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CN110452303A - 共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用 - Google Patents

共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用 Download PDF

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CN110452303A CN201910730507.5A CN201910730507A CN110452303A CN 110452303 A CN110452303 A CN 110452303A CN 201910730507 A CN201910730507 A CN 201910730507A CN 110452303 A CN110452303 A CN 110452303A
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Wuhan Institute of Virology of CAS
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Abstract

本发明涉及基于TYLCV‑C1蛋白的蛋白与核酸的共价连接，其利用TYLCV‑C1蛋白的催化作用，将目标蛋白与目标核酸共价连接形成蛋白核酸复合物，其反应条件温和，反应耗时短，效率高达93％，25℃反应10min即可，且TYLCV‑C1蛋白对目标蛋白及目标核酸的功能及性质无负面影响。

Description

共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用
技术领域
本发明涉及-生物交联、纳米技术领域，具体涉及基于TYLCV-C1蛋白自催化的蛋白与核酸的定点共价连接。
背景技术
蛋白核酸复合物，由于具备了蛋白质功能多样性以及核酸的可编程性，使其在生物技术上研究十分广泛。目前在核酸纳米结构上构建的多酶体系、固相载体如生物芯片上的蛋白固定、生物分子递送、高分辨成像技术上已有大量工作报导。但在上述技术中，所采用的蛋白核酸连接方法，大部分为化学交联，蛋白核酸随机连接，无法确定核酸连接的数目与状态，不仅需要对目的蛋白或核酸进行预修饰，而且反应过程会使蛋白不同程度失活，如通过化学交联剂预先修饰处理的核酸与蛋白表面的氨基或巯基反应形成共价连接，如利用交联剂(如sSMCC)的作用将烷硫基(Alkylthiol)修饰的核酸与表面含氨基的蛋白形成共价结合。也有采用酶促连接的方法，如通过在谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)的作用下，修饰Z-QG(N-carbobenzyloxy glutaminyl glycine)的核酸与融合有MKHKGS短肽的蛋白产生共价结合，但这类方法反应前需要对核酸、蛋白均进行修饰，应用受限。还有一些非共价结合方法，如通过亲和素(或链霉亲和素)与生物素的作用，金属离子与蛋白识别结构域的结合(如镍离子与聚组氨酸的结合)等实现蛋白核酸连接，但这些作用相对于共价结合，结合力低，受坏境影响，不稳定性高，应用受限。所以目前蛋白核酸连接技术有待发展，急需要一种稳定、高效、反应条件温和、化学计量比可控的共价定点连接技术。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种TYLCV-C1蛋白，其能够识别特定的目标核酸序列并进行剪切，将剪切后的目标核酸直接共价连接到TYLCV-C1蛋白的酪氨酸上，再通过TYLCV-C1蛋白与目标蛋白连接，从而实现定点、定向共价连接，而不影响蛋白及核酸的结构或性能。
TYLCV-C1蛋白为番茄黄化曲叶病毒的复制相关蛋白(Replication-associatedprotein)，为该病毒的C1基因编码，在病毒单链DNA的复制中起着重要作用。其在病毒基因间隔区域的识别序列上进行剪切引入缺口，从而启动滚环复制(rolling circlereplication，RCR)。
本发明提供一种共价连接核酸和肽或蛋白的方法，其包括使用TYLCV-C1蛋白共价连接目标核酸和目标肽或蛋白。
所述目标肽可为有生物活性多肽或人工合成多肽等。例如，细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、其它药用小肽以及诊断用多肽等。其中，活性肽又可为免疫活性肽、神经活性肽、胆固醇肽、促进矿物质吸收的肽(CPPS)、酶调节剂(如促胰酶肽)、激素肽如生长激素释放因子(GRFS)、白蛋白胰岛素增效肽、抗菌多肽(如乳酸链球菌素、橡胶素)、抗癌多肽(如肿瘤细胞坏死因子、环已肽)、抗艾滋病肽(如GLQ蛋白)等。
所述的目标蛋白可为单体蛋白、寡聚蛋白、多聚蛋白等。按其来源可为动物蛋白、植物蛋白或人工合成蛋白等。
其中，所述的目标肽或蛋白可以根据实际需要进行选择。
所述TYLCV-C1蛋白包括完整的天然的TYLCV-C1蛋白、经过改造的TYLCV-C1蛋白或TYLCV-C1蛋白结构域，所述经过改造的TYLCV-C1蛋白或TYLCV-C1蛋白结构域具有核酸酶的催化活性。
在本发明的一个具体实施方式中，连接所述核酸和所述肽或蛋白的方法中，还包括，在使用所述TYLCV-C1蛋白连接所述核酸和所述肽或蛋白之前，在所述核酸的5’端连接序列tatta或x-tatta，其中x代表一个或多个核苷酸碱基。
示例性地，所述x为1-30个核苷酸碱基。优选地，所述x为2-20个核苷酸碱基。更优选地，所述x为5-10个核苷酸碱基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述x为7个核苷酸碱基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标核酸的5’端连接cgtataatatta序列。
其中，序列tatta为TYLCV-C1蛋白的识别序列，cgtataa序列有助于TYLCV-C1蛋白的识别。
在本发明的一个具体实施方式中，其中所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白形成融合蛋白。当然本发明中所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白的连接也可通过现有技术中的其他方式进行连接，如通过化学修饰连接，或非共价结合等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接。
融合蛋白的设计中，经常需要用连接肽将不同功能的蛋白进行连接融合。连接肽的设计和选择对融合蛋白的表达、稳定性及功能活性至关重要。常见的两种连接肽分为柔性和刚性，其中柔性连接肽即成柔软线性的一类易折弯的氨基酸序列，刚性连接肽即成稳固螺旋结构的一类长度固定的氨基酸序列。设计连接肽时应考虑长度、氨基酸成分、亲水性、构象、柔韧性及电荷等影响。连接肽中的氨基酸组成对柔性连接头影响较大，而氨基酸排列影响着刚性连接肽的结构。
连接肽的长度直接影响着功能蛋白的间距，过程或过短的连接肽均会影响融合蛋白的稳定性与活性等。长度过短会导致空间位阻效应，两端的蛋白不能充分折叠或展开，形成错误构型或阻碍活性位点，造成融合蛋白无活性或低活性，二聚体形式大量出现；过长会导致融合蛋白整体结构松散，易被宿主细胞中的蛋白酶水解切断，失去融合意义。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性多肽连接。所述柔性连接肽的序列可依据目标肽或蛋白进行选择。柔性连接肽的序列，例如可为GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG、GGGGSGGGSGG等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性多肽GGGGS连接。
在本发明第一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过刚性连接肽连接。刚性连接肽的序列如：EAAAK，(EAAAK)2，(EAAAK)3，(EAAAK)4，(EAAAK)5，(EAAAK)6，AEAAAKA，A(EAAAK)2A，A(EAAAK)3A，A(EAAAK)4A，A(EAAAK)5A，A(EAAAK)6A等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示或其同源序列。
