CN110452952B - 一种glp-1类似物生物活性的检测方法 - Google Patents
一种glp-1类似物生物活性的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及GLP‑1类似物生物活性的检测方法，尤其是利拉鲁肽和杜拉鲁肽生物活性的检测方法。本发明通过用细胞培养基稀释细胞HEK293/GLP1R，用含磷酸二酯酶抑制剂的溶液稀释对照品和供试品，再用试剂盒检测刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪进行读数测定，最后用统计软件拟合实验数据，通过公式计算得供试品的生物活性。该方法较之前的试剂盒检测方法更为准确、快速，且重复性更高，故符合生物制品生物学活性测定方法的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GLP-1类似物生物活性的检测方法。
发明背景
近年来，随着社会经济发展、人口老龄化或生活方式西方化，糖尿病发病率日益提高。流行病学调查结果显示，中国已经成为全世界糖尿病第一大国。糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，在世界范围内日益严重威胁人类健康。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)受体激动剂类药物是一类新型抗糖尿病药物，是人体内一种肠源性多肽类激素，具有促进胰岛素分泌、促进胰岛β细胞增殖和分化的功能，其降糖作用具有血糖依赖性的特点，用药期间低血糖发生风险较低。由于它对胰岛素的刺激具有葡萄糖依赖性，因此不引起低血糖症状。
天然GLP-1因在体内半衰期短不适合临床实用。故开发了很多GLP-1类似物以满足临床治疗作用，现有的GLP-1类似物包括艾塞那肽、利拉鲁肽、利司那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、索玛鲁肽、Taspoglutide、ITCA650以及LAEx40等。
上述GLP-1及其类似物与细胞膜上GLP-1受体(G蛋白偶联受体)相互作用后，细胞内腺苷酸环化酶(adenylatecyclase)被激活，导致胞内cAMP水平升高。通过检测胞内cAMP的水平可计算出对应的GLP-1及其类似物的生物活性。因此，胞内cAMP水平检测法被广泛用于定量测定GLP-1及其类似物的体外生物学活性，目前常用试剂盒来检测细胞内cAMP的水平，但是试剂盒即使在熟练地操作人员操作下，检测结果重复性差，仍很难稳定地得到量效曲线，致使实验费时费力，尤其对于成本高的生物制品的检测而言，更是消耗财力。
发明内容
本发明为了解决上述难题，提供了一种改进的GLP-1类似物的生物活性检测方法。目前市场上的cAMP试剂盒在操作步骤中都会要求在细胞悬液的制备时加入磷酸二酯酶抑制剂，以防止细胞中的cAMP发生降解。
本发明改变传统思维，在细胞用对照品和供试品刺激之前不加入防止胞内cAMP降解的磷酸二酯酶抑制剂，同时将cAMP试剂盒中惯用的蛋白封闭液由BSA溶液改为8％-12％的FBS溶液。通过大量的实验发现，改进后的方法能够稳定准确地得到GLP-1类似物剂量效应曲线，且重复性更高。
本发明建立了一种GLP-1类似物的生物活性检测方法，所述方法包括如下步骤：
一种GLP-1类似物生物活性检测方法，所述方法使用cAMP检测试剂盒，包括以下步骤：
(1)用完全培养基稀释细胞，所述完全培养基中含8％-12％FBS；
(2)用含磷酸二酯酶抑制剂的稀释缓冲液配制GLP-1类似物对照品溶液和供试品溶液；
(3)将步骤(1)稀释后的细胞加入各孔板中，然后在不同孔板中分别加入步骤(2)配制的对照品溶液和供试品溶液，在37℃下进行孵育；
(4)用cAMP试剂盒检测GLP-1类似物刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪进行检测读数；
(5)计算生物活性。
本发明步骤(1)中，优选的细胞为HEK293/GLP1R。
本发明步骤(1)中，优选的完全培养基为DMEM培养基、1％青霉素/链霉素溶液以及8％-12％FBS的混合溶液。
本发明步骤(1)中，优选的细胞稀释浓度为250-1600cells/孔。
本发明步骤(2)中，优选的磷酸二酯酶抑制剂为IBMX。
本发明步骤(2)中，优选的稀释缓冲液中含IBMX的浓度为100-1500nM。
本发明中，GLP-1类似物优选为利拉鲁肽或杜拉鲁肽。
本发明步骤(2)中，优选的利拉鲁肽对照品和供试品检测时的浓度范围为8.19×10-4pM～5000nM，
本发明步骤(2)中，优选的杜拉鲁肽对照品和供试品检测时的浓度范围为0.05pM～500nM。
本发明步骤(3)中，优选的细胞刺激的孵育时间为30-40min。
该检测方法准确，快速，重复性高，可检测GLP-1类似物的生物学活性的变化，能够符合生物制品生物学活性测定方法的要求。测试结果的回收率范围为80％-120％，平均值为102.53％，RSD为10.12％，说明该方法的准确性和重复性较好。
附图说明
图1为cAMP标准曲线量效曲线图
图2为试剂盒改进前检测利拉鲁肽的量效曲线图
图3为在细胞稀释和化合物刺激时都加入IBMX后检测利拉鲁肽的量效曲线图
图4为只在化合物刺激时加入IBMX后检测利拉鲁肽的量效曲线图
图5为FBS替换BSA后的量效曲线图
图6为完全培养基中含不同浓度FBS检测的标准曲线图
图7为检测不同FBS浓度的量效曲线图
图8为IBMX浓度和相应细胞密度的量效曲线图
图9为检测利拉鲁肽浓度的量效曲线图
图10为检测杜拉鲁肽3倍稀释浓度的量效曲线图
图11为检测杜拉鲁肽4倍稀释浓度的量效曲线图
图12为检测杜拉鲁肽5倍稀释浓度的量效曲线图
图13为检测杜拉鲁肽的细胞密度量效曲线图
图14为细胞孵育不同时间的量效曲线图
图15为利拉鲁肽精密度量效曲线图
图16、图17、图18为利拉鲁肽不同理论相对生物活性准确度量效曲线图
图中IBMX和化合物刺激溶液的检测时浓度为细胞悬液和化合物刺激溶液等体积混合后的稀释浓度，即为配制时的二分之一。
