CN110478340A - 喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备肝癌药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备治疗肝癌的药物方面的应用。本发明的发明人偶然发现了喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用，促进了肝癌细胞凋亡的发生；并由此开发了喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在治疗肝癌方面的新用途，为肝癌的新药研发提供了新的思路和方法。

Description

喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备肝癌药物方面的应用

技术领域

本发明涉及一种喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备肝癌药物方面的应用，属于医药技术领域。

背景技术

肝癌是是全球致死率第二位的癌症。在过去十五年，肝癌的发生率增长了近两倍，平均每年有850,000新发肝癌病例。肝癌泛指多种原发性肝肿瘤，包括原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，肝内胆管癌，肝母细胞癌，胆管囊腺癌，血管肉瘤和上皮样血管内皮瘤。

在所有肝癌中，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)为最常见的类型，占肝癌总数的90％以上。HCC是全球十大致死恶性肿瘤之一，男性患者明显多于女性，在亚洲，每年HCC新发病例近500,000例，其中约60％来自中国。

HCC的发生发展与许多因素有关，如乙肝病毒和丙肝病毒的慢性感染，长期酒精摄入等。目前HCC的治疗仍以手术治疗为主，但适宜手术治疗的 HCC患者仅占所有HCC患者的10-20％。索拉非尼和瑞格非尼是现有两个被美国食品与药品监督管理局(FDA)批准用于治疗HCC的药物。然而，索拉非尼对晚期肝癌患者的生存期增益不足3个月，且易产生耐药。因此，研发其他治疗HCC的新药具有十分重要的意义。

很多研究发现，寄生虫与肿瘤存在密切的联系。首先，一些寄生虫可以致肿瘤，如皮肤型利什曼原虫和华支睾吸虫分别可以引起皮肤癌和胆管癌(程燕洁与姚丽君，2010)；其次，一些寄生虫有抗肿瘤的效果，如阿米巴滋养体能够诱导HeLa细胞凋亡(钱旻与张秀华等,2001)；最后，一些抗寄生虫药物也有抗肿瘤的效果，如抗疟疾药物青蒿素，在低浓度下抑制肿瘤细胞增殖 (Hooft and Guy et al.,2013)。广谱抗寄生虫苯并咪唑类药物如阿苯达唑、氟苯达唑可以抑制肿瘤细胞的有丝分裂、介导肿瘤细胞的凋亡、抑制血管生成等(何迎盈与罗治彬等,2011)。考虑到抗寄生虫药物与肿瘤细胞抑制可能存在一些关联性，本领域研究人员也在猜测，也许从现有的抗寄生虫药物中能够筛选出一些抗肿瘤的药物。

目前对于肝癌，尤其是肝细胞性肝癌还没有较好的临床药物，筛选和鉴定候选的肝癌新药也是迫在眉睫。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备治疗肝癌药物中的应用。

优选的，所述肝癌为肝细胞肝癌。

本发明另一方面提供了一种用于治疗肝癌的药物，该药物以喷他嘧啶羟乙基磺酸盐作为药物前体。

本发明再一方面提供了一种治疗肝癌的药物组合物，该药物组合物包含喷他嘧啶羟乙基磺酸盐或者以喷他嘧啶羟乙基磺酸盐作为药物前体的药物和药学上可接受的载体。

本发明提供了一种喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备治疗肝癌的药物方面的应用。本发明的发明人偶然发现了喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用，促进了肝癌细胞凋亡的发生；并由此开发了喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在治疗肝癌，尤其是肝细胞肝癌方面的新用途，为肝癌的新药研发提供了新的思路和方法。

附图说明

图1为喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的分子结构式；

图2为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞MHCC97H的细胞增殖影响的实验结果；

图3为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞Huh7的细胞增殖影响的实验结果；

图4为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞HepG2的细胞增殖影响的实验结果；上述图2至图4中，横坐标为喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的浓度(nM)，纵坐标为相对细胞存活率(Relative Cell Viability)；

图5为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞MHCC97H处理后细胞形态的观察结果；

图6为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对大鼠原代肝细胞(PRH)细胞增殖影响的实验结果；横坐标为喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的浓度(μM)，纵坐标为相对细胞存活率(Relative Cell Viability)；

图7和图8为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐促进肝癌细胞 MHCC97H的细胞凋亡的实验结果；

