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CN110475872B - 检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测受试者的手足口病(HFMD)的方法。特别地，该方法涉及检测这些受试者的唾液中有前景的生物标志物。在本发明的一个方面，提供了一种用于检测HFMD的方法，该方法包括确定唾液样品中微小RNA(miRNA)的存在，其中唾液样品中miRNA的存在指示HFMD。优选地，miRNA是选自mir‑18b、mir‑125a、mir‑145、mir‑155、mir‑221、mir‑324、mir‑335中的任何一种，并且还包含mir‑23a和mir‑142。

Description

检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测受试者的手足口病(HFMD)的方法。特别地，该方法涉及检测这些受试者的唾液中有前景的生物标志物。
背景技术
HFMD是一种广泛流行的由肠病毒属(Enterovirus)的人类肠道病毒物种A(HEV-A)引起的病毒性疾病，每年在西太平洋地区折磨数百万婴儿和儿童。近年来，柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A16(CA16)和肠病毒71(EV71)是HFMD的主要病因(Wang and Liu,2014)。然而，还报道了由其他HEV-A血清型如柯萨奇病毒A6(CA6)引起的病例数激增。HFMD通常是一种自限性疾病，其特征为发热和丘疹水疱性，有时为斑丘疹、手掌、脚掌、肘部和躯干皮疹以及口腔溃疡(Wang and Liu,2014)。然而，EV71相关的HFMD可以在适度比例的病例中迅速发展成严重的神经系统并发症，如无菌性脑膜炎和急性弛缓性脑膜炎。这些神经系统并发症可能反过来迅速发展为心肺功能衰竭和死亡(Solomon et al.,2010)。尽管神经系统并发症主要与EV71有关(Lin et al.,2003)，但据报道CA16也会导致神经系统并发症(Li,2010)。肠病毒感染可能引起的各种并发症和表现强烈需要快速准确地鉴定肠病毒，以便可以有效地隔离感染的患者以防止进一步传播。
HFMD通过粪便-口腔或液滴途径快速传播，目前由医生通过临床症状和表现进行诊断。对于轻度病例，大多数认为不需要额外的实验室试验(Li et al.,2015)。然而，上述可能导致误诊，并可能加重HFMD在非典型和轻度病例中的扩散。此外，目前还没有治愈HFMD的方法。治疗方案的选择限于减轻身体症状。因此，当存在导致死亡的神经系统并发症的风险时，跨越一系列导致HFMD的病原体的快速且准确的诊断变得至关重要(Chan et al.,2003)。
实验室HFMD诊断的黄金标准是从临床样品如咽喉或表皮囊泡拭子中鉴定病毒分离物(Perez-Ruiz,2003)。可以在人肌肉横纹肌肉瘤(RD)细胞和非洲绿猴肾(Vero)细胞中分离肠病毒，随后可以进行病毒RNA的逆转录聚合酶链反应(PCR)、间接免疫荧光和病毒微量中和测定(Perez-Ruiz,2003)。然而，上述方法相当漫长且耗时(Ooi et al.,2010)。尽管最近开发了利用现代分子例程例如定量实时PCR(qRT-PCR)的快速诊断方法来解决这些问题(Lin et al.,2003)，但由于肠病毒血清型之间的多种遗传差异，这种测定的灵敏性需要显著改善(Liang et al.,2012)。
因此，需要一种用于检测引起HFMD的病毒的改进方法。
在本说明书中列出或讨论明显在先公开的文献，但不应必然将其视为承认该文献是现有技术的一部分或者是公知常识。
本文提及的任何文献均通过引用其全部内容并入本文。
微小RNA(miRNA)是约22个核苷酸的单链RNA分子，其通过各种机制(例如Dicer切割或抑制转译机制)降解其靶mRNA而负调节基因表达(Weber et al.,2010)。与其靶mRNA具有部分互补性，miRNA可独特地调节数百种细胞基因表达，使其成为细胞状态的可能指标。最近开发了针对HFMD的许多基于miRNA的诊断测试，其利用感染患者的血清(Cookson etal.,2012b)(Cui et al.)。然而，已知miRNA易于从人唾液中的外来体(细胞分泌的囊泡)中分离。由于唾液的收集比表皮囊泡、直肠拭子和静脉切开术侵入性小，因此基于唾液的诊断测试对于主要感染儿童的HFMD尤其有益且方便。此外，唾液miRNA具有显著的稳定性和对细胞和物理降解的抗性(Arroyo et al.,2011b)，从而赋予其作为潜在的临床生物标志物。在这里，我们描述了一种唾液miRNA qPCR分析，其能够以接近90％的准确度识别HFMD患者。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了一种用于检测HFMD的方法，该方法包括确定唾液样品中的miRNA的存在，其中唾液样品中的miRNA的存在指示HFMD。
有利地，通过使用径向函数的称为支持向量机的机器学习算法来执行检测方法，所述径向函数发现几种miRNA的miRNA表达中的模式以确定样品中存在的miRNA的量。
“miRNA”意指包括可在RNA沉默和/或基因表达的转录后调节中起作用的任何小的非编码RNA分子。已经在植物和动物(包括人类)中鉴定出数百种miRNA，它们似乎没有内源性siRNA。因此，尽管与siRNA类似，但miRNA仍然是不同的。迄今观察到的miRNA长度为约21-22个核苷酸，并且它们来自较长的前体，这些前体由非蛋白质编码基因转录而来。前体形成在自身互补区域中相互折叠的结构；然后它们由动物中的核酸酶Dicer或植物中的DCL1加工。miRNA分子通过与其靶标精确或不精确的碱基配对来中断转译。miRNA由RNA聚合酶II转录，可以衍生自单个miRNA基因，来自蛋白质编码基因的内含子，或来自通常编码多个密切相关的miRNA的多顺反子转录物。将通常数千个碱基长的前体miRNA通过RNase Drosha在细胞核中加工成70至100-nt发夹形前体。在转运至细胞质后，Dicer进一步加工发夹以产生双链miRNA。然后将成熟的miRNA链整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中它通过碱基对互补性与其靶mRNA结合。在其中miRNA碱基与mRNA靶标完美配对的相对罕见的情况下，它促进mRNA降解。更常见的是，miRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体，影响mRNA稳定性或抑制mRNA转译。