图中“GLPC”表示利拉鲁肽，“DLLT”表示杜拉鲁肽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
说明：实施例中的细胞为HEK293/GLP1R细胞购于HD BIOSCIENCES(CHINA)CO.LTD.公司，384孔深孔板和384孔浅孔板分别购于Corning公司和Greiner公司，cAMP试剂盒购于Cisbio公司。
利拉鲁肽参比制剂购于原研公司诺和诺德(比活为1.0U/mg)，利拉鲁肽根据专利WO9808871所述方法制备，杜拉鲁肽参比制剂购于原研公司礼来(比活为1000U/mg)，杜拉鲁肽根据WO2004110472所述方法制备。
所述试剂如无特别说明，均为市售产品。实施例中采用的方法如无特别说明，均采用本领域常规方法。
溶液配制说明：
1)完全培养基：90％DMEM，10％FBS，1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)；用封口膜封口后，4℃保存；
2)IBMX(异丁基甲基黄嘌呤)母液(500mM)：称取IBMX 100mg，再加入DMSO 0.9ml，混匀后分装于EP管中，-20℃保存，配稀释缓冲液前拿出；
3)稀释缓冲液：取完全培养基10ml，加入IBMX母液40μl，混匀后备用，临用新配；
4)cAMP-d2溶液：按照cAMP检测试剂盒进行配制母液并分装于0.2ml EP管中，每支150μl，-80℃保存；临用前，将母液用62AM6PEC试剂盒(Cisbio)中的裂解缓冲液(lysisbuffer)稀释20倍，根据使用量配制适当体积；
5)anti-cAMP-Cryptate溶液：按照cAMP检测试剂盒进行配制母液并分装于0.2mlEP管中，每支150μl，-80℃保存；临用前，用62AM6PEC试剂盒(Cisbio)中的裂解缓冲液(lysis buffer)稀释20倍，根据使用量配制适当体积；
6)cAMP检测试剂混合溶液：临用前，将cAMP-d2溶液与等体积的anti-cAMP-Cryptate溶液混匀。
7)cAMP标准曲线溶液配制：使用完全培养基将cAMP检测试剂盒母液(cAMP标准品)配制并分装于0.2ml EP管中，每支25μl，-80℃保存；于384孔浅孔板中，用单道移液器按表1进行稀释。
表1 cAMP标曲溶液配制
| 序号 | 稀释方法 | cAMP终浓度(nM) |
| S1 | 试剂盒内母液(cAMP标准品) | 2800 |
| S2 | 6μL S1+18μL完全培养基 | 700 |
| S3 | 6μL S2+18μL完全培养基 | 175 |
| S4 | 6μL S3+18μL完全培养基 | 43.75 |
| S5 | 6μL S4+18μL完全培养基 | 10.94 |
| S6 | 6μL S5+18μL完全培养基 | 2.73 |
| S7 | 6μL S6+18μL完全培养基 | 0.684 |
| S8 | 6μL S6+18μL完全培养基 | 0.171 |
注：实施例中如无特别溶液配制说明，则所用溶液见上；有重新定义则以实施例中的配制溶液为准。
生物活性计算公式：
①Delta F的计算
cAMP的响应值以在665nm及620nm处的荧光值的比值来计，通过扣除阴性对照的背景值，最终用delta F来表示，具体公式如下：
其中，A665为检测在665nm波长下的荧光值；
A620为检测在620nm波长下的荧光值。
其中，RatioA为供试品或者对照品化合物的荧光比值；
Rationeg为阴性对照组三个复孔的Ratio平均值。
②cAMP标准曲线绘制：
以log(cAMP浓度)为横坐标，delta F为纵坐标，进行四参数拟合，具体公式如下：
其中，Y1为delta F值；
X1为log(cAMP浓度)值，nmol/L；
A1为曲线下渐近线估值(即bottom值)；
D1为曲线上渐近线估值(即top值)；
B1为曲线的斜率(即HillSlope值)；
IC50为半数抑制浓度，nmol/L。
③活性计算
以log(化合物实际浓度)为横坐标，cAMP浓度(或者delta F)为纵坐标，进行四参数拟合，具体公式如下：
其中，Y2为cAMP值，nmol/L；
X2为log(化合物浓度)值，nmol/L；
A2为曲线下渐近线估值(即bottom值)；
D2为曲线上渐近线估值(即top值)；
B2为曲线的斜率(即HillSlope值)；
EC50为半数效应浓度，nmol/L。
实施例1
(1)所需溶液配制
稀释缓冲液：20ml DMEM中含1000μM IBMX和0.1％BSA。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)用稀释缓冲液稀释至60μM；将此60μM母液用稀释缓冲液稀释至3μM；将3μM母液用稀释缓冲液稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液的制备
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清，1ml稀释缓冲液将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。
细胞稀释：按活细胞个数，用稀释缓冲液将细胞分别稀释至10万个/ml，共2ml，共20万个细胞，每孔5μl，细胞个数为500个/孔，放入25ml加样槽中备用。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中的不同浓度化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔：每孔加入10μl稀释缓冲液；
空白对照孔：每孔加入5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
cAMP标准曲线孔(S)：分别取不同cAMP标准曲线浓度溶液5μl，再加入稀释缓冲液5μl，