图9和图10为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐促进肝癌细胞Huh7的细胞凋亡的实验结果；

图11和图12为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐促进肝癌细胞HepG2 的细胞凋亡的实验结果；

图8、图10和图12中，横坐标为喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的浓度(nM)，纵坐标为细胞凋亡率；

图13为实施例4中实验组与对照组小鼠的皮下肿瘤的体积对比图；

图14为实施例4中实验组与对照组小鼠的皮下肿瘤的瘤重分布图。

具体实施方式

本发明的发明人在药物筛选的过程中，偶然发现已知化学物质“喷他嘧啶羟乙基磺酸盐”对肝癌细胞具有显著的杀伤力，可以应用于制备治疗肝癌的药物。

关于喷他嘧啶羟乙基磺酸盐，其英文名称为Pentamidine isethionate，分子式为C₂₃H₃₆N₄O₁₀S₂，具体分子结构如图1所示。喷他嘧啶羟乙基磺酸盐为喷他嘧啶(Pentamidine，PMD)与羟乙基磺酸形成的可溶性盐，正常状态下呈无臭、白色或接近白色的晶体或粉末，溶于二甲亚砜(DMSO)，也易溶于水。关于该物质的稳定性：一般在散装情况下，有光或60℃温度下可以保持稳定，室温下溶解于盐溶液中可在72小时内保持稳定。可以将喷他嘧啶羟乙基磺酸盐溶解于水后的母液浓度调节至10mM，长期于-80℃保存，短期于 -20℃保存。

关于喷他嘧啶，其属于联脒合成衍生物，在现有技术中用作抗原生动物和抗真菌剂，经研究表明其能够与病原体基因组中富含AT的DNA区域相互作用，从而干扰DNA的复制和功能。喷他嘧啶可以用于治疗锥虫病，利什曼病 (例如用于HIV感染患者的锥虫病，利什曼病)，另外，经研究表明喷他嘧啶对某些真菌感染和卡氏肺囊虫肺炎也是有效的。

但现有技术中从未披露过喷他嘧啶及其盐与肝癌细胞的关联性。

本发明的一个具体实施方案中提供了喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备治疗肝癌药物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，喷他嘧啶羟乙基磺酸盐用于制备治疗肝细胞肝癌药物。

另外，在本发明的发明人揭露了“喷他嘧啶羟乙基磺酸盐”在治疗肝癌方面的新用途，本领域技术人员在获知该启示的基础上，可以开发出以喷他嘧啶羟乙基磺酸盐为药物前体的其他抗肝癌新药；以及包含喷他嘧啶羟乙基磺酸盐与药学上可接受载体的组合物，以及或者以以喷他嘧啶羟乙基磺酸盐为药物前体的药物与药学上可接受载体的组合物。

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

除非另有描述，本发明的实施将采用细胞生物学等常规技术，这些均是本领域技术人员所熟知的。这些技术在诸如Bruce Alberts《细胞分子生物学》第5版(2002)等工具书中均有完整的描述，或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1

研究喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞系细胞增殖的抑制作用的实验

本实验采用了三种肝癌细胞系：MHCC97H、Huh7、HepG2。以5000个 /孔细胞量铺96孔板，一个对照组，五个实验组，每组五个重复。种板24小时后，弃掉上清，每孔加入100μl样品。其中，五个实验组样品分别为梯度浓度为50nM，100nM，500nM，1000nM，5000nM的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的培养基溶液(取10mM喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的母液，用DMEM培养基稀释制成)；对照组的样品为溶剂DMSO。

48小时后检测药物对细胞增殖的影响。使用同仁CCK-8终点法试剂盒。实验开始时，提前将试剂盒内带的反应液与无血清DMEM按1:10进行混合，弃掉孔内多余培养基，以每孔100μl CCK-8试剂混合液加入96孔板，30分钟后使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

实验结果如图2至图4所示，图2为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞MHCC97H的细胞增殖影响的实验结果；图3为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞Huh7的细胞增殖影响的实验结果；图4为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞HepG2的细胞增殖影响的实验结果。从图中可以看出，随着喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的浓度增加，实验组测定值与对照组(仅加入溶剂DMSO)组的比值急剧下降，显示药物组活细胞数量相比对照组明显减少。根据图2至图5的数据，可推算喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对肝癌细胞系MHCC97H、Huh7、HepG2细胞的IC50(50％抑制浓度) 分别为14.85±2.77nM、192.40±36.80nM和365.20±59.40nM，该结果显示喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对上述肝癌细胞系的细胞增殖有明显的抑制作用。

