剂、拉诺替普酶(lanoteplase)、重组人生长激素、恩夫韦肽(enfuvirtide)、VGV-1、干扰素(α)、芦西纳坦(lucinactant)、阿肽地尔(aviptadil)、艾替班特(icatibant)、艾卡拉肽(ecallantide)、奥米加南(omiganan)、Aurograb、醋酸培西加南(pexiganan acetate)、ADI-PEG-20、LDI-200、地加瑞克(degarelix)、cintredelinbesudotox、Favld、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽(liraglutide)、特立帕肽(teriparatide)、替法可近(tifacogin)、AA4500、T4N5脂质体洗剂、卡妥索单抗(Catumaxomab)、DWP413、ART-123、Chrysalin、去氨普酶(desmoteplase)、安地普酶(amediplase)、绒促卵泡素α(corifollitropinalpha)、TH-9507、替度鲁肽(teduglutide)、Diamyd、DWP-412、生长激素、重组G-CSF、胰岛素、胰岛素(Technosphere)、胰岛素(AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素β、干扰素α-n3、贝拉西普(belatacept)、透皮胰岛素贴剂、AMG-531、MBP-8298、Xerecept、奥培巴坎(opebacan)、AIDSVAX、GV-1001、LymphoScan、豹蛙酶(ranpirnase)、Lipoxysan、卢舒普肽(lusupultide)、MP52、sipuleucel-T、CTP-37、Insegia、vitespen、人凝血酶、凝血酶、TransMID、蛇毒纤溶酶(alfimeprase)、Puricase、特利加压素(terlipressin)、EUR-1008M、重组FGF-I、BDM-E、rotigaptide、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(duramycin)、SCV-07、OPI-45、内皮抑素(Endostatin)、血管他丁(Angiostatin)、ABT-510、Bowman Birk抑制剂、XMP-629、99mTc-Hynic-膜联蛋白V、kahalalide F、CTCE-9908、替维瑞克(teverelix)、ozarelix、罗米地辛(Romidepsin)、BAY-504798，白细胞介素4、PRX-321、Pepscan、iboctadekin、rh乳铁蛋白(rhlactoferrin)、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽(cilengitide)、Albuferon、Biphasix、IRX-2、ω干扰素、PCK-3145、CAP-232、帕西瑞肽(pasireotide)、huN901-DMI、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、MART-1、gp100、酪氨酸酶、奈米非肽(nemifitide)、rAAT、CGRP、培那西普(pegsunercept)、胸腺素β4、plitidepsin、GTP-200、雷莫拉宁(ramoplanin)、GRASPA、OBI-1、AC-100、鲑鱼降钙素(eligen)、艾沙瑞林(examorelin)、卡普瑞林(capromorelin)、Cardeva，velafermin、131I-TM-601、KK-220、T-10、乌拉立肽(ularitide)、depelestat、培尼沙肽(hematide)、Chrysalin、rNAPc2、重组因子V111(PEG化脂质体)、bFGF、PEG化重组葡激酶变体、V-10153、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、CZEN-002、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、艾塞那肽(exenatide)(受控释放，Medisorb)、AVE-0010、GA-GCB、阿伏瑞林(avorelin)、ACM-9604、醋酸利那洛肽(linaclotid eacetate)、CETi-1、Hemospan、VAL、速效胰岛素(注射用，Viadel)、胰岛素(eligen)、重组甲硫氨酰人瘦蛋白、pitrakinra、Multikine、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10、talactoferrin、rEV-131、rEV-131、重组人胰岛素、RPI-78M、奥普瑞白介素(oprelvekin)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、valategrast、干扰素α-n3、IRX-3、RDP-58、Tauferon、胆盐刺激脂肪酶、梅里斯普酶(Merispase)、碱性磷酸酶(alaline phosphatase)、EP-2104R、美拉诺坦(Melanotan)-II、布雷默浪丹(bremelanotide)、ATL-104、重组人微纤溶酶(microplasmin)、AX-200、SEMAX、ACV-1、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽(dynorphin)A、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、ALTU-135、重组神经氨酸酶、Vacc-5q、Vacc-4x、Tat类毒素、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)(Novasome)、Ostabolin-C、PTH类似物，MBRI-93.02、MTB72F、MVA-Ag85A、FARA04、BA-210、重组瘟疫FIV、AG-702、OxSODrol、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7、PR1肽抗原、突变体ras疫苗、HPV-16E7脂肽疫苗、迷路(labyrinthin)、WT1-肽、IDD-5、CDX-110、Pentrys、Norelin、CytoFab、P-9808、VT-111、icrocaptide、telbermin、芦平曲韦(rupintrivir)、reticulose、rGRF、HA、α-半乳糖苷酶A、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张素，D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07、DRF-7295、ABT-828、ErbB2特异性免疫毒素、DT3SSIL-3、TST-10088、PRO-1762、Combotox、胆囊收缩素-B/胃泌素受体结合肽、111In-hEGF、AE-37、trasnizumab-DM1、拮抗剂G、IL-12、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647、基于L-19的ra、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/1540/KLH、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-1(肽)、NA17.A2肽、CBP-501、重组人乳铁蛋白、FX-06、AP-214、WAP-8294A、ACP-HIP、SUN-11031、肽YY[3-36]、FGLL、阿塞西普(atacicept)、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34、F-18-CCR1、AT-1100、JPD-003、PTH(7-34)(Novasome)、耐久霉素、CAB-2、CTCE-0214、糖PEG化(GlycoPEGylated)促红细胞生成素、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、氨基康定(aminocandin)、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(teverelix)、EP-51216、hGH、OGP-I、西夫韦肽(sifuvirtide)、TV4710、ALG-889、Org-41259、rhCC10、F-991、胸腺喷丁(thymopentin)、r(m)CRP、肝选择性胰岛素、subalin、L19-IL-2融合蛋白、弹力素(elafin)、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、血小板生成素受体激动剂、AL-108、AL-208、神经生长因子作用拮抗剂、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、特立帕肽(teriparatide)(eligen)、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合物、EP-1043、gpE1、gpE2、MF-59、hPTH(1-34)、768974、SYN-101、PGN-0052、aviscumnine、BIM-23190、多表位酪氨酸酶肽、卡斯替母(enkastim)、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管靶向TNF、去氨加压素、奥那西普(onercept)和TP-9201。

在一些实施方案中，多肽是阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA)、英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE^TM)、利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN^TM/MAB THERA^TM)、依那西普(etanercept)(ENBREL^TM)、贝伐单抗(AVASTIN^TM)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN^TM)、pegrilgrastim(NEULASTA^TM)，或任何其他合适的多肽，包含生物仿制药和生物增强药(biobetter)。

其他合适的多肽是下面和US2016/0097074的表1中列出的那些：

在实施方案中，多肽是激素、血液凝结/凝固因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白质疫苗、或肽，如表2中显示。

表2.示例性的产物

在实施方案中，蛋白质是多特异性蛋白质，例如表3中所示的双特异性抗体。

表3：双特异性形式

表4

在一些实施方案中，多肽是由癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，重组或治疗性多肽是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，重组或治疗性多肽选自HER2、CD20、9-O-乙酰基-GD3、βhCG、A33抗原、CA19-9标志物、CA-125标志物、钙网织蛋白、碳酸酐酶(carboanhydrase)IX(MN/CA IX)、CCR5、CCR8、CD19、CD22、CD25、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD63、CD70、CC123、CD138、癌胚抗原(CEA；CD66e)、桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、内皮唾酸蛋白、ephrin A2(EphA2)、上皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、ErbB2、胎儿乙酰胆碱受体、成纤维细胞活化抗原(FAP)、岩藻糖基GM1、GD2、GD3、GM2、神经节苷脂GD3、Globo H、糖蛋白100、HER2/neu、HER3、HER4、胰岛素样生长因子受体1、Lewis-Y、LG、Ly-6、黑素瘤特异性硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSCP)、间皮蛋白、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5_AC、MUC5_B、MUC7、MUC16、穆勒抑制物(MIS)受体II型、浆细胞抗原、多聚SA、PSCA、PSMA、sonic hedgehog(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原、TNF-alpha前体以及它们的组合。

在一些实施方案中，多肽是活化受体并且选自2B4(CD244)、α₄β₁整联蛋白、β₂整联蛋白、CD2、CD16、CD27、CD38、CD96、CDlOO、CD160、CD137、CEACAMl(CD66)、CRTAM、CSl(CD319)、DNAM-1(CD226)、GITR(TNFRSF18)、KIR的活化形式、NKG2C、NKG2D、NKG2E，一种或多种天然细胞毒性受体、NTB-A、PEN-5及它们的组合，任选其中β₂整联蛋白包含CD11a-CD 18、CD11 b-CD 18、or CD11c-CD 18，任选地其中KIR的活化形式包含K1R2DS1、KIR2DS4或KIR-S，并且任选地其中天然细胞毒性受体包含NKp30、NKp44、NKp46或NKp80。

在一些实施方案中，多肽是抑制性受体并且选自KIR、ILT2/LIR-l/CD85j、KIR的抑制形式、KLRG1、LAIR-1、NKG2A、NKR-P1A、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9及它们的组合，任选地其中KIR的抑制形式包含KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2或KIR-L。

在一些实施方案中，多肽是活化受体并且选自CD3、CD2(LFA2、OX34)、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、CD137(4-1BB)、CD226、CD229(Ly9，SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC，BLAME)、CD352(Lyl08、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、NKG2D、SLAM(CD150，SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ、TIM1(HAVCR，KIM1)及它们的组合。

在一些实施方案中，多肽是抑制性受体并且选自PD-1(CD279)、2B4(CD244、SLAMF4)、B71(CD80)、B7Hl(CD274、PD-L1)、BTLA(CD272)、CD160(BY55、NK28)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CD358(DR6)、CTLA-4(CD152)、LAG3、LAIR1、PD-1H(VISTA)、TIGIT(VSIG9，VSTM3)、TIM2(TIMD2)、TIM3(HAVCR2，KIM3)及它们的组合。

其他示例性蛋白质包括但不限于Leader et al.,“Protein therapeutics:asummary and pharmacological classification”,Nature Reviews Drug Discovery,2008,7:21-39(其通过引用并入本文)的表1-10中描述的任何蛋白质；或本文描述的重组多肽的任何缀合物、变体、类似物或功能片段。