示例性地，所述同源序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示或其简并序列。
示例性地，所述简并序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
本发明另一方面还提供了TYLCV-C1蛋白在目标蛋白与目标核酸共价连接中的用途。
示例性地，所述的目标核酸的5’端连接序列tatta或x-tatta，其中x代表一个或多个核苷酸碱基。
示例性地，所述x为1-30个核苷酸碱基。优选地，所述x为2-20个核苷酸碱基。更优选地，所述x为5-10个核苷酸碱基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述x为7个核苷酸碱基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标核酸的5’端连接cgtataatatta序列。
其中，序列tatta为TYLCV-C1蛋白的识别序列，cgtataa序列有助于TYLCV-C1蛋白的识别。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白形成融合蛋白。
示例性地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性连接肽连接。所述柔性连接肽可依据目标蛋白的结构、性质等进行选择。柔性连接肽的序列，例如可为GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG、GGGGSGGGSGG等。优选地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过GGGGS连接。
本发明另一方面还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括目标蛋白和TYLCV-C1蛋白。
示例性地，所述目标蛋白和所述TYLCV-C1蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标蛋白和所述TYLCV-C1蛋白通过柔性连接肽连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示或其同源序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示或其简并序列。
本发明另一方面还提供了上述融合蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
通过基因重组将目标蛋白与TYLCV-C1蛋白融合形成融合蛋白，以及任选地，将所述融合蛋白进行表达。
本发明还提供上述一种复合物，该复合物包括目标蛋白和目标核酸，所述目标蛋白和所述目标核酸通过TYLCV-C1蛋白的催化作用而共价连接。
示例性地，所述目标蛋白和所述目标核酸通过TYLCV-C1蛋白共价连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标蛋白和所述目标核酸通过TYLCV-C1蛋白共价连接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标蛋白为荧光蛋白Venus、丙酮酸氧化酶、磷酸乙酰转移酶、链球菌G蛋白中的一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述目标核酸的序列为SEQ ID NO：3所示的序列、SEQ ID NO：4所示的序列、SEQ ID NO：5所示的序列中的一种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述复合物还包括TYLCV-C1蛋白，优选地，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或其同源序列。
本发明还提供上述复合物的制备方法，其包括如下步骤：
将连接有所述目标蛋白的TYLCV-C1蛋白与所述目标核酸相混合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述制备方法还包括在所述连接有所述目标蛋白的TYLCV-C1蛋白与所述目标核酸相混合的混合物中加入金属离子，例如锰离子、钙离子、镁离子等。
在本发明的一个具体实施方式中，在所述连接有所述目标蛋白的TYLCV-C1蛋白与所述目标核酸相混合的混合物中加入钙离子和乙酸。优选地，加入所述钙离子的浓度为2-4mM，所述乙酸的浓度为0.5-0.8％。更优选地，所述钙离子的浓度为4mM。
具体地，所述复合物的制备方法包括：
(1)融合蛋白的克隆：通过分子克隆将目标蛋白基因与TYLCV-C1蛋白基因融合形成融合蛋白的基因；(2)融合蛋白的表达、纯化：将融合蛋白的基因克隆入表达载体，并将构建的表达载体转化到大肠杆菌表达株中进行诱导表达，即获得融合蛋白。
(3)将融合蛋白与目标核酸混合，加入终浓度为4mM的钙离子和终浓度为0.5％的乙酸，25℃反应10min，即可获得核酸共价连接的蛋白。
本发明提供一种连接核酸和肽或蛋白的方法，其利用TYLCV-C1蛋白的催化作用，将目标肽或蛋白与目标核酸共价连接形成蛋白核酸复合物，其反应条件温和，反应耗时短，效率高，25℃反应10min即可，且TYLCV-C1蛋白对目标蛋白及目标核酸的功能及性质几乎无影响，甚至能够提高具有催化活性酶的酶活。
附图说明
图1所示为本发明实施例提供的TYLCV-C1蛋白与核酸连接的原理图。其中，POI表示目标蛋白；TYLCV表示TYLCV-C1蛋白。
图2所示为本发明实施例提供的荧光蛋白Venus与核酸形成的复合物的实验结果图。
图3所示为本发明实施例提供的丙酮酸氧化酶与核酸形成的复合物的实验结果图。
图4所示为本发明实施例中利用荧光强度测定蛋白核酸复合物Venus-TYLCV-C1-核酸中荧光蛋白Venus的活性。
图5所示为本发明实施例提供的SPG与核酸形成的复合物的实验结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
本文中所述的TYLCV-C1蛋白包括其相关突变体或者TYLCV-C1蛋白的部分结构域，所述突变体或部分结构域仍然具有核酸内切酶的功能，能够催化蛋白与核酸进行连接。
本发明所述的目标蛋白可为任意的蛋白，其根据需要进行选择。
本发明所述的目标核酸为任意的核酸序列，只需在其5’端连接tatta序列或cgtataatatta序列即可，若目标核酸序列本身在5’端已经含有tatta序列或cgtataatatta序列，则其无需再在5’端连接tatta序列或cgtataatatta序列。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
实施例1荧光蛋白Venus与TYLCV-C1蛋白的融合、表达
本实施例中以荧光蛋白Venus作为目标蛋白，将其与TYLCV-C1蛋白进行融合与表达。
本实施例中提供的目标蛋白与TYLCV-C1蛋白通过基因融合的方案进行连接，其也可采用其他方式连接，如：化学修饰或非共价结合等。
(1)融合蛋白的克隆：人工合成荧光蛋白Venus与TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列。其中，荧光蛋白Venus的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
荧光蛋白Venus作为目标蛋白，其与TYLCV-C1蛋白可直接连接或者通过柔性连接肽连接。例如，柔性连接肽的序列如GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG、GGGGSGGGSGG等。本实施例中荧光蛋白Venus与TYLCV-C1蛋白之间通过柔性连接肽GGGGS形成融合蛋白，其中融合蛋白的序列如SEQ ID NO：7所示。
(2)融合蛋白的表达、纯化：将融合蛋白的基因(其序列如SEQ ID NO：7所示)克隆入表达载体PET32a(蛋白可在多种表达载体和表达宿主中良好表达，这里仅描述在大肠杆菌中的表达并利用镍亲和层析柱纯化)。将构建的表达载体转化到大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，挑取阳性克隆。将挑取的阳性克隆转接到LB培养基，37℃、振荡培养至对数生长期(OD值约为0.5)。向培养物中加入工作终浓度为1mM的IPTG，25℃、振荡培养诱导蛋白表达8小时。Ni亲和层析纯化目标蛋白，即获得纯化的融合蛋白Venus-TYLCV-C1。
