CN110431227A - 新型整合位点及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了用于增强外源性基因在真核细胞中表达的组合物和方法。还提供了用于增强的和稳定的外源性基因表达的染色体基因座和序列。

Description

新型整合位点及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月19日提交的美国临时专利申请号62/473,454的优先权，其所公开的全部内容在此参考并入。

发明领域

本发明一般地涉及用于增强蛋白在真核细胞中的表达的组合物和方法。

背景技术

在哺乳动物细胞中生产重组蛋白对于研究或治疗用途非常重要。产生能够高水平且稳定表达重组蛋白的哺乳动物细胞系是生产工艺中的关键步骤。产生此类哺乳动物细胞系的最常用方法包括下述步骤：1)将包含转基因的载体转染进入哺乳动物细胞，以使得转基因可以并入细胞的染色体内，和2)选择高水平表达转基因的细胞。适于生产目的的稳定转染细胞系的选择通常是一个艰难的过程，因为表达的维持高度依赖于转基因整合位点基因组环境的性质，其中在绝大多数情况下表观遗传机制导致表达变异和沉默。因此，本领域对改进的哺乳动物表达系统存在持续的需求。

发明概述

在一个方面中，本公开内容提供了一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含整合在所述细胞的基因组基因座内的外源性核酸序列，其中所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛。在一个实施方式中，所述基因座是选自下组的基因组区域：核不均一核糖核蛋白A2(hnRNPA2)的启动子和周围区域、TATA结合蛋白(TBP)的启动子和周围区域、β-肌动蛋白的CpG岛/启动子和周围区域以及PDCD2的CpG岛/启动子和周围区域。在一个实施方式中，所述基因座包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核苷酸序列，SEQ ID NO:1对应于中国仓鼠基因组中的hnRNPA2 CpG岛/启动子基因座。在一个实施方式中，所述基因座包含与SEQID NO:2具有至少90％同一性的核苷酸序列，SEQ ID NO:2对应于人基因组中的hnRNPA2CpG岛/启动子基因座。在一个实施方式中，所述基因座包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核苷酸序列，SEQ ID NO:3对应于小鼠基因组中的hnRNPA2 CpG岛/启动子基因座。

在一个实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞或受精卵。

在一个实施方式中，所述外源性核酸序列包含外源性目标基因(GOI)。在一个实施方式中，所述外源性核酸序列包含外源性启动子。在一个实施方式中，所述外源性核酸编码蛋白。在一个实施方式中，所述外源性核酸编码抗体。在一个实施方式中，所述外源性核酸序列包含一个或多个重组酶识别序列。在一个实施方式中，所述重组酶识别序列选自下组：attP位点、attB、LoxP位点、Lox511位点、Lox2272位点、Lox2372位点、Lox5171位点、Loxm2位点、Lox71位点、Lox66位点、LoxFas位点、frt位点、由phiC31整合酶识别的位点、由Bxb1整合酶识别的位点和由Tn3整合酶识别的位点。

在另一个方面中，本公开内容提供了一种方法，所述方法包括：将外源性核酸引入哺乳动物细胞，其中将所述外源性核酸整合至所述基因组的基因座，所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛。在一个实施方式中，所述方法还包括将所述细胞发育成生物体。

在又一个方面中，本公开内容提供了一种方法，所述方法包括：(a)提供一种细胞，所述细胞包含整合在所述细胞的基因组基因座内的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列包含与外源性启动子可操作地连接的外源性GOI，和其中所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛；和(b)在能够使所述外源性GOI表达的条件下培养(a)中的所述细胞。在一个实施方式中，所述外源性GOI编码目标蛋白(POI)，且所述方法还包括收集所述POI。

附图说明

下述附图构成了本说明书的一部分，并且包括在本公开内容内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本申请给出的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开内容。

图1显示了当编码GFP的转基因插入CHO细胞的不同基因座时，GFP的表达水平。

图2显示了当编码荧光素酶的转基因插入CHO细胞的不同基因座时，荧光素酶的表达水平。

发明详述

在更详细地描述本公开内容之前，应当理解的是，本公开内容不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应当理解的是，本申请使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且并非旨在限制，因为本公开内容的范围仅受权利要求的限制。

除非另外定义，否则本申请使用的所有技术和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本申请所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可以用于实施或检测本公开内容，但是目前描述的是优选的方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本申请，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入，并且通过引用并入本申请以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前公开的内容，并且不应将其解释为承认由于在先的公开使得本公开内容无权先于此类出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期是不同的，其可能需要单独确认。

