CN110452877A

CN110452877A - 一种肺癌实体瘤原代细胞的培养方法

Info

Publication number: CN110452877A
Application number: CN201810426591.7A
Authority: CN
Inventors: 席建忠; 尹申意; 李娟�
Original assignee: Beijing Gishanley De Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: BEIJING GENEX HEALTH TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2019-11-15

Abstract

本发明公开了一种肺癌原代细胞的培养方法。本发明提供了一种肺癌实体瘤原代细胞培养方法及配套试剂，该技术的核心是：(1)用温和细胞解离试剂处理肺癌实体瘤组织，最大程度的保证了组织中癌细胞的活力；(2)配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对肺癌实体瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养，保证癌细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。利用本发明方法得到的肺癌原代细胞培养物可以用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法在肺癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

一种肺癌实体瘤原代细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肺癌实体瘤原代细胞的培养方法。

背景技术

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症，其中男性肺癌发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中最高，而女性肺癌发病率和死亡率均为第二位。同时，肺癌发病增长率和死亡增长率在所有恶性肿瘤中最高。可以说肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。

尽管世界各国的科研和医疗机构对肺癌的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。肺癌是一种复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。肺癌的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将肺癌实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是肺癌研究领域乃至肺癌诊断治疗领域的趋势。

现有的原代肿瘤细胞培养技术主要有2D培养，3D培养，重编程培养等几类，这些方法都不同程度的面临培养周期极长，培养成功率低，杂细胞难以去除等问题。

发明内容

为了有效解决上述技术问题，本发明提供了一种新的肺癌实体瘤原代细胞培养技术及配套试剂，该技术的核心是：(1)用温和细胞解离试剂处理肺癌实体瘤组织，最大程度的保证了组织中癌细胞的活力；(2)配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对肺癌实体瘤来源的肿瘤细胞进行体外培养，保证癌细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。

第一方面，本发明要求保护一种培养肺癌实体瘤原代细胞的方法。

本发明所提供的培养肺癌实体瘤原代细胞的方法，具体可包括如下步骤：

(1)用样本解离液对肺癌实体瘤组织进行解离处理，获得肺癌实体瘤原代细胞；

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；余量均为PBS。

其中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

在本发明的具体实施例中，所述胶原酶I的品牌货号为Gibco#17100-017；所述胶原酶IV的品牌货号为Gibco#17104-019；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

(2)利用肺癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养步骤(1)解离出来的肺癌实体瘤原代细胞；

所述肺癌实体瘤原代细胞培养基由双抗P/S(青霉素-链霉素)、HEPES、非必需氨基酸溶液、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白MSP、皮质醇、B27、ITS-X(Insulin,Transferrin,Selenium,Ethanolamine Solution)、Y-27632和Advanced DMEM/F12培养基组成；其中，所述双抗P/S中的青霉素在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述HEPES在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为8-12mM(如10mM)；所述非必需氨基酸溶液在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述GlutaMax在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述人重组蛋白EGF在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为10-100ng/mL；所述人重组蛋白bFGF在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白MSP在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-25ng/mL；所述皮质醇在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为20-50ng/mL；所述B27在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为1.5-2.5％(如2％，％表示体积百分含量)；所述ITS-X在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述Y-27632在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-20μM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。

进一步地，所述非必需氨基酸溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：甘氨酸10mM；L-丙氨酸10mM；L-天冬酰胺10mM；L-天冬氨酸10mM；L-谷氨酸10mM；L-脯氨酸10mM；L-丝氨酸10mM。所述B27为“B-27^TMSupplement(50X),minus vitamin A”(如Gibco#12587010，或与其组成相同的其他产品)。所述“B-27^TMSupplement(50X),minus vitamin A”中含有生物素(Biotin)、DL-α-生育酚乙酸酯(DL Alpha Tocopherol Acetate)、DL-α-生育酚(DL Alpha-Tocopherol)、BSA(fatty acid free Fraction V)、过氧化氢酶(Catalase)、人重组胰岛素(Human Recombinant Insulin)、人转铁蛋白(Human Transferrin)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)、皮质酮(Corticosterone)、D-半乳糖(D-Galactose)、乙醇胺盐酸(Ethanolamine HCl)、还原型谷胱甘肽(Glutathione(reduced))、左旋肉碱盐酸(L-Carnitine HCl)、亚油酸(Linoleic Acid)、亚麻酸(Linolenic Acid)、孕酮(Progesterone)、腐胺(Putrescine 2HCl)、亚硒酸钠(Sodium Selenite)、三碘甲状腺原氨酸(T3(triodo-I-thyronine))。所述ITS-X的溶剂为EBSS溶液(Earle's平衡盐溶液)，溶质及浓度如下：胰岛素1g/L；转铁蛋白0.55g/L；亚硒酸钠0.00067g/L；乙醇胺0.2g/L。所述GlutaMAX是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。所述GlutaMAX为“GlutaMAX^TMSupplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述“GlutaMAX^TMSupplement”的成分为L-alanyl-L-glutamine，是L-glutamine的替代物，浓度为200nM，溶剂为0.85％NaCl溶液。所述Y-27632为“Y-27632 dihydrochloride(一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，Ki分别为220nM和300nM)”(如MCE#129830-38-2，或与其组成相同的其他产品)。