其他重组蛋白质产物包括非抗体支架或替代蛋白质支架，如但不限于：DARPins、亲和体和adnectin。可以工程化改造此类非抗体支架或替代蛋白质支架以识别或结合一种或两种或更多个，例如1、2、3、4或5种或更多个不同的靶物或抗原。

可变直径生物反应器

本文公开的产物(例如产物变体)的制备方法可以与可变直径生物反应器容器(VDB)一起使用。可变直径生物反应器容器在本文中进行了描述，并且可以包括具有第一直径的第一容器部分和具有第二直径的第二容器部分，该第一直径配置为容纳液体培养基和生物材料，该第二直径大于第一直径，从而可以将液体培养基从容器内第一体积增加到第二体积。在一些方面，第一容器部分可以具有大于0.3:1的长宽比。在一些方面，第二容器部分可以具有大于0.3:1的长宽比。在一些方面，液体培养基包括接种物。第一容器部分可以配置为初始接种阶段生物反应器。第二容器部分可以配置为生长阶段或种子生物反应器。可变直径生物反应器容器可以进一步包含至少一个搅拌器。在一些方面，生物反应器可以进一步包括以下中的至少一个：搅拌器轴、叶轮、喷雾器、探头端口、填充端口、冷凝器、排气过滤器、泡沫破碎器板、样品端口、水平探头和测压仪。在一些方面，可变直径生物反应器容器可以配置用于培养哺乳动物、昆虫、植物或微生物细胞。

在其他方面，用于本文公开的产物(例如产物变体)的制备方法的可变直径生物反应器系统可以包括具有第一直径和第二直径使得容器的直径沿容器高度变化的生物反应器容器，在生物反应器容器内布置使得搅拌器在生物反应器容器的给定液体高度处提供期望的搅拌的搅拌器，以及可操作以将生物反应器容器从第一体积放大到第二体积的控制系统。在一些方面，第一容器部分具有大于0.3:1的长宽比，并且第二容器部分具有大于0.3:1的长宽比。容器的第一部分可以是初始接种阶段生物反应器。容器的第二部分可以是生长阶段容器部分。可变直径生物反应器系统还可以包括喷雾器、探头端口、填充端口、冷凝器、排气过滤器、泡沫破碎器板、样品端口、水平探头和/或测压仪。在一些方面，可变直径生物反应器系统配置用于哺乳动物细胞生产。

在其他方面，制备产物(例如产物变体)的方法包括用生长培养基和接种物接种第一体积的生物反应器，并在完成接种阶段后将另外的生长培养基添加到生物反应器，以将生物反应器的体积扩大至第二体积。在一些方面，方法可以进一步包括在生长阶段完成之后，向生物反应器添加另外的生长培养基，以将生物反应器的体积放大至第三体积。在某些方面，接种物是哺乳动物细胞。在其他方面，生物反应器可以具有0.3:1的最小长宽比。

可变直径生物反应器(VDB)，诸如本文中描述的可变直径生物反应器中生物材料(例如微生物和哺乳动物培养物)的生物反应器处理设计用于维持开始于最小接种物的生长条件，在生长持续时间内利用连续和/或推注培养基和/或补料添加来维持生长条件，并获得足以产生期望产物的培养物体积。通过在单个VDB中完成细胞生长和生产，可以消除多个较小体积的生物反应器。单个VDB将减少生产期望产物所需要的生物反应器设备的总占地面积，消除多个种子反应器、多个CIP、SIP、启动操作、运行后操作，并且使目前在使用多个种子生物反应器的情况下观察到的非对数细胞生长或延滞期效应最小化，因此简化总体设施操作，从而节省时间和成本。

例如，单一20,000L VDB可以替换200L N-3、1000L N-2和5000L N-1种子生物反应器。还估计用单一VDB替换3个种子生物反应器可以节省300平方英尺的洁净室空间。

在一些方面，利用用于生物反应器的下部部分的圆锥形或更小直径的圆柱几何形状和用于上部部分的圆柱形设计允许在一个生物反应器内可控的放大，从而提供了关于混合和充气的关键设计益处。例如，可以维持使用具有长宽比大于1:1(液位处的液体高度与容器宽度)的可变直径圆锥形或更小直径的圆柱形底罐以在对于增大到更大体积培养期间氧气转移足够的液体头部的情况下支持最小的接种体积。然后可以通过添加培养基以维持细胞生长来扩大培养体积。与典型的固定直径圆柱形罐式生物反应器设计相比，替代性底部设计可以实现更高的长宽比和以更低的体积运行的能力。

如本文所用，“生物材料”应理解为是指全部或部分由活的或死的细胞或病毒材料和/或细胞或病毒培养物产生和表达的产物组成的颗粒。例如，这可以包括真核或原核细胞，例如细菌、哺乳动物、植物、真菌、病毒如talimogene laherparepvec(T-VEC)，或任何其他期望的治疗或生化产物。在某些方面，“生物材料”包括为细胞疗法程序产生的细胞。在某些方面，“生物材料”包括为病毒疗法生产的病毒，包括病毒基因疗法、病毒免疫疗法或原生动物病毒疗法。在一些方面，“生物材料”包括用于发酵生产如本文所述的产物，例如产物变体的细胞或病毒培养物。在一些方面，生物材料可以包括惰性材料，例如基底或固定化材料。此外，如本文所用，“液体培养基”应理解为是指通常在生物反应器过程中使用的任何液体，例如生长培养基、水、接种物和生物材料。液体培养基可以具有悬浮、乳化、夹带或以其他方式存在于液体培养基中的固体颗粒和/或气体。

如图所示，可变直径生物反应器可以具有多个构造，其允许在单个生物反应器容器内从接种物到种子和生产的有效放大。在一些方面，当生物反应器培养基体积相对于传统的垂直圆柱均匀直径反应器较低时，可变直径生物反应器可以具有更合适的长宽比。从低体积接种直至生产体积的培养基或补料的添加也为细胞生长提供了稳定化的环境，这是因为废物得到稀释并且新鲜营养物不断被引入和混合。在一些方面，示例性可变直径生物反应器可以被配置用于发酵过程，并且可以是分批、补料分批或连续或灌注生产，并且生产方法可以随生物反应器容器内的培养阶段和体积阶段而改变。例如，在初始接种阶段期间，可以使用分批或补料分批过程。然后，一旦细胞生长阶段达到成熟并且生物反应器的体积放大到其期望的限度，就可以利用连续或灌注过程。本文所述的可变直径生物反应器可以由任何合适的材料形成并且可以被配置用于一次性使用的一次性系统。在一些方面，反应器可以配置为用于单型系统或多产物套件中。

此外，可变直径生物反应器可以配置为具有任何期望的总体积。如要更详细讨论的，VDB可以具有约20,000升(L)的总容积，但也可以设计具有例如1,000L总容积，或甚至10L总容积VDB。例如，10L总体积VDB也可以用于工艺开发或缩小研究，而1000L的体积可以充当中试规模的生物反应器。图1-3显示了具有圆锥形下部部分和圆柱形上部部分，由此改变上部圆柱形部分的高度以实现各种期望体积的可变直径生物反应器的实例。

图1显示了可变直径生物反应器(VDB)100。可变直径生物反应器100包括具有第一直径的第一容器部分102和具有第二直径的第二容器部分104，该第一直径配置为容纳液体培养基或生物材料培养物，如合适的细胞，该第二直径大于第一直径，从而可以将液体培养基从容器内第一体积增加到第二体积。可变直径生物反应器100还具有至少一个入口，例如人用道106，以及至少一个出口108。

图2显示了可变直径生物反应器(VDB)200，其具有相对于图1所示的可变直径生物反应器的上部圆柱形部分的高度降低的上部圆柱形部分的高度。可变直径生物反应器200包含第一容器部分202和第二容器部分204，所述第一容器部分202具有配置为容纳液体培养基的第一直径，所述第二容器部分204具有大于第一直径的第二直径。可变直径生物反应器200还具有至少一个入口，如人用道206，和至少一个出口208。

图3显示了可变直径生物反应器(VDB)300，其具有相对于图2所示的可变直径生物反应器的上部圆柱形部分的高度降低的上部圆柱形部分的高度。可变直径生物反应器300包含具有第一直径的第一容器部分302和具有第二直径的第二容器部分304，所述第一直径配置为容纳液体培养基，所述第二直径大于第一直径。可变直径生物反应器300还具有至少一个入口，例如人用道306，和至少一个出口308。

图4显示了可变直径生物反应器(VDB)400。可变直径生物反应器400包含第一容器部分402、第二容器部分404和第三容器部分406。第一容器部分具有沿容器的高度变化的直径，即第一容器部分402的直径和第二容器部分404的直径朝向生物反应器400的顶部增大。然而，如图所示，第三部分406的直径在整个部分406中保持相对均匀。

图5显示了可变直径生物反应器(VDB)500。可变直径生物反应器500包含第一容器部分502、第二容器部分504和第三容器部分506。第一容器部分具有沿容器的高度逐步变化的直径，即随着容器向上移动，第三容器部分506的直径大于第二容器部分504的体积，所述第二容器部分504的体积大于第一容器部分502的体积。如所示，在此方面中，每个阶段的直径在整个阶段中是均匀的，其中第一阶段502和第二阶段504之间有梯度增加，而第二阶段504和第三阶段506之间的直径有另一个梯度增加。

图6-9显示了各种生物反应器设计的示例长宽比和体积。如上所述，长宽比定义为容器的高度与宽度或直径之比。如所示，图6-9的反应器可以具有范围为约0升至25,000升(L)的体积。

图6是具有均匀直径的典型生物反应器600(即，不是可变直径的生物反应器)。典型的生物反应器600仅具有单个容器部分608，并且具有生物反应器高度602、体积604和长宽比606。典型的生物反应器600具有表1中所示的生物反应器高度602和长宽比606。如所示，在低体积，例如800L时，典型的均匀直径反应器的长宽比显著低于0.3。此外，均匀直径生物反应器需要以至少0.65或更高的长宽比操作，该长宽比在图6中代表约10,000L的体积。因此，均匀直径的生物反应器需要逐渐增加培养物体积的多个种子生物反应器，以实现最佳操作期望的培养物体积。