在各种实施方案中，用于检测HFMD的方法包括相对于预定标准确定或检测一种或多种miRNA的表达模式、存在或增加的水平，并且指示HFMD的诊断，并且这样的一、二、三、四、五、六、七、八种或更多种微小RNA包含选自miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-155、miR-221、miR-324、miR-335、miR-23a和miR-142的核苷酸序列，或与其完全互补的核苷酸序列及其组合，包含这些序列中的任一种或与其完全互补的核苷酸序列或其组合的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续碱基的miRNA；与这些序列中的任一种的核苷酸序列或与其完全互补的核苷酸序列或其组合至少80％或85％或90％或95％或更多一致性的微小RNA；或与这些序列中的任一种或其完整互补序列或其组合杂交的核苷酸序列。
“预定标准”意指包括任何预定值或阈值，其确定样品中存在的miRNA的量是否指示从其中取出样品的患者中的HFMD感染。例如，表达水平和模式。
在其他实施方案中，它可以包括任何统计模型，其可以将每个miRNA表达与可以插入从模型开发的回归方程中的值加权。使用SPSS统计软件比较本发明中收集的数据。通常，比较可以是代表大小的任何统计值，包括每个个体大小的排名和每个miRNA的序列的个体排名的统计分析。在本发明中，使用统计程序进行回归分析，以确定样品中测定的miRNA与HFMD感染之间的关联。每个miRNA具有特定的权/值(weight/value)(它们贡献最终决策(决策)的量)。标准化量将经受预定的回归方程，其产生在线性范围内的数字，其最终确定感染状态“是”或“否”。例如，在组合所有特征并使其经历回归方程之后，获得特定miRNA的权重10。这意味着如果获得权重8，那么样品来自HFMD感染者。权重小于8意味着样品来自未感染的患者。接受者操作特征曲线用于确定我们的最佳特异性和灵敏性截止点，如图4和5以及表4所示。下表5示出了在本发明的实施方案中使用的回归方程的实例。
在各种实施方案中，用至少一种与所述miRNA的一部分基本上互补的寡核苷酸引物或探针测定唾液样品中的miRNA的存在。miRNA是选自由miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-155、miR-221、miR-324、miR-335、miR-23a和miR-142构成的组的任一种。在一个实施方案中，该方法包括确定该组中至少两种miRNA序列的存在。在一个实施方案中，该方法包括确定miR-18b、miR-142、miR-155和miR-324的存在。
在其他实施方案中，本发明还提供了用于检测受试者中的HFMD的方法，其中相对于预定的标准或范围的一种或多种微小RNA的差异表达水平(增加的或减少的/不存在的)或差异唾液水平指示HFMD的诊断。例如，相对于没有HFMD的患者样品中的水平，miRNA的水平可以增加或减少(或不存在)。该方法任选地还包括将miRNA的水平(优选为miRNA的标准化水平)与预定标准或范围进行比较的步骤。或者，检测到与没有HFMD的患者相关的预定范围之外的水平则指示HFMD的诊断。
如本文所用，术语“差异表达”是指唾液样品中的一种或多种miRNA的表达模式与来自健康受试者的唾液样品中的一种或多种miRNA的表达模式的定量和定性差异。例如，差异表达的miRNA可以在正常与疾病状况中存在或不存在，或者可在疾病状况对比正常状况中增加或减少。这种定性调节的miRNA可以在唾液样品中显示出在对照或者疾病状况下可检测到的表达模式，但在两者中不可同时检测到。换句话说，当微小RNA的表达在患有HFMD的受试者的唾液样品中，以相对于其在来自没有HFMD的无病受试者的血液样品中的表达水平而不同的水平(更高或更低，存在或不存在)下发生时，miRNA差异表达。差异表达的miRNA的水平可以指样品中miRNA的未校正(原始)或标准化丰度。miRNA水平的比较可以考虑相对于未校正参考值的给定miRNA的未校正量化丰度。或者，给定miRNA的丰度可以表示为相对于该样品中的一种或多种另外的miRNA(或其他内部对照)的比例。在这种情况下，该“标准化”比例将相对于来自健康患者(或没有HFMD的患者)的样品的类似“标准化”参考值进行比较。
例如，检测到的看家(household)miRNA的CT值必须小于35，而任何其他标签的CT值必须小于40。
检测所需的唾液样品的量为50μl。
在各种实施方案中，通过以下方式确定唾液样品中miRNA的存在：(a)离心唾液样品以获得上清液，并过滤上清液；(b)从步骤(a)中获得的过滤上清液中提取RNA；(c)使用步骤(b)中提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA溶液；(d)使用步骤(c)中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应；和(e)用荧光定量PCR仪检测PCR产物，以获得介质(medium)中miRNA的表达水平。
在本发明的另一方面，提供了一种用于在患有HFMD的患者中辅助分类、诊断或确定预后的方法，该方法包括确定唾液样品中的miRNA的存在。miRNA是选自miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-155、miR-221、miR-324和miR-335、miR-23a和miR-142的任一种。
在本发明的另一个方面，提供了用于诊断人类HFMD的试剂盒，该试剂盒包括用于确定唾液样品中的miRNA的存在的测定物(测定，assay)。该试剂盒还包含至少一种与miRNA的一部分基本上互补、或特异性杂交的寡核苷酸引物或探针，或特异性扩增的引物，其中miRNA是选自miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-155、miR-221、miR-324、miR-335、miR-23a和miR-142中的任一种。
在本发明的另一个方面，提供了通过向受试者施用治疗剂来治疗被诊断患有HFMD的受试者的方法。
治疗剂可包含调节选自miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-155、miR-221、miR-324和miR-335、miR-23a和miR-142的miRNA中的任一种的活性或表达的任何分子。