在本发明的具体实施例中，所述双抗P/S(青霉素-链霉素)的品牌货号为Gibco#15140122；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述非必需氨基酸溶液的品牌货号为Gibco#11140-050；所述GlutaMAX的品牌货号为Gibco#35050061；所述人重组蛋白EGF的品牌货号为Peprotech AF-100-15-100；所述人重组蛋白bFGF的品牌货号为Peprotech AF-100-18B-50；所述人重组蛋白MSP的品牌货号为R&D#352-MS-050；所述皮质醇的品牌货号为Sigma#H0888；所述B27的品牌货号为Gibco#12587010；所述ITS的品牌货号为Gibco#51500056；所述Y-27632的品牌货号为MCE#129830-38-2；所述Advanced DMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010。

进一步地，步骤(1)中，可按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述肺癌实体瘤组织进行解离：按0.1-0.3mL(如0.1mL)所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述肺癌实体瘤组织(如剪成0.8-1.2mm³的小块)用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大量的单个细胞。

进一步地，步骤(2)中，可按照包括如下步骤的方法用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述肺癌实体瘤原代细胞：使用具有低吸附表面(low-attachment-surface)的培养容器，利用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述肺癌实体瘤原代细胞，37℃，5％CO₂条件下进行培养，每2-4天(如3天)更换一次培养基，直至细胞形成直径80-120μm(如100μm)的团块。

其中，初始接种密度可为10⁵个/cm²容器底面积，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板。

进一步地，在步骤(1)之前，还可包括如下对所述肺癌实体瘤组织进行解离前处理的步骤：用体积百分含量为70-75％(如75％)的乙醇清洗肺癌实体瘤组织样本表面10到30秒；用样本清洗液清洗所述肺癌实体瘤组织样本5-10次(如5次)，用无菌的PBS溶液清洗所述肺癌实体瘤组织样本5-10次(如5次)；然后除去所述肺癌实体瘤组织样本中的杂质、结缔组织、脂肪组织、坏死组织等影响原代细胞培养的成分。

其中，所述样本清洗液由双抗P/S(青霉素-链霉素)和PBS组成；其中，所述双抗P/S中的青霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；余量均为PBS。

在本发明的具体实施例中，所述双抗P/S的品牌货号为Gibco#15140122；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

对所述肺癌实体瘤组织进行解离前处理的步骤需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

进一步地，进行所述解离前处理的所述肺癌实体瘤组织样本的离体时间需为2小时以内，且在进行所述解离前处理之前一直保存于样本保存液中。

其中，所述样本保存液由胎牛血清、双抗P/S、HEPES和HBSS(Hank's平衡盐溶液)组成；其中，所述胎牛血清在所述样本保存液中的终浓度为1-5％(如2％，％表示体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述HEPES在所述样本保存液中的终浓度为8-12mM(如10mM)；余量均为HBSS。

在本发明的具体实施例中，所述胎牛血清的品牌货号为Gibco#16000-044；所述双抗P/S的品牌货号为Gibco#15140122；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述HBSS的品牌货号为Gibco#14170161。

进一步地，在步骤(1)中，用所述样本解离液对所述肺癌实体瘤组织进行解离处理后还可包括如下步骤：用8-15倍(如10倍)体积的消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；用100μm或40μm无菌细胞滤网过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清；后用3-5mL(如5mL)无菌PBS重悬细胞；再800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清；然后用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，在显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数。

其中，所述消化终止液由胎牛血清、双抗P/S和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清在所述消化终止液中的终浓度为8-12％(如10％，％表示体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；余量均为DMEM培养基。

在本发明的具体实施例中，所述胎牛血清的品牌货号为Gibco#16000-044；所述双抗P/S的品牌货号为Gibco#15140122；所述DMEM培养基的品牌货号为Gibco#11965-092。

进一步地，在步骤(2)中，还可包括如下步骤：待所述肺癌实体瘤原代细胞形成直径80-120μm(如100μm)的团块时，对所述肺癌实体瘤原代细胞进行传代。

其中，进行所述传代时采用的细胞消化液组成如下：每10mL所述细胞消化液中含有4-6mL(如5mL)Accutase，终浓度为5mM的EDTA(即10μL 0.5M EDTA)，1.5-2.5mL(如2mL)TrypLE Express，余量为PBS。