图7、8和9显示了不同配置的可变直径生物反应器，它们都能够以分别消除200L、1000L和4000L的多个种子生物反应器需要的期望体积运行。

图7显示了具有生物反应器高度702、体积704和长宽比706的示例性可变直径生物反应器(VDB)700。如所示，生物反应器700具有第一容器部分708、第二容器部分710和第三容器部分712。示例性生物反应器700具有表2中所示的生物反应器高度702、长宽比706和体积704。

图8显示了具有生物反应器高度802、体积804和长宽比806的示例性可变直径生物反应器(VDB)800。如所示，生物反应器800具有第一容器部分808、第二容器部分810和第三容器部分812。

图9显示了具有生物反应器高度902、体积904和长宽比906的示例性可变直径生物反应器(VDB)900。如所示，生物反应器900具有第一容器部分908和第二容器部分910。示例性反应器800、900具有表3中所示的生物反应器高度802、902和长宽比806、906。

图10和11显示了示例性可变直径生物反应器容器1000和1100。如所示，可变直径生物反应器1000、1200可以具有多种端口、探头、喷雾器和其他部件，诸如下列至少一种：搅拌器轴、叶轮、喷雾器、探头端口、填充端口、冷凝器、排气过滤器、泡沫破碎器板、样品端口、水平探头和测压仪。

图10是具有第一容器部分1002和第二容器部分1004的VDB 1000的示意图。在一些方面，第一容器部分1002具有增加为使得第一容器部分1002为圆锥形的直径。第二容器部分1004可以具有恒定的直径，使得其具有圆柱形形状。如所示，VDB 1000可以具有总生物反应器高度A。在某些方面，总生物反应器高度A可以在约5英尺至约50英尺的范围内。例如，总生物反应器高度可以为约20英尺。另外，如所示，生物反应器的上部部分可以具有高度B，下部部分可以具有高度C，并且生物反应器可以具有液体高度E。液体高度E可以基于期望的生产阶段而变化。在一些方面，下部部分的直径可以沿高度C变化，并且在一些方面，上部部分的直径可以沿高度B保持恒定。

如本文所述，VDB生物反应器的直径可以随着沿着总生物反应器高度A或下部部分高度C的移动而变化。如所示，第一容器部分1002可以具有作为下部部分高度C的函数而增加的直径。沿反应器高度A向上移动将直径增加到例如第二直径D2、第三直径D3和第四直径D4。在一些非限制性方面，例如，D1可以为约1英尺至约3英尺，D2可以为约1英尺至约5英尺，D3可以为约2英尺至约10英尺，并且D4可以为约3英尺至约20英尺。作为一个非限制性实例，VDB生物反应器高度A可以为约20英尺，其中下部部分高度C(锥体高度)为约15英寸，上部部分直径(D4)为约10英寸，底部直径(D1)约2英尺，D2为约3.25英尺，D3约4.8英尺，从而产生约24,909升(L)的总容积，13,789L的下部部分(圆锥)体积和11,120L上部部分(圆柱)体积。注意，在一些方面，诸如在图10中所示，上部部分可以具有均匀的直径，使得D4等于D5。此外，如所示，下部部分可以具有圆锥形状，该圆锥形状具有角度θ，该角度θ可以是适合于为下部部分提供期望的直径和体积的任何角度。应当理解的是，体积容积可以具有盘状底部1016，并且应当理解的是，成角度的顶点1018仅为了说明的目的而显示，并且不需要存在于反应器中。

此外，VDB 1000包含多个搅拌器叶轮1010a、1010b、1010c和1010d。搅拌器叶轮可以配置为提供搅拌，其配置用于布置特定的搅拌器叶轮1010a，1010b，1010c和1010d的特定容器部分1002、1004。如所示，叶轮1010d可以在生物反应器内以高度H布置，叶轮1010c可以在生物反应器内以高度I布置，叶轮1010b可以在生物反应器内以高度J布置，并且叶轮1010a可以在高度K处。例如，高度H、I、J、K可以在约1英尺至20英尺的范围内。在一些方面，搅拌器可以具有沿着VDB 1000的中点1011布置的单个驱动器(未示出)。在一些方面，VDB1000可以在整个生物反应器1000中包含挡板1012。如所示，挡板1012可以沿生物反应器的高度G或F延伸。在一些方面，VDB 1000可以包含多个端口1014。端口1014可以配置为入口、出口、探头诸如pH、温度、氧气或任何其他期望的探头或传感器。VDB 1000也可以包含单一叶轮。

图11是示例性VDB生物反应器1100的示意图。VDB生物反应器1100具有配置为添加和除去生物反应器培养基的入口1102和底部出口阀1104。VDB生物反应器1100可以具有第一容器部分1102、第二容器部分1104和第三容器部分1106。生物反应器具有搅拌器1108，其包括下部搅拌器1110、中间搅拌器1112、上部搅拌器1114和搅拌器电动机和驱动器1116。此外，生物反应器可以包含至少一个喷雾器1118，其配置为允许空气或其他营养物鼓泡通过生物反应器液体培养基。另外，生物反应器可以包含至少一个探头或添加端口1120。生物反应器还可以包括至少一个CIP端口1122。如所示，生物反应器可以配置为具有喷雾器1118、探头和添加端口1120以及容器部分1102、1104、1106之每个中的CIP端口1122。生物反应器可以包含用于控制生物反应器系统的任何合适的控制系统，包括监视和控制喷射、液体培养基的添加和除去、细胞生长和生产、氧气水平、体积、温度、pH值和其他任何期望的成分。在一些方面，控制系统配置为以连续或分批的方式放大生物反应器的体积。另外，生物反应器可以具有布置在其中的至少一个挡板1124，其配置为提供合适的混合条件而不在生物反应器接种物上引起过度的应激，该应激可导致凋亡。另外，生物反应器可以包含可以具有外部绝缘的传热壳1126。VDB 1100还可以包含一个叶轮。

图12是示例性灌注生物反应器的示意图，该灌注生物反应器例如用于获得稳态和/或准稳态培养(例如，其中细胞密度、营养物、废物副产物和/或产物电荷变体随时间保持恒定)。在一些实施方案中，灌注生物反应器可以设计为改进的连续搅拌罐反应器(CSTR)，其中将新鲜的营养培养基以恒定速率例如通过补料泵补料到主培养罐中。在一些实施方案中，可以将浓缩的营养物弹丸(bolus)添加到罐中，例如，以快速或立即改变一种或多种营养物的浓度，例如至期望的浓度。可以例如通过不断从罐中取出物质，例如以与添加新鲜营养物培养基的速率相当的速率来将罐中内容物的体积保持恒定。在一些实施方案中，可以使用反应器规模确定反应器罐中的物质量。在一些实施方案中，可以使用细胞流出泵从罐中除去含细胞的反应器洗脱液(细胞流出)。在一些实施方案中，使用渗透泵(例如，在细胞保留装置后面)从罐中除去无细胞的反应器洗脱液(渗透物)。例如，可以使用电容探头监测活细胞密度，例如其中在1000kHz下测得的电容与活细胞密度的离线测量线性相关。

在使用中，本文所述的可变直径生物反应器可用于生产一种或多种产物，例如一种或多种产物变体，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多个产物变体，允许通过将队列内必要的反应器限制到单个生物反应器来有效使用地面空间。具体而言，可以通过对第一体积的生物反应器接种生长培养基和接种物并向生物反应器添加另外的生长培养基以在完成接种阶段后将生物反应器体积扩大到第二体积来在单个VDB生物反应器中实现产物(例如产物变体)的生产。在一些方面，生物反应器的使用可以包括在生长阶段完成之后向生物反应器添加另外的生长培养基以将生物反应器的体积放大至第三体积。

也就是说，通过将接种生物反应器和所有必需的后续生长或种子反应器浓缩到单个生物反应器容器中，使特定工厂的占地面积最小化。例如，对于20,000升(L)的期望生产体积，可以使用单个20,000L生物反应器，该生物反应器由第一容器部分(即接种容器部分)、第二种子或生长部分以及第三种子或生长容器组成部分。例如，第一容器部分(接种容器部分)可以具有对应于约100L至约200L体积和约0.3:1至约2:1之间的期望长宽比的第一直径。接下来，第二和第三种子容器部分可以将生物反应器体积放大到期望的20,000L量，维持期望的长宽比范围。例如，长宽比可以保持在约0.3:1到约3:1之间。20,000L生物反应器单元可以进行以下中的一项或多项或全部：营养物和/或碳源的补料、注射合适的气体(例如氧气)、发酵或细胞培养基的流动、气相和液相的分离、维持生长温度、维持pH值、搅拌(例如搅动)和/或清洁/灭菌。

例如，在某些方面，此20,000L示例性生物反应器可以在第一体积接种生长培养基和接种物，例如哺乳动物细胞。在此接种阶段，可以以第一体积接种反应器，使得反应器的体积适合于接种物的初始生长。在合适的时间段以允许期望的细胞生长之后，可以将生物反应器放大至第二反应器体积，以实现接种物的第二生长阶段。即，在接种阶段完成后，可以将额外的生长培养基和生长所需的任何其他期望组分添加到生物反应器中，以将生物反应器的体积放大至第二体积。此第二体积可以是适合于接种物所需要的期望的连续生长条件的任何期望的体积。在此第二体积下，可以实现进一步的细胞生长和增殖。在一些方面，可以利用第三、第四或任何数量的增加的体积生长阶段来继续将反应器体积放大至期望的体积。

在一些方面，制备多个变体制剂的方法，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，所述方法包括：

(ai)通过在VDB中接种具有培养物(例如生长培养基)和接种物的第一体积并随后放大至期望的体积来产生细胞群体；

(aii)在第一条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有产物变体1的条件化培养基；

(b)回收产物变体1，例如一批产物变体1(例如，在第一种条件下生产)；

(d)回收产物变体2，例如一批产物变体2(例如，在第二条件下生产)；从而提供多个变体制剂，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，