本领域技术人员在阅读本公开内容之后将是显而易见的是，本申请所描述和示出的每个单独的实施方式具有离散的组件和特征，在不脱离本公开内容的范围或主旨的前提下，其可以容易地与任意其他若干实施方式的特征分离或组合在一起。任何列举的方法可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。

定义

提供下述定义以帮助读者。除非另有定义，否则本申请使用的所有术语、符号和其他科学或医学术语或专业术语均旨在具有化学和医学领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考而在本申请中定义具有通常理解含义的术语，并且本申请中包含的这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的术语定义具有实质性差异。

如在本申请中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一”、“一个(种)”和“该”包括复数指代。

在本公开内容中值得注意的是，术语如“包含”、“包括”、“含有”等具有美国专利法规定的含义；其是包容性或开放式的，并且不排除其他的、未列举的元素或方法步骤。术语如“基本上由……组成”等具有美国专利法规定的含义；其允许包含不会对请求保护的发明的基本特征和新颖性特征产生实质影响的其他成分或步骤。术语“由……组成”具有美国专利法中赋予其的含义；即这些术语是封闭式的。

如在本申请中所使用的，术语“抗体”包括与一种特定抗原或多种抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(二价)抗体。天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由可变区以及第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物的重链分类为α、δ、ε、γ和μ，以及哺乳动物的轻链分类为λ或κ。抗体为“Y”形，Y的茎由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包含与单一轻链的可变区和恒定区键合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。这两条链的可变区通常含有三个称为互补性决定区(CDR)(轻(L)链CDR包括LCDR1、LCDR2、LCDR3，重(H)链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)的高变环。可以通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani的公约来定义或鉴定本申请公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J Mol Biol 273(4):927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,JMol Biol,196:901(1987)；Chothia,C.等，Nature 342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。三个CDR插入称为框架区(FR)的侧翼区段之间，其比CDR更高度保守并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但是显示出不同的效应器功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体进行分类。抗体的五个主要类型或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征为分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。将若干主要抗体类型分成亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。

如在本申请中所使用的，“细胞”可以是原核的或真核的。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞(例如，哺乳动物细胞或人细胞)的类型包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞(例如，B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和过度分泌的中性粒细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如，网织红细胞)、肥大细胞、血小板或巨核细胞和树突状细胞)；来自内分泌系统或器官的细胞(例如，甲状腺细胞(例如，甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如，甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞)、肾上腺细胞(例如，嗜铬细胞)和松果体的细胞(pineal cell)(例如，松果体细胞(pinealocyte)))；来自神经系统或器官的细胞(例如，成胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞和垂体细胞(例如，促性腺激、皮质激素、甲状腺素、生长激素和催乳素细胞))；来自呼吸系统或器官的细胞(例如，肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞和肺泡巨噬细胞)；来自循环系统或器官的细胞(例如，心肌细胞和周细胞)；来自消化系统或器官的细胞(例如，胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞和肝细胞(例如，肝细胞和枯否细胞))；来自外皮系统或器官的细胞(例如，骨细胞(例如，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)，牙齿细胞(例如，成牙骨质细胞和成釉细胞)，软骨细胞(例如，成软骨细胞和软骨细胞)，皮肤/毛发细胞(例如，毛细胞、角质形成细胞和黑素细胞(痣细胞))，肌肉细胞(例如，肌细胞)，脂肪细胞，成纤维细胞和肌腱细胞)；来自泌尿系统或器官的细胞(例如，足细胞、肾小球旁细胞，肾小球内肾小球膜细胞、肾小球外肾小球膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞和黄斑密度细胞)；以及来自生殖系统或器官的细胞(例如，精子、支持细胞、间质细胞、卵子、卵母细胞)。细胞可以是正常的健康细胞；或者患病或不健康的细胞(例如，癌细胞)。细胞还包括哺乳动物受精卵或干细胞，其包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期同时保持未分化状态并分化成特化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)、专能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞和单能干细胞，其中任何一种都可以从体细胞诱导。干细胞还可以包括癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔形目细胞，例如家兔细胞。哺乳动物细胞还可以是灵长类细胞，例如人细胞。在某些实例中，细胞是用于大规模生物生产的细胞，例如CHO细胞。

在核酸序列背景下的“同源序列”指与参照核酸序列基本上同源的序列。在一些实施方式中，如果其至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应核苷酸在残基的相关伸展上是相同的，则认为两条序列基本上同源。在一些实施方式中，相关伸展是完整(即，全长)序列。