在本发明的一个方面，提供了治疗患有HFMD的受试者的方法，例如，通过向受试者施用有效量的调节靶细胞中的至少一种miRNA的水平的试剂。在一些实施方案中，所述试剂增加或刺激哺乳动物受试者中的miRNA的表达或活性(即，miRNA增强剂)。在其他实施方案中，所述试剂降低或抑制哺乳动物受试者中的miRNA的表达或活性(即，miRNA或miRNA抑制剂)。
“调节miRNA水平的试剂”表示当施用给样品或受试者时，所述试剂增加或减少至少一种miRNA的测量值。在一些实施方案中，miRNA增加或减少为1倍至20倍，或超过20倍的量。在一些特定的实施方案中，miRNA增加或减少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、9倍、10倍、12倍或15倍或更多。在其他实施方案中，miRNA增加或减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％或更多。
miRNA增强剂(增强子，enhancer)是分子，例如核酸分子，其起到增加细胞中的miRNA基因产物水平的作用。在一个变型中，miRNA增强剂包含miRNA或其变体的序列。在另一个变型中，miRNA分子是合成分子。在另一个变型中，miRNA分子包含一个或多个稳定突变。miRNA序列的长度可为12-100个核苷酸。例如，miRNA序列可包含20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、21-23、21-25、12-33、18-24、18-26或21-23个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA序列可包含15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。miRNA的序列可以是前体-miRNA的前13-33或21-25个核苷酸。在一些实施方案中，miRNA的序列可以是前体-miRNA的最后13-33或21-25个核苷酸。
在另一个变型中，miRNA增强剂包含前体-miRNA(pri-miRNA)或其变体的序列。前体-miRNA序列可包含30-300、35-375、45-250、55-200、70-150或80-100个核苷酸。前体-miRNA还可以包含miRNA及其互补物，及其变体。前体-miRNA可以形成发夹结构。发夹可包含基本上互补的第一和第二核酸序列。第一和第二核酸序列可以来自37-50个核苷酸。第一和第二核酸序列可以由8-12个核苷酸的第三序列分开。发夹结构可具有小于-25Kcal/mole(千卡/摩尔)的自由能，如通过维也纳算法使用默认参数计算的，如在Hofacker等人，Monatshefte f.Chemie 125:167-188(1994)中描述的，其内容并入本文。发夹可包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核甘酸的末端环。
相反，miRNA抑制剂降低或抑制哺乳动物受试者中miRNA的表达或活性。在一些实施方案中，miRNA抑制剂是antagomir(安塔够妙)。如本文所用，术语“antagomir”是能够阻断miRNA活性的抗miRNA分子。Antagomir可包含长度总共为12-50或8-50，或8-40，或5-40个核苷酸。在一些实施方案中，antagomir包含总共为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸。antagomir的序列可以包含miRNA序列的互补序列，使得例如抗miRNA与miRNA结合以阻断其活性。
试剂盒可进一步包括水和杂交缓冲液，以促进寡核苷酸引物或探针与可能存在于样品中的miRNA的杂交。
试剂盒的组分可以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，其中可以放置组分，并且优选适当地等分。在试剂盒中存在多于一种组分(标记试剂且标记可以包装在一起)的情况下，试剂盒通常还包含第二、第三或其他另外的容器，其中可以单独放置另外的组分。然而，组分的各种组合可包含在小瓶中。本发明的试剂盒典型地还包括用于容纳核酸的装置，以及用于商业销售的紧密限制的任何其他试剂容器。这种容器可包括注射或吹塑成型塑料容器，其中保留期望的小瓶。当试剂盒的组分在一种和/或多种液体溶液中提供时，液体溶液是水溶液，特别优选的是无菌水溶液。
然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。设想溶剂也可以在另一容器装置中提供。
容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器装置，核酸制剂被放入其中，优选适当地分配。试剂盒还可包含第二容器装置，用于容纳无菌的药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂。
本发明的试剂盒典型地还包括用于容纳用于商业销售的紧密限制的小瓶的装置，诸如例如注射和/或吹塑成型塑料容器，其中保留期望的小瓶。
这种试剂盒还可包括保留或维持寡核苷酸或保护其免于降解的组分。这些组分可以不含RNA酶或保护免受RNA酶影响。这种试剂盒通常在合适的装置中包含用于每种单独试剂或溶液的不同容器。试剂盒还将包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包含的任何其他试剂的说明。说明可包括可实施的变型。
预期这些试剂是本发明试剂盒的实施方案。然而，这种试剂盒不限于上文鉴定的特定项目，并且可包括用于操纵或表征miRNA的任何试剂。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括(comprising)”结合使用时，使用词语“一个(a)”或“一个(an)”可以表示“一个(one)”，但它也与“一个或多个(one or more)”、“至少一个(at least one)”，“和”一个或多于一个(one or more than one)的含义一致。
预期本文所讨论的任何实施方案可以关于本发明的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。
