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CN110441457A - 一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法 - Google Patents

一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法 Download PDF

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CN110441457A
CN110441457A CN201910711898.6A CN201910711898A CN110441457A CN 110441457 A CN110441457 A CN 110441457A CN 201910711898 A CN201910711898 A CN 201910711898A CN 110441457 A CN110441457 A CN 110441457A
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CN
China
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urine
internal standard
concentration
homocysteine
isotopic internal
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Application number
CN201910711898.6A
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熊江辉
陈颖
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Shenzhen Greenhouse Interplanetary Space Science And Technology Research Institute
Original Assignee
Shenzhen Greenhouse Interplanetary Space Science And Technology Research Institute
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Abstract

本发明提出了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。更具体地说，本发明提出了以同位素内标为校准品，以尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度差异，结合UPLC‑MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。本发明提供的方法在检测尿液中同型半胱氨酸浓度的同时检测肌酐浓度，由此可以归一化同型半胱氨酸浓度，使得尿液中的同型半胱氨酸能够为评估、诊断或监测心脑血管疾病提供技术基础，并为心脑血管疾病的风险预估和个性化干预提供有效信息和依据。

Description

一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法
技术领域
本发明涉及分析化学和医学检测领域，具体地，本发明涉及一种基于高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的快速检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。
背景技术
心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液粘稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。研究表明，心脑血管疾病的致病机制可能在于血液的病变，其对人体的损害是隐秘的、逐渐的和全身性的，且早期很难发现明显的临床症状。寻找合理、有效的生物标志物来诊断、分级和指导心脑血管疾病的治疗一直是临床检验诊断学科重点关注的内容。目前已有一系列较为成熟、临床普遍开展的生物标志物检测，为心脑血管疾病的诊断与治疗提供了重要的参考依据。心脑血管疾病的常见指标例如有血清脂质、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)。
同型半胱氨酸Hcy是蛋白质代谢过程中的降解产物。在正常情况下，血液中的同型半胱氨酸在酶和维生素B6、叶酸的辅助下参与机体转硫基、转甲基过程，并被降解为半胱氨酸，转换为部分蛋白质。当人体的新陈代谢出现障碍时，同型半胱氨酸由于无法降解而在体内聚集。高浓度的同型半胱氨酸会对血管内壁造成损害，使血管内膜增厚、粗糙，形成斑块，进而使管腔狭窄甚至阻塞，动脉供血不全，导致动脉粥样硬化和冠心病的发生。大量研究表明，高的同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病的独立危险因素。
现有的临床心脑血管疾病血液标志物如同型半胱氨酸、胆固醇、脂质等的检测方法大多采用生化法、免疫法等，方法的特异性和准确度较低，无法满足较高的要求。同时因为要采血，对采样的要求较高，需要专业人员及特定场地才能进行采样。
针对上述情况，本发明提出了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸的方法，为心脑血管疾病的风险预估和个性化干预提供了便利且精准的线索。
发明内容
本发明提出了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。更具体地说，本发明提出了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法。
本发明检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法以同位素内标为校准品，用尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，使用UPLC-MS/MS来检测尿液中的同型半胱氨酸浓度。
在第一方面，本发明提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸的浓度。
在第二方面，本发明提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法，所述方法包括：
步骤1，配制样品：
1a.配制标品溶液，其包括多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；
1b.配制同位素内标溶液，其包括同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；
步骤2，样品预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样；其中，所述样品预处理包括：