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔、空白对照孔和cAMP标准曲线孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
检测cAMP标准曲线孔，绘制得到的cAMP标准曲线量效曲线图见图1，图1中四参数拟合数据和IC50数据见表2。实验得出，利用试剂盒本身提供的方法，在其他条件较优时，检测原研制剂利拉鲁肽仍无量效曲线，实验结果见图2，图2中四参数拟合数据和EC50数据见表3。
表2图1中四参数拟合数据和IC50数据
| Bottom | 1.063 |
| Top | 2155 |
| LogIC50 | 1.476 |
| HillSlope | -0.9593 |
| IC50 | 29.90 |
| R2 | 0.9993 |
表3图2中四参数拟合数据和EC50数据
| Bottom | 133.9 |
| Top | 147.7 |
| LogEC50 | 2.207 |
| HillSlope | 21.31 |
| EC50 | 161.1 |
| R2 | 0.1188 |
实施例2
(1)所需溶液配制
见溶液配制说明部分。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将对照品化合物利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)和供试品化合物利拉鲁肽(1.6mM)用稀释缓冲液稀释至60μM；将此60μM母液用稀释缓冲液稀释至3μM；将3μM母液用稀释缓冲液稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液的制备
实验组1：
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清，1ml稀释缓冲液将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。
按活细胞个数，用稀释缓冲液将细胞分别稀释至16万个/ml，共5ml，共80万个细胞，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中备用。
实验组2：
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清，1ml完全培养基将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。
按活细胞个数，用完全培养基将细胞分别稀释至16万个/ml，共5ml，共80万个细胞，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中备用。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中的不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：每孔加入5μl完全培养基和5μl稀释缓冲液；
空白对照孔(BL)：每孔加入5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
实验组2比实验组1具有显著的量效曲线，且实验组2满足量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5，故得出，实验组2在细胞稀释配制时，以及细胞悬液在与化合物混合之前不加入IBMX可以提高方法的窗口值和稳定性，实验结果分别见图3(实验组1)和图4(实验组2)，其中图3和图4的四参数拟合数据和EC50数据分别见表4和表5。
表4图3中四参数拟合数据和EC50数据
表5图4中四参数拟合数据和EC50数据
| 对照品 | 供试品 | |
| Bottom | 0.5636 | 0.5636 |
| Top | 120.0 | 120.0 |
| LogEC50 | -0.8723 | -0.8003 |
| HillSlope | 1.066 | 1.066 |
| EC50 | 0.1342 | 0.1584 |
| R2 | 0.9942 | 0.9972 |
实施例3
(1)所需溶液配制
培养基1：0.1％BSA+DMEM，称取BSA约5mg，加入5ml DMEM，溶解并混匀。
培养基2：3％FBS+DMEM，取FBS 0.15ml，加入DMEM定容至5ml，混匀。
稀释缓冲液1：0.1％BSA+DMEM，称取BSA约5mg，加入5ml DMEM，溶解并混匀，再加入IBMX母液20μl，混匀。
稀释缓冲液2：3％FBS+DMEM，取FBS 0.15ml，加入DMEM定容至5ml，混匀，再加入IBMX母液20μl，混匀。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)分别用稀释缓冲液1/2稀释至60μM；将60μM母液用稀释缓冲液1/2稀释至3μM；将3μM母液用稀释缓冲液1/2稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次用稀释缓冲液1/2梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液的制备
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清。
0.1％BSA组：1ml稀释缓冲液1将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。按活细胞个数，用培养基1将细胞稀释至16万个/ml，共2ml，共32万个细胞，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中。