在本发明的另一方面，提供了一种诊断测试系统，其适于执行本发明任何方面所要求保护的任何方法。这种诊断测试系统可包括用于获得包括与受试者样品(例如，在本发明的情况下为唾液)中HFMD的诊断相关的一种或多种miRNA的活性或水平的测试结果的装置；用于收集和跟踪一个或多个个体样品的测试结果的装置；用于将一种或多种miRNA的活性或水平与预定标准进行比较的装置；和用于报告一种或多种miRNA的活性或水平是否满足或超过预定标准的装置。
在本发明的另一个方面，提供了一种计算机程序，包括在计算机可读介质中实现的计算机可执行指令，用于执行本发明任何方面的任何方法步骤实施方案的步骤。
在整个该申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定值的装置或方法的误差的标准偏差。
权利要求中术语“或”的使用是用于表示“和/或”，除非明确指出仅涉及替代方案或者替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅涉及替代方案的定义和“和/或”。
如在说明书和权利要求书中所用，词语“包括(comprising)”(和任何形式的包括(comprising)，例如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)，“具有(having)”(和任何形式的具有(having)，例如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及任何形式的包括(including)，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“包含(containing)”(以及任何形式的包含(containing)，例如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外未列举的要素或方法步骤。
从以下详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解，详细描述和具体实施例虽然表明了本发明的具体实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言从本详细描述中将变得显而易见。
为了使本发明可被完全理解并易于付诸实践，现在将仅通过非限制性实例描述本发明的优选实施方案，该描述参考所附解释说明性附图。
附图说明
在附图中：
图1.显示使用的不同患者队列(群组，cohort)的流程图。在新加坡队列1上进行HFMD感染的潜在miRNA生物标志物的筛选，其由3个EV71、3个CA6和3个健康汇集的唾液组成。随后在“验证集1和2”中在队列汇集的患者上验证来自初步筛选的8个推定的miRNA预测因子。还构建了4种表现最佳的miRNA的二级模型。此处，UTI感染队列包括22名患者。
图2.新加坡HFMD队列1筛选的表达分析(A)基于跨样品组的miRNA表达值的PCA绘图。(B)显示跨不同样品的差异表达的miRNA基因表达谱的热图。
图3：显示新加坡HFMD队列1筛选中显著和非显著miRNA的分布的火山图。A.健康与EV71 B.健康与CA6.进行学生T检验(非参数)，并使用大于4倍的绝对倍数变化和(0.05)的p值确定HIT。
图4.具有不同数量的miRNA标签(signature)的“验证集1”的预测模型的接收者操作特征曲线(ROC)。图例对应颜色代码。VS1.10，验证集一个有10个标签，VS1.4验证集一个有4个miRNA预测因子。
图5.具有不同数量的miRNA标签的“验证集2”的预测模型的接收者操作特征曲线(ROC)。图例对应颜色代码。VS1.10，验证集一个有10个标签，VS1.4验证集一个有4个miRNA预测因子。
图6.在验证集2上用A.8miRNA和B.4miRNA模型计算的HFMD的风险。使用具有非参数曼-惠特尼检验(双尾)的Graphpad Prism 6.0计算显著性。数据点代表一式三份实验的平均读数。***表示p值小于0.0001。
图7.HFMD患者在感染期间和恢复后的风险指数。圆圈表示具有一式三份读数的数据点。三角和蓝线表示使用R中的ggplot2文库通过线性回归计算的趋势线。使用GraphpadPrism 6.0计算显著性，并使用重复测量的配对t检验。*表示p值小于0.05。
图8.维恩图显示样品组之间的HIT重叠
图9：在根据本发明的一个实施方案的两个模型中使用的miRNA的组合物。
图10：新加坡和中国台湾队列中经过验证的miRNA的差异表达。HFMD和健康人群中miRNA表达的箱形图。星号表示HFMD与健康之间的显著性。(***P<10-3，**P<10-2，FDR-调节的ANOVA)
图11：参与模型开发和验证的整体研究设计和患者队列。在3个EV71、3个CA6和3个健康汇集的唾液样品上进行HFMD感染的潜在miRNA生物标志物的筛选。来自初步筛选的8个推定的miRNA预测因子随后用于使用训练集形成诊断模型，该训练集(training set)包括75％的具有支持向量机的“新加坡队列”。使用10倍的k倍验证方法进行交叉验证，并测定两种模型的各自性能。使用包括25％的“新加坡队列”和整个“中国台湾队列”的测试集进行两种模型的盲法验证。
图12：唾液miRnome筛选中HFMD的唾液miRNA表达。(A)PCA绘图基于跨池(pool)的miRNA表达值(每个n＝3)。(B)热图显示不同样品中差异表达的miRNA基因表达谱(n＝3)。火山图用于说明在C.健康与EV71(n＝6)和D.健康与CA6(n＝6)中的新加坡HFMD队列1筛选中显著和非显著miRNA的分布。红色代表具有绝对4倍变化的群体，而显著的miRNA以黄色或绿色表示而红色是不显著的。进行学生t检验(非参数)并且使用大于4倍的绝对倍数变化和小于0.05的p值确定HIT。
图13：miRNA选择和性能调整。A.命中miRNA的逻辑回归。ROC曲线用于显示HFMD诊断中单个miRNA与整个“新加坡队列”的灵敏性和特异性。B.诊断模型的总体准确性通过在“新加坡队列”的训练集中使用支持向量机模型增加miRNA分类器的数量来解决。C.单个miRNA在6-miRNA模型中的重要性。使用R软件中的“插入符号(caret)”包计算每个模型的准确度。“ggplot2”文库用于使用R软件进行说明。
图14：健康和HFMD患者在盲法验证中的风险评分。获得“新加坡队列”的测试集中的(A)6-miRNA模型和(B)4-miRNA模型的HFMD的风险指数。这两个模型也在“中国台湾队列”中使用(C)6-miRNA模型和(D)4-miRNA模型进行验证。圆圈表示具有一式三份读数的数据点。使用R软件中的ggplot2文库构建箱形图。