2a.向尿液和标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；
2b.使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；
2c.对尿液进行去除蛋白；
步骤3，构建标准曲线，其中，将步骤2的含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；
步骤4，获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度，其中将步骤2的所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。
在第三方面，本发明提供了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸浓度的系统，包括：
样品配制模块，所述模块用于配制标品溶液和同位素内标溶液，所述标品溶液为多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；所述同位素内标溶液为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；
样品预处理模块，对样品进行预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样，其中，所述样品预处理包括：向标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；以及对尿液进行去除蛋白；
数据测定模块，其中，将所述含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；将所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS测定；
计算模块，用含同位素内标的标品溶液的UPLC-MS/MS结果构建标准曲线，结合含同位素内标的尿样的UPLC-MS/MS结果获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。
在第四方面，本发明提供一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度的试剂用于制备评估、诊断或监测心脑血管疾病的试剂盒的用途。
附图说明
图1是同型半胱氨酸标品、未加还原剂的标品溶液中同位素标品同型半胱氨酸二聚体-d8、以及加入还原剂的标品溶液中同位素标品同型半胱氨酸-d4的二级离子质谱图。
图2是肌酐标品及其同位素标品肌酐-d3的二级离子质谱图。
图3是由五个浓度的同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液检测得到的同型半胱氨酸的标准曲线图(上)，以及由四个浓度的肌酐同位素内标的标品溶液检测得到肌酐的标准曲线图(下)。
图4是含同位素内标的尿样中同型半胱氨酸(上)和肌酐(下)的MRM质谱图和二级离子质谱图。
具体实施方式
在本发明中，肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外，因此其浓度与肾功能相关，长期高血压或血性心功能不全会引起肾损伤，进而使肌酐水平升高。每20g肌肉代谢大约可产生1mg肌酐，在肉类食物摄入量稳定时，身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定。由此，本发明将肌酐用作尿液浓度均一化的重要指标，以排除尿液浓度本身对同型半胱氨酸浓度的差异影响。换句话说，人体尿液中的肌酐浓度被应用于人体尿液中同型半胱氨酸浓度的精准定量，使得能够评估、诊断或监测心脑血管疾病并对其进行及时干预和调节。
在第一方面，本发明提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸的浓度。
本发明提供的方法能够在检测尿液中同型半胱氨酸浓度的同时检测肌酐浓度，由此可以归一化同型半胱氨酸浓度。
在第二方面，本发明提供了一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的方法，所述方法包括：
步骤1，配制样品：
1a.配制标品溶液，其包括多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；
1b.配制同位素内标溶液，其包括同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；
步骤2，样品预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样；其中，所述样品预处理包括：
2a.向尿液和标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；
2b.使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；
2c.对尿液进行去除蛋白；
步骤3，构建标准曲线，其中，将步骤2的含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；
步骤4，获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度，其中将步骤2的所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。
在一个实施方案中，本发明的方法中的步骤1a和1b并无前后顺序的限定。
在一个实施方案中，所述尿液可以是新鲜的尿液。在这种情况下，可以对尿液直接进行检测。
在又一个实施方案中，所述尿液是经长期低温冻存的。在优选的实施方案中，在低温冻存前在尿液加入叠氮化钠，以防止尿液在低温运输或保存中滋生细菌或发生氧化从而改变同型半胱氨酸的浓度。
在一个优选实施方案中，加入叠氮化钠的量以能够抑制尿样中细菌滋生为准，例如为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。在又一个实施方案中，所述尿液可以来自干尿液样品。当需要时，所述干尿液样品经合适的溶剂溶解后应用于本发明的方法。所述合适的溶剂是本领域技术人员根据需要能够确定的，可以与后续步骤中稀释尿液所使用的溶剂相同或不同。
在一个实施方案中，步骤1a中配制的多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；步骤1a中配制的多个浓度的肌酐标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个。
在一个优选的实施方案中，同型半胱氨酸标品溶液和肌酐标品溶液的浓度可以是相同或不同的。
在另一个优选的实施方案中，同型半胱氨酸标品溶液和肌酐标品溶液的浓度可以是相同或不同的。