实施例2荧光蛋白Venus与核酸形成的复合物的制备
蛋白与核酸连接的原理图如图1所示。图1中POI表示目标蛋白。本实施例中目标核酸为5’端连接tatta序列的任意核酸序列，优选地为5’端连接cgtataatatta序列的任意核酸序列。本实施例中具体以SEQ ID NO：3所示的目标核酸序列3为例加以说明。
在SEQ ID NO：3所示的目标核酸序列3的5’端插入tatta序列。本实施例中优选地在SEQ ID NO：3所示的目标核酸序列3的5’端插入cgtataatatta序列，形成如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列12。
将实施例1中纯化所得融合蛋白Venus-TYLCV-C1与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列12相混合，加入终浓度为4mM的锰离子，于25℃反应10min，即可获得与蛋白核酸复合物Venus-TYLCV-C1-核酸。
将所得蛋白核酸复合物Venus-TYLCV-C1-核酸进行SDS-PAGE电泳确认，与核酸共价连接的蛋白核酸复合物分子量大，在SDS-PAGE中条带相较于原蛋白会滞后，因此，在SDS-PAGE电泳中会存在一条滞后链如图2所示。图2中从左向右的通道分别表示：1为marker；2为对照；3为复合物；从图2中可以看出，通道3相较于对照通道2存在着明显的滞后条带，说明本实施例中的目标蛋白与目标核酸已共价连接形成蛋白核酸复合物Venus-TYLCV-C1-核酸。
实施例3荧光蛋白Venus与核酸形成的复合物的荧光强度测定
本实施例中利用荧光强度测定蛋白核酸复合物Venus-TYLCV-C1-核酸中荧光蛋白Venus的活性。将实例2中所得蛋白核酸复合物Venus-TYLCV-C1-核酸于酶标仪中测定荧光强度。取蛋白核酸复合物Venus-TYLCV-C1-核酸3.6ug，加入纯水定容至100ul。阳性对照为3.6ugVenus-TYLCV-C1蛋白；阴性对照为纯水。测试条件为：激发波长515nm，测定发射波长530nm处荧光强度。结果如图4所示，图中从左向右数据分别表示：1为复合物；2为阳性对照；3为阴性对照。从图中可以看出复合物荧光强度相较于阳性对照组并无降低，说明实施例1和实施例2中所提供的在利用TYLCV-C1蛋白催化目标蛋白与目标核酸形成蛋白核酸复合物的整个过程对目标蛋白的活性无影响，且最后形成的蛋白核酸复合物中的目标蛋白依然能够保持其原有的活性。
实施例4丙酮酸氧化酶与TYLCV-C1蛋白的融合与表达
本实施例中以丙酮酸氧化酶(POX，pyruvate oxidase)作为目标蛋白，将其与TYLCV-C1蛋白进行融合与表达。TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本实施例中提供的丙酮酸氧化酶与TYLCV-C1蛋白通过基因融合的方案进行连接，其也可采用其他方式连接，如：化学修饰或非共价结合等。
(1)融合蛋白的克隆：人工合成丙酮酸氧化酶与TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列。其中，丙酮酸氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
本实施例中丙酮酸氧化酶与TYLCV-C1蛋白通过柔性连接肽GGGGS连接而形成融合蛋白，简称为POX-TYLCV-C1，其中，融合蛋白POX-TYLCV-C1的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
(2)融合蛋白的表达、纯化：将融合蛋白POX-TYLCV-C1的基因(其序列如SEQ IDNO：9所示)克隆入表达载体PET32a(蛋白可在多种表达载体和表达宿主中良好表达，这里仅描述在大肠杆菌中的表达并利用镍亲和层析柱纯化)。将构建的表达载体转化到大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，挑取阳性克隆。将挑取的阳性克隆转接到LB培养基，37℃、振荡培养至对数生长期(OD值约为0.5)。向培养物中加入工作终浓度为1mM的IPTG，25℃、振荡培养诱导蛋白表达8小时。Ni亲和层析纯化目标蛋白，即获得纯化的融合蛋白POX-TYLCV-C1。
实施例5丙酮酸氧化酶与核酸形成的复合物的制备
将实施例4中纯化所得融合蛋白POX-TYLCV-C1与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列4相混合，加入终浓度为4mM的镁离子，于37℃反应10min，即可获得与蛋白核酸复合物POX-TYLCV-C1-核酸。
将所得蛋白核酸复合物POX-TYLCV-C1-核酸进行SDS-PAGE电泳确认，其结果如图3所示。与核酸共价连接的蛋白核酸复合物分子量大，在SDS-PAGE中条带相较于原蛋白会滞后，因此，在SDS-PAGE电泳中会存在一条滞后链如图3所示。图3中从左向右的通道分别表示：1为marker；2为复合物；3为对照。从图3中可以看出，通道2中相较于对照存在着明显的滞后条带，说明本实施例中的目标蛋白与目标核酸已共价连接形成蛋白核酸复合物POX-TYLCV-C1-核酸。
本申请的发明人还试验了将磷酸乙酰转移酶(PTA，PhosphateAcetyltransferase)通过TYLCV-C1蛋白与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列4相连接，其也形成了磷酸乙酰转移酶与核酸的复合物。
实施例6复合物中丙酮酸氧化酶的活力测定
以单独表达的丙酮酸氧化酶的活力为对照，试验实施例4中形成的融合蛋白POX-TYLCV-C1中的丙酮酸氧化酶的活力以及实施例5中的复合物POX-TYLCV-C1-核酸中的丙酮酸氧化酶的活力。本实施例中丙酮酸氧化酶的活力测定步骤如下：
(1)测定原理
丙酮酸氧化酶使样本中的丙酮酸发生反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下生成水和氧，以消耗样本中的丙酮酸，其催化下列反应：
由以上反应式可知，可以通过在550nm波长处测定醌亚胺染料的吸光度值来确定丙酮酸氧化酶的酶活。
(2)测定试剂
(A)反应混合液1：50mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.4)2.0mL，2mmol/L的黄素腺嘌呤二核苷酸0.1mL，3mmol/L的硫胺素焦磷酸酯0.2mL，15mmol/L的4-氨基安替比林溶液1.0mL，50U/mL的过氧化物酶溶液1.0mL，蒸馏水1.7mL。
(B)反应混合液2：0.2％的2,4-二氯苯酚2.0mL，0.15mol/L的硫酸镁溶液2.0mL。
(C)底物溶液：1.0mol/L的丙酮酸钾溶液。
(D)反应终止液：将3.72mg的EDTA二钠盐溶解于100mL的水中。
(E)酶稀释液：50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)。
(3)测定操作过程
(A)取0.6mL的反应混合液1、0.3mL的反应混合液2和0.1mL的底物溶液，充分混合，然后加热到37℃。
(B)用酶稀释液将丙酮酸氧化酶样品稀释至酶活力单位为0.1～0.2U/mL，然后取0.02mL的样品稀释液加入到步骤(A)形成的混合液中，混匀，在37℃下恒温10min。
(C)加入反应终止液2.0mL，在37℃下平衡5min。
(D)取0.1mL的上述酶溶液，在37℃恒温的分光光度计(岛津UV-2450分光光度计)中，于550nm下测定吸光度值(A1)。
(E)用酶稀释液代替丙酮酸氧化酶样品按上述步骤操作，测定吸光度值(A2)。
(F)计算ΔA值：ΔA＝A1-A2。
(4)酶活力单位定义：在上述条件下，1分钟内消耗1μmol丙酮酸的酶量为1U。
(5)酶活计算公式：
酶活力(U/mg)＝(0.82×ΔA×Df)÷C
其中：10为反应时间；Vt为总体积3.02mL；Vs为样品体积0.02mL；Df为丙酮酸氧化酶样品的稀释倍数；1/2为反应中2mol H2O2产生1mol的醌亚胺染料物质；36.88为在测定条件下醌亚胺染料的摩尔吸光系数(cm2/μmol)；C为溶液中酶的浓度(mg/mL)。