其中产物变体1(或产物变体1的制剂)与产物变体2(或产物变体2的制剂)的不同之处在于物理、化学、生物学或药学特性。

编号的实施方案

1.制备多个变体制剂的方法，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，所述方法包括：

在配置成允许细胞培养的容器中提供细胞群体；

(a-ii)从培养物中回收产物变体1；

(a-iii)任选地向所述条件化培养基添加替代培养基；

(a-v)任选地回收另外的产物变体1；

(a-vi)任选地组合来自(a-ii)和(a-v)的产物变体1；

(b-ii)从培养物中回收产物变体2；

(b-iii)任选地向条件化培养基添加替代培养基，

(b-v)任选地回收另外的产物变体2；

(b-vi)任选地组合来自(b-ii)和(b-v)的产物变体2；

从一批产物变体1中获得产物变体1；

从一批产物变体2中获得产物变体2；

其中变体1(或变体1的制剂)与变体2(或变体2的制剂)的不同之处在于物理、化学、生物学或药学性质。

2.根据段落1的方法，其中所述多个包括：第三变体的制剂；第四变体的制剂；第五变体的制剂；第六变体的制剂；第七变体的制剂；第八变体的制剂；第九变体的制剂；第十变体的制剂；第十一变体的制剂；第十二变体的制剂；第十三变体的制剂；第十四变体的制剂；第十五变体的制剂；第十六变体的制剂；第十七变体的制剂；第十八变体的制剂；第十九变体的制剂；和/或第二十变体的制剂。

3.制备多个变体制剂的方法，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，所述方法包括：

(b)回收产物变体1；

(c)在第二条件下在培养基中培养所述细胞群体以形成含有产物变体2的条件化培养基；

(d)回收产物变体2；

其中产物变体1(或产物变体1的制剂)与产物变体2(或产物变体2的制剂)的不同之处在于物理、化学、生物学或药学性质。

4.根据段落3的方法，其中所述多个包括：第三变体的制剂；第四变体的制剂；第五变体的制剂；第六变体的制剂；第七变体的制剂；第八变体的制剂；第九变体的制剂；第十变体的制剂；第十一变体的制剂；第十二变体的制剂；第十三变体的制剂；第十四变体的制剂；第十五变体的制剂；第十六变体的制剂；第十七变体的制剂；第十八变体的制剂；第十九变体的制剂；和/或第二十变体的制剂。

5.段落3或4的方法，其中在步骤(b)中回收包括获得在步骤(a)中形成的条件化培养基的等分试样。

6.段落5的方法，其进一步包括从所述条件化培养基的等分试样中回收产物变体1。

7.段落5的方法，其中步骤(b)进一步包括将替代培养基添加到所述条件化培养基。

8.段落7的方法，其中(a)中的所述培养基和所述替代培养基是相同的。

9.段落7的方法，其中(a)中的培养基和替代培养基彼此的不同之处在于一种或多种组分，例如化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖组成、氨基己糖、n-乙酰基氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原剂/氧化剂、缓冲液成分或激素。

10.段落7-9中任一项的方法，其中所述替代培养基的体积小于、等于或大于取出的等分试样的体积。

11.段落7-10中任一项的方法，其中(a)的培养基中的细胞群体包含在容器中。

12.段落11的方法，其中取出的等分试样的体积、添加的替代培养基的体积或两者独立地占整个培养物体积或容器容量的5％至100％。

13.段落11的方法，其中取出的量、添加的替代培养基或两者独立地为每天容器操作的容器体积的0.1至5倍。

14.段落7的方法，其中(b)进一步包括在所述第一条件下进一步培养所述细胞群体以产生另外的条件化培养基。

15.段落7或14的方法，其包括：(bii)回收第二量的产物变体1。

16.段落15的方法，其中在步骤(bii)中回收包括获得进一步的条件化培养基的等分试样。

17.段落15或16的方法，其包括：向先前步骤的培养基添加替代培养基，并重复段落14和15以及任选地段落16的步骤，例如将段落14和15以及任选地段落16的步骤重复X次，其中X为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

18.段落17的方法，其中(a)中的所述培养基和替代培养基是相同的。

19.段落17的方法，其中(a)中的培养基和替代培养基彼此的不同之处在于一种或多种组分，例如化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖组成、氨基己糖、n-乙酰基氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原剂/氧化剂、缓冲液成分或激素。

20.段落17-19中任一项的方法，其中所述替代培养基的体积小于、等于或大于取出的等分试样的体积。

21.段落17-20中任一项的方法，其中(a)的培养基中的细胞群体包含在容器中。

22.段落21的方法，其中取出的等分试样的体积、添加的替代培养基的体积或两者独立地占整个培养物体积或容器容量的5％至100％。

23.段落21的方法，其中取出的量、添加的替代培养基或两者独立地为每天容器操作的容器体积的0.1至5倍。

24.段落15-23中任一项的方法，其包括组合在不同时间获得的变体1。

25.段落15-24中任一项的方法，其包括组合来自多个量、等分试样或批次的产物变体1。

26.段落1-25中任一项的方法，其中在第一条件下将细胞群体培养1天或更多天。

27.段落1-26中任一项的方法，其中在达到参数的目标值之后，在所述第二条件下培养所述细胞群体。

28.段落27的方法，其中所述参数选自：产生的产物变体1的量、在所述第一条件下的培养持续时间或培养物的存活力。

29.段落28的方法，其中所述参数可以进一步选自活细胞浓度。

30.段落1至29中的任一项的方法，包括：对所述培养基或其他条件进行操作以实现所述第二条件。

31.段落30的方法，其中对所述培养基或其他条件的操作包括改变以下中的一项或多项：pH；dO₂水平；搅动；温度；体积；细胞群体密度；培养基成分的浓度；搅动；下列的存在或含量：营养物、药物、抑制剂或其他化学成分(例如，化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖成分、氨基己糖、n-乙酰基氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原剂/氧化剂、缓冲液成分或激素)。

32.段落31的方法，其包括将不同的培养基添加到所述细胞群体。

33.段落1-32中任一项的方法，其中所述细胞群体的培养是灌注生产培养。

34.段落33的方法，其包括在所述培养基转变成第二条件时中断灌注。

35.段落33的方法，其包括在所述培养基转变成第二条件时将灌注物转向至废物。

36.段落1至35中任一项的方法，其中在产物变体2的生产期间从下游单元操作中除去产物变体1。

37.段落1至36中任一项的方法，其包括培养所述细胞直至达到参数的目标值。

38.段落3-37中任一项的方法，其中在步骤(d)中回收包括获得在步骤(c)中形成的条件化培养基的等分试样。

39.段落38的方法，其进一步包括从条件化培养基的等分试样中回收产物变体2。

40.段落39的方法，其中步骤(d)进一步包括将替代培养基添加到所述条件化培养基。

41.段落40的方法，其中(c)中的所述培养基和所述替代培养基是相同的。

42.段落40的方法，其中(c)中的培养基和替代培养基彼此的不同之处在于一种或多种组分，例如化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖组成、氨基己糖、n-乙酰基氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原剂/氧化剂、缓冲液成分或激素。

43.段落40-42中任一项的方法，其中所述替代培养基的体积小于、等于或大于取出的等分试样的体积。

44.段落40-43中任一项的方法，其中(c)的培养基中的细胞群体包含在容器中。

45.段落44的方法，其中取出的等分试样的体积、添加的替代培养基的体积或两者独立地占整个培养物体积或容器容量的5％至100％。

46.段落44的方法，其中取出的量、添加的替代培养基或两者独立地为每天容器操作的容器体积的0.1至5倍。

47.段落40的方法，其中(d)进一步包括在所述第二条件下进一步培养所述细胞群体以产生另外的条件化培养基。

48.段落40或47的方法，其包括(dii)回收第二量的产物变体2。

49.段落48的方法，其中在步骤(dii)中回收包括获得进一步的条件化培养基的等分试样。

50.段落48或49的方法，其包括向先前步骤的培养基添加替代培养基，并重复段落47和48以及任选地段落49的步骤，例如，将段落47和48以及任选地段落49的步骤重复X次，其中X是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

51.段落50的方法，其中(c)中的所述培养基和所述替代培养基是相同的。

52.段落50的方法，其中(c)中的培养基和替代培养基彼此的不同之处在于一种或多种组分，例如化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖组成、氨基己糖、n-乙酰基氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原剂/氧化剂、缓冲液成分或激素。

53.段落50-52中任一项的方法，其中所述替代培养基的体积小于、等于或大于取出的等分试样的体积。

54.段落50-53中任一项的方法，其中(c)的培养基中的细胞群体包含在容器中。

55.段落54的方法，其中取出的等分试样的体积、添加的替代培养基的体积或两者独立地占整个培养物体积或容器容量的5％至100％。

56.段落50-53中任一项的方法，其中取出的量、添加的替代培养基或两者独立地为每天容器操作的容器体积的0.1至5倍。

57.段落48-56中任一项的方法，其包括组合在不同时间获得的变体2，例如产物变体2的多个批次、等分试样或量，例如，组合产物变体2的第一和第二量或批次。

58.段落48-57中任一项的方法，其包括组合来自多个量、等分试样或批次的产物变体2。

59.根据段落1-58中任一项的方法，其中在第二条件下将细胞群体培养1天或更多天。

60.段落1-59中任一项的方法，其中在达到参数的目标值之后，在第三条件下培养细胞群体。

61.段落60的方法，其中所述参数选自：产生的产物变体2的量、在第二条件下的培养持续时间或培养物的存活力。

62.段落61的方法，其中所述参数可以进一步选自活细胞浓度。

63.段落60-62中任一项的方法，其包括操作培养基或其他条件以达到第三条件。

64.段落63的方法，其中操作培养基或其他条件包括改变以下中的一种或多种：pH；dO₂水平；搅动；温度；体积；细胞群体密度；培养基成分的浓度；搅动；下列的存在或含量：营养物、药物、抑制剂或其他化学成分(例如化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖类成分、氨基己糖、n-乙酰基氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原/氧化剂，缓冲液成分或激素)。