同型半胱氨酸标品和肌酐标品是能够商购得到的，例如，本发明所用的同型半胱氨酸标品和肌酐标品可购自Sigma-Aldrich公司，但并不限于此。所述同型半胱氨酸标品的浓度和肌酐标品的浓度需要分布在一个范围内，以便利用它们的测定结果作标准曲线。所述同型半胱氨酸标品的浓度的范围例如是0.5ng/ml至100ng/ml，所述肌酐标品的浓度的范围例如是40ng/ml至5000ng/ml。不希望被理论所束缚，发明人发现，即使所选择的同型半胱氨酸标品或肌酐标品的浓度范围很窄，例如同型半胱氨酸标品的浓度范围为2ng/ml至10ng/ml或肌酐标品的浓度范围200ng/ml至1000ng/ml，仍然可以通过标准曲线拟合得到拟合系数如0.99的线性回归方程。在这种情况下，即使待检测的尿样中同型半胱氨酸或肌酐浓度并未落入标品溶液的窄范围中，也仍然能够通过所拟合的线性回归方程得到精确的同型半胱氨酸或肌酐浓度。
在又一个实施方案中，标品溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。这些溶剂也是能够商购得到的，例如购自Fisher公司，但并不限于此。
在一个实施方案中，步骤1b中配制的同位素内标溶液分别为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液。同型半胱氨酸同位素内标溶液的浓度和肌酐同位素内标溶液的浓度可以是相同或不同的，条件是同型半胱氨酸同位素内标溶液的浓度落入所配制的同型半胱氨酸标品溶液的浓度范围，并且肌酐同位素内标溶液的浓度落入配制的肌酐标品溶液的浓度范围。
在又一个实施方案中，在步骤1b中配制的同型半胱氨酸的同位素内标可以选自同型半胱氨酸二聚体的氘代化合物，例如同型半胱氨酸二聚体的一氘代化合物、二氘代化合物、三氘代化合物、四氘代化合物、五氘代化合物、六氘代化合物、七氘代化合物、八氘代化合物或等，优选为八氘代化合物(同型半胱氨酸二聚体-d8)。肌酐的同位素内标可以选自肌酐的氘代化合物，例如肌酐的一氘代化合物、二氘代化合物、或三氘代化合物，优选为三氘代化合物(肌酐-d3)。
同型半胱氨酸二聚体的同位素内标和肌酐的同位素内标是能够商购得到的，例如，本发明所用的同型半胱氨酸二聚体的同位素内标商购自上海甄准有限公司，肌酐的同位素内标商购自Toronto Research Chemicals，但并不限于此。
在又一个实施方案中，步骤1b中的同位素内标溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。这些溶剂也是本领域技术人员能够商购得到的，例如购自Fisher公司，但并不限于此。
在一个优选实施方案中，标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是相同或不同的。
在一个实施方案中，样品预处理步骤是为了分别得到含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液、含肌酐同位素内标的标品溶液、含同型半胱氨酸同位素内标的尿样和含肌酐同位素内标的尿样。
在一个优选的实施方案中，所述样品预处理包括：首先对尿液进行去除蛋白，得到尿样；然后向标品溶液和尿样中分别加入相同量的相应的同位素内标溶液；接着向尿液和标品溶液中加入还原剂，使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；最终得到经还原的含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样。
在另一个优选的实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先向尿液和标品溶液中分别加入相同量的相应的同位素内标溶液；接着向尿液和标品溶液中加入还原剂，使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；然后对含同位素内标的尿液进行去除蛋白；最终得到经还原的含同位素内标的尿样和含同位素内标的标品溶液。
在具体的实施方案中，含同位素内标的标品溶液为含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液和含肌酐同位素内标的标品溶液。向不同浓度的同型半胱氨酸标品溶液中加入相同量的同型半胱氨酸同位素内标溶液，相应地，向不同浓度的肌酐标品溶液中加入相同量的肌酐同位素内标溶液。
含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液用于之后构建同型半胱氨酸的浓度标准曲线，含肌酐同位素内标的标品溶液用于之后构建肌酐的浓度标准曲线。任选地，含肌酐同位素内标的标品溶液不经过还原剂还原。
在具体的实施方案中，含同位素内标溶液的尿样为含同型半胱氨酸同位素内标的尿样和含肌酐同位素内标的尿样。向尿样中加入相同量的同型半胱氨酸同位素内标溶液得到含同型半胱氨酸同位素内标的尿样，相应地，向另一份相同的尿样中加入相同量的肌酐同位素内标溶液得到含肌酐同位素内标的尿样。
含同型半胱氨酸同位素内标的尿样用于之后测量尿样中的同型半胱氨酸浓度，含肌酐同位素内标的尿样用于之后测量尿样中的肌酐浓度。任选地，含肌酐同位素内标的尿样不经过还原剂还原。
在氧气存在的条件下，蛋白质中的半胱氨酸及其结构类似物的结构中包含末端巯基的分子在溶液中趋向于形成二聚体。尿液中约75％的同型半胱氨酸与白蛋白结合，作为结合态的同型半胱氨酸；另一部分则通过二硫键以的Hcy-Hcy、Hcy-半胱氨酸化合物形式存在；仅有1％至2％以还原态形式存在。因此，无法直接测定尿液中的总同型半胱氨酸含量。同型半胱氨酸和其二聚体在二级质谱上面也是有非常大的差别，如图1所示，同型半胱氨酸二聚体-d8的母离子是277.1，而同型半胱氨酸-d4母离子是140.0。
在本发明中使用的“还原剂”用于还原同型半胱氨酸的分子间或分子内二硫键的化合物。在具体的实施方案中，本发明的还原剂用于还原尿液中的同型半胱氨酸二聚体、同型半胱氨酸标品溶液中的同型半胱氨酸二聚体以及同型半胱氨酸二聚体-d8之间的二硫键。其中，同型半胱氨酸二聚体-d8经还原水解后得到同型半胱氨酸-d4。
在优选的实施方案中，本发明的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)，更具体地为二硫苏糖醇的0.1M氢氧化钠水溶液。所添加的还原剂的量足以使得尿液或标品溶液中的同型半胱氨酸保持游离态，具体来说，还原剂在尿液或标品溶液中的浓度可以为10mM至100mM。
当加入DTT时，通过DTT自身形成包含二硫键的六元环系来避免同型半胱氨酸形成二聚体。当缺乏还原剂时，溶液中的同型半胱氨酸大部分以结合态形式存在，游离态形式含量较低，因而响应相对很低，无法准确测定。当加入还原剂时，由于还原剂能够发挥抗氧化作用，有效地抑制了同型半胱氨酸结构中的巯基发生分子间或分子内偶联，使得能够测得尿液中的同型半胱氨酸，保证了检测方法的可行性和准确性。表1显示了经DTT还原水解的含同位素内标的同型半胱氨酸标品溶液和未加DTT的含同位素内标的同型半胱氨酸标品溶液中的同型半胱氨酸响应值有显著差异。
表1.加入DTT还原水解的样本和未加DTT样本的响应
尿液中含有的蛋白质等大分子化合物需要除去。去除蛋白包括使尿液或含同位素内标溶液的尿液先进行沉淀得到上清液，然后对所述上清液滤除而过滤上清液。
在具体实施方案中，去除蛋白采用了有机溶剂沉淀法，即在尿液中加入合适的有机溶剂来沉淀蛋白，然后通过离心加过滤的方式加以去除。这里使用的有机溶剂起着沉淀缓冲液的作用。优选地，该沉淀缓冲液是1ml/L甲酸的乙腈溶液。在此沉淀溶液中，乙腈可以用于沉淀尿液中的蛋白质等大分子化合物。当尿液中含有同位素内标时，甲酸可以调节同位素内标的溶解性。