原料来源：
聚乙二醇购自美国陶氏化学公司，丙酮酸购自上海谱振生物科技有限公司，过氧化物酶购自上海佳和生物科技有限公司。
对照组丙酮酸氧化酶为根据实施例4中融合蛋白的克隆与表达方法所制备的单独的丙酮酸氧化酶(其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示)；试验组分别为实施例4所制备的融合蛋白POX-TYLCV-C1中的丙酮酸氧化酶的酶活以及实施例5中复合物POX-TYLCV-C1-核酸中的丙酮酸氧化酶的酶活。
其结果显示，实施例4中POX-TYLCV-C1的丙酮酸氧化酶的酶活以及实施例5中POX-TYLCV-C1-核酸的丙酮酸氧化酶的酶活均高于对照组丙酮酸氧化酶的酶活，POX-TYLCV-C1的丙酮酸氧化酶的酶活约为对照组丙酮酸氧化酶的酶活的1.63倍；POX-TYLCV-C1-核酸的丙酮酸氧化酶的酶活约为对照组丙酮酸氧化酶的酶活的1.61倍，可见实施例4和实施例5中所提供的在利用TYLCV-C1蛋白催化丙酮酸氧化酶与目标核酸形成蛋白核酸复合物的整个过程中，不但没有造成丙酮酸氧化酶活性的降低，反而增强了丙酮酸氧化酶的酶活，也即TYLCV-C1蛋白不仅能够催化丙酮酸氧化酶与目标核酸连接，且TYLCV-C1蛋白能够提高融合蛋白及复合物中丙酮酸氧化酶的酶活。
本申请的发明人还试验了磷酸乙酰转移酶(PTA，Phosphate Acetyltransferase)通过TYLCV-C1蛋白与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列4相连接的过程中所形成的磷酸乙酰转移酶与TYLCV-C1蛋白形成的融合蛋白以及磷酸乙酰转移酶与核酸形成的复合物中磷酸乙酰转移酶的酶活，其实验结果为，磷酸乙酰转移酶与TYLCV-C1蛋白形成的融合蛋白的磷酸乙酰转移酶的酶活以及磷酸乙酰转移酶与核酸形成的复合物中磷酸乙酰转移酶的酶活均高于单独游离的磷酸乙酰转移酶的酶活，分别为单独游离的磷酸乙酰转移酶的酶活的1.54倍和1.49倍
实施例7SPG与TYLCV-C1蛋白形成复合物
本实施例中以SPG，(链球菌G蛋白，Streptococcus Protein G)作为目标蛋白，将其与TYLCV-C1蛋白进行融合与表达。TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
(1)融合蛋白的克隆：人工合成SPG与TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列。SPG的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，TYLCV-C1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本实施例中SPG与TYLCV-C1蛋白通过柔性连接肽GGGGS连接而形成融合蛋白，简称为SPG-TYLCV-C1，其中，融合蛋白SPG-TYLCV-C1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
(2)融合蛋白的表达、纯化：将融合蛋白SPG-TYLCV-C1的基因(其序列如SEQ IDNO：11所示)克隆入表达载体PET32a(蛋白可在多种表达载体和表达宿主中良好表达，这里仅描述在大肠杆菌中的表达并利用镍亲和层析柱纯化)。将构建的表达载体转化到大肠杆菌表达株BL21(DE3)中，挑取阳性克隆。将挑取的阳性克隆转接到LB培养基，37℃、振荡培养至对数生长期(OD值约为0.5)。向培养物中加入工作终浓度为1mM的IPTG，25℃、振荡培养诱导蛋白表达8小时。Ni亲和层析纯化目标蛋白，即获得纯化的融合蛋白SPG-TYLCV-C1。
实施例8SPG与核酸形成的复合物的制备
将实施例7中纯化所得融合蛋白SPG-TYLCV-C1与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列5相混合，加入终浓度为4mM的钙离子，于16℃反应30min，即可获得与蛋白核酸复合物SPG-TYLCV-C1-核酸。
将所得蛋白核酸复合物SPG-TYLCV-C1-核酸进行SDS-PAGE电泳确认，其结果如图5所示。图5中从左向右的通道分别表示：1为marker；2为复合物；3为对照。从图5中可以看出，通道2中相较于对照存在着明显的滞后条带，说明本实施例中的目标蛋白与目标核酸已共价连接形成蛋白核酸复合物SPG-TYLCV-C1-核酸。
以单独的SPG为对照，试验实施例7中形成的融合蛋白中SPG结合抗原活性以及实施例8中SPG与核酸形成的复合物中的SPG结合抗原活性，其结果显示，实施7中形成的融合蛋白中的SPG的活性以及实施例8中丙酮酸氧化酶与核酸形成的复合物中的SPG与单独的SPG的活性并无差异，可见实施例7和实施例8中所提供的在利用TYLCV-C1蛋白催化目标蛋白与目标核酸形成蛋白核酸复合物的整个过程对目标蛋白的活性均无影响，且最后形成的蛋白核酸复合物中的目标蛋白依然能够保持其原有的活性。
实施例9试验不同反应条件对SPG-TYLCV-C1-核酸制备的影响
本申请的发明人还试验了不同反应条件对于蛋白与核酸连接的影响。以实施例8中蛋白核酸复合物SPG-TYLCV-C1与核酸的连接为对照，试验加入不同的乙酸浓度、不同的钙离子浓度以及不同的反应温度对SPG-TYLCV-C1-核酸制备的影响。具体过程如下：将实施例7中纯化所得融合蛋白SPG-TYLCV-C1与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列5相混合，加入不同浓度的乙酸，不同浓度的钙离子，分别于16℃、25℃、37℃进行反应10min后进行电泳，在光密度扫描仪上检测条带灰度值(Bio-Rad GS-900光密度扫描仪)，计算反应完成时的连接效率，连接效率E的计算如下：
E＝E(C)/E(C)+E(P)，其中E(C)为蛋白核酸复合物条带灰度值，E(P)为目标蛋白条带灰度值。试验方案及结果见表1所示。
表1不同反应条件对SPG-TYLCV-C1-核酸制备的影响
金属离子及加入量 反应温度 反应效率
钙离子4mM 37℃ 67％
乙酸0.2％ 37℃ -
钙离子2mM 37℃ 60％
钙离子4mM+乙酸0.2％ 37℃ 78％
钙离子4mM 25℃ 63％
乙酸0.2％ 25℃ -
钙离子4mM+乙酸0.2％ 25℃ 82％
钙离子4mM+乙酸0.5％ 25℃ 93％
钙离子4mM+乙酸0.8％ 25℃ 87％
钙离子4mM+乙酸1％ 25℃ 87％
钙离子4mM+乙酸2％ 25℃ 71％
钙离子4mM 16℃ 50％
乙酸0.2％ 16℃ -
钙离子4mM+乙酸0.2％ 16℃ 56％
钙离子4mM+乙酸0.5％ 16℃ 73％
注：-表示无反应。
由表1可以看出，不同浓度的乙酸对SPG-TYLCV-C1与核酸的连接有一定的影响，在SPG-TYLCV-C1与核酸相混合的混合物中，单独加入乙酸时，SPG-TYLCV-C1无法与核酸共价连接形成蛋白核酸复合物；4mM的钙离子较2mM的钙离子更能够促进SPG-TYLCV-C1与核酸的连接；而将钙离子与乙酸同时加入到SPG-TYLCV-C1与核酸相混合的混合物中时，SPG-TYLCV-C1与核酸连接效率更高，尤其是当4mM的钙离子与0.5％的乙酸加入到SPG-TYLCV-C1与核酸相混合的混合物中时，其反应效率最高，且所需的反应温度约在室温条件下。本申请的发明人同样试验了其他蛋白与核酸的共价连接，如实施例2中荧光蛋白与核酸的共价连接、实施例5中丙酮酸氧化酶与核酸的连接以及磷酸乙酰转移酶与核酸的共价连接，其结果均显示，在目标蛋白与目标核酸共价连接过程中，加入4mM钙离子和0.5％的乙酸，使得目标蛋白与目标核酸共价连接反应效率最高。
本实施例利用TYLCV-C1蛋白能够识别tatta序列，并能够催化将目标蛋白与含有tatta序列的目标核酸相连接，实现了蛋白与核酸的共价连接，而且该连接对目标蛋白与目标核酸无需引入任何化学试剂，仅需额外加入金属离子即可，且反应条件温和，反应耗时短效率高，在25℃时反应10min即可完成，整个制备过程及最后形成的蛋白核酸复合物均对目标蛋白无负面影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 共价连接核酸和肽或蛋白的方法及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TYLCV-C1蛋白氨基酸序列
