CN110438192A - 一种无糖小分子肽粉的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无糖小分子肽粉的制备方法及其应用，以贻贝肉为原料，依次经过步骤：提取水提粗蛋白、透析除盐、中性蛋白酶酶解、醇沉除糖和冻干，得无糖小分子贻贝肽。本发明以贻贝蛋白为原料，取材容易，可显著降低生产成本，满足大规模生产的需要；使用生物酶解的方法，得到具有成骨活性的混合贻贝肽，又用了除糖和超滤分离，得到无糖小分子贻贝肽，使产品更易于吸收；采取冷冻干燥技术对促成骨活性肽进行冻干，增加了产品的保存时间；制备的小分子贻贝肽是具有成骨活性的生物活性肽，可以成为制备功能食品的良好原料，尤其是对于无糖配料应用需求的各类食品，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及水产品加工技术领域，更具体地说，涉及一种无糖小分子肽粉的制备方法及其应用。
背景技术
目前，传统骨质疏松症治疗药物主要包括骨吸收抑制剂和骨形成促进剂。骨吸收抑制剂主要是通过抑制破骨细胞的形成和活性，从而抑制骨的吸收来减缓骨钙的丢失，但由于骨质疏松症患者通常都会钙吸收不足，若单独应用此类药物则可能造成低钙血症。而骨形成促进剂目前研究较少，主要包括甲状旁腺激素、细胞因子、氟化物和锶制剂等，但其来源有限，靶向性差也限制了其应用。随着现代患者在饮食与健康方面的意识提高，食源性生物活性肽因其具有安全、无毒副作用、价格竞争力强和易于吸收等优点在预防和治疗治骨质疏松领域受到了越来越广泛的关注。
贻贝(Mytilus edulis)是一种营养丰富的水产品。其每百克鲜贝肉含蛋白质10.8克，糖2.4克，灰分2.4克，脂肪1.4克，其蛋白质含量很高。贻贝蛋白的营养价值高且具有良好的抗氧化活性，抗炎活性及抗肿瘤活性。值得一提的是，贻贝的营养价值高还由于它所含的蛋白质有人体需要的缬氨酸、亮氨酸等8种必需氨基酸。越来越多的证据表明，蛋白质含量高的水产品通过消化酶解转化为小生物活性肽更加易于人体吸收，进而食用高蛋白质的水产品对人体有很大的益处。
目前对于骨质疏松的研究，医学上尚没有能够彻底治愈的方法，且因骨质疏松发病早期基本没有什么不良反应，因而，不易被发现，不能及时的进行治疗，但是一旦发病，将会很难治愈，外科手术以及目前常见的的预防和治疗骨质疏松的药物，长期服用这类药物会引起便秘等一系列不适反应症状，不仅医疗成本高，而且会有一定的毒副作用，并且很难达到彻底治愈的目的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种无糖小分子贻贝肽的制备方法并开发了具有成骨活性的贻贝多肽产品。
为了达到上述目的，本发明提供一种无糖小分子肽粉的制备方法，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取贻贝肉6000～12000rpm、匀浆3～10min，所得贻贝浆加水，1～25℃静置2～8h提取蛋白，然后离心取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:3～5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白离心，收集上清液B，将所述上清液B用500～3500D的透析袋和水进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30～100加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度30～60℃下搅拌酶解2～6小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶3000～6000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管进行超滤离心，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液3～10倍体积的无水乙醇，静置18～24h，离心取上清液C；将所述上清液C置于60～75℃旋转蒸发至原体积的1/5～1/10，除去乙醇，得溶液B；干燥，得无糖小分子肽粉；所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
优选方式下，步骤S1所述离心具体为：6000～12000g、5～30min。
优选方式下，步骤S2所述离心具体为：6000～12000g、5～30min。
优选方式下，步骤S2所述透析具体为：将所述上清液B置于500～3500D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100～150倍，每6～12h更换一次双蒸水，共透析24～36h。
优选方式下，步骤S3所述搅拌的转速为50～75rpm。
优选方式下，步骤S4所述旋转蒸发的转速为60～80rpm；所述超滤离心的参数为4000～8000rpm、10～30min；所述离心参数为：8000～12000g、10～30min。
优选方式下，步骤S2所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度在15Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
优选方式下，步骤S4所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度在15Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃；
优选方式下，步骤S4所述喷雾干燥为常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
优选方式下，步骤S4所述喷雾干燥为低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
优选方式下，所述无糖小分子肽粉的制备方法，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，所得贻贝浆加水，4℃静置6h提取蛋白，然后10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B用1000D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：将所述上清液B置于1000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析36h。