在优选实施方案中，所述沉淀包括在低温下沉淀，例如在-15度至-30度、优选在-20度沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。在另一个优选实施方案中，所述沉淀包括在加入沉淀缓冲液之后，采用合适的装备如漩涡混合器vortex剧烈震荡混匀一段时间，如10秒至1分钟、优选20秒至45秒、更优选30秒，然后放置在-20度下沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。
在一个实施方案中，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液，以防止残渣堵塞后续使用的色谱柱。在一些实施方案中，通过离心机的离心作用，能够有效沉降尿液中的变性蛋白质，而使小分子待测物同型半胱氨酸和肌酐保留在上清液中。
在一个实施方案中，尿样或标品溶液与同位素内标溶液可以是适合后续UPLC-MS/MS分析的任意重量比，例如为100:1至1:1，优选为50:1至5:1，更优选为20:1、15:1、10:1或5:1。
在具体实施方案中，得到的含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样的浓度可以是适合后续UPLC-MS/MS分析并且能够构建浓度标准曲线的任意浓度，例如ng/mL级别或μg/mL级别。
在具体实施方案中，为了使含肌酐同位素内标的标品溶液和含肌酐同位素内标的尿样中的同位素内标的浓度相同，在进行UPLC-MS/MS检测之前，含肌酐同位素内标的标品溶液和含肌酐同位素内标的尿样可以经过另外的稀释。稀释所用的试剂可以是沉淀中使用的沉淀缓冲液，也可以是标品溶液或尿样各自使用的溶剂。进一步稀释的原因是尿液中肌酐浓度很高，可以达到0.3mg/ml至2mg/ml，所以需要稀释20至100倍，优选50倍或100倍，得到μg/ml级别的浓度，以得到更精准的质谱结果。
在一个实施方案中，尿液中的同型半胱氨酸直接沉淀取上清后经UPLC-MS/MS的离子响应度正好，因此无需另外的稀释。这也是本申请中尿液中的肌酐和同型半胱氨酸需要两份尿样分别检测的原因。
高效液相色谱-串联质谱联用被用来分析含同位素内标的标品溶液，其中，含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液中的同型半胱氨酸浓度与最终得到的质谱的离子响应度成正比，该质谱的离子响应度对应于同型半胱氨酸与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比。含肌酐同位素内标的标品溶液中的肌酐浓度与最终得到的质谱的离子响应度成正比，该质谱的离子响应度对应于肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比。在已知含同位素内标的标品溶液中同型半胱氨酸、肌酐、同型半胱氨酸的同位素内标和肌酐的同位素内标的浓度的情况下，不同浓度的含同位素内标标品溶液通过质谱得到的离子响应度能够用来构建浓度标准曲线(同型半胱氨酸浓度v.s.离子响应度；肌酐浓度v.s.离子响应度)。
在一个实施方案中，构建标准曲线的步骤包括构建同型半胱氨酸的浓度标准曲线和构建肌酐的浓度标准曲线。
在一个具体实施方案中，将经过样品预处理步骤的含同位素内标溶液的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定。含同位素内标的标品溶液的浓度是适合UPLC-MS/MS分析并且能够构建浓度标准曲线的任意浓度，例如ng/mL级别或μg/mL级别。
在另一个具体实施方案中，由不同浓度的含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液构建同型半胱氨酸的浓度标准曲线，通过拟合能够得到与同型半胱氨酸浓度相关的线性回归方程，其中浓度标准曲线的纵坐标是标品溶液中的被测组分——同型半胱氨酸与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比，横坐标是同型半胱氨酸的浓度，以ng/mL计。由不同浓度的含肌酐同位素内标的标品溶液构建肌酐的浓度标准曲线，通过拟合能够得到与肌酐浓度相关的线性回归方程，其中浓度标准曲线的纵坐标是标品溶液中的被测组分——肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比，横坐标是肌酐的浓度，以ng/mL计。
在一个实施方案中，在步骤4中，将样品预处理步骤中得到的所述含同型半胱氨酸同位素内标溶液的尿样和含肌酐同位素内标溶液的尿样分别进行UPLC-MS/MS分析，结合所构建的同型半胱氨酸的浓度标准曲线和肌酐的标准曲线分别获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。
使用高效液相色谱-串联质谱联用来分析含同位素内标的尿样，得到的离子响应度对应于同型半胱氨酸与其同位素内标的色谱峰的峰面积之比或肌酐与其同位素内标的色谱峰的峰面积之比。在获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度的步骤中，采用标准曲线法，分别将经UPLC-MS/MS检测得到的尿液中同型半胱氨酸的离子响应度和肌酐的离子响应度代入各自的标准曲线步骤中得到的线性回归方程，分别计算得出同型半胱氨酸和肌酐各自在尿液中的浓度，然后用同型半胱氨酸的浓度除以肌酐的浓度，计算出在统一肌酐浓度的情况下同型半胱氨酸的真实定量。
在第三方面，本发明提供了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸浓度的系统，包括：
样品配制模块，所述模块用于配制标品溶液和同位素内标溶液，所述标品溶液为多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；所述同位素内标溶液为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；
样品预处理模块，对样品进行预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样，其中，所述样品预处理包括：向标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；以及使尿液进行去除蛋白；
数据测定模块，其中，将所述含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；将所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS测定；
计算模块，用含同位素内标的标品溶液的UPLC-MS/MS结果构建标准曲线，结合含同位素内标的尿样的UPLC-MS/MS结果获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。
在一个具体的实施方案中，所述尿液是新鲜的尿液。
在又一个具体的实施方案中，所述尿液是经长期低温冻存的。优选地，在所述低温冻存的尿液中含有叠氮化钠，以防止尿液在低温运输或保存中滋生细菌或发生氧化从而改变同型半胱氨酸的浓度。优选地，加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。