<400> 1
Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu
1 5 10 15
Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gln Ile
20 25 30
Thr Asn Leu Gln Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg
35 40 45
Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gln Phe
50 55 60
Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gln Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser
65 70 75 80
Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gln Gly Ala Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Asp Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu
100 105 110
Trp Gly Thr Phe Gln Ile Asp Gly Arg
115 120
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TYLCV-C1蛋白核苷酸序列
<400> 2
atgcctcgtt caggccgctt tagcattaaa gcgaagaact actttctgac ctatccgaaa 60
tgcgatctga ccaaagaaaa cgcgctgagc cagattacca acctgcagac cccgaccaac 120
aaactgttca tcaaaatttg ccgcgaactg catgaaaacg gcgaaccgca tctgcatatt 180
ctgattcagt tcgagggcaa atataactgc accaaccagc gcttttttga tctggtgagc 240
cctactcgta gcgcgcattt tcatccgaac attcagggcg cgaaaagcag cagcgatgtg 300
aaaagctaca tcgataagga tggcgatgtg ctggaatggg gcacctttca gattgatggc 360
cgt 363
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核苷酸序列3
<400> 3
ccggatggcc gcgc 14
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核苷酸序列4
<400> 4
cgtataatat tacgggtgag gccggcg 27
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核苷酸序列5
<400> 5
cgtataatat taccgaagcg accaggcgat ataat 35
<210> 6
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 荧光蛋白Venus的核苷酸序列
<400> 6
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt gatctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccttgggcta cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg cgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 7
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Venus-TYLCV-C1融合蛋白
<400> 7
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt gatctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccttgggcta cggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg cgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagggt 720
ggaggtggat cgggatccga aaacctttac ttccaaggcc ctcgttcagg ccgctttagc 780
attaaagcga agaactactt tctgacctat ccgaaatgcg atctgaccaa agaaaacgcg 840
ctgagccaga ttaccaacct gcagaccccg accaacaaac tgttcatcaa aatttgccgc 900
gaactgcatg aaaacggcga accgcatctg catattctga ttcagttcga gggcaaatat 960
aactgcacca accagcgctt ttttgatctg gtgagcccta ctcgtagcgc gcattttcat 1020
ccgaacattc agggcgcgaa aagcagcagc gatgtgaaaa gctacatcga taaggatggc 1080
gatgtgctgg aatggggcac ctttcagatt gatggccgtc tcgagcacca ccaccaccac 1140
cactga 1146
<210> 8
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 丙酮酸氧化酶的核苷酸序列
<400> 8
atgagcgaca acaagatcaa cattggtctg gcggttatga aaatcctgga aagctggggc 60
gcggacacca tttatggtat cccgagcggc accctgagca gcctgatgga tgcgatgggt 120
gaggaagaga acaacgtgaa gttcctgcag gttaaacatg aagaggtggg tgcgatggcg 180
gcggtgatgc aaagcaaatt tggtggcaac ctgggtgtga ccgttggtag cggtggcccg 240
ggtgcgagcc acctgattaa cggcctgtac gacgcggcga tggataacat tccggtggtt 300
gcgatcctgg gtagccgtcc gcagcgtgaa ctgaacatgg acgcgttcca ggagctgaac 360
caaaacccga tgtacgatca catcgcggtt tataaccgtc gtgtggcgta cgcggaacaa 420
ctgccgaagc tggttgacga ggcggcgcgt atggcgattg cgaaacgtgg tgtggcggtt 480
ctggaagttc cgggcgattt tgcgaaagtg gagatcgaca acgatcagtg gtatagcagc 540
gcgaacagcc tgcgtaaata tgcgccgatt gcgccggcgg cgcaagacat tgatgcggcg 600
gttgagctgc tgaacaacag caaacgtccg gtgatttatg cgggtatcgg cacgatgggt 660
cacggtccgg cggttcagga actggcgcgt aagattaaag cgccggtgat caccaccggt 720
aaaaacttcg aaacctttga gtgggacttc gaggcgctga ccggtagcac ctaccgtgtt 780