3％FBS组：1ml稀释缓冲液2将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。按活细胞个数，用培养基2将细胞稀释至16万个/ml，共2ml，共32万个细胞，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中。
c)化合物刺激：
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：每孔加入5μl稀释缓冲液1/2和5μl培养基1/2；
空白对照孔(BL)：每孔加入5μl稀释缓冲液1/2和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
3％FBS的蛋白浓度与0.1％BSA相当，实验结果得出：蛋白浓度相当的情况下，选用FBS比选用BSA检测利拉鲁肽得到的窗口值更高，量效曲线更明显，且3％FBS组满足量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5，故在蛋白浓度相当时，选用FBS溶液比选用BSA溶液，系统适应性更好。实验结果见图5，其中图5中四参数拟合数据和EC50数据见表6。
表6图5中四参数拟合数据和EC50数据
| 3％FBS | 0.1％BSA | |
| Bottom | -0.2953 | --0.6813 |
| Top | 133.4 | 109.0 |
| LogEC50 | -0.03230 | 0.04665 |
| HillSlope | 1.079 | 0.9287 |
| EC50 | 0.9283 | 1.113 |
| R2 | 0.9792 | 0.9815 |
实施例4
(1)所需溶液配制
完全培养基：90％DMEM，10％FBS，1％Pen/Strep；用封口膜封口后，4℃保存。
培养基：
培养基1(0％FBS)：取加入1％双抗的DMEM 10ml；
培养基2(1％FBS)：取加入1％双抗的DMEM 9.9ml，再加入FBS 0.1ml；
培养基3(5％FBS)：取加入1％双抗的DMEM 9.5ml，再加入FBS 0.5ml；
培养基4(8％FBS)：取加入1％双抗的DMEM 9.2ml，再加入FBS 0.8ml；
培养基5(10％FBS)：取加入1％双抗的DMEM 9.0ml，再加入FBS 1.0ml；
培养基6(12％FBS)：取加入1％双抗的DMEM 8.8ml，再加入FBS 1.2ml；
稀释缓冲液：
稀释缓冲液1(0％FBS)：取培养基1 5ml，再加入IBMX母液20μl；
稀释缓冲液2(1％FBS)：取培养基2 5ml，再加入IBMX母液20μl；
稀释缓冲液3(5％FBS)：取培养基3 5ml，再加入IBMX母液20μl；
稀释缓冲液4(8％FBS)：取培养基4 5ml，再加入IBMX母液20μl；
稀释缓冲液5(10％FBS)：取培养基5 5ml，再加入IBMX母液20μl；
稀释缓冲液6(12％FBS)：取培养基6 5ml，再加入IBMX母液20μl；
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)分别用稀释缓冲液1/2/3/4/5/6稀释至60μM；将60μM母液用稀释缓冲液1/2/3/4/5/6稀释至3μM；将3μM母液用稀释缓冲液1/2/3/4/5/6稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次用稀释缓冲液1/2/3/4/5/6梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
表7不同浓度FBS的标曲溶液配制
| 序号 | 稀释方法 | cAMP终浓度(nM) |
| S1 | 试剂盒内母液(cAMP标准品) | 2800 |
| S2 | 6μL S1+18μL培养基1/2/3/4/5/6 | 700 |
| S3 | 6μL S2+18Μl培养基1/2/3/4/5/6 | 175 |
| S4 | 6μL S3+18μL培养基1/2/3/4/5/6 | 43.75 |
| S5 | 6μL S4+18μL培养基1/2/3/4/5/6 | 10.94 |
| S6 | 6μL S5+18μL培养基1/2/3/4/5/6 | 2.73 |
| S7 | 6μL S6+18μL培养基1/2/3/4/5/6 | 0.68 |
| S8 | 6μL S6+18μL培养基1/2/3/4/5/6 | 0.17 |
b)细胞悬液的制备
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清。1ml培养基1/2/3/4/5/6将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。
按活细胞个数，接着再分别用培养基1/2/3/4/5/6将细胞稀释至16万个/ml，共2ml，共32万个细胞，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中。
c)化合物刺激：
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：每孔加入5μl稀释缓冲液1/2/3/4/5/6和5μl培养基1/2/3/4/5/6；
空白对照孔(BL)：每孔加入5μl稀释缓冲液1/2/3/4/5/6和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
不同浓度FBS的标曲溶液检测方法同实施例1中cAMP标准曲线检测方法，不同浓度FBS的标曲溶液量效曲线图见图6，其中图6中四参数拟合数据和EC50数据见表8，当量效曲线的线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5时，对应的FBS浓度均可满足实验条件。但FBS浓度低于8％时，EC50随着FBS浓度的提高而降低；FBS浓度在8％～12％之内，EC50值变化不大，在此范围内，FBS的浓度实验耐用性更高，故FBS浓度在8％～12％之内，检测效果最优。实验结果见图7，图7中四参数拟合数据和EC50数据见表9。