图15：新加坡和中国台湾队列中命中miRNA的差异表达。健康(橙色)，“新加坡HFMD”(绿色)和“中国台湾HFMD”(蓝色)队列中的miRNA表达的箱形图。星号表示HFMD与健康之间的显著性。(***P<10-3，**P<10-2，**P<0.05，FDR调整的非参数ANOVA，使用邓纳特多重比较检验，使用95％Cl)。
具体实施方式
手足口病或HFMD导致儿童自限性发热和皮疹。然而，在罕见的孤立事件中，它可能导致严重的神经系统并发症和死亡。在新加坡，诊断主要通过评估临床症状表现和病毒基因组含量的聚合酶链反应(PCR)分析来完成。
本发明采用基于实时定量聚合酶链反应(qPCR)的检测来检测HFMD感染患者的唾液样品中循环miRNA谱的变化。最初，我们筛选了患者唾液中miRNA水平的变化，随后选择了显著调节的miRNA以在多个患者队列中进一步验证。将患者的miRNA表达值与多因素回归方法相结合，并确定个体患者的风险评分。我们的使用8个miRNA的评分模型预测了HFMD的疾病状态，总体准确率为88.3％，曲线下面积(AUC)为93.6％。此外，我们观察到通过减少预测因子数量至4个miRNA，仍然可以做出相当准确的预测。可以观察到，4-miRNA模型仍然表现出81.7％的总体准确率，AUC为88.7％。这是证明人类感染状态可以通过在唾液中循环miRNA来诊断的第一项研究。该研究用作许多其他传染病诊断工作流的未来发展的垫脚石，并且作为常规的非侵入性监控平台将非常有用。
实施例1
1.材料和方法
(a).患者样品和感染
从2012年8月至2016年2月，从竹脚(KK)妇幼医院获得了总共35个HFMD疑似咽拭子和唾液临床样品。该采集在CIRB编号2012/448/E下获得新加坡健康中心机构审查委员会(CIRB)的批准。从各个儿童护理中心收集健康的唾液样品，这些中心参加了新加坡国立大学伦理审查委员会批准号B-14-273的唾液收集活动。使用先前在唾液样品中建立的pan-entero PCR反应确认患者样品中肠病毒的存在。
(b).miRNA提取和逆转录
使用生物流体提取试剂盒(Exiqon,Inc.)和1μg的MS2载体RNA(Roche,Ltd.)从50ul的唾液中提取miRNA，并在30μl的水中洗脱。
来自制造商的略微修改的方案用于逆转录RNA。使用通用cDNA合成试剂盒(Exiqon,Inc.)，使用7ul RNA代替2ul以逆转录先前提取的miRNA。在PCR之前使用无RNA酶的水将合成的cDNA稀释20倍，而不是制造商方案中的40倍稀释。
(c).使用miRNA qPCR组进行初步筛选
首先使用血清血浆聚焦的miRCURY LNATM微小RNA PCR(Exiqon,Inc.)筛选唾液池(在结果部分中描述)的失调miRNA。选择该组作为唾液的miRnome(miRNA组)，发现其与来自血清/血浆的那些显著重叠。将合成的cDNA在水中稀释40倍，并将2μl加入到qPCR板的每个孔中。使用ExiLENT绿色预混液(Exiqon,Inc.)根据制造方案进行定量实时PCR反应。
(d).用于验证的单独qPCR分析
使用选择的8种miRNA连同1种标准化RNA，使用单独的qRT-PCR测定进行验证。如上所述提取唾液、逆转录和扩增。分析每个反应的熔化曲线以确保靶的特异性扩增，并且仅考虑具有小于30的CT值的标准化(RNA)的样品用于进一步分析。
(e).统计分析
在初步筛选期间，在两步中完成数据标准化。首先，使用跨越所有板的每个组中存在的板间校准器在所有板上进行板间校准，以最小化运行间的差异。标准化的第二步涉及确定参考基因。使用NormFinder算法(http://www.moma.dk/normfinder-software)分析原始CT值以获得CT值低于30的最稳定存在的miRNA。使用GenEx qPCR分析软件(http:// genex.gene-quantification.info)测定显著失调的miRNA。
使用先前选择的正规化子(normalizer)对来自验证研究的原始CT值进行标准化，并且用SPSS(IBM,Inc.)进一步分析标准化CT值以确定潜在的生物标志物。使用全因子模型进行多项式回归分析以构建预测模型。为了确保最佳模型性能，使用4的较小miRNA来构建另一个模型。虽然来自两个验证集的模型的性能没有受到很大影响(参见结果部分)，但是当使用最大数量的预测因子时，获得了性能最佳的模型。
使用Prism(GraphPad Software,Inc.)使用非参数曼-惠特尼检验计算HFMD和健康组之间的风险评分差异的统计学显著性。使用Prism(GraphPad Software,Inc.)的重复测量的配对t检验计算HFMD感染期间和恢复期后的风险评分的统计差异。
2.结果集1
(a).在HFMD感染的患者和健康个体中的唾液miRNA表达
收集来自多个患者队列的唾液(图1)，其中新加坡队列由34名患者和来自中国台湾队列的22名患者组成，其二者在样品采集时住院治疗HFMD。来自所有患者的唾液样品通过使用改编的pan-entero PCR方案被阳性诊断为HFMD(Cardosa et al.,2003)。我们还收集了25名儿童的健康样品(考虑到诸如年龄、性别和种族的混杂因素)，这些儿童的唾液检测为HFMD阴性(图1)。通过比较汇集的样品(n＝3)的miRNA表达水平进行初步筛选。将EV71、CA6感染的和健康的患者池掺入合成的miRNA，uniSP6，其随后用于检测每个池中的PCR抑制。使用Exiqon的血清血浆miRNA谱分析qPCR阵列评估miRNA表达水平。使用Exiqon的预定义板间校准器完成板间校准。在CT值标准化后，我们应用学生t检验来确定跨池的显著(p<0.05)失调的miRNA。
在先前提到的患者池中分析了总共179种miRNA的丰度。我们的初步筛选将miRNA的子集分类为相对健康池在HFMD唾液中进行显著调节(图3)。单向分层聚类和主成分分析显示两个清晰的聚类，具有健康和肠病毒感染之间的分子miRNA标签的差异模式(图2)。如所预期的，EV71和CA6池相对于健康池表现出相当相似的表达谱(图2)。