术语“可操作地连接”指元件的排布，其中这样描述的部件被配置成执行其通常的功能。因此，与多肽可操作地连接的给定信号肽指示多肽从细胞中分泌。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将指示编码序列的表达。启动子或其他控制元件不需要与编码序列相邻，只要其具有指示编码序列表达的功能即可。例如，在启动子序列与编码序列之间可以存在间隔的非翻译但转录的序列，而仍可以将启动子序列认为与编码序列“可操作地连接”。

术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且指任意长度核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任意三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链的短链或长链RNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线形的或环状的。

当描述核酸序列(如SEQ ID NO:1或其片段时)，“同一性百分比”旨在包括沿着连续同源区域显示所述同一性的同源序列，但是在计算同一性百分比时不考虑存在的缺口、缺失或与比较序列没有同源性的插入。如在本申请中所使用的，例如SEQ ID NO:1或其片段与物种同源物之间同一性百分比的确定将不包括这种序列比较：即在比对中与物种同源物无同源性的序列进行的比较(即，SEQ ID NO:1或其片段在该点有插入，或物种同源物具有缺口或缺失，视情况而定)。因此，“同一性百分比”不包括对缺口、缺失和插入的罚分。

当在遗传学中使用时，术语“启动子”指启动特定基因转录的DNA区域。启动子通常位于基因的转录起始位点上游，并且其长度可以是约100-1000个碱基对。

在通常情况下，“蛋白”是多肽(即，通过肽键彼此连接的至少2个氨基酸串)。蛋白可以包括除氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域技术人员将意识到“蛋白”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可以是其功能部分。本领域技术人员还将意识到有时蛋白可以包含一条以上多肽链，例如其通过一个或多个二硫键连接或以其他方式缔合。

如在本申请中所使用的，术语“对象”指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、家兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、山羊、马或灵长类)。人包括出生前或出生后形式。在很多实施方式中，对象是人。对象可以是患者，其是指到医疗提供者处对疾病进行诊断或治疗的人。在本申请中使用的术语“对象”与“个体”或“患者”可以互换使用。对象可以患有或易患某种疾病或病症，但是可以表现或不表现出所述疾病或病症的症状。

如在本申请中所使用的，术语“载体”指其中可以可操作地插入编码蛋白的多核苷酸以使得该蛋白能够表达的媒介(vehicle)。可以将载体用于转化、转导或转染宿主细胞，以使得其携带的遗传元件在宿主细胞内表达。载体的实例包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC))、噬菌体(如λ噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。作为载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可以含有用于控制表达的多种元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。此外，载体可以含有复制原点。载体还可以含有帮助其进入细胞的物质，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白包膜。

外源基因表达增强的细胞和生物体

在一个方面中，本公开内容提供了一种外源基因表达增强的哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞包含整合在细胞基因组的基因座中的外源性核酸序列，其中所述基因组包含延伸的无甲基化CpG岛。

在哺乳动物DNA中，二核苷酸CpG被DNA甲基转移酶所识别，该酶将胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是不稳定的并且易于转化为胸腺嘧啶。其结果是，出现CpG二核苷酸的频率远低于偶然出现的频率。然而，基因组DNA一些部分具有CpG的频率接近于偶然出现的频率，并且将这些序列称为CpG岛。如在本申请中所使用的，“CpG岛”指至少200bp的DNA序列，其具有至少50％的GC含量，以及具有至少0.6的观察到的/预计的CpG含量比(即，CpG二核苷酸的含量占偶然出现频率的至少60％)(Gardiner-Green M和Frommer M.JMol Biol(1987)196,261-282；Rice P,Longden I和Bleasby A Trends Genet(2000)16,276-277)。

无甲基化CpG岛是本领域所熟知的(Bird等，Cell(1985)40:91-99；Tazi&Bird,Cell(1990)60:909-920)并且可以将其定义为其中大部分胞嘧啶残基未被甲基化且通常在两个间隔很近(0.1-3kb)的分开转录的基因的5'末端延伸的CpG岛。据报道，这些DNA区域在整个发育过程中在所有组织中保持低甲基化(Wise和Pravtcheva,Genomics(1999)60:258-271)。它们通常与普遍表达基因的5’末端结合，以及据估计40％的基因显示出组织限制性表达性质(Antequera,F.&Bird,A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,1195-11999；Cross,S.H.&Bird,A.P.Curr.Opin,Genet.Dev.(1995)5,309-314)，并且已知其位于活性染色质区域(Tazi,J.&Bird,A.Cell(1990)60,909-920)。