表8图6中四参数拟合数据和EC50数据
| 0％FBS | 1％FBS | 5％FBS | 8％FBS | 10％FBS | 12％FBS | |
| Bottom | 9.488 | 3.924 | 9.541 | 3.011 | 15.44 | 8.771 |
| Top | 1865 | 1877 | 1762 | 1758 | 1816 | 1795 |
| LogEC50 | 1.403 | 1.442 | 1.297 | 1.357 | 1.313 | 1.348 |
| HillSlope | -0.9288 | -0.9098 | -0.8741 | -0.8914 | -0.8738 | -0.9115 |
| EC50 | 25.26 | 27.65 | 19.81 | 22.78 | 20.57 | 22.30 |
| R2 | 0.9989 | 0.9997 | 0.9953 | 0.9989 | 0.9985 | 0.9988 |
表9图7中四参数拟合数据和EC50数据
| 0％FBS | 1％FBS | 5％FBS | 8％FBS | 10％FBS | 12％FBS | |
| Bottom | -0.8134 | -0.7556 | -0.6347 | -0.9621 | 2.333 | -1.473 |
| Top | 234.0 | 223.5 | 258.9 | 189.2 | 199.2 | 205.4 |
| LogEC50 | 0.6464 | -0.4265 | -0.5380 | -0.7576 | -0.6974 | -0.6645 |
| HillSlope | 1.055 | 1.084 | 0.9415 | 1.064 | 1.271 | 0.9346 |
| EC50 | 4.430 | 0.3746 | 0.2897 | 0.1748 | 0.2007 | 0.2165 |
| R2 | 0.9655 | 0.9935 | 0.9878 | 0.9906 | 0.9698 | 0.9864 |
实施例5
(1)所需溶液配制
稀释缓冲液：
稀释缓冲液1(200μM IBMX)：取完全培养基10ml，再加入IBMX母液4μl；
稀释缓冲液2(990μM IBMX)：取完全培养基10ml，再加入IBMX母液19.8μl；
稀释缓冲液3(1462.5μM IBMX)：取完全培养基10ml，再加入IBMX母液29.25μl；
稀释缓冲液4(1740μM IBMX)：取完全培养基10ml，再加入IBMX母液34.8μl；
稀释缓冲液5(1972.5μM IBMX)：取完全培养基10ml，再加入IBMX母液39.45μl；
稀释缓冲液6(3000μM IBMX)：取完全培养基10ml，再加入IBMX母液60μl。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)分别用不同IBMX浓度的稀释缓冲液1/2/3/4/5/6稀释至80μM。将80μM母液分别用不同IBMX浓度的稀释缓冲液1/2/3/4/5/6稀释至18μM。将18μM母液分别用不同IBMX浓度的稀释缓冲液1/2/3/4/5/6稀释成6μM(第一个化合物点)，再依次用不同IBMX浓度的稀释缓冲液1/2/3/4/5/6梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液制备
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清。1ml完全培养基将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。
按活细胞个数，接着再分别用完全培养基配制不同细胞浓度的细胞悬液(见表10)，每孔5μL，放入25ml加样槽中。
表10不同细胞浓度和IBMX浓度实验组
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：每孔加入5μl稀释缓冲液1/2/3/4/5/6和5μl完全培养基；
空白对照孔(BL)：每孔加入5μl稀释缓冲液1/2/3/4/5/6和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
实验结果得出，检测利拉鲁肽细胞浓度在250-1500细胞/孔，IBMX浓度在100-1500μM范围时的量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5，故测利拉鲁肽细胞浓度在250-1500细胞/孔，IBMX浓度在100-1500μM范围内均可满足条件。具体结果见图8，图8中四参数拟合数据和EC50数据见表11。
表11图8中四参数拟合数据和EC50数据
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| Bottom | 5.875 | -0.6678 | 14.00 | 6.718 | 6.877 | 12.61 | 7.428 | 22.00 |
| Top | 78.60 | 225.5 | 132.2 | 121.2 | 194.5 | 278.3 | 431.9 | 543.0 |
| LogEC50 | 0.4393 | 0.6905 | 0.1169 | 0.1497 | 0.2351 | 0.4813 | 0.5960 | 0.4937 |
| HillSlope | 1.458 | 1.135 | 1.300 | 0.9857 | 0.9922 | 0.8565 | 0.9134 | 1.024 |
| EC50 | 2.750 | 4.903 | 1.309 | 1.412 | 1.718 | 3.029 | 3.945 | 3.116 |
| R2 | 0.9800 | 0.9949 | 0.9868 | 0.9873 | 0.9885 | 0.9855 | 0.9818 | 0.9884 |
实施例6
(1)所需溶液配制