65.段落64的方法，其包括将不同的培养基添加到细胞群体。

66.段落1-65中任一项的方法，其中细胞群体的培养是灌注生产培养。

67.段落66的方法，其包括在培养基转变为第三状态时中断灌注。

68.段落66的方法，包括在培养基转变成第三条件时将灌注物转移至废物。

69.段落1-68中任一项的方法，其中在产物变体3的生产期间从下游单元操作中移除产物变体2。

70.段落1-69中任一项的方法，包括培养细胞直到达到参数的目标值。

71.段落1-70中任一项的方法，其中所述多个包括在第三条件下制备的第三变体的制剂。

72.段落71的方法，其中多个包括在第四条件下制备的第四变体的制剂，例如，通过本文所述的用于制备第一或第二个变体的制剂的步骤制备的在第四条件下制备的第四变体的制剂。

73.段落72的方法，其中多个包括在第五条件下制备的第五变体的制剂，例如，通过本文所述的用于制备第一或第二个变体的制剂的步骤制备的在第五条件下制备的第五变体的制剂。

74.段落73的方法，其中多个包括在第N个条件下制备的第N个变体的制剂，例如，通过本文所述的用于制备第一或第二变体的制剂步骤在第N个条件下制得的第N个变体的制剂，其中N等于或大于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30。

75.段落1或2的方法，其中步骤(a)和步骤(b)在同一容器，例如生产培养容器中进行。

76.段落3-75中任一项的方法，其中步骤(a)至(d)在同一容器，例如生产培养容器中进行。

77.段落76的方法，其中所述容器配置为允许以灌注模式操作。

78.段落77的方法，其中所述容器配置为允许在培养期间取出培养基和添加培养基。

79.段落75或78的方法，其中所述容器包含可变直径的生物反应器。

80.段落1-79中任一项的方法，其包括纯化产物变体1。

81.段落1-80中任一项的方法，其包括纯化产物变体2。

82.段落80或81中任一项的方法，其中产物变体在培养细胞群体的容器下游的单元操作中纯化。

83.段落1-82中任一项的方法，其进一步包括针对下列一项或多项，评估第一产物变体(或所述第一产物变体的制剂)与第二产物变体(或第二产物变体的制剂)如何不同：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化；

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

84.段落1-83中任一项的方法，其进一步包括提供产物变体1的制剂。

85.段落1-84中任一项的方法，其进一步包括提供产物变体2的制剂。

86.段落1-85中任一项的方法，其进一步包括提供不同产物变体的多个制剂。

87.段落1-86中任一项的方法，其中第一产物变体(或所述第一变体的制剂)与第二产物变体(或第二产物变体的制剂)的不同之处在于以下中的一项或多项：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化；

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

88.段落1-87中任一项的方法，其包括产生多个产物变体(或产物变体的制剂)，其中所述产物变体(或产物变体的制剂)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个各自彼此的不同之处在于以下中的一项或多项：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化；

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

89.段落88的方法，其包括生产3种产物变体(或产物变体的制剂)，每种产物变体彼此的不同之处在于以下中的一项或多项：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化；

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

90.段落1-89中任一项的方法，其中所述第一条件和/或第二条件是稳态条件。

91.段落63-65中任一项的方法，其中所述条件使稳态条件。

92.段落30-32或63-65中任一项的方法，所述培养基的操作包括向所述培养基添加以下中的一种或一种的浓缩弹丸：所述培养基的组分、营养物、药物、抑制剂或其他化学成分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)，任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)，任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)、任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)、N-乙酰甘露糖胺、丁酸钠、N-乙酰精氨酸或L-精氨酸。

93.段落30-32或63-65中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括增加进入所述反应器的所述培养基(例如，替代培养基)中以下中的一种或多种的浓度：所述培养基的组分、营养物、药物、抑制剂或其他化学成分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)、任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)、任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)、任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)、N-乙酰甘露糖胺、丁酸钠、N-乙酰精氨酸或L-精氨酸。

94.段落30-32或63-65中任一项的方法，，其中所述培养基的操作包括以下中的一项或两项：

a)向所述培养基添加组分的浓缩弹丸，或

b)增加进入所述反应器的所述培养基(例如替代培养基)中组分的浓度，

其中所述组分选自以下中的一种或多种：培养基的组分、营养物、药物、抑制剂或其他化学组分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)、任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)、任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)、任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)、N-乙酰甘露糖胺，丁酸钠、N-乙酰精氨酸或L-精氨酸。

95.段落92-94中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加CuSO₄(例如，通过向所述培养基添加CuSO₄的浓缩弹丸，通过增加进入所述反应器的所述培养基(例如替代培养基)中的CuSO₄的浓度或两者)。

96.段落92-94中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加N-乙酰精氨酸(例如，通过向所述培养基添加N-乙酰精氨酸的浓缩弹丸，通过增加进入所述反应器的所述培养基(例如替代培养基)中的N-乙酰精氨酸的浓度或两者)。

97.段落92-94中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加赖氨酸(例如，通过向所述培养基添加赖氨酸的浓缩弹丸，通过增加进入所述反应器的所述培养基(例如替代培养基)中的赖氨酸的浓度或两者)。

98.段落11-13、21-23、43-45、53-55或73-77中任一项的方法，其中所述容器是生物反应器，例如灌注生物反应器和/或可变直径生物反应器。

99.本文中所述或通过段落1-98中任一项的方法制备或可制备的变体产物的制剂。

100.多个变体制剂，所述多个至少包含本文所述或通过段落1-98中任一项的方法制备或可制备的产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂。

101.容器，例如生物反应器，例如灌注生物反应器和/或可变直径生物反应器，其装载有本文所述的细胞混合物。

102.评估用于制备多个产物变体制剂的方法的进展的方法，其包括：

从而评估用于制备多个产物变体的方法的进展。

103.段落102的方法，其中制备多个产物变体制剂的方法是段1-98中任一项的方法。

104.修改用于生产产物变体的方法的方法，其包括：

生产的产物变体1的量、在所述第一条件下的培养时间或培养物的存活力；

从而修改所述生产产物变体的方法。

105.段落102-104中任一项的方法，其中(b)的目标参数进一步包括活细胞浓度。

106.段落102-105中任一项的方法，其中操作培养基或其他条件包括改变以下中的一项或多项：pH；dO₂水平；搅动；温度；体积；细胞群体密度；培养基成分的浓度；搅动；营养物、药物、抑制剂或其他化学成分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)，任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)，任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)，任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)，N-乙酰甘露糖胺，丁酸钠，N-乙酰精氨酸或L-精氨酸的存在或量。

107.段落106的方法，其包括将不同的培养基添加到细胞群体。

108.段落102-107中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加以下中的一种或多种的浓缩弹丸：所述培养基的组分、营养物、药物、抑制剂或其他化学成分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)，任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)，任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)、任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)、N-乙酰甘露糖胺、丁酸钠、N-乙酰精氨酸或L-精氨酸。

109.段落102-107中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括增加进入反应器的培养基(例如替代培养基)中以下中的一种或多种的浓度：培养基的组分、营养物、药物、抑制剂或其他化学成分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)，任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)，任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)、任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)、N-乙酰甘露糖胺、丁酸钠、N-乙酰精氨酸或L-精氨酸。

110.段落102-107中任一项的方法，其中培养基的操作包括以下中的一项或两项：

a)向所述培养基添加组分的浓缩弹丸，或

111.段落1-98中任一项的方法，其中所述回收的产物变体1是至少50,60,70,80,90,95,99或100％的产物变体1(例如，按重量、体积或摩尔比计)，例如占回收的总产物的百分比。

112.段落1-98中任一项的方法，其中所述回收的产物变体2是至少50,60,70,80,90,95,99或100％的产物变体2(例如，按重量、体积或摩尔比计)，例如占回收的总产物的百分比。

113.段落1-98中任一项的方法，其中对于产物变体1，与从没有在所述第一条件下培养的细胞群体和培养基生产的产物相比，将所述回收的产物变体1富集至少5,10,20,30,40,50,60,70,80,90或100％。

114.段落1-98中任一项的方法，其中对于产物变体2，与从没有在所述第二条件下培养的细胞群体和培养基生产的产物相比，将所述回收的产物变体2富集至少5,10,20,30,40,50,60,70,80,90或100％。

115.段落1-98或111-114中任一项的方法，其进一步包括在回收产物变体1之后评估所述回收的产物变体1。

116.段落115的方法，其中评估所述回收的产物变体1包括评估选自以下的产物质量属性中一种或多种的水平：糖基化、唾液酸化、电荷、序列(例如，N端或C端序列)、同质性、纯度(例如，回收的产物是至少50,60,70,80,90,95,99或100％产物变体1(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为占回收的总产物的百分比))、活性、非活性变体的量、聚集的倾向或聚集、澄清度、脱酰胺、糖化、甲硫氨酸氧化或生产的产物变体1的量。

117.段落1-98或111-114中任一项的方法，其还包括在回收产物变体2之后，评估回收的产物变体2。

118.段落117的方法，其中评估回收的产物变体2包括评估选自以下的产物质量属性中一种或多种的水平：糖基化、唾液酸化、电荷、序列(例如，N端或C端序列)、同质性、纯度(例如，回收的产物是至少50,60,70,80,90,95,99或100％产物变体2(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为占回收的总产物的百分比))、活性、非活性变体的量、聚集的倾向或聚集、澄清度、脱酰胺、糖化、甲硫氨酸氧化或生产的产物变体2的量。

119.段落115-118中任一项的方法，其进一步包括响应于所述回收的产物变体的评估，测定是否添加替代培养基，在当前条件下进一步培养所述细胞群体，或在进一步的条件下培养所述细胞群体。

120.段落1-98或111-119中任一项的方法，其中从单一生产容器，例如生物反应器，例如灌注生物反应器和/或可变直径生物反应器生产所述多个变体制剂。

121.段落120的方法，其中从单一生产容器，例如生物反应器，例如灌注生物反应器和/或可变直径生物反应器连续地(例如，在不中断细胞群体培养，例如以清空和/或清洁所述容器的情况下维持用于主动生产的条件)生产所述多个变体制剂。

122.段落121的方法，其中在比下述时间更短的时间中生产所述多个变体制剂，所述时间是从在类似条件下在中断(例如，用于清空、清洗并且在进一步的条件下重新开始所述细胞群体的培养)的情况下序贯地制备所述多个变体制剂会经过的。

123.段落121的方法，其中消耗或占用比下述资源更少的资源(例如、设备、培养、能源或人员)生产所述多个变体制剂，所述资源会是从在类似条件下在中断(例如，用于清空、清洗并且在进一步的条件下重新开始所述细胞群体的培养)的情况下序贯地制备所述多个变体制剂消耗或占用的。