“延伸的无甲基化CpG岛”是延伸跨过包含一个以上转录起始位点的区域和/或延伸超过300bp和优选地超过500bp的无甲基化CpG岛。延伸的无甲基化CpG岛的边界在功能上通过在该区域上使用PCR结合限制性核酸内切酶来定义，所述限制性核酸内切酶在其识别的序列处消化(切割)DNA的能力对存在的任何CpG残基的甲基化状态敏感。一种这样的酶是HpaII，其在CCGG位点识别和消化，CCGG位点通常存在于CpG岛内，但仅在中心CG残基未被甲基化的情况下才能进行识别和消化。因此，如果DNA未被甲基化，则使用HpaII消化的DNA以及在含有HpaII位点的区域进行PCR，将由于HpaII的消化而不产生扩增产物。当DNA被甲基化时PCR才会产生扩增产物。因此，在无甲基化区域之外，HpaII将不消化DNA并且将观察到PCR扩增产物，从而定义了“延伸的无甲基化CpG岛”的边界。

在一个实施方式中，包含延伸的无甲基化CpG岛的基因座是选自下组的基因组区域：核不均一核糖核蛋白A2(hnRNPA2)的启动子和周围区域、TATA结合蛋白(TBP)的启动子和周围区域、β-肌动蛋白的CpG岛/启动子和周围区域以及PDCD2的CpG岛/启动子和周围区域。在一个实施方式中，本申请公开的基因座包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，基因座包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，基因座包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核苷酸序列。

当用于描述增强的表达时，术语“增强的”或“增强”包括比在将外源性核酸序列随机整合至基因组或在不同基因座整合(例如与在相同表达构建体中单一拷贝的随机整合混合物相比)所通常观察到的表达增强至少约1.2倍至增强至少约5倍。使用本发明的序列观察到的成倍表达增强是指在基本上相同的条件下测量的与本发明的基因组中不存在整合的情况相比的相同基因的表达水平，例如与在整合至相同物种的基因组的另一基因座中的情况相比。

当将短语“外源性核酸”、“外源性核酸序列”、“外源性基因”或“外源性启动子”用于目标基因座时，该短语指自然界中存在的目标基因座中不存在的任何DNA序列或基因。例如，在CHO基因座(例如，包含SEQ ID NO:1序列的基因座)中的“外源性核酸序列”可以是在自然界的特定CHO基因座中不存在的仓鼠基因(即，来自仓鼠基因组中另一基因座的仓鼠基因)，来自任意其他物种的基因(例如，人基因)、嵌合基因(例如，人/小鼠基因)或者其他任何在自然界中的目标CHO基因座中不存在的基因。

在某些实施方式中，本公开内容中的外源性基因编码目标蛋白。可以使用适于在真核细胞中表达的任何目标蛋白。例如，目标蛋白包括但不限于抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段或者细胞表面受体胞外域或其片段。目标蛋白可以是由单一亚基构成的简单多肽，或者包含两个或多个亚基的复合多亚基蛋白。

在一个实施方式中，本公开内容中的外源性核酸序列包含与外源性基因可操作地连接的外源性启动子。外源性启动子包括但不限于来源于病毒的常用启动子和增强子，例如多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)。可以使用病毒基因组启动子、控制和/或信号序列以驱动表达，条件是此类控制序列与所选择的宿主细胞是相容的。还可以使用非病毒细胞启动子(例如，β-珠蛋白和EF-1α启动子)，其取决于表达外源性基因的细胞的类型。

可以通过本领域公知的任何方法将外源性核酸序列整合至基因组的特定基因座中。在某些实施方式中，通过同源重组将外源性核酸序列整合至特定基因座。对于同源重组，将同源多核苷酸分子(例如，同源臂)排成一列并交换其序列的一段。如果转基因的侧翼是同源基因组序列，则在该交换过程中可以引入转基因。在一个实例中，可以在整合位点将重组位点引入宿主细胞基因组。

可以通过在整合位点处在染色体DNA中引入断裂促进在真核细胞中的同源重组。已经证明，如果在染色体靶序列内引入双链断裂，则在基因靶向期间同源重组的频率增加。基因靶向载体也用于促进同源重组。在缺乏用于同源定向修复的基因靶向的情况下，细胞经常通过非同源末端连接(NHEJ)闭合双链断裂，这可能导致在切割位点缺失或插入多个核苷酸。当发生插入或缺失(InDel)时，则在断裂位点随机插入或缺失少量核苷酸，并且这些InDel可以移位或破坏靶基因座内基因的任何开放阅读框(ORF)。应当理解的是，本发明中涉及的基因座(例如，具有延伸的无甲基化CpG岛的基因座)通常不是编码区基因。因此，通过在该基因座的插入和/或缺失不能预见到其破坏内源性基因转录。因此，在某些实施方式中，通过非同源末端连接(NHEJ)机制将外源性核酸序列整合至特定基因座。