为了进一步验证，我们纳入了miRNA标签，其通过学生t检验从筛选中显著区分HFMD与健康。在新加坡HFMD队列2中进一步验证了来自初步筛选的8个miRNA标签和1个正规化子。首先，对不同池的原始CT值进行板间校准。我们使用Gurbb测试在不同的池中进行异常值(离群值)检测，未检测到异常值。在不同的板上测定不同样品的加标水平，UniSp6以获得PCR污染物的显著抑制，因此检测到显著的抑制。通过在不同运行中检测到的最大CT值加1来计算缺失值。我们使用Genorm的Norm Finder算法来预测2个性能最佳的正规化子。然后在健康队列(n＝25)中独立地验证两个正规化子，并且观察到一个正规化子表现不佳，因为在许多样品中未检测到特定miRNA的表达(数据未示出)。因此，选择hsa-miR-23a-3p作为正规化子并用于所有miRNA标签的标准化CT值。将Ct值进行对数转换，并使用学生t检验来确定不同样品中显著调节的miRNA。根据显著性水平对HIT进行分类，并选择来自EV71对健康的前2个HIT，来自CA6对健康的2个HIT和来自EV71和CA6之间重叠的2个HITS(参见下表3和图8)。
表3：选择用于验证的重要miRNA的列表。
(b).用于鉴定HFMD感染的多变量模型
先前选择的9个miRNA表达值用于使用多项式回归方法在新加坡HFMD队列2的患者中开发HFMD预测模型。我们考虑到不依赖于病原体，感染时引发的某些初次免疫反应可能是相似的。因此，在由细菌引起的尿路感染(UTI)患者中也描绘了9个miRNA表达值，并且在开发模型时考虑了这些因素以避免潜在的误诊。我们的精确算法预测了HFMD的疾病状态，总体准确率为88.3％，曲线下面积(AUC)为93.6％(见下表1；图2)。
表1.预测模型对HFMD辨别的表现。用2个验证集和2个miRNA预测因子集构建了4个不同的模型(图1)。显示曲线下面积(AUC，来自接受者操作特征曲线(ROC)，图4、5)以及总体准确率(ACC)、灵敏性(SEN，准确预测HFMD患者为“HFMD”的概率)和特异性(SPE，将健康个体预测为“健康”的概率)。使用SPSS(IBM,Inc.)中的多项式回归计算准确率、灵敏性和特异性。自举法(bootstrapping)完成1,000次，95％Cl。
此外，我们观察到通过减少预测因子数量到4个miRNA(参见表4和图4)，仍然可以做出相当准确的预测。
表4.预测会受到来自新加坡HFMD队列1的显著调节的miRNA的影响的分子途径。Target Scan 2.0用于预测经验证的miRNA的基因靶标。KEEG途径分析用于富集所涉及的途径。
可以观察到，4-miRNA模型仍然显示出81.7％的总体准确率，AUC为88.7％(参见下表2)。
表2.验证集1和2中的患者的病理检查所见
(c).使用来自不同地理来源的患者样品的验证
值得注意的是，我们的患者样品仅在我们研究的三年内仅从医院获得，因此，我们之前验证的标签容易因地理、种族或许多未知命令而有偏差，这还是个问题。为了避免固有的研究偏差，我们将前9种miRNA用于独立的中国台湾HFMD队列(n＝22)，该队列在不同的时间段内被募集。令人惊讶的是，尽管在新加坡队列中进行筛选，但使用相同的9个miRNA标签的中国台湾队列开发的模型仍然非常准确，总体准确率为88.3％，AUC为94.9(表1和图3)。此后，我们使用8和4个miRNA预测因子模型分析了验证集2中的HFMD的风险评分。至于健康控制，我们使用了在一周时间后返回检查后(post-checkup)的患者。实际上，在两种模型中观察到HFMD患者的平均风险评分显著(p值)高于健康对照(图6)。
表5
上表5显示了对有助于上述决策模型的每种miRNA给出的权重。在这里，将标签的标准化CT值进行等式：V＝1/(1+EXP(截距+(权重b×标准化CT))其中b是来自相应模型的给定miRNA的权重。如果V小于给定模型的预定截止点，则患者被认为是HFMD阳性。使用SPSS软件使用ROC分析确定截止点。
最后，我们分析了一组收集的唾液，之后HFMD症状消退(即，在疾病的第一次发作期间检测到肠病毒RNA，但在检查后(复查，post-checkup)无法检测到)。在这些病例中有3例，我们在病毒感染发生期间和之后都有唾液样品。可以看出，一般在临床表现减少后，HFMD的风险评分显著降低。尽管测试的样品数量最低(n＝6)，但可以建议测试可能用于预测HFMD是否已经平息到其中病毒载量被充分降低的水平，以阻止进一步扩散，这可能对患者隔离有用。
3.结果集2
(a)患者信息和研究设计
从多个患者队列中收集本研究中使用的唾液样品(图11)。来自“新加坡队列”(n＝35)和“中国台湾队列”(n＝24)的HFMD患者在样品收集时因症状性HFMD住院，且收集的唾液样品通过使用如前所述的改编的pan-entero PCR方案诊断为肠病毒阳性。我们还收集了来自新加坡的23名儿童的健康样品(考虑诸如年龄、性别和种族的混杂因素)，其唾液样品通过pan-entero PCR检测HFMD阴性。患者特征详情总结于表6中。
表6.HFMD的病理检查所见
筛查人群中HFMD患者的差异miRNA表达。使用Exiqon miRNA qPCR组描绘HFMD和健康样品之间的差异性唾液miRNA表达。通过鉴定汇集的EV71和CA6患者唾液样品中针对健康组(每组n＝3)中的失调miRNA进行初步筛选。用合成miRNA，uniSP6加标(spike)所汇集的样品，其随后用于确保每个池中的PCR抑制剂的不存在。为了减少板对板的变化，使用来自制造商的预定义的板间校准器进行板间校准。通过选择以最小方差稳定表达miRNA来进行miRNA表达标准化，并且使用学生t检验来确定不同池中的显著(p<0.05)失调的miRNA。
总共分析了179种miRNA，并且初步筛选将miRNA的子集分类为在HFMD唾液中相对于健康对照池显著调节。我们发现EV71对健康对照池之间有23个显著表达的miRNA，且CA6对健康对照池之间有10个，其中7个miRNA的重叠使用小于0.05的p值和4倍的绝对变化差异(图8)。在通过主成分分析降低尺寸后，发现筛选阵列的独立重复之间的miRNA表达密切相关(图12A)，并且单向分层聚类分析显示具有健康对照和肠病毒患者之间的分子miRNA标签的差异模式的清晰聚类(图12B)。还进行了基因集富集分析以使用KEEG在代表性途径上分类，并鉴定了涉及病毒感染的许多生物过程，例如内吞作用、细胞骨架调节和MAPK信号传导途径(表3)。之后，选择具有1个来自初步筛选的正规化子(表4)显著失调的8个miRNA标签以使用具有特异性引物的qPCR在个体患者中在“新加坡队列”和“中国台湾队列”中验证。
(b)单个miRNA的诊断性能，特征选择和模型开发
在确定“新加坡队列”中的8-miRNA标签的表达水平后，采用接受者操作特征分析以通过使用R软件中实施的“插入符号”和“ROC”包来评估各个miRNA在给定阈值下的相应灵敏性和特异性。虽然大多数miRNA的表达水平与HFMD的疾病状态呈正相关(图13A)，但hsa-miR-221-3p在诊断HFMD方面表现出最高的准确性，阳性预测值为83.90％，阴性预测值为75.00％。相反，hsa-miR-18b-5p在HFMD鉴定中效果最差，阳性预测值为63.00％，阴性预测值为50.00％。