ggctggaagc cggcgaacga aaccatcctg gaggcggaca ccgtgctgtt tgcgggtagc 840
aacttcccgt ttagcgaagt tgagggcacc ttccgtaacg tggataactt tatccagatt 900
gacatcgatc cggcgatgct gggtaaacgt caccatgcgg atgtggcgat cctgggtgat 960
gcgggtctgg cgattgacga aatcctgaac aaggtggacg cggttgaaga gagcgcgtgg 1020
tggaccgcga acctgaaaaa cattgcgaac tggcgtgaat atatcaacat gctggagacc 1080
aaggaagagg gtgacctgca gttctaccaa gtttataacg cgattaacaa ccacgcggac 1140
gaggatgcga tttacagcat cgatgtgggc aacagcaccc agaccagcat ccgtcacctg 1200
cacatgaccc cgaaaaacat gtggcgtacc agcccgctgt tcgcgacgat gggtattgcg 1260
attccgggtg gcctgggtgc gaagaacacc tacccggatc gtcaagtttg gaacatcatt 1320
ggtgacggcg cgtttagcat gacctatccg gatgtggtta ccaacgttcg ttacaacatg 1380
ccggtgatta acgtggtttt cagcaacacc gaatatgcgt ttatcaagaa caaatacgag 1440
gacaccaaca agaacctgtt cggtgttgat tttaccgacg tggattatgc gaagattgcg 1500
gaagcgcagg gtgcgaaagg cttcaccgtg agccgtatcg aagacatgga tcgtgttatg 1560
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caagaccgtc cgattccggt tgagaccctg aagctggata gcaaactgta cagcgaagac 1680
gagatcaagg cgtacaaaga acgttatgag gcggcgaacc tggtgccgtt tcgtgaatat 1740
ctggaagcgg agggtctgga gagcaagtac atcaaa 1776
<210> 9
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白POX-TYLCV-C1的核苷酸序列
<400> 9
atgagcgaca acaagatcaa cattggtctg gcggttatga aaatcctgga aagctggggc 60
gcggacacca tttatggtat cccgagcggc accctgagca gcctgatgga tgcgatgggt 120
gaggaagaga acaacgtgaa gttcctgcag gttaaacatg aagaggtggg tgcgatggcg 180
gcggtgatgc aaagcaaatt tggtggcaac ctgggtgtga ccgttggtag cggtggcccg 240
ggtgcgagcc acctgattaa cggcctgtac gacgcggcga tggataacat tccggtggtt 300
gcgatcctgg gtagccgtcc gcagcgtgaa ctgaacatgg acgcgttcca ggagctgaac 360
caaaacccga tgtacgatca catcgcggtt tataaccgtc gtgtggcgta cgcggaacaa 420
ctgccgaagc tggttgacga ggcggcgcgt atggcgattg cgaaacgtgg tgtggcggtt 480
ctggaagttc cgggcgattt tgcgaaagtg gagatcgaca acgatcagtg gtatagcagc 540
gcgaacagcc tgcgtaaata tgcgccgatt gcgccggcgg cgcaagacat tgatgcggcg 600
gttgagctgc tgaacaacag caaacgtccg gtgatttatg cgggtatcgg cacgatgggt 660
cacggtccgg cggttcagga actggcgcgt aagattaaag cgccggtgat caccaccggt 720
aaaaacttcg aaacctttga gtgggacttc gaggcgctga ccggtagcac ctaccgtgtt 780
ggctggaagc cggcgaacga aaccatcctg gaggcggaca ccgtgctgtt tgcgggtagc 840
aacttcccgt ttagcgaagt tgagggcacc ttccgtaacg tggataactt tatccagatt 900
gacatcgatc cggcgatgct gggtaaacgt caccatgcgg atgtggcgat cctgggtgat 960
gcgggtctgg cgattgacga aatcctgaac aaggtggacg cggttgaaga gagcgcgtgg 1020
tggaccgcga acctgaaaaa cattgcgaac tggcgtgaat atatcaacat gctggagacc 1080
aaggaagagg gtgacctgca gttctaccaa gtttataacg cgattaacaa ccacgcggac 1140
gaggatgcga tttacagcat cgatgtgggc aacagcaccc agaccagcat ccgtcacctg 1200
cacatgaccc cgaaaaacat gtggcgtacc agcccgctgt tcgcgacgat gggtattgcg 1260
attccgggtg gcctgggtgc gaagaacacc tacccggatc gtcaagtttg gaacatcatt 1320
ggtgacggcg cgtttagcat gacctatccg gatgtggtta ccaacgttcg ttacaacatg 1380
ccggtgatta acgtggtttt cagcaacacc gaatatgcgt ttatcaagaa caaatacgag 1440
gacaccaaca agaacctgtt cggtgttgat tttaccgacg tggattatgc gaagattgcg 1500
gaagcgcagg gtgcgaaagg cttcaccgtg agccgtatcg aagacatgga tcgtgttatg 1560
gcggaggcgg tggcggcgaa caaggcgggc cacaccgtgg ttattgattg caaaatcacc 1620
caagaccgtc cgattccggt tgagaccctg aagctggata gcaaactgta cagcgaagac 1680
gagatcaagg cgtacaaaga acgttatgag gcggcgaacc tggtgccgtt tcgtgaatat 1740
ctggaagcgg agggtctgga gagcaagtac atcaaaggtg gaggtggatc gggatccgaa 1800
aacctttact tccaaggccc tcgttcaggc cgctttagca ttaaagcgaa gaactacttt 1860
ctgacctatc cgaaatgcga tctgaccaaa gaaaacgcgc tgagccagat taccaacctg 1920
cagaccccga ccaacaaact gttcatcaaa atttgccgcg aactgcatga aaacggcgaa 1980
ccgcatctgc atattctgat tcagttcgag ggcaaatata actgcaccaa ccagcgcttt 2040
tttgatctgg tgagccctac tcgtagcgcg cattttcatc cgaacattca gggcgcgaaa 2100