在某些实施方式中，通过位点特异性核酸酶促进外源性核酸的整合。如在本申请中所使用的，“核酸酶”是能够切割核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。“位点特异性核酸酶”指其功能依赖于特异性核苷酸序列的核酸酶。通常地，位点特异性核酸酶识别并结合至特异性核苷酸序列，并且切割核苷酸序列内或其附近的磷酸二酯键。在某些实施方式中，使用位点特异性核酸酶通过位点特异性切割产生双链断裂。位点特异性核酸酶的实例包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)相关(Cas)核酸酶。

在某些实施方式中，整合至基因座的外源性核酸序列包含重组酶识别序列。如在本申请中所使用的，重组酶识别序列指由位点特异性重组酶识别的序列。术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”指促进DNA在特定靶位点之间重排的高度特异性的酶家族(Greindley等，2006；Esposito,D.和Scocca,J.J.Nucleic Acids Research(1997)25,3605-3614；Nunes-Duby,S.E.等，Nucleic Acids Research(1998)26,391-406；Stark,W.M.等，Trendsin Genetics(1992)8,432-439)。实际上，可以将所有位点特异性重组酶分为两个结构和机制上不同的组中的一个：酪氨酸(例如，Cre、Flp和λ整合酶)或苏氨酸(例如，phiC31整合酶、γ-δ解离酶，Tn3解离酶和Gin转化酶)重组酶。两个重组酶家族均识别由两个反向重复的结合元件组成的靶位点，所述结合元件位于发生DNA断裂和再连接的间隔序列的侧翼。重组过程需要两个重组酶单体伴随结合至每个靶位点：两个DNA结合二聚体(四聚体)，然后连接形成突触复合体(synaptic complex)，导致交叉和链交换。在Tn3解离酶中含有活化突变的Tn3解离酶的“过度活化”形式可以在没有辅助位点的28bp核心位点催化链交换，据推测是通过四聚体三级/四级结构的重构实现的。在某些实施方式中，重组酶识别序列选自下组：attP位点、attB位点、LoxP位点、Lox511位点、Lox2272位点、Lox2372位点、Lox5171位点、Loxm2位点、Lox71位点、Lox66位点、LoxFas位点、frt位点、由phiC31识别的位点和由Tn3识别的位点。

当将重组酶识别序列整合至基因组的基因座中时，其可以用于促进其他核酸序列整合至基因座，例如通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)过程。在一个实施方式中，重组酶识别序列是由整合酶(例如，phi C31和Tn3)识别的attP或attB。例如，当由phiC31识别的attP整合至细胞的基因座时，通过在phiC31整合酶存在下将包含转基因和attB的载体导入细胞，可以将转基因整合至基因座。

在一个实施方式中，本公开内容的细胞是ES细胞或受精卵，并且可以发育成生物体。因此，在另一个方面中本公开内容提供了一种转基因动物，所述转基因动物在其种系中包含整合在基因组基因座内的外源核酸序列，其中所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛。动物可以是小鼠、大鼠、家兔、犬、猫、牛、绵羊、山羊或非人灵长类动物。

用于增强外源性基因表达的方法和组合物

在另一个方面中，本公开内容提供了一种在哺乳动物细胞中增强外源性基因表达的方法。在一个实施方式中，所述方法包括将外源性核酸引入哺乳动物细胞，其中将所述外源性核酸整合至基因组的基因座中，所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛。

在将核酸序列插入细胞的背景下，术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”，并且包括将核酸序列掺入原核或真核细胞中，其中所述核酸序列可以瞬时存在于细胞中或者可以掺入细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自主复制子。可以使用本领域公知的任何方法将本公开内容中的核酸引入细胞中。可以使用转化动物细胞的各种技术，包括例如：显微注射、逆转录病毒介导的基因转移、电穿孔、转染、纳米颗粒介导的基因转移等(参见例如，Keown等，Methods in Enzymology 1990,185:527-537)。在一个实施方式中，通过病毒(例如，腺相关病毒)将载体引入细胞。