在又一个具体的实施方案中，所述尿液来自干尿液样品。可选地，所述干尿液样品经溶剂溶解后。
在一个具体的实施方案中，样品配制模块中所配制的多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；优选地，多个浓度的肌酐标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；同型半胱氨酸标品溶液和肌酐标品溶液的浓度可以是相同或不同的。
在又一个具体的实施方案中，标品溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。
在一个具体的实施方案中，样品配制模块中所配制的同位素内标溶液为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液。
在一个具体的实施方案中，样品配制模块中所配制的同型半胱氨酸同位素内标溶液的浓度和肌酐同位素内标溶液的浓度可以是相同或不同的，条件是同型半胱氨酸同位素内标溶液的浓度落入所配制的标品溶液中同型半胱氨酸标品的浓度范围，并且肌酐同位素内标溶液的浓度落入配制的标品溶液中肌酐标品的浓度范围。
在一个实施方案中，样品配制模块中的同型半胱氨酸的同位素内标可以选自同型半胱氨酸二聚体的氘代化合物，例如同型半胱氨酸二聚体的一氘代化合物、二氘代化合物、三氘代化合物、四氘代化合物、五氘代化合物、六氘代化合物、七氘代化合物、八氘代化合物或等，优选为八氘代化合物(同型半胱氨酸二聚体-d8)。肌酐的同位素内标可以选自肌酐的氘代化合物，例如肌酐的一氘代化合物、二氘代化合物、或三氘代化合物，优选为三氘代化合物(肌酐-d3)。
在一个具体的实施方案中，所述同位素内标溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。
在一个优选的实施方案中，样品配制模块中的标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是相同的。在又一个实施方案中，标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是不同的。
在一个实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先对尿液进行去除蛋白的步骤；然后向标品溶液和尿液中分别加入相同量的相应的同位素内标溶液；接着向尿液和标品溶液中加入还原剂，使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；得到经还原的含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样。
在又一个实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先向尿液和标品溶液中分别加入相同量的相应的同位素内标溶液；接着向尿液和标品溶液中加入还原剂，使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；然后对含同位素内标的尿液进行去除蛋白的步骤；得到经还原的含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样。
在一个具体的实施方案中，含同位素内标的标品溶液为含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液和含肌酐同位素内标的标品溶液。向不同浓度的同型半胱氨酸标品溶液中加入相同量的同型半胱氨酸同位素内标溶液，相应地，向不同浓度的肌酐标品溶液中加入相同量的肌酐同位素内标溶液。含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液用于之后构建同型半胱氨酸的浓度标准曲线，含肌酐同位素内标的标品溶液用于之后构建肌酐的浓度标准曲线。任选地，含肌酐同位素内标的标品溶液不经过还原剂还原。
在另一个具体的实施方案中，含同位素内标溶液的尿样为含同型半胱氨酸同位素内标的尿样和含肌酐同位素内标的尿样。向尿样中加入相同量的同型半胱氨酸同位素内标溶液得到含同型半胱氨酸同位素内标的尿样，相应地，向另一份相同的尿样中加入相同量的肌酐同位素内标溶液得到含肌酐同位素内标的尿样。含同型半胱氨酸同位素内标的尿样用于之后测量尿样中的同型半胱氨酸浓度，含肌酐同位素内标的尿样用于之后测量尿样中的肌酐浓度。任选地，含肌酐同位素内标的尿样不经过还原剂还原。
在具体的实施方案中，所述还原剂为用于还原同型半胱氨酸的分子间或分子内二硫键的化合物，优选为二硫苏糖醇(DTT)，更具体地为二硫苏糖醇的0.1M氢氧化钠水溶液。所添加的还原剂的量足以使得尿液或标品溶液中的同型半胱氨酸保持游离态，具体来说，还原剂在尿液或标品溶液中的浓度可以为10mM至100mM。
在一个实施方案中，去除蛋白采用了有机溶剂沉淀法，即在尿液中加入合适的有机溶剂来沉淀蛋白，然后通过离心加过滤的方式加以去除。优选地，该沉淀缓冲液是1ml/L甲酸的乙腈溶液。
在一个优选实施方案中，所述沉淀包括在低温下沉淀，例如在-15度至-30度、优选在-20度沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。在另一个优选实施方案，所述沉淀包括在加入沉淀缓冲液之后，采用合适的装备如漩涡混合器vortex剧烈震荡混匀一段时间，如10秒至1分钟、优选20秒至45秒、更优选30秒，然后放置在-20度下沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。
在一个实施方案中，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液。
在一个实施方案中，在样品预处理模块中，尿样或标品溶液与同位素内标溶液可以是适合后续UPLC-MS/MS分析的任意重量比，例如为100:1至1:1，优选为50:1至5:1，更优选为20:1、15:1、10:1或5:1。
在一个实施方案中，为了使含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样中的同位素内标的浓度相同，在进行UPLC-MS/MS检测之前，含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样经过另外的稀释。稀释所用的试剂是样品预处理模块中使用的沉淀缓冲液，或者是标品溶液或尿样各自使用的溶剂。
在一个实施方案中，含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液和含同型半胱氨酸同位素内标的尿样在进行UPLC-MS/MS检测之前不经过另外的稀释。
在一个实施方案中，含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样的浓度可以是适合后续UPLC-MS/MS分析并且能够构建浓度标准曲线的任意浓度，例如ng/mL级别或μg/mL级别。
在一个实施方案中，在数据测定模块中，含同位素内标的标品溶液为含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液和含肌酐同位素内标的标品溶液。含同位素内标的尿样为含同型半胱氨酸同位素内标的尿样和含肌酐同位素内标的尿样。