124.段落99的制剂，其配制为药学有效组合物。

125.药物组合物，其包含段落99的制剂。

126.段落125的药物组合物，其包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

127.多个段落100的变体制剂，其配制为一种或多种药学上有效的组合物。

128.试剂盒，其包含多个段落100的变体制剂。

129.段落128的试剂盒，其中所述多个中的每种变体制剂分别包装到容器中。

130.段落129的试剂盒，其中至少一个容器包括产物变体1，其为至少50、60、70、80、90、95、99或100％产物变体1(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为存在的总产物的百分比)。

131.段落129的试剂盒，其中至少一个容器包括产物变体2，其为至少50、60、70、80、90、95、99或100％产物变体2(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为存在的总产物的百分比)。

132.段落128的试剂盒，其中所述试剂盒包括容器；

其中至少一个容器包含至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％产物变体1(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为存在的总产物的百分比)的产物变体1，或其中至少一个容器包含至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％产物变体2(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为存在的总产物的百分比)的产物变体2；和

其中至少一个容器包含产物变体1和2的混合物。

133.段落1-98或111-119中任一项的方法，其中所述细胞群体包含至少一种CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8GS敲除细胞、CHOZN、CHO-GSKO细胞、CHOXceed细胞或CHO衍生细胞。

134.段落1-98或111-119中任一项的方法，其中所述细胞群体包含至少一种Hela、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS(例如COS1和COS7)、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11或CHOZN细胞，或由此衍生的任何细胞。

135.段落1-98或111-119中任一项的方法，其中所述产物变体选自以下中的一种或多种：抗体分子(例如，单克隆抗体，双特异性抗体)、抗体模拟物(特异性结合抗原，但在结构上与抗体无关的多肽分子，如例如DARPins、affibodies、adnectins或IgNAR)、融合蛋白(例如Fc融合蛋白，嵌合细胞因子)、其他重组蛋白(例如糖基化蛋白、酶、激素)、病毒治疗剂(例如抗癌溶瘤性病毒、用于基因疗法和病毒免疫疗法的病毒载体)、细胞治疗剂(例如多能干细胞、间充质干细胞和成体干细胞)、疫苗或脂质包囊的颗粒(例如外来体，病毒样颗粒)、RNA(如例如siRNA)或DNA(如例如质粒DNA)、抗生素或氨基酸。

实施例

实施例1：同质性蛋白质产物的生产

将与本发明的方法一起使用的生物反应器单元，例如可变直径生物反应器容纳在适当的制造环境，ISO 7级中。将冷冻细胞分开融化，并连接到含有培养基的第一个一次性(SU)生产容器。在受控条件(例如，温度、pH、溶解氧、搅拌)下培养起始的培养物。一旦培养足够的培养物，例如，培养物达到阈值密度，将它转移到含有培养基的生产培养容器。能够以灌注模式操作生产培养容器。生产培养的初始条件(温度、pH、溶解氧、搅拌、培养基)能够生产产物变体1。通过一系列下游纯化步骤纯化含有产物变体1的灌注物，从而得到纯化的产物1。纯化或其他后培养过程可以与后续变体的生产同时进行，或者在生产一些或所有后续变体的一些或全部之后进行。

一旦生产足够量的产物变体1，就操作培养条件，例如降低或升高pH和/或将不同组成的浓缩培养基添加到生物反应器。将灌注中断和/或将灌注物转移至废物。在此阶段期间通过使用适当的清洁和消毒缓冲液对下游单元操作来清除产物变体1。一旦生物反应器达到稳定运行，就可以开始收集和纯化灌注物以生产产物变体2。设想为了生产每种产物变体，需要约2天，因此，在30天的灌注培养持续时间内，可以生产15种不同的产物变体。可以通过培养持续时间或规模，例如灌注更高体积来调整生产的每种产物变体的量。本发明有可能在如图12所示的传统搅拌生物反应器或可变直径生物反应器中采用生产培养物，以便在更宽的培养体积范围操作生物反应器时提供额外的灵活性。

利用本文描述的方法，一种灌注生物反应器可以比相似的补料分批生物反应器或平行的多个补料分批反应器在短得多的时间段内产生多个产物变体。在较大规模(例如2000L)下，从融化冷冻细胞到开始生产培养的持续时间在补料分批生产的情况下可以花费超过30天。本文描述的方法可以将时间段减少到2天或更短。

实施例2：在灌注反应器中生产异质性蛋白质产物

可以在单个生物反应器中生产产物，例如蛋白质，从而获得产物例如蛋白质的多个级分或变体，例如各自具有不同的产物质量属性。在一个实例中，在灌注生物反应器设备中生产这些级分。

如图12所示的示例性灌注生物反应器设备可以设计为获得稳态细胞培养物(其可以称为准稳态)，其中细胞密度、营养物、任何化学物质、废物副产物或产物电荷变体中的至少一种随着时间保持恒定。将设备设计为改进的连续搅拌釜反应器(CSTR)，其中新鲜营养培养基通过补料泵以恒定速率补料到罐，并且不断取出一定量的罐内容物，从而使罐中的液位保持于恒定体积。使用刻度和比例积分(PI)控制器将反应器体积维持于恒定值，以控制总洗脱液速率(其通常定义为渗透液和细胞流出泵速率之和)。PI控制器规定维持反应器质量设定点所需要的总洗脱速率。

在反应器内，在悬浮培养中培养细胞。通过位于罐出口流处的细胞保留装置将细胞保留在反应器设备中。细胞保留装置在允许任何液体可溶成分通过渗透物泵自由离开反应器的情况下将细胞保留在反应器中。液体可溶成分包括营养物、废物副产物和蛋白质产物。由于细胞在有利条件下连续分裂，还使用分开的含有细胞的反应器洗脱液流，其由细胞流出泵控制。

通过控制细胞流出泵速率将反应器细胞密度维持于恒定的设定点。在此实例中，使用电容探头测量活细胞密度，其中以1000kHz测得的电容与活细胞密度的离线测量线性相关。将通过电容测量确定的活细胞密度值输入到PI控制器中，所述PI控制器确定细胞流出泵的速率。通过计算如反应器体积控制器规定为细胞流出的总洗脱液流的比例来确定细胞流出率。以此种方式，通过以等于细胞生长的速率经由细胞流出流除去细胞来控制细胞密度，如由使用电容测量细胞密度的反馈控制器确定的。

上面概述的灌注设备可以用于获得具有不同产物质量属性的多个产物级份。通过创建多个稳态产生这些级份，每个稳态产生具有不同质量属性的产物。通过改变新鲜营养物进料中已知影响产物质量属性的一种或多种营养物或任何其他化学物质的浓度来产生这些离散稳态条件。一旦达到初始稳态(定义为恒定的细胞密度和产物质量属性水平)，根据期望的对产物质量属性的影响，提高或降低影响产物质量属性的一种或多种营养物或任何其他化学物质的反应器浓度。

为了提高营养物的反应器浓度，将所述营养物的浓缩弹丸在将新鲜营养物进料中的营养物浓度增加到期望的反应器浓度的情况下同时添加到反应器。浓缩的营养物弹丸包含足够的营养物，以立即将营养物的反应器浓度提高到新的期望稳态浓度。以此种方式，获得了反应器营养物浓度的几乎瞬时的增加。尽管营养物弹丸不是达到稳态产物质量属性分数所必需的，但它确实用来缩短这样做所需要的时间。为了降低营养物的反应器浓度，将新鲜营养物进料中的营养物浓度简单地降低至期望的反应器浓度。在此种情况下需要额外的时间来获得新的稳态，这是因为由于稀释动力学，必须使营养液的反应器浓度达到新的稳态值。

电荷变体

在一个实例中，使用上文描述的灌注设备获得具有不同电荷变体概况，单克隆抗体(单抗)的产物质量属性的多个产物级份。为了影响产物的电荷变体概况，可以使用对电荷变体具有影响的任何化学物质或营养物。在此实例中，使用硫酸铜(CuSO₄)和赖氨酸来影响电荷变体概况。在此种情况下，使用表达单克隆抗体的GS-/-CHO细胞系生产产物。

实施例3：摇瓶实验以鉴定调节电荷变异的化合物

在一个实例中，鉴定出可用于调节电荷变异的化合物。评估三种不同的化学物质(CuSO₄、赖氨酸和羧肽酶抑制剂N乙酰精氨酸)。简而言之，将表达单抗的Lonza GS^-/-CHO细胞在摇瓶中在添加有CuSO₄(0.4、1.2、2.0μM)、赖氨酸(10、25、50mM)或N-乙酰精氨酸(0.1、1、10mM)的培养基中培养5天。在第5天，收获培养基，在蛋白A树脂上纯化单抗，并测量纯化了的单抗的电荷变异。

CuSO₄的测试剂量均不影响细胞生长(图13A)或培养物的代谢概况。当与缺乏另外的CuSO₄相比时(主：64±0.6％，p<0.01；碱性：21±0.16％，p<0.01；图15A-15C)，2.0μMCuSO₄增加主峰的丰度(69±1.4％)，同时降低碱性峰的丰度(17±1.3％)。

50mM和25mM额外的赖氨酸两者的添加导致细胞生长的降低，如通过存活细胞密度的降低证明(图13B-13C)。当与无另外的赖氨酸相比时(碱性：21±0.2％，p<0.001；主要：64±0.6％，p＜0.001；图14A)，10mM另外的赖氨酸增加碱性峰的丰度(25±0.7％)，同时主峰的丰度降低(61±0.6％)。与赖氨酸相似，N-乙酰精氨酸引起碱性电荷变体的增加，而降低了主峰(图14C)。然而，N-乙酰精氨酸的效果不如赖氨酸的效果稳健，并且不影响细胞生长(图13C)或代谢概况。在补充另外的2.0μM CuSO₄之后，观察到主峰的显著增加和碱性峰的显著下降(图15D)。还计算了这些电荷变体的相对量的变化(图15E)(参见实施例4)。