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶5000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液5倍体积的无水乙醇，静置24h，10000g离心30min取上清液C；将所述上清液C置于75℃、65rpm旋转蒸发至原体积的1/10，除去乙醇，得溶液B；冷冻干燥或喷雾干燥，得无糖小分子肽粉；
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥为常压喷雾干燥或低温喷雾干燥，
常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
本发明的有益效果：
(1)贻贝是一种来源广泛的，常见的水产品，以贻贝蛋白为原料取材容易，安全无副作用，可显著降低生产成本，满足大规模生产的需要。
(2)使用生物酶解的方法，得到具有成骨活性的混合贻贝肽，又用了除糖和超滤分离，得到无糖小分子贻贝肽，使产品更易于吸收。
(3)得到的无糖小分子贻贝肽具有一定的成骨活性，其可以成为制备功能食品的良好原料或来源之一。
附图说明
图1是本发明对比例1制备的贻贝混合肽、大分子贻贝混合肽、小分子贻贝肽的成骨活性；上标字母表示使用ANOVA确定的每组之间的显着差异；上标字母两个字母相同，两个字母之间没有显着差异，不同字母的组两者之间存在显着差异(p<0.05)。
图2是本发明对比例2制备的贻贝混合肽、大分子贻贝混合肽、小分子贻贝混合肽无糖小分子混合贻贝肽的成骨活性；上标字母表示使用ANOVA确定的每组之间的显着差异；上标字母两个字母相同，两个字母之间没有显着差异，不同字母的组两者之间存在显着差异(p<0.05)。
图3是本发明对比例3制备的贻贝混合肽、大分子贻贝混合肽、小分子贻贝混合肽、无糖小分子混合贻贝肽的成骨活性；上标字母表示使用ANOVA确定的每组之间的显着差异；上标字母两个字母相同，两个字母之间没有显着差异，不同字母的组两者之间存在显着差异(p<0.05)。
图4是本发明实施例1制备的无糖小分子肽粉，及对比例3中无糖贻贝混合肽、无糖大分子贻贝肽的成骨活性；上标字母表示使用ANOVA确定的每组之间的显着差异；上标字母两个字母相同，两个字母之间没有显着差异，不同字母的组两者之间存在显着差异(p<0.05)。
图5本发明是实施例2制备的无糖小分子肽粉，及对比例3中无糖贻贝混合肽、无糖大分子贻贝肽的成骨活性；上标字母表示使用ANOVA确定的每组之间的显着差异；上标字母两个字母相同，两个字母之间没有显着差异，不同字母的组两者之间存在显着差异(p<0.05)。
图6是本发明实施例3制备的无糖小分子肽粉，及对比例3中无糖贻贝混合肽、无糖大分子贻贝肽的成骨活性。上标字母表示使用ANOVA确定的每组之间的显着差异；上标字母两个字母相同，两个字母之间没有显着差异，不同字母的组两者之间存在显着差异(p<0.05)。
具体实施方式
以下是对发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明提供一种无糖小分子贻贝肽的制备方法，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取贻贝肉6000～12000rpm、匀浆3～10min，所得贻贝浆加水，1～25℃静置2～8h提取蛋白，然后离心取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:3～5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白离心，收集上清液B，将所述上清液B用500～3500D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度在15～25Pa，；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30～100加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度30～60℃下50～75rpm搅拌酶解2～6小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶3000～6000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管进行超滤离心，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液3～10倍体积的无水乙醇，静置18～24h，离心取上清液C；将所述上清液C置于60～75℃旋转蒸发至原体积的1/5～1/10，除去乙醇，得溶液B；冷冻干燥或喷雾干燥，得无糖小分子肽；
所述
①冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃冷冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度在15Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
②采用喷雾干燥的方法
常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
实施例1
一种无糖小分子肽粉的制备方法，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，所得贻贝浆加水，4℃静置6h提取蛋白，然后10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B用3000D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：将所述上清液B置于3000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析24h。
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:50加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶4000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液3倍体积的无水乙醇，静置18h，10000g离心30min取上清液C；将所述上清液C置于75℃、60rpm旋转蒸发至原体积的1/5，除去乙醇，得溶液B；冷冻干燥或喷雾干燥，得无糖小分子肽粉；
冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥为常压喷雾干燥或低温喷雾干燥，