在具体实施方式中，分别对不同浓度的含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液、不同浓度的含肌酐同位素内标的标品溶液、含同型半胱氨酸同位素内标的尿样和含肌酐同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS测定。
在一个实施方案中，在计算模块中，构建标准曲线包括构建同型半胱氨酸的浓度标准曲线和构建肌酐的浓度标准曲线。
在一个具体实施方案中，在计算模块中，首先由不同浓度的含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液构建同型半胱氨酸的浓度标准曲线，通过拟合能够得到与同型半胱氨酸浓度相关的线性回归方程，其中浓度标准曲线的纵坐标是标品溶液中的被测组分——同型半胱氨酸与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比，横坐标是同型半胱氨酸的浓度，以ng/mL计。由不同浓度的含肌酐同位素内标的标品溶液构建肌酐的浓度标准曲线，通过拟合能够得到与肌酐浓度相关的线性回归方程，其中浓度标准曲线的纵坐标是标品溶液中的被测组分——肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比，即响应比；横坐标是肌酐的浓度，以ng/mL计。然后采用标准曲线法，分别将经UPLC-MS/MS检测得到的尿样中同型半胱氨酸的离子响应度和肌酐的离子响应度代入所构建的线性回归方程，分别计算得出尿样中同型半胱氨酸和肌酐的浓度，然后用同型半胱氨酸的浓度除以肌酐的浓度，计算出在统一肌酐浓度的情况下同型半胱氨酸的真实定量。
在本发明中，所述系统包括用于实现本发明方法的设备和/或试剂，还可以称为装置。
在第四方面，本发明提供一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度的试剂用于制备评估、诊断或监测心脑血管疾病的试剂盒的用途。
在一个实施方案中，所述试剂包括同型半胱氨酸标品、肌酐标品、同型半胱氨酸的同位素内标和肌酐的同位素内标。
在又一个实施方案中，所述试剂包括含有同型半胱氨酸标品和肌酐标品的标品溶液、含有同型半胱氨酸的同位素内标和肌酐的同位素内标的同位素内标溶液。
在一个优选的实施方案中，所述试剂还可以包括用于沉淀蛋白的沉淀缓冲液。
在另一个优选的实施方案中，所述试剂还可以包括用于稀释尿液的溶剂。
在另一个优选的实施方案中，所述试剂还可以包括用于还原同型半胱氨酸的分子间或分子内二硫键的还原剂，如DTT。
在具体实施方案中，所述心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液粘稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病，例如高血压、高血脂、冠心病、脑卒中，包括脑出血、脑血栓形成、脑栓塞、蛛网膜下腔出血等疾病，但不限于此。
如本文所用，术语“同型半胱氨酸”是指2-氨基-4-巯基丁酸。天然存在的同型半胱氨酸的2位碳原子通常为S构型，结构如下所示。
如本文所用，术语“同型半胱氨酸二聚体-d8”是指八氘代同型半胱氨酸二聚体，其结构如下所示。
如本文所用，术语“同型半胱氨酸-d4”是指八氘代的同型半胱氨酸二聚体经还原剂还原之后的四氘代的同型半胱氨酸，其结构如下所示。
如本文所用，术语“肌酐”是指2-亚氨基-1-甲基咪唑啉-4-酮，其结构如下所示。
如本文所用，术语“肌酐-d3”是指2-亚氨基-1-三氘代甲基咪唑啉-4-酮，其结构如下所示。
不希望被理论所束缚，本发明的方法步骤中列出的顺序并非将本发明的方法限定于只能采用以上顺序。本领域技术人员可以在理解了本发明的构思和精神之后，对本发明进行修改，在不影响本发明的整体构思的前提下，修改后的技术方案也同样在本发明权利要求的保护范围内。
以下将结合具体实施例来进一步说明本发明中的技术方案。除非特殊说明，下列实施例中所使用的仪器、试剂及材料均可通过常规商业手段获得。
1、材料和仪器
材料：肌酐标品，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigama公司；DL-同型半胱氨酸标品，白色粉末，纯度≥99％，购自sigma公司；同型半胱氨酸二聚体-d8，白色粉末，纯度≥98％，购自上海甄准有限公司；肌酐-d3，白色粉末，纯度≥98％，购自Toronto ResearchChemicals；超纯水，自制；甲酸，色谱纯，购自Fisher公司；乙酸，色谱纯，购自Fisher公司；甲醇，色谱纯，购自Fisher公司；乙腈，色谱纯，购自Merke公司；DTT，纯度≥99％，购自Sigma-Aldrich公司。。
仪器：1290Infinity II型超高效液相色谱仪(UPLC)，购自Agilent公司；6470三重四级杆质谱仪，购自Agilent公司；MS105DU型分析天平，购自Mettler-Toledo公司；明澈D24UV型纯水仪，购自Merck Millipore公司；台式离心机，购自Eppendrof公司。
2、检测条件
液相色谱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱的规格：100mm×2.1mm，粒径：1.7μm；柱温：40℃；进样量：5μL至10μL；流动相：流动相A：0.2％(体积/体积)甲酸水溶液/流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min至0.5mL/min；流动相B的比例如下述表1所示(百分数均以体积百分比计算)。
本发明的方法中的液相色谱分离采用二元梯度洗脱方式，具体使用如表2所示的洗脱程序的二元梯度洗脱方式。
表2.液相色谱的洗脱参数
洗脱时间(min) 流动相B比例(％)
0 3
5 25
8 90
8.1 3
13 3
质谱：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：200度至600度；离子源电压：4000V至5000V；喷嘴电压：500V至1000V；氮气流速：3L/min至5L/min；鞘气温度：200度至300度；鞘气流速：5L/min至15L/min；Nebulizer压力：45psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式。
本发明的术语“多重反应监测”(multiple reaction monitoring，MRM)是指一种基于已知信息或假定信息来设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，同时去除大量不符合规则的离子信号的干扰，从而得到所需质谱信息的数据监测及获取方式。多重反应监测涉及小分子生物标志物和内标以及各自对应的监测离子对、去簇电压和碰撞能量。
质谱检测方法中的离子源为电喷雾离子源。该类型离子源可以支持正离子及负离子两种检测模式。由于本发明的同型半胱氨酸和肌酐容易结合质子，因此上述方法中的检测方式采用正离子检测。
本发明对同型半胱氨酸和肌酐以及相应的标品进行质谱检测的参数见下表3，其包括分子量(MW)，保留时间(RT)，前体离子(Q1)和用于定性和定量的产物离子(Q3)，裂解电压(CE)。