见溶液配制说明部分。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将供试品化合物利拉鲁肽(1.6mM)用稀释缓冲液稀释至60μM母液。
梯度稀释：将60μM母液先用稀释缓冲液稀释成10μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释5倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液的制备
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清。1ml完全培养基将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。
按活细胞个数，用完全培养基将细胞分别稀释至16万个/ml，共5ml，共80万个细胞，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中备用。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：每孔加入5μl稀释缓冲液和5μl完全培养基；
空白对照孔(BL)：5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
利拉鲁肽检测时浓度范围在8.0×10-4pM～5000nM内，检测结果具有显著的量效曲线，且量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5，故利拉鲁肽检测时浓度在此范围都可以实现对其的检测。实验结果见图9，图9中四参数拟合数据和EC50数据见表12。
表12图9中四参数拟合数据和EC50数据
| Bottom | 1.031 |
| Top | 155.9 |
| LogEC50 | -1.036 |
| HillSlope | 0.9310 |
| EC50 | 0.09194 |
| R2 | 0.9786 |
实施例7
(1)所需溶液配制
见溶液配制说明部分。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
取稀释缓冲液342.6μl，再加入供试品化合物杜拉鲁肽10μl，混匀，得到将1μM母液；
3倍稀释：将1μM母液用稀释缓冲液稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
4倍稀释：将1μM母液用稀释缓冲液稀释成0.25μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释4倍，得到共10个不同浓度的化合物刺激溶液。
5倍稀释：将1μM母液用稀释缓冲液稀释成0.2μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释5倍，得到共10个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液的制备
复苏计数：液氮罐中取出细胞(HEK293/GLP1R)后，立即37℃水浴，完全融化后，将细胞逐滴加入至装有10ml温热完全培养基的15ml离心管中，细胞自然沉降5min后，900rpm离心5min，弃上清。1ml完全培养基将细胞重悬后，取20μl细胞悬液与等体积的台盼蓝混合，取10μl计算活细胞数。
按活细胞个数，用完全培养基将细胞分别稀释至16万个/ml，共5ml，共80万个细胞，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中备用。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：每孔加入5μl稀释缓冲液和5μl完全培养基；
空白对照孔(BL)：每孔加入5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
实验结果得出：杜拉鲁肽检测时在0.05pM～500nM浓度范围内，检测结果具有显著的量效曲线，且量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5，故杜拉鲁肽检测时浓度在此范围都可以满足检测要求。实验结果见图10、图11和图12，图10、图11和图12中四参数拟合数据和EC50数据见表13。
表13图10、图11和图12中四参数拟合数据和EC50数据
实施例8
(1)所需溶液配制
见溶液配制说明部分。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
取稀释缓冲液342.6μl，再加入供试品化合物杜拉鲁肽10μl，混匀，得到将1μM母液；将1μM母液用稀释缓冲液稀释成0.2μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释5倍，得到共10个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液制备
1600cells/well：用完全培养基将细胞分别稀释至32万个/ml，每孔5μl，细胞个数为1600个/孔，放入25ml加样槽中。
800cells/well：用完全培养基将细胞分别稀释至16万个/ml，每孔5μl，细胞个数为800个/孔，放入25ml加样槽中。
400cells/well：用完全培养基将细胞分别稀释至8万个/ml，每孔5μl，细胞个数为400个/孔，放入25ml加样槽中。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：每孔加入5μl稀释缓冲液和5μl完全培养基；
空白对照孔(BL)：每孔加入5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