所述常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
所述低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
实施例2
一种无糖小分子肽粉的制备方法，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，所得贻贝浆加水，4℃静置6h提取蛋白，然后10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B用1000D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：将所述上清液B置于1000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析24h。
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶5000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液3倍体积的无水乙醇，静置18h，10000g离心30min取上清液C；将所述上清液C置于65℃、75rpm旋转蒸发至原体积的1/10，除去乙醇，得溶液B；冷冻干燥或喷雾干燥，得无糖小分子肽粉；
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥为常压喷雾干燥或低温喷雾干燥，
常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
实施例3
一种无糖小分子肽粉的制备方法，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，所得贻贝浆加水，4℃静置6h提取蛋白，然后10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B用1000D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：将所述上清液B置于1000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析36h。
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶5000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液5倍体积的无水乙醇，静置24h，10000g离心30min取上清液C；将所述上清液C置于75℃、65rpm旋转蒸发至原体积的1/10，除去乙醇，得溶液B；冷冻干燥，得无糖小分子肽粉；
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥的方法为常压喷雾干燥或低温喷雾干燥，
常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
对比例1
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，所得贻贝浆加水，4℃静置6h提取蛋白，然后10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B用3000D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：将所述上清液B置于3000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析24h。
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:50加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶4000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过3KDa的超滤离心管的穿透液和未穿透液，即大分子贻贝混合肽和小分子贻贝混合肽，将贻贝混合肽和大分子贻贝混合肽的溶液，加入所述穿透液3倍体积的无水乙醇，静置18h，10000g离心30min取上清液；将所述上清液置于75℃、60rpm旋转蒸发至原体积的1/5，除去乙醇，得无糖贻贝混合肽，无糖大分子贻贝肽溶液；将上述贻贝混合肽，大分子贻贝混合肽，小分子贻贝混合肽，无糖贻贝混合肽，无糖大分子肽冷冻干燥或喷雾干燥，得贻贝混合肽粉，大分子贻贝混合粉，小分子贻贝混合肽粉，无糖贻贝混合肽粉，无糖大分子肽粉；
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥的方法为常压喷雾干燥为低温喷雾干燥
常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
对比例2
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，所得贻贝浆加水，4℃静置6h提取蛋白，然后10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B用1000D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：将所述上清液B置于1000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析24h。
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa，；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃；
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶5000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过3KDa的超滤离心管的穿透液和未穿透液，即大分子贻贝混合肽和小分子贻贝混合肽，将贻贝混合肽和大分子贻贝混合肽的溶液，加入所述穿透液3倍体积的无水乙醇，静置18h，10000g离心30min取上清液；将所述上清液置于65℃、75rpm旋转蒸发至原体积的1/10，除去乙醇，得无糖贻贝混合肽，无糖大分子贻贝肽溶液；将上述贻贝混合肽，大分子贻贝混合肽，小分子贻贝混合肽，无糖贻贝混合肽，无糖大分子肽冷冻干燥或喷雾干燥，得贻贝混合肽粉，大分子贻贝混合肽粉，小分子贻贝混合肽粉，无糖贻贝混合肽粉，无糖大分子肽粉；