表3.同型半胱氨酸、同型半胱氨酸-d4、肌酐、肌酐-d3的质谱参数
3、实施例
3.1样品预处理
同位素内标溶液的配制：分别配制浓度为5ng/mL的同型半胱氨酸二聚体-d8的同位素内标溶液和浓度为100μg/mL的肌酐-d3的同位素内标溶液，以备用，溶剂为50％甲醇和10％甲醇的混合物。考虑到同型半胱氨酸二聚体-d8还原水解后浓度会变为原始的2倍，所以最终使用的同位素同型半胱氨酸-d4的浓度为10ng/mL。
处理尿样：取六个不同的尿液样品，一式两份各100μL。一份用于测量同型半胱氨酸的浓度，往其中加入以上配制的10μL的同型半胱氨酸同位素内标溶液，充分混匀，然后加入足量的DTT(在0.1M的氢氧化钠溶液中500mM)还原水解同型半胱氨酸；一份用于测量肌酐浓度，加入以上配制的10μL的肌酐同位素内标溶液，充分混匀。然后每份中分别加入390μL沉淀缓冲液(1ml/L甲酸的乙腈溶液)，混匀，-20度沉淀30分钟；在12000g下高速离心10分钟，取上清500μL，经0.22μm滤膜滤过滤；得到六个含同型半胱氨酸同位素内标的待测尿样和六个含肌酐同位素内标的待测尿样。
含同位素内标的标品溶液的配制：分别精密称取相同量的待测的同型半胱氨酸标品和肌酐标品10mg，分别用50％甲醇和10％甲醇溶解后配制成浓度为1mg/mL的同型半胱氨酸标品储备液和肌酐标品储备液。用50％甲醇将1mg/mL的肌酐标品浓度稀释为一系列标准曲线浓度：4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL。分别吸取以上浓度的肌酐标品溶液各100μL，加入10μL的肌酐同位素溶液，混匀待用。用0.2％甲酸溶液将1mg/mL的同型半胱氨酸标品浓度稀释为一系列标准曲线的5个浓度点SD1′至SD5′，其浓度分别为2.5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL。分别吸取以上浓度的同型半胱氨酸标品溶液各100μL，加入10μL的同型半胱氨酸同位素溶液，分别得到5个浓度的混匀待用110μL的含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液。
3.2构建标准曲线
取3.1节得到的肌酐同位素内标的标品溶液的4个浓度点SD1至SD4各50μL，浓度分别为4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL，分别加入950μL50％甲醇稀释，取100μL等待UPLC-MS/MS进样分析，这里相当于一共稀释100倍。也就是说，含肌酐同位素内标的标品溶液的最终检测浓度分别为0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL，如表3所示。使4种浓度的含肌酐同位素内标的标品溶液经过液相色谱分离。
取3.1节得到的110μL的含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液的5个浓度点SD1′至SD5′，加入足量的DTT(在0.1M的氢氧化钠溶液中500mM)还原水解同型半胱氨酸二聚体；然后加入沉淀缓冲液(如尿样处理中所使用的)，将含同型半胱氨酸同位素内标的标品溶液的浓度稀释为0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL，如下表4所示。使5种浓度的经还原的含同型半胱氨酸内标的标品溶液经过液相色谱分离。
表4.标品溶液的检测浓度
液相色谱的条件为：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱的规格：100mm×2.1mm，粒径：1.7μm；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相：流动相A：0.2％(体积/体积)甲酸水溶液/流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；流动相B的组成比例如上述表2所示。
经过色谱法分离过程之后，被分离的标品同型半胱氨酸及其同位素内标和标品肌酐及其同位素内标分别进入质谱检测步骤。质谱检测的条件为：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：300度；离子源电压：4000V；喷嘴电压：1000V；氮气流速：5L/min；鞘气温度：250度；鞘气流速：10L/min；Nebulizer压力：45psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式。得到的二级质谱数据如图1和图2所示。
由UPLC-MS/MS得到的标品溶液中同型半胱氨酸的质谱响应度、肌酐的质谱响应度、同型半胱氨酸的浓度和肌酐浓度，如下表5所示。可以看出，标品溶液中的肌酐的预期浓度与最终浓度相符很好，准确度为97.1至100.7。而对于标品溶液中的同型半胱氨酸，发现当标品溶液中同型半胱氨酸浓度过低时，例如预期浓度为0.5ng/mL时，预期浓度与最终浓度偏差较大。但随着标品溶液中皮质醇浓度越来越高，预期浓度与最终浓度之间的准确度也越来越高。
表5.标品溶液中同型半胱氨酸和肌酐的浓度(以ng/mL计)结果。
根据UPLC-MS/MS得到的同型半胱氨酸和肌酐标品溶液的质谱响应度，以被测同型半胱氨酸的浓度为横坐标，以标品溶液中同型半胱氨酸与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比为纵坐标，绘制同型半胱氨酸的标准曲线，并拟合得到线性回归方程。类似地，以被测肌酐的浓度为横坐标，以标品溶液中肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比为纵坐标，绘制肌酐的标准曲线，并拟合得到线性回归方程。同型半胱氨酸的标准曲线和肌酐的标准曲线分别如图3所示。所得到的线性回归方程的具体参数如表6所列。
表6.本方法的实施例中同型半胱氨酸和肌酐线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限
y：被测组分与内标定量色谱峰峰面积之比；
x：被测组分同型半胱氨酸和肌酐的浓度，ng/mL。
3.3尿样的检测
取3.1节得到的6×2个尿样各5μL，通过UPLC-MS/MS联用方法进行测定，并分析各自的检测结果。液相色谱与质谱的条件与含同位素内标的标品溶液的条件相同。图3是尿样中同型半胱氨酸和肌酐的MRM质谱图和二级离子质谱图。
采用标准曲线法，根据3.2节构建的浓度标准曲线，将同型半胱氨酸与其同位素内标的色谱峰面积的比值代入相应的线性回归方程，计算得出同型半胱氨酸在尿液中的浓度。类似地得到肌酐在尿液中的浓度。然后，用同型半胱氨酸的浓度除以肌酐的浓度，计算出在统一肌酐浓度的情况下同型半胱氨酸的真实定量。表7示出了六个尿样中经肌酐归一化的同型半胱氨酸的浓度结果。
表7.尿样中经肌酐归一化的同型半胱氨酸的浓度结果。
上述UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中同型半胱氨酸和肌酐的方法，以3倍基线噪声所对应的浓度为检出限时，检出限为0.1ng/mL至1.0ng/mL；以10倍基线噪声所对应的浓度为定量限时，其定量限为0.3ng/mL至3.0ng/mL。