随后，为了确定是否可以通过整合多个miRNA的表达来进一步提高诊断准确性，支持向量机算法实现了与R软件中的“插入符号”包中的径向核的miRNA表达组合(用于模型训练和验证的R脚本详细显示如下)。值得注意的是，某些miRNA对的表达水平彼此高度相关(数据未示出)，因此为了减少模型中的冗余，我们确定了最佳表现的miRNA和组合，以包括在最终诊断模型中。为了评估，将“新加坡队列”随机分成训练集和具有约束的测试集，使得训练和测试集都包含相同比例的HFMD患者。训练集占整个“新加坡队列”的75％，然后应用于训练其中具有所有可能数目的miRNA和组合的HFMD诊断模型。最后，模型以6个miRNA的85.00％的峰值准确率收敛(图13B)。尽管具有6-miRNA的诊断模型导致具有85.00％的最高诊断准确率，但4-miRNA模型也使得可接受的准确率为80.00％，因此选择用于进一步验证(图13B)。
为了进行特征选择，训练数据集中的两个miRNA表达在所有可能的组合中配对以产生预测模型；然后通过与实际感染状态进行比较，在测试集中确定各个模型的性能。在获得最佳配对之后，使用另外一个miRNA重复该过程成为所有组合中的配对，并且在测试集中再次盲法验证模型以获得具有3个miRNA的表现最佳的模型。重复迭代直到所得模型的预测性能没有显著改善预测性能。
(c)使用训练集中的10倍交叉验证和测试集中的盲法评估的诊断模型的性能评估
由于训练数据集的大小相对有限，为了避免过度拟合，我们利用10倍交叉验证方法来适当地评估前面6-miRNA和4-miRNA诊断模型的性能。不是包含单独的验证集，10倍交叉验证方法将训练数据集等分为10个部分；用9个部分的数据集训练诊断模型，在数据集的剩余一个部分上测试模型性能，并重复该过程10次迭代。模型在训练集中的最终表现是通过平均每轮的准确率、灵敏性和特异性来确定的(表7)。
表7.在HFMD辨别中的预测模型的表现在“新加坡队列”的训练集上用miRNA表达构建4和6个miRNA预测因子模型。在“新加坡队列”和“中国台湾队列”的测试集上评估这两个模型。总体准确率(ACC)与灵敏性(SPE，将健康个体预测为“健康”的概率)一起显示。使用在R.k-倍中实施的包“crossval”计算各自的准确率、灵敏性和特异性。使用包“插入符号”进行交叉验证并重复10倍。
正如预期的那样，6-miRNA模型在诊断HFMD方面与4-miRNA对应物相比稍微更有效，准确率提高约4％。
此外，模型的拟合也以盲法方式评估，用于估计的和真实感染状态与测试数据集之间的差异，其构成“新加坡队列”的25％。令人惊讶的是，6和4个miRNA模型在对盲法HFMD病例进行分类时用测试集数据表现出色，各自的准确率分别为92.86％和91.67％(表7)。如此高的准确率是盲法测试集数据中风险得分分离很好的结果(图14A和14B)，这反映了我们模型中的适当复杂性，避免了过度拟合与方差和偏差之间的精细平衡。
(d)对来自不同地理来源的HFMD患者的盲法模型评估
值得注意的是，我们的患者样品仅在我们研究的三年内从一家医院获得，因此我们之前验证的miRNA标签可能容易因地理、种族或其他未知因素而有偏差。为了避免固有的研究偏差，我们评估了HFMD诊断模型对单独的中国台湾HFMD队列的表现，其包括来自中国台湾的24名HFMD患者和23名健康个体。来自中国台湾的HFMD患者样品是在与新加坡样品不同的时间段内获得的。有趣的是，尽管最初的模型开发是使用“新加坡队列”进行的，但HFMD诊断模型在区分中国台湾的HFMD方面仍具有显著的准确性，6-miRNA模型的总体准确率为77.08％，且4-miRNA模型的总体准确率为68.75％(表7)。我们还分析了“中国台湾队列”中的HFMD的风险评分，并且发现在8个(图14C)和4个miRNA模型(图14D)中，观察到HFMD患者的平均风险评分显著高于健康对照，p值小于0.0001。
4.讨论
开发稳健的HFMD测试试剂盒受到许多因素阻碍。首先，已知HFMD由多种肠病毒引起，例如EV71、CA16、CA6，并且在某些情况下，还由艾柯病毒引起。此外，EV71本身具有许多株系，它们表现出广泛变化的基因组和衣壳结构。先前的原因有效地使得开发一种测定法极具挑战性，该测定法将使所有引起HFMD的肠病毒株系交叉反应，同时保持良好的特异性和灵敏性。我们的测试试图通过识别由HFMD独特引起的一般miRNA标签反应来解决那些问题。该测试在临床环境中更为理想，使得：(1)它需要50ul唾液的适度起始材料；(2)唾液的收集是非侵入性的；(3)从提取到数据分析的miRNA的完整分析(分型、谱图化，profiling)可以在仅仅4小时内完成，这比普遍接受的目前的传统pan-enteroPCR方法显著更短，传统pan-enteroPCR方法需要凝胶电泳或病毒分离，其需要数周才能完成；(4)我们还观察到跨度为7天的个体中的标签miRNA水平的显著性分离与喉拭子样品中的病毒载量相关(图7)。这表明该模型可用于隔离受感染的个体，直到标签恢复正常以控制疾病在人群中的传播。
最近报道了许多旨在用作HFMD诊断标志物的miRNA(Cui et al.；Jia et al.,2014)。许多这些测试在有症状的HFMD患者中使用血清miRNA，特别是那些感染特定株系EV71的患者。尽管已知血清和唾液中存在的miRNA高度相似(Weber et al.,2010)，但我们没有观察到我们的研究与其他先前报道的HFMD患者血清分布(profiling serum)的标签显著重叠。据我们所知，本研究首次尝试在HFMD患者中进行基于唾液的miRNA分析，而之前的研究则集中在血清标志物上(Cui et al.；Wang et al.,2016)。在我们研究中验证的6和4个miRNA中，发现hsa-miR-221-3p是两个组中最重要的miRNA。此外，Wang等人报道，在严重EV71病例中，hsa-miR-221-3p也显著下调(Wang et al.,2016)。虽然我们研究中发现的所有其他miRNA与之前发表的不同，但由于我们的研究使用的是唾液而不是血清，因此预计会有这样的发现。