实验结果得出，检测杜拉鲁肽每孔400～1600个细胞时，检测结果具有显著的量效曲线，且量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于3，故当细胞浓度为每孔400～1600个时都可满足对杜拉鲁肽的检测要求，实验结果见图13，图13中四参数拟合数据和EC50数据见表14。
表14图13中四参数拟合数据和EC50数据
| 1600cells/well | 800cells/well | 400cells/well | |
| Bottom | 200.7 | 345.7 | 571.0 |
| Top | 1765 | 1937 | 1978 |
| LogEC50 | -1.851 | -1.789 | -1.698 |
| HillSlope | -1.154 | -0.9897 | -0.9022 |
| EC50 | 0.01409 | 0.01627 | 0.02005 |
| R2 | 0.9984 | 0.9931 | 0.9844 |
实施例9
(1)所需溶液配制
见溶液配制说明部分。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)用稀释缓冲液稀释至80μM。将80μM母液用稀释缓冲液稀释至18μM。将18μM母液用稀释缓冲液稀释成6μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液制备
复苏计数方法同实施例7，按活细胞个数，用完全培养基将细胞分别稀释至10万个/ml，共5ml，共50万个细胞，每孔5μl，细胞个数为500个/孔，放入25ml加样槽中备用。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：5μl稀释缓冲液和5μl完全培养基；
空白对照孔(BL)：5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中，其中孵育时间设置为30min，35min和40min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
实验结果得出细胞孵育时间30-40min内无明显差异，检测具有显著的量效曲线，且量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5，故细胞孵育时间在此范围都可以满足检测要求。实验结果见图14，图14中四参数拟合数据和EC50数据见表15。
表15图14中四参数拟合数据和EC50数据
| 30min | 35min | 40min | |
| Bottom | 5.401 | 5.099 | 9.244 |
| Top | 154.6 | 148.5 | 159.7 |
| LogEC50 | -0.6479 | -0.6420 | -0.7734 |
| HillSlope | 1.094 | 1.125 | 1.147 |
| EC50 | 0.2249 | 0.2281 | 0.1685 |
| R2 | 0.9870 | 0.9864 | 0.9758 |
实施例10
(1)所需溶液配制
见溶液配制说明部分。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
将对照品化合物利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)和供试品化合物利拉鲁肽(1.6mM)分别用稀释缓冲液稀释至60μM母液；将此60μM母液用稀释缓冲液稀释至3μM；将3μM母液用稀释缓冲液稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液制备
配制方法同实施例7。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：5μl稀释缓冲液和5μl完全培养基；
空白对照孔(BL)：5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
按上述步骤测试供试品的生物学活性6次，测试结果见表16和图15，图15中四参数拟合数据和EC50数据见表17，且量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5。实验结果得出6份利拉鲁肽注射液的相对生物活性的RSD值为12.39％(RSD≤15.0％)，符合可接受标准。
表16精密度的验证
表17图15中四参数拟合数据和EC50数据
| T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | T6 | 对照品 | |
| Bottom | 23.43 | 23.43 | 23.43 | 23.43 | 23.43 | 23.43 | 23.43 |
| Top | 335.5 | 335.5 | 335.5 | 335.5 | 335.5 | 335.5 | 335.5 |
| LogEC50 | -0.6599 | -0.5820 | -0.5685 | -0.5251 | -0.5151 | -0.5654 | -0.6446 |
| HillSlope | 1.077 | 1.077 | 1.077 | 1.077 | 1.077 | 1.077 | 1.077 |
| EC50 | 0.2188 | 0.2618 | 0.2701 | 0.2984 | 0.3054 | 0.2720 | 0.2267 |
| R2 | 0.9757 | 0.9720 | 0.9804 | 0.9696 | 0.9826 | 0.9638 | 0.9806 |
实施例11
(1)所需溶液配制
见溶液配制说明部分。
cAMP标准曲线同实施例1。
(2)实验步骤
a)化合物刺激溶液
对照品化合物刺激溶液：
将对照品化合物利拉鲁肽制剂(诺和诺德，1.6mM)和供试品化合物利拉鲁肽(1.6mM)分别用稀释缓冲液稀释至60μM母液；将此60μM母液用稀释缓冲液稀释至3μM；将3μM母液用稀释缓冲液稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