进一步地，所述Accutase为“StemPro^TMAccutase^TMCell Dissociation Reagent”(如Gibco#A11105-01，或与其组成相同的其他产品)。所述Accutase是一种单一成分的酶，在D-PBS，0.5mM EDTA溶液中溶解。所述TrypLE Express为“TrypLE^TMExpress Enzyme(1X),no phenol red”(如Gibco#12604013，或与其组成相同的其他产品)。所述“TrypLE^TMExpressEnzyme(1X),no phenol red”中含有200mg/L的KCl、200mg/L的KH₂PO₄、8000mg/L的NaCl、2160mg/L的Na₂HPO₄·7H₂O、457.6mg/L的EDTA；还含有重组蛋白酶。

在本发明的具体实施例中，所述Accutase的品牌货号为Gibco#A11105-01；所述0.5M EDTA的品牌货号为Invitrogen#AM9261；所述TrypLE Express的品牌货号为Gibco#12604013；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

更进一步地，进行所述传代时采用的消化温度为37℃。

更进一步地，进行所述传代时采用的消化终止液即为前文所述的消化终止液。

更加具体地，进行所述传代的步骤：收集待传代的细胞团块，离心后用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，再离心，然后用所述细胞消化液重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化，直到细胞团块都被消化为单个细胞，用所述消化终止液(其用量可为5-10倍，如10倍体积)终止消化反应，收集细胞悬液；离心后用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，计数，然后使用具有低吸附表面的培养容器悬浮培养细胞(初始接种密度可为10⁵个/cm²容器底面积，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板)，培养条件为37℃，5％CO₂。上述传代步骤中的所有离心均具体可为800-1000g(如800g)室温离心10-20分钟(如10分钟)。

进一步地，所述方法还可包括对经过2-3次传代扩增后的所述肺癌实体瘤原代细胞进行冻存和/或复苏的步骤。

其中，进行所述冻存时采用的细胞冻存液由Advanced DMEM/F12培养基、DMSO和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述Advanced DMEM/F12培养基、所述DMSO和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)，如20:2:1；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。

在本发明的具体实施例中，所述Advanced DMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010；所述DMSO的品牌货号为Sigma#D2438；所述甲基纤维素的品牌货号为Sigma#M7027。

更进一步地，进行所述冻存的具体步骤：收集待冻存的细胞团块，离心后用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，再离心，然后用所述细胞消化液重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化，直到细胞团块都被消化为单个细胞，用所述消化终止液(其用量可为5-10倍，如10倍体积)终止消化反应，收集细胞悬液；离心后用所述细胞冻存液，按0.5-2×10⁶/mL(如10⁶/mL)的密度重悬细胞沉淀，梯度降温盒过夜冻存后转移至液氮中长期保存。上述冻存步骤中的所有离心均具体可为800-1000g(如800g)室温离心10-20分钟(如10分钟)。

更进一步地，进行所述复苏的具体步骤：将装有待复苏细胞的冻存管从液氮中取出，在37-39℃(如37℃)无菌水中迅速融化细胞；离心(如800-1000g，如800g室温离心5-10分钟，如10分钟)后用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，然后使用具有低吸附表面的培养容器悬浮培养细胞(初始接种密度可为10⁵个/cm²容器底面积)，每管细胞(10⁶个)复苏至3.5cm培养皿)，培养条件为37℃，5％CO₂。

第二方面，本发明要求保护一种用于培养肺癌实体瘤原代细胞的成套试剂。

本发明所提供的用于培养肺癌实体瘤原代细胞的成套试剂，具体可为如下任一：

(A)由前文所述样本解离液和所述肺癌实体瘤原代细胞培养基组成；

(B)由前文所述样本解离液、所述肺癌实体瘤原代细胞培养基和如下试剂中至少一种组成：前文所述样本保存液、所述细胞消化液、所述样本清洗液、所述消化终止液和所述细胞冻存液。

进一步地，所述(B)具体可如由前文所述样本解离液、所述肺癌实体瘤原代细胞培养基、所述样本保存液和所述细胞消化液组成。

所述样本保存液可用于样本离体后的暂时保存，可以在有样本离体后，短时间内维持样本中细胞的活性。所述样本保存液配制好后4℃可保存1个月。

所述样本清洗液可用于样本的清洗和消毒。所述样本清洗液需现配现用。

所述样本解离液可用于样本的解离，可以将样本中的肺癌实体瘤原代细胞从组织中解离出来。所述样本解离液需现配现用，其中的胶原酶I和胶原酶IV可以储液(母液)形式-20℃长期保存，具体可为10倍储液(母液)。10×胶原酶I储液由所述胶原酶I和PBS组成；其中所述胶原酶I的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。10×胶原酶IV储液由所述胶原酶IV和PBS组成；其中所述胶原酶IV的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。所述胶原酶I和所述胶原酶IV的酶活定义见前文。