agcagcagcg atgtgaaaag ctacatcgat aaggatggcg atgtgctgga atggggcacc 2160
tttcagattg atggccgtct cgagcaccac caccaccacc actga 2205
<210> 10
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SPG的核苷酸序列
<400> 10
atgcagtaca agcttatcct gaacggtaaa accctgaaag gtgaaaccac caccgaagct 60
gttgacgctg ctaccgcgga aaaagttttc aaacagtacg ctaacgacaa cggtgttgac 120
ggtgaatgga cctacgacga cgctaccaaa accttcacgg taaccgagga t 171
<210> 11
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 融合蛋白SPG-TYLCV-C1的核苷酸序列
<400> 11
atgcagtaca agcttatcct gaacggtaaa accctgaaag gtgaaaccac caccgaagct 60
gttgacgctg ctaccgcgga aaaagttttc aaacagtacg ctaacgacaa cggtgttgac 120
ggtgaatgga cctacgacga cgctaccaaa accttcacgg taaccgagga tggtggaggt 180
ggatcgggat ccgaaaacct ttacttccaa ggccctcgtt caggccgctt tagcattaaa 240
gcgaagaact actttctgac ctatccgaaa tgcgatctga ccaaagaaaa cgcgctgagc 300
cagattacca acctgcagac cccgaccaac aaactgttca tcaaaatttg ccgcgaactg 360
catgaaaacg gcgaaccgca tctgcatatt ctgattcagt tcgagggcaa atataactgc 420
accaaccagc gcttttttga tctggtgagc cctactcgta gcgcgcattt tcatccgaac 480
attcagggcg cgaaaagcag cagcgatgtg aaaagctaca tcgataagga tggcgatgtg 540
ctggaatggg gcacctttca gattgatggc cgtctcgagc accaccacca ccaccactga 600
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核苷酸序列12
<400> 12
cgtataatat taccggatgg ccgcgc 26

Claims (20)

1.一种共价连接核酸和肽或蛋白的方法，其包括使用TYLCV-C1蛋白共价连接目标核酸和目标肽或蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括在使用所述TYLCV-C1蛋白连接所述核酸和所述肽或蛋白之前，在所述核酸的5’端连接序列tatta或x-tatta，其中x代表一个或多个核苷酸碱基；优选地，所述x为1-30个核苷酸碱基。
3.根据权利要求2的所述的方法，其中所述目标核酸的5’端连接cgtataatatta序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白形成融合蛋白。
5.根据权利要求4的方法，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接；优选地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性连接肽连接形成融合蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示或其同源序列。
7.TYLCV-C1蛋白在目标肽或蛋白与目标核酸连接中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，所述的目标核酸的5’端连接序列tatta或x-tatta，其中x代表一个或多个核苷酸碱基；优选地，所述x为1-30个核苷酸碱基；优选地，所述目标核酸的5’端连接cgtataatatta序列。
9.根据权利要求8所述的用途，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白形成融合蛋白；优选地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白直接连接或通过柔性连接肽连接；优选地，所述TYLCV-C1蛋白与所述目标肽或蛋白通过柔性连接肽连接形成融合蛋白。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示或其同源序列。
11.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括目标蛋白和TYLCV蛋白。
12.如权利要求11所述的融合蛋白，所述目标蛋白和所述TYLCV蛋白直接连接或通过柔性多肽连接。
13.如权利要求12所述的融合蛋白，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或其同源序列。
14.权利要求11-13中任一项所述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
通过基因重组将目标蛋白与TYLCV蛋白融合形成融合蛋白，以及任选地，将所述融合蛋白进行表达。
15.如权利要求14所述的制备方法，所述融合蛋白还包括柔性多肽，所述目标蛋白与所述TYLCV蛋白通过柔性多肽连接。
16.一种复合物，包括目标蛋白和目标核酸，所述目标蛋白和所述目标核酸通过TYLCV蛋白的催化作用而连接。
17.如权利要求16中所述的复合物，所述目标蛋白和所述目标核酸直接连接或通过柔性多肽连接；优选地，所述目标蛋白和所述目标核酸通过柔性多肽连接。
18.如权利要求17中所述的复合物，所述复合物还包括TYLCV蛋白，优选地，所述TYLCV-C1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或其同源序列。
19.权利要求16-18中任一项所述的复合物的制备方法，其包括如下步骤：
通过基因重组将目标蛋白与TYLCV蛋白融合形成融合蛋白，并将所述融合蛋白与目标核酸混合。
20.如权利要求19所述的制备方法，其特征在于，还包括在所述融合蛋白与所述目标核酸混合的混合物中加入金属离子，优选地，在所述融合蛋白与所述目标核酸混合的混合物中加入钙离子和乙酸。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111088235A (zh) * 2020-01-27 2020-05-01 福建晨欣科生物科技有限公司 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseI及其使用方法
CN111088234A (zh) * 2020-01-27 2020-05-01 福建晨欣科生物科技有限公司 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法
CN111088236A (zh) * 2020-01-27 2020-05-01 福建晨欣科生物科技有限公司 一种单链RNA肽连接酶sRPlaseI及其使用方法
CN111117978A (zh) * 2020-01-27 2020-05-08 福建晨欣科生物科技有限公司 一种单链DNA肽连接酶sDPlaseI及其使用方法
CN112778426A (zh) * 2021-01-06 2021-05-11 深圳伯生生物传感技术有限公司 一种精准抗体核酸定向连接方法
CN112851765A (zh) * 2021-02-09 2021-05-28 中国科学院武汉病毒研究所 蛋白或肽与核酸共价连接的方法