理论相对活性水平为50％、100％、150％的化合物刺激溶液：
6μM母液：量取稀释缓冲液3985μl，再加入利拉鲁肽参比制剂(诺和诺德，1.6mM)15μl，混匀；
3μM母液(即生物活性线性溶液)：用稀释缓冲液将6μM母液稀释成不同理论相对生物活性的3μM准确度溶液(见表18)，按上述方法平行配制3份。
表18理论相对活性水平配制
| 理论相对活性水平 | 50％ | 100％ | 150％ |
| 6μM母液液μl | 250 | 500 | 750 |
| 加入稀释缓冲液体积μl | 750 | 500 | 250 |
将这三种不同理论相对生物活性的3μM准确度溶液用稀释缓冲液分别稀释成1μM(第一个化合物点)，再依次梯度稀释3倍，得到共15个不同浓度的化合物刺激溶液。
b)细胞悬液制备
配制方法同实施例7。
c)化合物刺激
化合物实验孔：每孔加入5μl步骤a)中不同浓度的化合物刺激溶液和5μl细胞悬液；
阴性对照孔(N)：5μl稀释缓冲液和5μl完全培养基；
空白对照孔(BL)：5μl稀释缓冲液和5μl细胞悬液；
以上每孔设置3个平行复孔，然后将孔板贴上透明封板膜，37℃，5％CO2培养箱中孵育30min。
d)检测
用移液枪给化合物实验孔和空白对照孔各加入10μl cAMP检测试剂混合溶液，阴性对照孔加入5μl lysis buffer和5μl anti-cAMP-crytate溶液，贴上透明封板膜，2-8℃避光孵育过夜，检测前除去液体表面气泡，于BMG PHERA star FS多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值(HTRF control kit)。
取理论相对活性水平分别为50％、100％、150％的15个不同浓度的化合物刺激溶液，根据公式计算各梯度稀释液cAMP值。根据得到的cAMP浓度和对应化合物浓度进行四参数拟合，得到理论相对活性水平的相对生物活性值、单个回收率、平均回收率及回收率(n＝9)的RSD％。
回收率计算公式：
实验结果见表19、图16、图17和图18，其中图16、图17和图18中四参数拟合数据和EC50数据分别见表20、表21和表22，且得到的供试品量效曲线线性相关系数r不小于0.9600；量效曲线的Top值/Bottom值应不小于5。实验得出准确度溶液回收率单值在80％～120％之间；回收率均值为102.53％，RSD为10.12％(≤15.0％)，通过上述实验说明该方法的准确性和重复性较好。
表19准确度实验
表20图16中四参数拟合数据和EC50数据
| 50％ | 100％ | 150％ | 对照品 | |
| Bottom | 6.487 | 6.487 | 6.487 | 6.487 |
| Top | 230.2 | 230.2 | 230.2 | 230.2 |
| LogEC50 | -0.2612 | -0.6077 | -0.7002 | -0.5482 |
| HillSlope | 1.409 | 1.409 | 1.409 | 1.409 |
| EC50 | 0.5480 | 0.2468 | 0.1994 | 0.2830 |
| R2 | 0.9964 | 0.9941 | 0.9884 | 0.9925 |
表21图17中四参数拟合数据和EC50数据
| 50％ | 100％ | 150％ | 对照品 | |
| Bottom | 44.68 | 44.68 | 44.68 | 44.68 |
| Top | 265.5 | 265.5 | 265.5 | 265.5 |
| LogEC50 | -0.1796 | -0.5195 | -0.6433 | -0.4703 |
| HillSlope | 1.133 | 1.133 | 1.133 | 1.133 |
| EC50 | 0.6614 | 0.3023 | 0.2273 | 0.3386 |
| R2 | 0.9654 | 0.9671 | 0.9575 | 0.9546 |
表22图18中四参数拟合数据和EC50数据
Claims (4)
1.一种GLP-1类似物生物活性检测方法，包括使用cAMP检测试剂盒，其特征在于所述方法为以下步骤：
（1）用完全培养基稀释细胞，所述完全培养基为DMEM培养基、1%青霉素和链霉素溶液以及8%-12%FBS；
（2）用含磷酸二酯酶抑制剂的稀释缓冲液配制GLP-1类似物对照品溶液和供试品溶液；
（3）将步骤（1）稀释后的细胞加入各孔板中，然后在不同孔板中分别加入步骤（2）配制的对照品溶液和供试品溶液，在37℃下进行孵育；
（4）用cAMP试剂盒检测GLP-1类似物刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪进行检测读数；
（5）计算生物活性；
其中，步骤(1)中所述细胞为HEK293/GLP1R；步骤(2)中所述的稀释缓冲液为完全培养基中加入磷酸二酯酶抑制剂IBMX，且IBMX浓度为100-1500 nM；所述GLP-1类似物为利拉鲁肽或杜拉鲁肽；步骤(3)中各孔板中细胞的浓度为250-1600 cells/孔。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述GLP-1类似物为利拉鲁肽，步骤(2)中所述GLP-1类似物对照品溶液和/或供试品溶液检测时浓度为8.19×10-4pM-5000nM。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述GLP-1类似物为杜拉鲁肽，步骤(2)所述GLP-1类似物对照品溶液和/或供试品溶液检测时浓度为0.05pM-500nM。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法步骤(3)中的细胞孵育时间为30-40 min。
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