由于以下原因，基于唾液miRNA的HFMD诊断测试在临床环境中更为可取：(1)它只需要50ul的唾液，(2)唾液的收集是非侵入性的且(3)从提取到数据分析的miRNA的完整分析(分型、谱图化，profiling)可以在4小时内完成，这比目前传统的pan-entero PCR方法显著更快，传统的pan-entero PCR方法需要凝胶电泳或病毒分离，需要数天才能完成。一个不太重要但又有趣的问题是，我们研究的标签miRNA是否从受感染的组织或周围未感染的组织中释放出来，作为针对病毒感染的诱发免疫反应。已知在该研究中鉴定的整个miRNA组存在于人血液样品的血清和血浆中(Arroyo et al.,2011a；Cookson et al.,2012a)。已知hsa-miR-221-3p在许多类型的癌症中上调(Calin et al.,2005；Szafranska et al.,2007)，并且miRNA的功能通过抑制ARF4蛋白被认为是细胞凋亡的正调节剂(Wu et al.,2017)。可能的是，在两个我们的HFMD队列中，hsa-miR-221-3p的显著下调似乎表明特异性病毒发病机制可以抑制感染细胞的细胞凋亡(其可能允许进一步复制肠病毒)(图15)(James and Green,2002)。有趣的是，我们发现大多数我们的miRNA预测因子在HFMD期间通常都会上调。在该研究中，发现hsa-miR-324-3p在唾液样品中显著上调(图15)。尚不知道hsa-miR-324-3p表达水平在许多失调的细胞进程如感染和癌症中发生改变。然而，有趣的是，我们还发现EV71、CA16和CA6在ViTa软件(http://vita.mbc.nctu.edu.tw)预测的各自基因组中含有has-miR-324-3p靶位点(http://vita.mbc.nctu.edu.tw)。因此，我们假设hsa-miR-324-3p表达水平的增加可能是针对肠病毒的广谱特异性抗病毒应答，尽管需要进一步的体外研究来巩固这种现象。
以下显示使用ViTA的命中(hit)miRNA靶位点预测，包括用于模型训练和盲法评估的R脚本。
使用ViTA的命中miRNA靶位点预测
人柯萨奇病毒A16
柯萨奇病毒A16多聚蛋白基因，完整cds
登录号-AF177911
人柯萨奇病毒A6
人柯萨奇病毒A6株系Gdula，全基因组
登录号-AY421764
人肠病毒71
人肠病毒71基因组RNA，全基因组，亚株：BrCr-TR。
登录号-AB204852
人肠病毒71
肠病毒71多聚蛋白基因，完整cds。
登录号-AF176044
命中miRNA的个体性能
has-miR-18b-5p
has-miR-125a-5p
has-miR-142-3p
hsa-miR-145-5p
hsa-miR-155-5p
hsa-miR-221-3p
hsa-miR-324-3p
hsa-miR-335-5p
用于模型训练和盲法评估的R脚本
与“新加坡队列”的92.86％相比，虽然对“中国台湾队列”的盲法评估中的6-miRNA模型的诊断准确率显著低于77.08％；但可以理解的是，由于遗传和表观遗传学的差异，不同地理区域之间的miRNA反应可能略有不同。我们设想在未来将会需要在更大的队列中对HFMD感染患者中存在的病毒滴度和我们的miRNA预测因子水平进行系统比较以微调我们的检测算法。然而，通过给出交叉验证和盲法评估数据，可以安全地假设6-miRNA组合物不太可能被改变。我们相信我们的唾液测试有可能进一步发展成一种护理点设备，其中公众和学校可以使用它来定期监测HFMD以预防疾病传播。
4.结论
本发明提供了用于HFMD感染的可靠诊断平台，其中可以使用唾液，并且一组循环miRNA可以用作健康患者的有前景的辨别HFMD的潜在生物标志物。
尽管在前面的描述中已经描述了本发明的优选实施例，但是所属技术领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节进行许多变化或修改。
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Claims (5)

1.用于确定唾液样品中miRNA组的存在的试剂在制备用于检测手足口病(HFMD)的制品中的用途，其中所述唾液样品中所述miRNA组的存在指示HFMD，并且所述miRNA组选自以下各组：
4-miRNA组，由miR-18b、miR-145、miR-155和miR-324组成；
6-miRNA组，由miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-221、miR-324和miR-142组成；或
8-miRNA组，由miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-155、miR-221、miR-324、miR-335和miR-142组成。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂包括寡核苷酸引物或探针的组，并且所述寡核苷酸引物或探针的组中每一种寡核苷酸引物或探针分别与所述miRNA组中的每一种miRNA的一部分基本上互补。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述唾液样品的量为约50μl。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述唾液样品中所述miRNA的存在通过以下确定：
(a)离心所述唾液样品以得到上清液，以及过滤所述上清液；
(b)从步骤(a)中获得的经过滤的上清液中提取RNA；
(c)使用步骤(b)中提取的RNA进行逆转录反应以得到cDNA溶液；
(d)使用步骤(c)中获得的所述cDNA溶液进行PCR扩增反应；和
(e)用荧光定量PCR仪检测PCR产物，以获得介质中miRNA的表达水平。
5.一种用于诊断人体中HFMD的试剂盒，所述试剂盒包括寡核苷酸引物或探针的组，并且所述寡核苷酸引物或探针的组中每一种寡核苷酸引物或探针分别与miRNA组中的每一种miRNA的一部分基本上互补，其中所述miRNA组选自以下各组：
4-miRNA组，由miR-18b、miR-145、miR-155和miR-324组成；
6-miRNA组，由miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-221、miR-324和miR-142组成；或
8-miRNA组，由miR-18b、miR-125a、miR-145、miR-155、miR-221、miR-324、miR-335和miR-142组成。
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