所述细胞消化液可用于细胞团块的消化和传代，可以将肺癌肿瘤团块消化成单个细胞。所述细胞消化液需现配现用。

所述消化终止液可用于终止样本解离或细胞消化过程。所述消化终止液配制好后可在4℃保存一个月。

所述肺癌实体瘤原代细胞培养基可用于肺癌实体瘤原代细胞的培养。所述肺癌实体瘤原代细胞培养基配制好后需用0.22μM针头式滤器(Millipore SLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。其中的人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白MSP、皮质醇和Y-27632可以储液(母液)形式-80℃长期保存，具体可为1000倍储液(母液)。1000×人重组蛋白EGF储液由人重组蛋白EGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白EGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。1000×人重组蛋白bFGF储液由人重组蛋白bFGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。1000×人重组蛋白MSP储液由人重组蛋白MSP、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白MSP的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。上述三种1000倍储液中，所述BSA是可以100倍储液(母液)形式存在(现配现用)，具体由BSA和PBS组成，其中BSA(Sigma#A1933)的终浓度为0.1g/mL，余量均为PBS。另外，1000×皮质醇储液由皮质醇、无水乙醇和超纯水组成，其中所述皮质醇的终浓度为25μg/mL，所述无水乙醇的终浓度为5％(体积百分含量)，余量均为超纯水。1000×Y-27632由Y-27632和超纯水组成，其中Y-27632的终浓度为10mM，余量均为超纯水。

所述细胞冻存液需现配现用。其中，所述1％甲基纤维素溶液可在4℃长期保存。

第三方面，本发明要求保护前文所述的成套试剂在培养肺癌实体瘤原代细胞中的应用。

更进一步地，所述肺癌具体可为原发性肺癌，病理分期为II期或III期，病理分型为非小细胞肺癌或小细胞肺癌，肺癌标本重量超过20mg的样本。

在本发明中，以上所有的所述PBS均可为1×PBS，pH7.3-7.5。其具体组成如下：溶剂为水，溶质及浓度为：KH₂PO₄ 144mg/L，NaCl 9000mg/L，Na₂HPO₄·7H₂O 795mg/L。

本发明提供了一种从新鲜肺癌实体瘤组织中提取培养肺癌原代肿瘤细胞的方法和配套试剂，该方法具有以下优点：

1、组织样本用量少，仅需20mg左右的肺癌手术样本；

2、培养周期短，仅需3-10天即可获得10⁷数量级的肺癌原代肿瘤细胞；

3、培养稳定性高，用本方法对合格的肺癌手术标本进行体外培养的成功率高达70％；

4、细胞纯度高，利用本方法得到的肺癌原代细胞培养物中，癌细胞的比例可以达到70％-95％，杂细胞干扰少。

利用本发明方法得到的肺癌原代细胞培养物可以用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法在肺癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为肺癌组织经过处理后得到的单细胞。标尺为200μm，10倍放大。

图2为肺癌组织原代培养后得到的细胞团块。标尺为100μm，10倍放大。

图3为肺癌组织原代培养后得到的肺癌细胞HE染色图。标尺为50μm，40倍放大。

图4为肺癌组织原代培养后得到的癌细胞团块免疫荧光染色图。

图5为根据测序结果进行拷贝数变异分析(CNV)显示各代肺癌原代细胞培养物(P1、P2、P3、P4)与原发肺癌肿瘤组织(Tumor)的拷贝数变异情况高度一致。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、配制用于培养肺癌原代细胞的试剂

1、样本保存液(100mL)

样本保存液(100mL)的具体配方如表1所示。

表1样本保存液(100mL)

样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管5mL。分装后可于4℃保存1个月。

2、样本清洗液(100mL)

样本清洗液(100mL)的具体配方如表2所示。

表2样本清洗液(100mL)

样本清洗液需现配现用。

3、样本解离液(10mL)

样本解离液(10mL)的具体配方如表3所示。

表3样本解离液(10mL)

注：样本解离液现配现用。

表3中，胶原酶储液的配制如表4和表5所示。

表4 10×胶原酶I储液(100mL)

10×胶原酶I储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表5 10×胶原酶IV储液(100mL)

10×胶原酶IV储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表4和表5中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

4、细胞消化液(10mL)

细胞消化液(10mL)的具体配方如表6所示。

表6细胞消化液(10mL)

细胞消化液现配现用。

5、消化终止液(100mL)

消化终止液(100mL)的具体配方如表7所示。

表7消化终止液(100mL)