在将外源性核酸序列引入目标细胞后，其可以通过本领域公知的任何方法整合至细胞基因组的特定基因座中。在某些实施方式中，外源性核酸序列通过同源重组整合至特定基因座。在某些实施方式中，外源性核酸序列通过非同源末端连接(NHEJ)机制整合至特定基因座。在一个实施方式中，本公开内容中的方法还包括将位点特异性核酸酶引入细胞。在一个实施方式中，位点特异性核酸酶是Cas核酸酶。在一个实施方式中，本公开内容中的方法还包括向细胞中引入整合了外源核酸的基因座序列的gRNA互补物。

在一个实施方式中，本申请使用的细胞是ES细胞或受精卵，并且本公开内容中的方法还包括将细胞发育成生物体。

在另一个方面中，本公开内容提供了用于增强外源性基因在哺乳动物细胞中表达的组合物。

在另一个方面中，本公开内容还提供了治疗或处理方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的包含外源性核酸的载体，其中所述外源性核酸整合至所述对象的细胞基因组的基因座中，所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛。

如在本申请中所使用的，“治疗”或“处理”病况包括预防或缓解病况、延缓病况发病或其进展速度、降低发展成病况的风险、阻止或推迟与病况相关症状的出现、减轻或终止与病况相关的症状、使病况产生完全或部分消退、治愈病况或者其某些的组合。

生产重组蛋白的方法

在另一个方面中，本公开内容提供了在哺乳动物细胞中生产重组蛋白的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：(a)提供一种细胞，所述细胞包含整合在所述细胞的基因组基因座内的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列包含与外源性启动子可操作地连接的外源性GOI，和其中所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛；和(b)在能够使所述外源性GOI表达的条件下培养(a)中的所述细胞。在某些实施方式中，本公开内容中的细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，外源性GOI编码目标蛋白(POI)，并且本公开内容中的方法还包括收集所述POI。在一个实施方式中，目标蛋白选自下组：免疫球蛋白或其片段以及受体或其配体结合片段。在某些实施方式中，目标蛋白选自下组：抗体轻链或其抗原结合片段，以及抗体重链或其抗原结合片段。

实施例

包括下述实施例以显示本公开内容的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开内容的主旨和范围的前提下，可以对所公开的具体实施方式进行很多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1

本实施例说明了hnRNPA2基因座是蛋白表达的活性位点。用线性化的CMV-GFP-T2A-puro供体DNA以及靶向待测试的包括ASC2、ASC3、ASC7和REGN1在内的每个基因组基因座的Cas9-gRNA来转染CHO-S细胞。ASC2对应于hnRNPA2(SEQ ID NO:1)。ASC3和ASC7对应于基因组中的两个其他无关基因座。REGN1指美国专利申请公开号US2016/0115502A1中所述的活性位点。随机指仅与供体DNA随机整合并作为基线对照。转染4天后，使用嘌呤霉素选择细胞，持续3天。用非选择性培养基培养存活的细胞。在转染后21、42和82天收集细胞，并使用流式细胞术进行GFP分析。对GFP信号中位值占随机插入中位值的百分比作图(图1)。与经检测的所有其他基因座相比，ASC2基因座在82天的延长培养期中仍具有非常稳健的GFP信号。用于靶向ASC2、ASC3、ASC7和REGN1的gRNA序列列于下表中。

表1：靶向不同基因座的gRNA序列

基因座	序列	SEQ ID NO
			ASC2	TGTAAAATACTTAGTATGACNGG	4
ASC3	TGACAATGGGACCAGTAGTANGG	5
			ASC7	ACTCTGATCAGCTATCTTGANGG	6
REGN1	ATCTAAACTGTAACATTGAANGG	7

实施例2

本实施例说明了hnRNPA2基因座是蛋白表达的活性位点。用线性化的CMV-mCherry-PGK-Luc供体DNA以及靶向待测试的包括ASC2、ASC3、ASC7和REGN1在内的每个基因组基因座的Cas9-gRNA来转染CHO-S细胞。ASC2对应于hnRNPA2(SEQ ID NO:1)。ASC3和ASC7对应于基因组中的两个其他无关基因座。REGN1指美国专利申请公开号US2016/0115502A1中所述的活性位点。随机指仅与供体DNA随机整合并作为对照。转染4周后，通过FACS富集表达mCherry的红色荧光细胞，并且再培养4周。使用荧光素酶测定系统(Promega)测量荧光素酶活性，并通过ATP光系统(Perkin Elmer)进行归一化。实验单独重复进行三次。对荧光素酶活性与ATP光信号之比作图(图2)。样品标记与实施例1中相同。与经检测的所有其他基因座相比，ASC2基因座的荧光素酶活性最高。