之后，对处理后的细胞进行白光和细胞核染色观察喷他嘧啶羟乙基磺酸盐是否影响细胞和细胞核形态。具体操作如下：去除DMEM培养基，使用 PBS清洗每孔细胞，再用4％的甲醛固定15分钟。去除甲醛，用PBS洗细胞两次后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色。15秒后吸去DAPI，用PBS清洗细胞后在镜下观察细胞核形态。结果如图5所示，随着喷他嘧啶羟乙基磺酸盐浓度(0-500nM)增加，活细胞数量逐渐减少，且通过DAPI 进行细胞核染色后，发现在高浓度喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的作用下，有些细胞核明显发生了皱缩与溶解。这些结果表明随着浓度增加，喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对MHCC97H细胞毒性逐步增加。

实施例2

研究喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对大鼠原代肝细胞的毒性作用

使用大鼠肝静脉灌流分离大鼠原代肝细胞(详细分离方法见何文辉博士论文《乙型肝炎病毒感染模型的建立及其早期入侵的分子机制的研究》)，含有胶原的96孔板铺板，并使用原代肝细胞培养基进行培养，其余实施方法与实施例1中所述实验方法相同。

结果如图6显示，随着喷他嘧啶羟乙基磺酸盐浓度增加，各实验组活细胞数量相对于对照组并未见明显下降，这说明喷他嘧啶羟乙基磺酸盐对大鼠原代肝细胞基本没有细胞毒性。

实施例3

研究喷他嘧啶羟乙基磺酸盐促进肝癌细胞的细胞凋亡的实验

将肝癌细胞系MHCC97H、Huh7、HepG2细胞分别接种于12孔板，分别加入梯度浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐，对照组加入等量DMSO。48小时后收取细胞，使用同仁细胞凋亡试剂盒进行检测。

实验结果参见图7至图，其中图7和图8为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐促进肝癌细胞MHCC97H的细胞凋亡的实验结果；图9和图10为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐促进肝癌细胞Huh7的细胞凋亡的实验结果；图11和图12为不同浓度的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐促进肝癌细胞HepG2的细胞凋亡的实验结果。

图7、9和11中，凋亡细胞会被染料AnnixV和PI染色，分别位于图中右上与右下象限。随着喷他嘧啶羟乙基磺酸盐浓度的增加，可以看出发生凋亡的细胞数目越来越多，图8、10和12示出了对应的凋亡率数据结果；可以看出：喷他嘧啶羟乙基磺酸盐可以通过促进细胞凋亡，对肝癌细胞有杀伤作用。

实施例4

研究喷他嘧啶羟乙基磺酸盐降低荷瘤小鼠瘤重的实验

将MHCC97H细胞用PBS重悬后，按照1×10⁷个/ml的浓度进行鼠皮下接种，每组6只小鼠，接种细胞一周后，实验组按照20mg/kg皮下注射药物(喷他嘧啶羟乙基磺酸盐的灭菌水溶液)，每三天接种一次药物，对照组注射灭菌水。4周后将裸鼠处死。测量实验组和对照组的体积和瘤重。

如图13和图14所示，相比对照组，实验组的肿瘤体积减少，重量减少。证明喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在小鼠体内也有杀伤肿瘤的作用。

综上所述，本发明的发明人偶然发现了喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在肝癌治疗方面的新应用。经低浓度(nM水平)的喷他嘧啶羟乙基磺酸盐处理后，肝癌细胞明显产生增殖抑制作用，发生凋亡；并由此开发了喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在治疗肝癌，尤其是肝细胞肝癌方面的新用途，为肝癌的新药研发提供了新的思路和方法。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.喷他嘧啶羟乙基磺酸盐在制备治疗肝癌药物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于：所述肝癌为肝细胞肝癌。

3.一种用于治疗肝癌的药物，其特征在于：该药物以喷他嘧啶羟乙基磺酸盐作为药物前体。

4.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于：该药物组合物包含喷他嘧啶羟乙基磺酸盐或者以喷他嘧啶羟乙基磺酸盐作为药物前体的药物和药学上可接受的载体。