消化终止液配制后，可在4℃保存一个月。

6、肺癌实体瘤原代细胞培养基(100mL)

肺癌实体瘤原代细胞培养基(100mL)的具体配方如表8所示。

表8肺癌实体瘤原代细胞培养基(100mL)

肺癌实体瘤原代细胞培养基配制完成后，用0.22μM针头式滤器(MilliporeSLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。

表8中，人重组蛋白储液的配制如表9-表12所示，皮质醇储液储液的配制如表13所示，Y-27632储液的配制如表14所示。

表9 100×BSA溶液(1mL)

100×BSA溶液现配现用。

表10 1000×人重组蛋白EGF储液(5mL)

1000×人重组蛋白EGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表11 1000×人重组蛋白bFGF储液(2.5mL)

1000×人重组蛋白bEGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表12 1000×人重组蛋白MSP储液(2.5mL)

1000×人重组蛋白MSP储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表13 1000×皮质醇储液(100mL)

1000×皮质醇储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表14 1000×Y-27632储液(3.125mL)

1000×Y-27632储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

7、细胞冻存液

细胞冻存液的具体配方如表15所示。

表15细胞冻存液

细胞冻存液现配现用。

表15中，1％甲基纤维素溶液的配制如表16所示。

表16 1％甲基纤维素溶液(10mL)

1％甲基纤维素溶液配制后可在4℃长期保存。

实施例2、肺癌术后标本的获取

1、与三甲医院合作，合作的开展通过了正规的医学伦理审查。

2、主治医生医生按照医学指南规定的临床指征选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养，样本的选取标准为：原发性肺癌，病理分期为II期或III期，病理分型为非小细胞肺癌或小细胞肺癌，肺癌标本重量超过20mg的样本。

3、主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、吸烟史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验编号的命名原则为采集样本的八位数字日期+患者住院号后四位。例如2018年1月1日提供的样本，患者住院号为T001512765，则样本实验编号为201801012765。

4、术中由外科医生，在手术室无菌环境中采集新鲜标本，置于事先准备好的样本保存液(见实施例1)中。样本离体后在冰上暂存，两小时内运输到实验室进行下一步操作。

实施例3、肺癌组织样本解离前处理

下述操作需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

下述操作中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。

1、样本称重。

2、用75％(体积百分含量)乙醇清洗样本表面10到30秒。

3、用样本清洗液清洗样本五次，用无菌的PBS溶液清洗样本5次。

4、用眼科剪、眼科镊、手术刀等器材，小心将样本中的脂肪组织、结缔组织、坏死组织剥离。

实施例4、肺癌组织样本解离

下述实施例中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。

1、用眼科剪将组织剪碎成1mm³左右的小块。

2、按0.1mL样本解离液(见实施例1)每mg组织的用量，用事先37℃预热的样本解离液处理剪碎的组织样本，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大量的单个细胞。

3、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。

4、用100μm无菌细胞滤网过滤细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞。

5、800g室温离心10分钟，弃去上清。

6、用5mL无菌PBS重悬细胞，800g室温离心10分钟，弃去上清。

7、用肺癌实体瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，在显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数。

如图1所示，解离得到的单细胞悬液中，除了肿瘤细胞以外还混杂着大量各种类型的其他细胞，如红细胞，淋巴细胞，纤维细胞等等。本方法的优势之一就是在后续的培养过程中，只有癌细胞可以进行大量扩增，而其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的肺癌原代肿瘤细胞。

实施例5、肺癌原代细胞培养

1、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行肺癌原代细胞悬浮培养，所用培养基即为实施例1中的肺癌实体瘤原代细胞培养基，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板，37℃，5％CO₂条件下在细胞培养箱中进行培养。

2、每天观察细胞状态，每3天更换一次培养基，直至细胞形成直径100μm左右的团块。

如图2所示，经过3-10天的培养，癌细胞大量扩增形成直径100μm大小的细胞团块，肿瘤细胞总数量可以超过10⁷，其他类型的细胞数量明显减少甚至消失。本方法经过大量样本测试，肺癌原代肿瘤细胞体外培养成功率可以达到70％。

实施例6、肺癌原代细胞传代

1、收集培养皿中的细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。

2、用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。

3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每5分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。

4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。

5、800g室温离心10分钟，弃去上清。

6、用肺癌实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，细胞计数。

7、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行肺癌原代细胞培养，所用培养基即为实施例1中的肺癌实体瘤原代细胞培养基，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板，37℃，5％CO₂条件下在细胞培养箱中进行培养。

实施例7、肺癌原代细胞的冻存

悬浮培养的肺癌原代细胞经过2-3次传代扩增后，可以进行冻存：

3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每15分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。