序列表

<110> 应用干细胞有限公司

<120> 新型整合位点及其用途

<130> 044903-8014WO01

<150> 62/473,454

<151> 2017-03-19

<160> 7

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 4000

<212> DNA

<213> 中国仓鼠

<400> 1

ccgggaaccg gatttggcgg ccgccatttt cccgtctcct tgctcgcagc ggtttttcgc 60

gtcccgcact ctgcggctct gcccgttcgg ccccttcccc cccgcgtggg agccattagc 120

tggtttcctt tgtccccggc ccgttttggt ggcgttccga gggggatctg gggtgttttg 180

agctctgatc tcggagtcct gcgcacctcg ttttaggcgc tccgccctcc ttccccctcg 240

acgaaatggc gccattgcgc tcccgagcca cacggtgtgc gcggccgggt gggggtggcg 300

gcggcctccg caagggttcc cggcgcaggc cccgggcgag gagtgcgatc cgggcctgag 360

cctgctgctg aaggcagcct tgcagcaaag aaaccatttt acttccccga gctggctcct 420

aattccttta attaagcgat ttgtgagtct gcagttgtaa aaggaagccc agagtgctca 480

gctgtagtta gaaggtgatc ttgggcggag ggatattttt ttattgctgc gtatgtttat 540

tttcctgaag gatcctgatg tttgaaataa ttcagattat gaggatttta aagggaacca 600

caggatttgt tcctaaaaca acagatcttt acgcgtgatg gtcacgttag ggaagagaaa 660

ataacttttc gtagttcacc tttgattaca gcatggaaca gtccagtatt aacgcaggaa 720

cctagctatg taaaaacttt tatttgggac acaatgtatt tgaactttgt catttgcttt 780

tttctgattt atgtttgcaa atggttgatt attacattga taagcataag gtttcaaatt 840

aaaggggtct acttggttat attctttgac cctaagcacg tttataaaat aaccttgttt 900

ataatcgata gtggacgtcg ggtaagtttg gaaaaaccta tgaggtaagt aataagcttt 960

tgctttttgt tagtgacatt aaaaatggta agtttatgct tacagtttga atttaaagat 1020

ggcacatctg tggacattta tctagaattg cctggaaact tggatttcca gtcatactaa 1080

gtattttaca cgtcctattt taatctttaa cctattttgt ctactcaatt tctccaaatt 1140

tcagaacctg agaaagggca tcgaacaaaa tttttacaga ctttttttga aggaacctta 1200

atagatttgg gttgtaataa gagttgtgga aattttttgt gtgttatgaa ttttgtcttt 1260

tcagtttgtt atgcaatcaa gacaggtcct ggatagtatt acccagttta taagcatctt 1320

ggtttttaag ctgttttatt tataagtcag taataacaca actttagtat ttacttcagg 1380

aaattactat tggaaatttt tgagagattt gtcagaaggc cactaattac taaaaggaaa 1440

gttaagccag gcgttggtgg cgcacgcctt taatcccaga ggcaggcgga tatttgtgag 1500

ttcgaggcca gcctggtctc cagagcgagt gccaggatag gctccaaaaa aaatgtaaag 1560

taactgttgg ggcaatagca actgtagata aatgtgtgct tcttagtact gtagcctgaa 1620

caccagacaa ggagtgcctc ccaaaaaatt agatggaata aattttgcta agttaaaaga 1680

aaactatttt gaggtggtgc gtatatctgg tgttcaactt tactcatgga acttctttca 1740

gagttgaagg atcccccatt gaaatagtta gtctaactcc agggtggggg ggcagtttaa 1800

ggaaaggcag atctgccact actctgaaat tgaatcctga attaagcagt ggatatcgaa 1860

atttcagggt tttttttttt caatttaaaa aaataagttt gagcaaagtt ctgtgcttga 1920

gttgtagact ttaataaaga atttcataag aattctttga taccctttaa atcagagttg 1980

gttatggttt ttctcaaagg tttttaagaa agtgtaagct aaggtaattt atatgaatta 2040

aagttagatc aaatattagt gactttaaaa cttgcatagt tcagctgagg caatttttgg 2100

tgtaacacaa ctaatatgca gtttaacata tggtttaaat ttgatgtaag tttttttttt 2160

ccccccagaa aactttagaa actgttcctt tggagaggaa aaaggtactc tgccagcagg 2220

tcacctcata tttaagaatt taatttcctg catacaaaga gaaaatgtaa ataaaaattg 2280