CN112851771A (zh) * 2021-02-09 2021-05-28 中国科学院武汉病毒研究所 连接核酸与蛋白或肽的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1378593A (zh) * 1999-08-20 2002-11-06 约翰斯霍普金斯大学医学院 构建融合文库的方法和组合物及该文库的用途
US20020172968A1 (en) * 2001-02-22 2002-11-21 Hongxiang Liu Biochips comprising nucleic acid/protein conjugates
US20030036643A1 (en) * 2000-09-14 2003-02-20 Jin Cheng He Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
CN1434870A (zh) * 1999-12-23 2003-08-06 三菱制药株式会社 病毒核心蛋白－阳离子脂质－核酸－递送复合物
US20050136404A1 (en) * 1997-07-02 2005-06-23 Doucette-Stamm Lynn A. Nucleic acid and amino acid sequences relating to streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
EP1507860A4 (en) * 2001-04-02 2005-08-03 Univ Washington REFERENCE TOOLS FOR DYNAMIC ACTIONS
CN1791676A (zh) * 2003-05-19 2006-06-21 Enea－意大利国家新技术能源及环境局 制备特征为双粒病毒组持续抗性的转基因植物的方法
CN105555794A (zh) * 2013-07-10 2016-05-04 哈佛学院院长及董事 涉及核酸-蛋白质复合物的组合物和方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050136404A1 (en) * 1997-07-02 2005-06-23 Doucette-Stamm Lynn A. Nucleic acid and amino acid sequences relating to streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
CN1378593A (zh) * 1999-08-20 2002-11-06 约翰斯霍普金斯大学医学院 构建融合文库的方法和组合物及该文库的用途
CN1434870A (zh) * 1999-12-23 2003-08-06 三菱制药株式会社 病毒核心蛋白－阳离子脂质－核酸－递送复合物
US20030036643A1 (en) * 2000-09-14 2003-02-20 Jin Cheng He Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
US20020172968A1 (en) * 2001-02-22 2002-11-21 Hongxiang Liu Biochips comprising nucleic acid/protein conjugates
EP1507860A4 (en) * 2001-04-02 2005-08-03 Univ Washington REFERENCE TOOLS FOR DYNAMIC ACTIONS
CN1791676A (zh) * 2003-05-19 2006-06-21 Enea－意大利国家新技术能源及环境局 制备特征为双粒病毒组持续抗性的转基因植物的方法
CN105555794A (zh) * 2013-07-10 2016-05-04 哈佛学院院长及董事 涉及核酸-蛋白质复合物的组合物和方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL: "UniProtKB - J7HK25 (J7HK25_TYCSV)", 《EMBL》 *
ISABELLE JUPIN等: "DNA replication specificity of TYLCV geminivirus is mediated by the amino-terminal 116 amino acids of the Rep protein", 《FEBS LETTERS》 *
J LAUFS等: "In vitro cleavage and joining at the viral origin of replication by the replication initiator protein of tomato yellow leaf curl virus", 《PNAS》 *
LAUFS,J.等: "RecName: Full=Replication-associated protein; Short=Rep; AltName: Full=Protein C1", 《GENBANK DATABASE》 *
NORIS,E.等: "Rep protein [Tomato yellow leaf curl Sardinia virus]", 《GENBANK DATABASE》 *
RAJRANI RUHEL等: "Multifunctional roles of geminivirus encoded replication initiator protein", 《VIRUSDISEASE》 *
冯登敏: "Rep蛋白介导的定点整合研究进展", 《国外医学遗传学分册》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111117978B (zh) * 2020-01-27 2022-07-15 黄种山 一种单链DNA肽连接酶sDPlaseI及其使用方法
CN111088234A (zh) * 2020-01-27 2020-05-01 福建晨欣科生物科技有限公司 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法
CN111088236A (zh) * 2020-01-27 2020-05-01 福建晨欣科生物科技有限公司 一种单链RNA肽连接酶sRPlaseI及其使用方法
CN111117978A (zh) * 2020-01-27 2020-05-08 福建晨欣科生物科技有限公司 一种单链DNA肽连接酶sDPlaseI及其使用方法
CN111088235B (zh) * 2020-01-27 2022-07-12 黄种山 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseI及其使用方法
CN111088234B (zh) * 2020-01-27 2022-07-15 黄种山 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseII及使用方法
CN111088235A (zh) * 2020-01-27 2020-05-01 福建晨欣科生物科技有限公司 一种双链DNA肽连接酶dDPlaseI及其使用方法
CN111088236B (zh) * 2020-01-27 2022-07-22 黄种山 一种单链RNA肽连接酶sRPlaseI及其使用方法
CN112778426A (zh) * 2021-01-06 2021-05-11 深圳伯生生物传感技术有限公司 一种精准抗体核酸定向连接方法
CN112778426B (zh) * 2021-01-06 2023-12-12 深圳伯生生物传感技术有限公司 一种精准抗体核酸定向连接方法
CN112851765A (zh) * 2021-02-09 2021-05-28 中国科学院武汉病毒研究所 蛋白或肽与核酸共价连接的方法
CN112851771A (zh) * 2021-02-09 2021-05-28 中国科学院武汉病毒研究所 连接核酸与蛋白或肽的方法
CN112851765B (zh) * 2021-02-09 2023-02-28 中国科学院武汉病毒研究所 蛋白或肽与核酸共价连接的方法

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