4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液，细胞计数。

5、800g室温离心10分钟，弃去上清。

6、用细胞冻存液(见实施例1)，按10⁶/mL的密度重悬细胞沉淀，2mL冻存管每管1mL细胞悬液，梯度降温盒过夜冻存后转移至液氮中长期保存。

实施例8、肺癌原代细胞的复苏

液氮中保存的肺癌原代细胞可以进行复苏：

1、提前五分钟准备37℃无菌水。

2、将冻存管从液氮中取出，在37℃无菌水中迅速融化细胞。

3、800g室温离心10分钟，弃去上清。

4、用肺癌实体瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，使用低吸附表面进行肺癌原代细胞培养，每管细胞复苏至3.5cm培养皿中，37℃，5％CO₂条件下在细胞培养箱中进行培养。

实施例9、肺癌原代细胞的HE染色鉴定

下述实施例中用到的试剂耗材说明：

HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，#G1120)；

阳离子防脱玻片(北京中杉金桥生物科技有限公司)；

二甲苯、甲醇、丙酮(北京化学试剂公司，分析纯)；

中性树脂胶(北京益利精细化学品有限公司)。

1、将悬浮细胞制成浓度为10⁴/mL的细胞悬液，滴加10μL于阳离子防脱玻片上，自然晾干。

2、在风干的细胞上小心滴加50μL经4℃预冷过的甲醇/丙酮混合液(体积比1:1)，然后将玻片放入4℃冰箱固定10mins。

3、取出固定细胞的玻片，室温自然晾干。

4、用200μL PBS清洗玻片两次。

5、待玻片上水分微干时加入100μL苏木精染液染色1mins。

6、吸去苏木精染液，用200μL自来水清洗玻片3次。

7、滴加100μL分化液分化1mins。

8、吸去分化液，依次用自来水清洗玻片2次，蒸馏水清洗玻片1次。

9、吸去玻片表面水分，滴加200μL伊红染液染色40s。

10、吸去伊红染液，依次用75％、80％、90％、100％乙醇漂洗脱水20s、20s、40s、40s。

11、等乙醇晾干后，滴加50μL二甲苯进行细胞通透。

12、等二甲苯晾干完全后，滴加一滴中性树脂胶，用盖玻片封片，在显微镜下观察并拍照。

图3展示了体外培养得到的肺癌原代肿瘤细胞HE染色效果图，可以看到这些细胞普遍具有核质比高、核深染、核内染色质凝集、多核、细胞大小不均一等癌细胞特征。

实施例10、肺癌原代细胞的免疫荧光染色鉴定

下述实施例中用到的试剂说明：

多聚甲醛(北京化学试剂公司，分析纯)，用超纯水溶解多聚甲醛粉末，制成4％(4g/100mL)多聚甲醛溶液；

甲醇、二甲基亚砜(北京化学试剂公司，分析纯)；

双氧水(北京化学试剂公司，35％)；

甲醇、二甲基亚砜、35％双氧水按照4:4:1(体积比)的比例混合制成丹氏漂洗液；

牛血清白蛋白(Sigma，#A1933)，用PBS溶液溶解牛血清白蛋白，制成3％(3g/100mL)的BSA溶液；

免疫荧光一抗抗体(Abcam，#ab17139)；

免疫荧光二抗抗体(CST，#4408)；

Hoechst染液(北京索莱宝生物科技有限公司，#C0021)；

按以下步骤对肺癌细胞团块进行免疫荧光染色，一抗为CK8+CK18，表征上皮来源的细胞。

1、收集培养皿中的细胞团块，用PBS清洗一遍后，用4％多聚甲醛重悬细胞沉淀，4℃过夜固定。

2、800g离心弃去上清，用预冷的甲醇溶液重悬细胞沉淀，在冰上放置1小时。

3、800g离心弃去上清，丹氏漂洗液重悬细胞沉淀，室温放置2小时。

4、800g离心弃去上清，依次用75％、50％、25％(体积百分含量)用PBS稀释的甲醇溶液清洗细胞，每次10分钟。

5、800g离心弃去上清，用3％BSA溶液悬浮细胞沉淀，室温封闭2小时。

6、按1：500的比例，用3％BSA溶液稀释一抗，并用抗体稀释液(3％BSA溶液)重悬细胞沉淀，4℃一抗过夜。

7、800g离心弃去上清，用PBS溶液清洗细胞沉淀5次，每次20分钟。

8、按1：2000的比例，用3％BSA溶液稀释二抗，并用抗体稀释液(3％BSA溶液)重悬细胞沉淀，室温二抗2小时。

9、800g离心弃去上清，用PBS溶液清洗细胞沉淀5次，每次20分钟。

10、按1/100的体积比加入100×Hoechst染液，室温染色20分钟。

11、用PBS溶液清洗细胞沉淀2次，每次10分钟。使用激光共聚焦显微镜观察细胞团块的染色情况。

图4展示了体外培养的肺癌原代肿瘤细胞团块免疫荧光染色的效果图，可以看到组成细胞团块的细胞都是CK8/CK18阳性，是上皮来源的，证实了本方法培养得到的是纯度较高的肿瘤细胞。对20个肺癌样本原代培养物进行免疫荧光染色鉴定，统计结果显示经本方法得到的肺癌原代细胞中，肿瘤细胞的比例达到75％-95％(表17)。