因此，本发明具有如下优点或者有益效果：
1)本发明所采用的尿液沉淀法，操作简单，价格低廉，较现有的液液萃取或者固液萃取技术快速。
2)本发明检测尿液样本中同型半胱氨酸的方法能够同时检测尿液中的肌酐浓度，由此能够更好的排除尿液浓度差异和不同时间取样造成的同型半胱氨酸浓度变化。
3)本发明所采用的方法检出限和定量限均在ng/mL级别，具有灵敏度高、特异性好、精密度高、准确性高等特点。
因此，本发明的检测方法快速、准确、灵敏度高、专属性好、操作简单方便，为精准测定尿液样本中的同型半胱氨酸浓度提供了一种新方法。该方法不仅适合于测定尿液样本，而且适合于测定干尿片样品，适用范围得到进一步扩展。利用本发明的检测方法不仅可以有效地了解尿液中同型半胱氨酸的实时浓度水平，进而使得能够评估、诊断或监测心脑血管疾病并对其进行及时干预和调节。

Claims (9)

1.一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中同型半胱氨酸的浓度。
2.一种检测尿液中同型半胱氨酸的方法，所述方法包括：
步骤1，配制样品：
1a.配制标品溶液，所述标品溶液为多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；优选地，多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；优选地，多个浓度的肌酐标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；
1b.配制同位素内标溶液，其为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；优选地，所述同型半胱氨酸同位素内标为同型半胱氨酸二聚体的氘代化合物，优选同型半胱氨酸二聚体的八氘代化合物；优选地，所述肌酐同位素内标为肌酐的氘代化合物，优选肌酐的三氘代化合物；优选地，所述同位素内标溶液的溶剂为甲醇、甲酸或其混合物的水溶液；
步骤2，样品预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样，其中，所述样品预处理包括：
2a.向尿液和标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；
2b.使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；所述还原剂例如为用于还原同型半胱氨酸的分子间或分子内二硫键的化合物，优选为二硫苏糖醇；
2c.对尿液进行去除蛋白；优选地，所述去除蛋白包括对所述尿液先进行沉淀得到上清液，然后对所述上清液进行滤除；优选地，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液；
步骤3，构建标准曲线，其中将步骤2的含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；
步骤4，获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度，其中，将步骤2的所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述尿液选自新鲜尿液、经长期低温冻存的尿液、或干尿液；所述新鲜尿液直接进行检测；经长期低温冻存的尿液地优选在低温冻存前在尿液加入叠氮化钠，优选加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤2中，所述沉淀包括在尿液中加入沉淀缓冲液，优选为1ml/L甲酸的乙腈溶液；或者，所述沉淀包括在低温如-15度至-30度，优选在-20度，沉淀约20分钟至数小时，优选为20分钟至1小时，更优选为30分钟。
5.一种检测尿液中同型半胱氨酸浓度的系统，所述系统包括：
样品配制模块，所述模块用于配制标品溶液和同位素内标溶液，所述标品溶液为多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液和多个浓度的肌酐标品溶液；优选地，多个浓度的同型半胱氨酸标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；优选地，多个浓度的肌酐标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；所述同位素内标溶液为同型半胱氨酸同位素内标溶液和肌酐同位素内标溶液；优选地，所述同型半胱氨酸同位素内标为同型半胱氨酸二聚体的氘代化合物，优选同型半胱氨酸二聚体的八氘代化合物；优选地，所述肌酐同位素内标为肌酐的氘代化合物，优选肌酐的三氘代化合物；优选地，所述同位素内标溶液的溶剂为甲醇、甲酸或其混合物的水溶液；
样品预处理模块，对样品进行预处理，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样，其中，所述样品预处理包括：向尿液和标品溶液中加入的相应的同位素内标溶液；使尿液和标品溶液经还原剂进行还原；以及对尿液进行去除蛋白；所述还原剂例如为用于还原同型半胱氨酸的分子间或分子内二硫键的化合物，优选为二硫苏糖醇；优选地，所述去除蛋白包括对所述尿液先进行沉淀得到上清液，然后对所述上清液进行滤除；优选地，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液；
数据测定模块，将所述含同位素内标的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；将所述含同位素内标的尿样进行UPLC-MS/MS测定；
计算模块，用含同位素内标的标品溶液的UPLC-MS/MS结果构建标准曲线，结合含同位素内标的尿样的UPLC-MS/MS结果获得同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的同型半胱氨酸浓度。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，所述尿液选自新鲜尿液、经长期低温冻存的尿液、或干尿液；经长期低温冻存的尿液地优选在低温冻存前在尿液加入叠氮化钠，优选加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。
7.根据权利要求5所述的系统，其中，在所述样品预处理模块中，所述沉淀包括在尿液中加入沉淀缓冲液，优选为1ml/L甲酸的乙腈溶液；或者，所述沉淀包括在低温如-15度至-30度，优选在-20度，沉淀20分钟至数小时，优选为20分钟至1小时，更优选为30分钟。
8.根据权利要求5所述的系统，其中，在所述样品预处理模块中得到的含同位素内标的标品溶液在进行UPLC-MS/MS测定之前还进行稀释；或者，在所述样品预处理模块中得到的含同位素内标的尿样在进行UPLC-MS/MS测定之前还进行稀释。
9.一种检测同型半胱氨酸浓度和肌酐浓度的试剂用于制备评估、诊断或监测心脑血管疾病的试剂盒的用途，优选地，所述试剂包括同型半胱氨酸标品及其同位素内标和肌酐标品及其同位素内标。
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