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
喷雾干燥的方法为常压喷雾干燥或低温喷雾干燥，
常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150-220℃，物料温度控制在60-90℃。
低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
对比例3
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，所得贻贝浆加水，4℃静置6h提取蛋白，然后10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B用1000D的透析袋进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述透析具体为：将所述上清液B置于1000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析36h。
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶5000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过3KDa的超滤离心管的穿透液和未穿透液，即大分子贻贝混合肽和小分子贻贝混合肽，将贻贝混合肽和大分子贻贝混合肽的溶液，加入所述穿透液5倍体积的无水乙醇，静置24h，10000g离心30min取上清液；将所述上清液置于75℃、65rpm旋转蒸发至原体积的1/10，除去乙醇，得无糖贻贝混合肽，无糖大分子贻贝肽溶液；将上述贻贝混合肽，大分子贻贝混合肽，小分子贻贝混合肽，无糖贻贝混合肽，无糖大分子肽冷冻干燥或喷雾干燥，得贻贝混合肽粉，大分子贻贝混合肽粉，小分子贻贝混合肽粉，无糖贻贝混合肽粉，无糖大分子肽粉；
所述冷冻干燥方法采用梯度变温方式进行，冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段时间进行抽真空，第二段至第七段的真空度15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
所述喷雾干燥的方法为常压喷雾干燥或低温喷雾干燥，
常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
取实施例1～实施例3中制备的无糖小分子肽粉，及对比例1～对比例3所述贻贝混合肽粉、大分子贻贝混合肽粉、小分子贻贝混合肽粉、无糖贻贝混合肽粉、无糖大分子贻贝肽粉按下述方法进行成骨活性的测定：
成骨活性的测定方法
成骨活性的测定方法：用MTT法测定MC3T3-E1细胞的成骨细胞增殖情况，将MC3T3-E1细胞以5000个细胞的密度接种在96孔板中，并将细胞在含有体积分数10％FBS的α-MEM培养基中在5％CO2的中于37℃培养24小时；之后，更换细胞培养基，并用PBS缓冲液洗涤；在含有不同浓度样品(贻贝混合肽粉、大分子贻贝混合肽粉、小分子贻贝混合肽粉、无糖贻贝混合肽粉、无糖大分子贻贝肽粉、无糖小分子贻贝肽粉、只加培养基为空白)的α-MEM培养基于37℃下代替原α-MEM培养基72小时，之后在每孔加入10μLMTT溶液(5mg/mL)在培养箱内培养4小时；之后，用150μL二甲基亚砜(DMSO)代替培养基，50rpm摇动10分钟。使用MicroplateReader(Eon，BioTek，USA)在570nm处测其吸光度值。每个孔中MC3T3-E1细胞的活力为活细胞的吸光值。
细胞活力＝样品的吸光值/空白的吸光值
结果如图1～6所示，图1～图3中的小分子混合贻贝肽冻干粉在浓度为100μg/mL相较于100μg/mL混合贻贝肽冻干粉和100μg/mL大分子贻贝混合肽冻干粉有更高的成骨活性，且其中对比例3中的100μg/mL小分子混合贻贝肽的成骨细胞增值率为44.18％，在实施例中又多了一步无糖的步骤除去了小分子贻贝混合肽的多糖，且图6中实施例3中100μg/mL无糖小分子贻贝肽冻干粉的成骨细胞增殖率为47.28％的效果最好，最终选择实施例3中的条件中的无糖小分子贻贝肽冻干粉为最优条件。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取贻贝肉6000～12000rpm、匀浆3～10min，得贻贝浆，加水，1～25℃静置2～8h，离心取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:3～5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白离心，收集上清液B，将所述上清液B用500～3500D的透析袋和水进行透析脱盐，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30～100加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，30～60℃搅拌酶解2～6小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，所述中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶3000～6000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管进行超滤离心，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液3～10倍体积的无水乙醇，静置18～24h，离心取上清液C；将所述上清液C置于60～75℃旋转蒸发至原体积的1/5～1/10，得溶液B；干燥，得无糖小分子肽粉；其中，所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述离心具体为：6000～12000g、5～30min。
3.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述透析具体为：将所述上清液B置于500～3500D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100～150倍，每6～12h更换一次双蒸水，共透析24～36h。
4.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，步骤S2所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度为15Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