表17肺癌样本原代培养物免疫荧光染色鉴定

实施例11、肺癌原代细胞培养物与原发肿瘤组织

下述实施例中提及的DNA提取流程采用天根血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)进行。

下述实施例中提及的建库流程采用NEB DNA测序建库试剂盒(E7645)进行。

下述实施例中提及的高通量测序是指Illumina HiSeq X-ten测序平台。

1、取得肺癌实体瘤样本，进行体外培养操作之前，先取肺癌实体瘤样本10mg进行DNA提取，建库及全基因组高通量测序(WGS)，测序深度300×，剩余实体瘤样本用于肺癌原代细胞体外培养。

2、肺癌组织处理后经过一段时间的培养，形成直径100μm以上的细胞团块记为P0代细胞，之后按传代的次数依次记为P1，P2，…，Pn。从P1、P2、P3、P4代的肺癌原代肿瘤细胞培养物中各取10⁶个细胞，进行DNA提取，建库及全基因组高通量测序(WGS)，测序深度300×。

3、各组测序结果分别进行拷贝数变异分析(CNV)，比较原发肺癌肿瘤组织与各代肺癌原代细胞培养物之间的拷贝数变异，如图5所示，各代肺癌原代细胞培养物(P1、P2、P3、P4)与原发肺癌肿瘤组织(Tumor)的拷贝数变异情况高度一致，因此经本方法得到的肺癌原代细胞能够代表患者原发肿瘤的真实情况。

实施例12、不同原代细胞培养基培养成功率比较

本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅培养基配方有所区别。进行测试的各种原代细胞培养基见表18。其中方案D为本发明中采用的配方，具体见表8。

表18测试用原代细胞培养基配方(100 mL)

原代细胞培养基配制完成后，用0.22μM针头式滤器(Millipore SLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。

四种原代细胞培养基方案各处理20例样本，按实施例3、4、5中所述方法进行样本处理和培养操作，培养10天后统计肺癌实体瘤原代细胞培养成功率如表19所示：

表19不同培养基培养情况

可以看到，原代细胞培养基对肺癌原代细胞的培养成功率影响极大，本发明使用的肺癌实体瘤原代细胞培养基(表8)可以最大程度的刺激肺癌实体瘤组织样本中癌细胞增殖，提高肺癌实体瘤原代细胞培养的成功率。

实施例13、不同样本保存液培养成功率比较

本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅样本保存液配方有所区别。进行测试的各种样本保存液见表20。其中方案E为本发明中采用的配方，具体见表1。

表20测试用样本保存液配方(100mL)

上表中各种样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管5mL。分装后可于4℃保存1个月。

五种样本保存液方案各处理20例样本，样本离体后在样本保存液中4℃暂存，离体2小时后，按实施例3、4、5中所述方法进行样本处理和培养操作，培养10天后统计肺癌实体瘤原代细胞培养成功率如表21：

表21不同样本保存液培养情况

可以看到，样本保存液配方对肺癌实体瘤原代细胞培养的成功率有较大的影响，本发明使用的样本保存液(表1)可以最大程度的保护肺癌实体瘤组织样本中癌细胞的活性，提高培养的成功率。

实施例14、不同样本解离液培养成功率比较

本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅样本解离液配方有所区别。进行测试的各种样本解离液见表22。其中方案D为本发明中采用的配方，具体见表3。

表22测试用样本解离液配方(10mL)

样本解离液现配现用。

选取20例肺癌实体瘤组织块重量超过100mg的样本，平均分成四份，分别用上述四种样本解离液，按实施例3、4、5中所述方法进行样本处理和培养操作。培养10天后统计肺癌实体瘤原代细胞培养成功率如下表23：

表23不同样本解离液培养情况

可以看到，样本解离液配方对肺癌实体瘤原代细胞培养的成功率有很大的影响，本发明使用的样本解离液(表3)可以最大程度分离肺癌实体瘤组织中的癌细胞，提高肺癌实体瘤原代细胞培养的成功率。

实施例15、不同细胞消化液传代成功率比较

本实施例中所有样本原代细胞传代操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅细胞消化液配方有所区别。进行测试的各种样本解离液见表24。其中方案D为本发明中采用的配方，具体见表6。

表24测试用细胞消化液配方(10mL)