根据这项研究，2.0μM另外的CuSO₄和10mM另外的赖氨酸各自鉴定为用于调节灌注反应器中电荷变异的有效化合物。

实施例4：在灌注反应器中通过CuSO₄调节电荷变异

在灌注反应器中生长25天后，每天取出来自中空纤维过滤器的灌注物侧的30mL保留物，并在-80℃贮存，用于蛋白A纯化和随后的电荷变异分析。在基础条件下生长5天后(第25至29天)，经由添加营养物弹丸立即给反应器中的CuSO₄浓度补充额外的2.0μM CuSO4。同时，将含有另外的2.0μM CuSO₄浓度的新培养基袋附着并灌注到反应器4天。在引入另外的2.0μM CuSO₄的一天之内，电荷变异曲线变为新的稳态。当与基础条件的电荷变异概况相比时(主：68±0.5％，p<0.001；碱性：14±0.3％，p＜0.05)，此种新的电荷变异状态具有更高的主峰丰度(72±0.3％)和更低的碱性峰丰度(11±0.3％)。这些丰度变化等于主峰相对丰度增加6％和碱性峰相对丰度减少14％(图15E)。相对丰度是对于基础条件下的电荷变体，在较高CuSO₄浓度下观察到的电荷变体与基础条件下的带电荷变体之间的差异，以百分比表示。该实验证明了从单个生物反应器产生两种不同电荷变异概况的能力。

实施例5：灌注反应器中的两种电荷变异调节

为了在单个灌注反应器中显示在相反方向上调节电荷变异概况的能力，进行了四个交替的梯级变化：(i)增加至2.0μM的额外CuSO₄，(ii)返回至基础条件，(iii)增加到10mM另外的赖氨酸，以及(iv)随后返回至基础条件。在该实验的持续时间内，每天抽取来自中空纤维过滤器的灌注物侧的30mL样品，并纯化单抗并分析电荷变异。使用如由电荷变异的稳定确定的稳态值来比较梯级变化之间的电荷变异之差。图16A-16C显示了对于酸性峰(图16A)、碱性峰(图16B)和主峰(图16C)中的每种，面积百分比随时间的变化。观察到的变化将在下面的后续段落中详细描述。

当与转换前(71±0.5％，p<0.0001)和转换后稳态(71±0.2％，p<0.0001)相比时，给灌注反应器补充2.0μM CuSO₄引起主峰丰度的显著增加(74±0.2％)(图17B)。此外，当与转换前(17±0.6％，p<0.0001)和转换后稳态(17±0.2％，p<0.0001)相比时，主峰丰度的此变化伴随着酸性峰的显著降低(15±0.3％)(图17A)。电荷变异的这些变化等于主峰的相对丰度增加4％和酸性峰的相对丰度减少8％。观察到无碱性峰的实质性变化(图17C)。此数据显示了CuSO₄以可逆方式调节电荷变异的能力，因为在CuSO₄之前和之后的稳态电荷变异概况之间没有显著差异(图17D-17E)。

当与转换前的稳态(71±0.2％，p<0.0001)和转换后的稳态(70±0.2％，p<0.0001)相比时，给灌注反应器补充10mM赖氨酸引起主峰丰度的显著降低(64±0.3％)(图18B)。此外，当与转换前的稳态(12±0.3％，p<0.0001)和转换后的稳态(13±0.3％,p<0.0001)相比时，10mM赖氨酸补充后碱性峰的丰度显著增加(20±0.1％)(图18C)。电荷变异的这些变化等于主峰的相对丰度降低10％和碱性峰的相对丰度增加62％。这些数据显示了赖氨酸可以用于以可逆方式调节电荷变异，因为赖氨酸之前和之后的稳态电荷变异概况之间没有显著差异。

在图19A-19D和20A中显示了展示电荷变异的差异的示例性电泳图。通常，通过主峰碱性侧(pI 7.2)上的肩部生长证明CuSO₄的效果(图19B)，而通过以下看到赖氨酸的效果：主峰(pI 7.2)减少和碱性峰，特别是具有pI 7.5的峰增长(图19D)。

这些数据共同证明了在相反方向上单抗质量属性的操作，即，单个生物反应器中在添加化学物质1的情况下质量属性的丰度增加以及除去化学物质1后在添加化学物质2的情况下相同质量属性的丰度降低。

实施例6：方法

该实施例中描述的方法用于本文所述的实验，例如实施例2-5。

用于电荷变异分析的单抗纯化

使用蛋白A旋转柱纯化产生的单抗。简而言之，首先用600uL结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)洗涤旋转柱两次。然后将4.8-6.0mL灌注物以600uL的等分试样应用于蛋白A旋转柱，总共8-10次应用。结合后，通过两次添加400uL洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，0.1M NaCl，pH 3.5)洗脱单抗，并通过添加60uL 1M Tris，pH 9.0中和。随后，使用以下HPLC蛋白A方法确定每个样品中单抗的浓度。

HPLC蛋白A单抗定量

使用蛋白质A柱(0.1mL，Life Technologies；Bedford，MA)完成单抗定量。该方法由两个流动相组成：(i)结合缓冲液(50mM甘氨酸，150mM NaCl，pH 8.0)和(ii)洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，150mM NaCl，pH 2.5)。在注射到HPLC之前，将所有样品在结合缓冲液中以1:1稀释。缓冲液的流速恒定于2mL/min。每个样品的HPLC分析花费约2分钟。层析方法如下：对于前30秒，泵入100％结合缓冲液，接着泵入100％洗脱缓冲液达46秒，然后用100％结合缓冲液再平衡14秒。在二极管阵列检测器上在280nm的波长处测量吸光度。将吸光度与单抗参考标准制剂的标准曲线进行比较，并计算样品中单抗的量。

电荷变异分析

将150ug纯化的单抗添加到Amicon Ultra 30kDa MWCO离心过滤器(一式三份)，并通过在14,000RCF下离心20分钟浓缩至20-30μL体积。然后，将此样品添加到175uL的主混合物溶液(0.5％甲基纤维素，2M尿素，1％Pharmalytes pH 3-10，3％Pharmalytes pH 6.7-7.7和5μL/mL的以下pI标志物：5.85、6.14，8.18)。将每个样品高速涡旋振荡30秒，然后在9300RCF下离心3分钟。然后将150μL样品转移到具有300μL插入物的2mL小瓶中，并放入设置为8℃的iCE 3系统的自动取样器中。然后在1500V下在初始聚焦时段1分钟内，然后在3000V下在最终聚焦时间11分钟内测量电荷变异。

数据分析与统计学

将电泳图从iCE软件中输出为Empower文件，并且输入Empower中进行分析。设计处理方法，其对电泳图中存在的峰进行积分，并计算每个峰的面积百分比。对于这些电泳图的每个，通常观察到7个峰，特别是在6.6、6.9、7.2、7.3、7.5和7.7的pI。按面积计，认为pI 7.2处的电荷变体是主峰，因为它表示具有最大面积百分比的变体。为了分析，认为具有pI 6.6和6.9的变体是酸性变体，而认为pI 7.3、7.5和7.7的变体是碱性变体(参见例如图20所示的示例性电泳图)。为了统计学分析，将这些变体的相应百分比面积的总和相加，以获得总峰面积，并计算出每个相应组相对于总峰面积的百分比面积。然后，在稳态间对面积百分比值取平均值，并且通常使用双因素ANOVA，接着进行Bonferroni事后分析比较平均值。

实施例7：改变半乳糖基化水平

在另一个实例中，使用上文描述的灌注设备产生具有不同半乳糖基化水平的产物的多个级分。涵盖的是，对半乳糖基化具有影响的任何营养物可以用于影响产物的半乳糖基化水平。在该实施例中，使用半乳糖影响产物的半乳糖基化水平。反应器半乳糖浓度在0-10mM的范围内以离散梯级增加调节。允许反应器中产物的半乳糖基化达到稳态值，之后进行接下来的梯级变化。补料到反应器的半乳糖浓度为0、0.01、0.086、0.79和10mM。达到了相应的稳态半乳糖基化值46％、46％、46％、52％和58％。图21显示了在灌注设备中随时间的半乳糖浓度的梯级增加以及产物百分比半乳糖基化的相应变化。图22进一步覆盖了在指示的时间点检测到的反应器中半乳糖浓度。参见例如Downey et al.,Biotechnol Prog.2017Nov；33(6):1647-1661，其通过引用整体并入本文。

Claims

在配置成允许细胞培养的容器中提供细胞群体；

(a-ii)从培养物中回收产物变体1；

(a-iii)任选地向所述条件化培养基添加替代培养基；

(a-v)任选地回收另外的产物变体1；

(a-vi)任选地组合来自(a-ii)和(a-v)的产物变体1；

(b-ii)从培养物中回收产物变体2；

(b-iii)任选地向所述条件化培养基添加替代培养基，

(b-v)任选地回收另外的产物变体2；

(b-vi)任选地组合来自(b-ii)和(b-v)的产物变体2；

从一批产物变体1中获得产物变体1；

从一批产物变体2中获得产物变体2；

2.制备多个变体制剂的方法，所述多个至少包含产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂，所述方法包括：

(b)回收产物变体1；

(d)回收产物变体2；

3.权利要求2或3的方法，其中在步骤(b)中回收包括获得在步骤(a)中形成的条件化培养基的等分试样。

4.权利要求3的方法，其进一步包括从所述条件化培养基的等分试样中回收产物变体1。

5.权利要求3的方法，其中步骤(b)进一步包括将替代培养基添加到所述条件化培养基。

6.权利要求5的方法，其中(a)中的所述培养基和所述替代培养基是相同的。

7.权利要求5的方法，其中(b)进一步包括在所述第一条件下进一步培养所述细胞群体以产生另外的条件化培养基。

8.权利要求5或7的方法，其包括：(bii)回收第二量的产物变体1。

9.权利要求8的方法，其中在步骤(bii)中回收包括获得进一步的条件化培养基的等分试样。

10.权利要求8或9的方法，其包括：向先前步骤的培养基添加替代培养基，并重复权利要求7和8以及任选地权利要求9的步骤，例如将权利要求7和8以及任选地权利要求9的步骤重复X次，其中X为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

11.权利要求10的方法，其中(a)中的所述培养基和替代培养基是相同的。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中在达到参数的目标值之后，在所述第二条件下培养所述细胞群体。