5.根据权利要求1所述无糖小分子贻贝肽的制备方法，其特征在于，步骤S4所述超滤离心的参数为4000～8000rpm、10～30min。
6.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，步骤S4所述离心参数为：8000～12000g、10～30min。
7.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，步骤S4所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃～-50℃预冻3～5小时，第二段：-45℃～-40℃冷冻1～3小时，第三段：-30℃～-25℃冷冻1～2小时，第四段：-10℃～-5℃冷冻1～2小时，第五段：5℃～15℃干燥1～2小时，第六段：15℃～20℃干燥1～2小时，第七段：20℃～25℃干燥1～2小时；在第二段进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度为15Pa；真空泵启动温度为-60℃～-50℃，隔板温度设定为-30℃～-20℃。
8.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，步骤S4所述喷雾干燥为常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃。
9.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，步骤S4所述喷雾干燥为低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
10.根据权利要求1所述无糖小分子肽粉的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、贻贝水提粗蛋白的制备：取500g贻贝肉10000rpm、匀浆10min，得贻贝浆，加水，4℃静置6h，10000g离心30min取上清液A，得到的水提粗蛋白；其中，所述贻贝浆和水的重量体积比为：1:5g/mL；
S2、脱盐：将步骤S1所述水提粗蛋白10000g离心30min，收集上清液B，将所述上清液B置于1000D的透析袋中，使用双蒸水对其进行透析，所述双蒸水的用量为上清液B体积的100倍，每6h更换一次双蒸水，共透析36h，得到水提脱盐贻贝蛋白；将所述水提脱盐贻贝蛋白进行冷冻干燥，得到水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉；
所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻2小时，第三段：-30℃冷冻1小时，第四段：-10℃冷冻2小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥1小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度为15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃。
S3、酶解：将步骤S3所述水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉，按料液重量比1:30加水复溶成溶液A，向所述溶液A中加入中性蛋白酶，在温度40℃下55rpm搅拌酶解4小时，所得酶解产物溶液为具有成骨活性的贻贝混合肽；其中，中性蛋白酶的添加量以所述溶液A中水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉总重量为基准，每克水提脱盐的贻贝蛋白冻干粉加入中性蛋白酶5000U；
S4、醇沉：取步骤S3所述具有成骨活性的贻贝混合肽，使用3KDa的超滤离心管6000rpm超滤离心30min，取通过超滤离心管的穿透液，即分子量在3KDa以下的溶液，加入所述穿透液5倍体积的无水乙醇，静置24h，10000g离心30min取上清液C；将所述上清液C置于75℃、65rpm旋转蒸发至原体积的1/10，得溶液B；冷冻干燥或喷雾干燥，得无糖小分子肽粉；
所述冷冻干燥的时间-温度程序设置如下，第一段：-60℃预冻3小时，第二段：-45℃冷冻3小时，第三段：-30℃冷冻2小时，第四段：-10℃冷冻1小时，第五段：5℃干燥1小时，第六段：15℃干燥2小时，第七段：25℃干燥2小时；在第二段进行抽真空，所述第二段至第七段的真空度为15Pa；真空泵启动温度为-60℃，隔板温度设定为-30℃；
所述喷雾干燥为常压喷雾干燥或低温喷雾干燥，
所述常压喷雾干燥：喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为30％～40％，设置进风温度150～220℃，物料温度控制在60～90℃；
所述低温喷雾干燥：低温喷雾干燥控制溶液中的固形物质量含量范围为15％～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，物料温度控制在30～60℃。
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| CN110946761A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-04-03 | 东阿阿胶股份有限公司 | 一种猪苓汤基准物质的制备方法和定性检测方法 |
| CN113604531A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-05 | 大连工业大学 | 一种同时制备贻贝功能脂质和活性多肽的方法 |
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| CN101948899A (zh) * | 2010-09-16 | 2011-01-19 | 浙江工商大学 | 酶解贻贝蛋白制备降血压肽的方法 |
| CN104177484A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-12-03 | 浙江海洋学院 | 一种抗前列腺癌贻贝糖蛋白及其制备和应用 |
| CN108904420A (zh) * | 2018-06-28 | 2018-11-30 | 爱思开百朗德生物科技（海门）有限公司 | 具有祛痘功效的护肤品原料组合物及其制备方法、应用 |
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