细胞消化液现配现用。

选取20例培养成功的肺癌样本，将培养得到的肺癌实体瘤原代细胞，分别用上述四种细胞消化液，按实施例6中所述方法进行连续传代操作。每当癌细胞扩增形成直径100μm大小的细胞团时就进行传代(不超过10次)，记录最大传代次数。统计结果如表25：

表25不同细胞消化液培养情况

可以看到，细胞消化液配方对肺癌实体瘤原代细胞传代的成功率有很大的影响，本发明使用的细胞消化液(表6)可以温和解离细胞团块中的癌细胞，使样本可以进行连续传代而保持肺癌实体瘤原代细胞活性。

Claims

1.一种培养肺癌实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；余量均为PBS；

所述肺癌实体瘤原代细胞培养基由双抗P/S、HEPES、非必需氨基酸溶液、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白MSP、皮质醇、B27、ITS-X、Y-27632和AdvancedDMEM/F12培养基组成；其中，所述双抗P/S中的青霉素在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为100-200μg/mL；所述HEPES在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为8-12mM；所述非必需氨基酸溶液在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述GlutaMax在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述人重组蛋白EGF在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为10-100ng/mL；所述人重组蛋白bFGF在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白MSP在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-25ng/mL；所述皮质醇在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为20-50ng/mL；所述B27在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为1.5-2.5％(体积百分含量)；所述ITS-X在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述Y-27632在所述肺癌实体瘤原代细胞培养基中的终浓度为5-20μM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，是按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述肺癌实体瘤组织进行解离的：按0.1-0.3mL所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述肺癌实体瘤组织用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，是按照包括如下步骤的方法用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述肺癌实体瘤原代细胞的：使用具有低吸附表面的培养容器，利用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述肺癌实体瘤原代细胞，37℃，5％CO₂条件下进行培养，每2-4天更换一次培养基。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(1)之前，还包括如下对所述肺癌实体瘤组织进行解离前处理的步骤：用体积百分含量为70-75％的乙醇清洗肺癌实体瘤组织样本表面；用样本清洗液和无菌的PBS溶液先后清洗所述肺癌实体瘤组织样本；

具体的，所述样本清洗液由双抗P/S和PBS组成；其中，所述双抗P/S中的青霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素在所述样本清洗液中的终浓度为100-200μg/mL；余量均为PBS。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：进行所述解离前处理的所述肺癌实体瘤组织样本的离体时间为2小时以内，且在进行所述解离前处理之前一直保存于样本保存液中；

具体的，所述样本保存液由胎牛血清、双抗P/S、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清在所述样本保存液中的终浓度为1-5％(体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素在所述样本保存液中的终浓度为100-200μg/mL；所述HEPES在所述样本保存液中的终浓度为8-12mM；余量均为HBSS。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，用所述样本解离液对所述肺癌实体瘤组织进行解离处理后还包括如下步骤：用消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；离心后用无菌PBS重悬细胞；再离心，然后用所述肺癌实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀；

具体的，所述消化终止液由胎牛血清、双抗P/S和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清在所述消化终止液中的终浓度为8-12％(体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素在所述消化终止液中的终浓度为100-200μg/mL；余量均为DMEM培养基。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(2)中，还包括如下步骤：待所述肺癌实体瘤原代细胞形成直径80-120μm的团块时，对所述肺癌实体瘤原代细胞进行传代；

具体的，进行所述传代时采用的细胞消化液组成如下：每10mL所述细胞消化液中含有4-6mL Accutase，终浓度为5mM的EDTA，1.5-2.5mL TrypLE Express，余量为PBS；和/或

进行所述传代时采用的消化终止液为权利要求6中所述的消化终止液；

和/或

所述方法还包括对经过2-3次传代扩增后的所述肺癌实体瘤原代细胞进行冻存和/或复苏的步骤；

具体的，进行所述冻存时采用的细胞冻存液由Advanced DMEM/F12培养基、DMSO和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述Advanced DMEM/F12培养基、所述DMSO和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。

8.一种用于培养肺癌实体瘤原代细胞的成套试剂，为如下任一：

(A)由权利要求1-7任一中所述样本解离液和所述肺癌实体瘤原代细胞培养基组成；

(B)由权利要求1-7任一中所述样本解离液、所述肺癌实体瘤原代细胞培养基和如下试剂中至少一种组成：权利要求1-7任一中所述样本保存液、所述细胞消化液、所述样本清洗液、所述消化终止液和所述细胞冻存液。

9.权利要求8所述的成套试剂在培养肺癌实体瘤原代细胞中的应用。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或成套试剂或应用，其特征在于：所述肺癌为原发性肺癌，病理分期为II期或III期，病理分型为非小细胞肺癌或小细胞肺癌。