13.权利要求12的方法，其中所述参数选自：产生的产物变体1的量、在所述第一条件下的培养持续时间或培养物的存活力。

14.权利要求1至13中任一项的方法，其包括：对所述培养基或其他条件进行操作以实现所述第二条件。

15.权利要求14的方法，其中对所述培养基或其他条件的操作包括改变以下中的一项或多项：pH；dO₂水平；搅动；温度；体积；细胞群体密度；培养基成分的浓度；搅动；下列的存在或含量：营养物、药物、抑制剂或其他化学成分(例如，化学盐、金属和金属离子、氨基酸、氨基酸衍生物、糖成分、氨基己糖、n-乙酰基氨基己糖、维生素、脂质、多胺、还原剂/氧化剂、缓冲液成分或激素)。

16.权利要求15的方法，其包括将不同的培养基添加到所述细胞群体。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述细胞群体的培养是灌注生产培养。

18.权利要求17的方法，其包括在所述培养基转变成第二条件时中断灌注。

19.权利要求17的方法，其包括在所述培养基转变成第二条件时将灌注物转向至废物。

20.权利要求1至19中任一项的方法，其中在产物变体2的生产期间从下游单元操作中除去产物变体1。

21.权利要求1至20中任一项的方法，其包括培养所述细胞直至达到参数的目标值。

22.权利要求2-21中任一项的方法，其中在步骤(d)中回收包括获得在步骤(c)中形成的条件化培养基的等分试样。

23.权利要求22的方法，其进一步包括从条件化培养基的等分试样中回收产物变体2。

24.权利要求23的方法，其中步骤(d)进一步包括将替代培养基添加到所述条件化培养基。

25.权利要求24的方法，其中(c)中的所述培养基和所述替代培养基是相同的。

26.权利要求24的方法，其中(d)进一步包括在所述第二条件下进一步培养所述细胞群体以产生另外的条件化培养基。

27.权利要求24或26的方法，其包括(dii)回收第二量的产物变体2。

28.权利要求27的方法，其中在步骤(dii)中回收包括获得进一步的条件化培养基的等分试样。

29.权利要求27或28的方法，其包括向先前步骤的培养基添加替代培养基，并重复权利要求26和27以及任选地权利要求28的步骤，例如，将权利要求26和27以及任选地权利要求28的步骤重复X次，其中X是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

30.权利要求29的方法，其中(c)中的所述培养基和所述替代培养基是相同的。

31.权利要求1的方法，其中步骤(a)和步骤(b)在同一容器，例如生产培养容器中进行。

32.权利要求3-31中任一项的方法，其中步骤(a)至(d)在同一容器，例如生产培养容器中进行。

33.权利要求32的方法，其中所述容器配置为允许以灌注模式操作。

34.权利要求33的方法，其中所述容器配置为允许在培养期间取出培养基和添加培养基。

35.权利要求31或34的方法，其中所述容器包含可变直径的生物反应器。

36.权利要求1-35中任一项的方法，其进一步包括针对下列一项或多项，评估第一产物变体(或所述第一产物变体的制剂)与第二产物变体(或第二产物变体的制剂)如何不同：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化；

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

37.权利要求1-36中任一项的方法，其中第一产物变体(或所述第一变体的制剂)与第二产物变体(或第二产物变体的制剂)的不同之处在于以下中的一项或多项：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化；

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

38.权利要求1-37中任一项的方法，其包括产生多个产物变体(或产物变体的制剂)，其中所述产物变体(或产物变体的制剂)中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个各自彼此的不同之处在于以下中的一项或多项：

糖基化(例如半乳糖基化)；

唾液酸化；

电荷(例如pI)；

序列，例如N端或C端序列，

同质性；

纯度；

活性；

无活性变体的量；

聚集的倾向或聚集；

澄清度；

脱酰胺；

糖化；

脯氨酸酰胺化；

二硫化物异质性；

二聚化；

蛋白酶易感性或蛋白水解降解；和

甲硫氨酸氧化。

39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述第一条件和/或第二条件是稳态条件。

40.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加以下中的一种或多种的浓缩弹丸：所述培养基的组分、营养物、药物、抑制剂或其他化学成分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)，任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)，任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)、任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)、N-乙酰甘露糖胺、丁酸钠、N-乙酰精氨酸或L-精氨酸。

41.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括增加进入所述反应器的所述培养基(例如，替代培养基)中以下一种或多种的浓度：所述培养基的组分、营养物、药物、抑制剂或其他化学成分，例如赖氨酸，半乳糖，任何水溶性铜化合物(例如硫酸亚铜或氯化铜)、任何水溶性锰化合物(例如氯化锰)、任何水溶性锌化合物(例如氯化锌)、任何水溶性铁化合物(例如硫酸亚铁)、N-乙酰甘露糖胺、丁酸钠、N-乙酰精氨酸或L-精氨酸。

42.权利要求14-16中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括以下中的一项或两项：

a)向所述培养基添加组分的浓缩弹丸，或

43.权利要求40-42中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加CuSO₄(例如，通过向所述培养基添加CuSO₄的浓缩弹丸，通过增加进入所述反应器的所述培养基(例如替代培养基)中的CuSO₄的浓度或两者)。

44.权利要求40-42中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加N-乙酰精氨酸(例如，通过向所述培养基添加N-乙酰精氨酸的浓缩弹丸，通过增加进入所述反应器的所述培养基(例如替代培养基)中的N-乙酰精氨酸的浓度或两者)。

45.权利要求40-42中任一项的方法，其中所述培养基的操作包括向所述培养基添加赖氨酸(例如，通过向所述培养基添加赖氨酸的浓缩弹丸，通过增加进入所述反应器的所述培养基(例如替代培养基)中的赖氨酸的浓度或两者)。

46.本文中所述或通过权利要求1-45中任一项的方法制备或可制备的变体产物的制剂。

47.多个变体制剂，所述多个至少包含本文所述或通过权利要求1-45中任一项的方法制备或可制备的产物的第一变体(产物变体1)的制剂和产物的第二变体(产物变体2)的制剂。

48.容器，例如生物反应器，例如灌注生物反应器和/或可变直径生物反应器，其装载有本文所述的细胞混合物。

49.评估用于制备多个产物变体制剂的方法的进展的方法，其包括：

(b)获取用于制备多个产物变体制剂的方法朝着一个或多个目标参数进展的值，所述目标参数选自：生产的产物变体1的量、在所述第一条件下的培养持续时间或培养物的存活力；

(d)任选地，响应于已经达到的一个或多个目标参数的测定，操作所述培养基或其他条件以达到第二条件，

从而评估用于制备多个产物变体的方法的进展。

50.修改用于生产产物变体的方法的方法，其包括：

(a)在第一条件下在培养基中培养细胞群体以形成含有所述产物变体(产物变体1)的条件化培养基；

从而修改所述生产产物变体的方法。

51.权利要求1-45中任一项的方法，其中所述回收的产物变体1是至少50、60、70、80、90、95、99或100％的产物变体1(例如，按重量、体积或摩尔比计)，例如占回收的总产物的百分比。

52.权利要求1-45中任一项的方法，其中所述回收的产物变体2是至少50、60、70、80、90、95、99或100％的产物变体2(例如，按重量、体积或摩尔比计)，例如占回收的总产物的百分比。

53.权利要求1-45中任一项的方法，其中对于产物变体1，与从没有在所述第一条件下培养的细胞群体和培养基生产的产物相比，将所述回收的产物变体1富集至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

54.权利要求1-45中任一项的方法，其中对于产物变体2，与从没有在所述第二条件下培养的细胞群体和培养基生产的产物相比，将所述回收的产物变体2富集至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

55.权利要求1-45或51-54中任一项的方法，其进一步包括在回收产物变体1之后评估所述回收的产物变体1。

56.权利要求55的方法，其中评估所述回收的产物变体1包括评估选自以下的产物质量属性中一种或多种的水平：糖基化、唾液酸化、电荷、序列(例如，N端或C端序列)、同质性、纯度(例如，回收的产物是至少50、60、70、80、90、95、99或100％产物变体1(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为占回收的总产物的百分比))、活性、非活性变体的量、聚集的倾向或聚集、澄清度、脱酰胺、糖化、甲硫氨酸氧化或生产的产物变体1的量。

57.权利要求1-45或51-54中任一项的方法，其还包括在回收产物变体2之后，评估回收的产物变体2。

58.权利要求57的方法，其中评估回收的产物变体2包括评估选自以下产物质量属性中的一种或多种的水平：糖基化、唾液酸化、电荷、序列(例如，N端或C端序列)、同质性、纯度(例如，回收的产物是至少50、60、70、80、90、95、99或100％产物变体2(例如，按重量、体积或摩尔比计，或作为占回收的总产物的百分比))、活性、非活性变体的量、聚集的倾向或聚集、澄清度、脱酰胺、糖化、甲硫氨酸氧化或生产的产物变体2的量。

59.权利要求55-58中任一项的方法，其进一步包括响应于所述回收的产物变体的评估，测定是否添加替代培养基，在当前条件下进一步培养所述细胞群体，或在进一步的条件下培养所述细胞群体。

60.权利要求1-45或51-54中任一项的方法，其中从单一生产容器，例如生物反应器，例如灌注生物反应器和/或可变直径生物反应器生产所述多个变体制剂。

61.权利要求60的方法，其中从单一生产容器，例如生物反应器，例如灌注生物反应器和/或可变直径生物反应器连续地(例如，在不中断细胞群体培养，例如以清空和/或清洁所述容器的情况下维持用于主动生产的条件)生产所述多个变体制剂。

62.权利要求61的方法，其中在比下述时间更短的时间中生产所述多个变体制剂，所述时间是从在类似条件下在中断(例如，用于清空、清洗并且在进一步的条件下重新开始所述细胞群体的培养)的情况下序贯地制备所述多个变体制剂会经过的。

63.权利要求61的方法，其中消耗或占用比下述资源更少的资源(例如、设备、培养、能源或人员)生产所述多个变体制剂，所述资源会是从在类似条件下在中断(例如，用于清空、清洗并且在进一步的条件下重新开始所述细胞群体的培养)的情况下序贯地制备所述多个变体制剂消耗或占用的。

64.药物组合物，其包含权利要求46的制剂。

65.试剂盒，其包含权利要求47的多个变体制剂。