aaatggtatt ttcctttaca gagagaaaag gagcagttcc gcaaactctt tattggtggc 2340

ttaagctttg aaactacaga agaaagtttg agaaactact atgagcaatg gggaaagctc 2400

acagactgtg tggtacgtta aatgtgaaag tctgactgtg ggttttagta tggttgagtt 2460

taagcataaa ttttgggctg agccagcctg cagtgccaca tgcctttagt cccagccctt 2520

agagtctggc ggatctctga gtttgagacc agactggtct ataagagcta gttccaggac 2580

agcctccaaa gacacagaga agcccctgtc tcccaaaaat ccaaaaagga taattttctt 2640

gttgggatga atcatacagg aaattagtat ataaaaaagg acattggggc gggctctcaa 2700

acagggtgtc tctgtaacca accacattag cctcgaactc ttctctccaa attctgagat 2760

taaaggcgtg tgctaccaca cctggccaaa aaaaaaaaaa aaataaaaaa gaccaattgg 2820

tttgttcata actaccttga aattaatgct gacatctttt ggttttaaag gttatgagag 2880

atcctgcaag caaaagatca aggggatttg gatttgtaac attctcatcc atggctgagg 2940

tagatgctgc catggctgca aggcctcatt ccattgatgg cagagtagtt gagccaaaac 3000

gtgctgtagc aagagaggtg agcaaaatat gttcagtggt tttcttgggt tgtactagct 3060

ttttgtacat gactttctag gacttaactt caaatctatt gctatatctg aaggaatttg 3120

tcctaagact gaagtataag tttgtgcttt caaggtggtt taatttgtgt atttgttttt 3180

tctgtcagat aactttgtca ctatctgttg taggagtctg gaaaaccagg agcccatgtg 3240

actgtgaaga aactgtttgt cggtggaatt aaagaggata ctgaggaaca ccaccttaga 3300

gattactttg aagaatatgg gaaaattgat actattgaaa taattactga taggcagtct 3360

gggaagaaaa gaggctttgg ctttgttact tttgatgacc atgatcctgt ggataaaatt 3420

gtatgtaagt gtctaggcat aagagtggtt gtatataaaa tgttgggtgt attaacagcc 3480

tgttaaaaca ttcaggattg cactgggtgt tggtggcaca cacctttaat cccagcactc 3540

aggaggcaga ggcaggcgga tatgtgtgag ttccaggcca acctggtctc tagagccagt 3600

gccaggatag gctccaaagc tacacagaga aaccctgtct ggaaaaacca aaagaaaaat 3660

tgcttattag aatgtattta tgattcagtt tttttgtttt tgtttcagtg caaaaatatc 3720

acaccatcaa tggtcacaat gcagaagtta gaaaggcatt gtctagacaa gaaatgcaag 3780

aagtccaaag ttctaggagt ggacgaggag gtaagaaatc atacattttt agatttgtgt 3840

attttatatg tatatataca tttgatgggt tttgtctgaa tgcttgctac taatcaaaac 3900

atatatccta ggaaactttg gttttggtga ttctcgtggt ggcggcggca attttggacc 3960

aggaccagga agcaacttca gggggggttc tggtgagtgt 4000

<210> 2

<211> 4000

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

taattaaata acaaaaggaa aaaacttaag atgcttcaac cccgtttcgt gacactttga 60

aaaaagaatc acctcttgca aacacccgct cccgaccccc gccgctgaag cccggcgtcc 120

agaggcctaa gcgcgggtgc ccgcccccac ccgggagcgc gggcctcgtg gtcagcgcat 180

ccgcggggag aaacaaaggc cgcggcacgg gggctcaagg gcactgcgcc acaccgcacg 240

cgcctacccc cgcggcggcc acgttaactg ggcggtcgcc gcagcctcgg gacagccggc 300

cgcgcgccgc caggcctcgc ggacgcggga ccacgcgccg ccctccggga ggcccaagtc 360

tcgacccagc cccgcgtggc ggctggggga gggggcgcct ccgccggaac gcgggtgggg 420

gaggggaggg ggaaatgcgc tttgtctcga aatggggcaa ccgtcgccac agctccctac 480

cccctcgagg gcagagcagt ccccccacta actaccggcg ctggccgcgc gccaggccag 540

ccgcgaggcc accgcccgac cctccactcc ttcccgcagc tcccggcgcg gggtccggcg 600

agaaggggag gggaggggag cggagaaccg ggcccccggg acgcgtgtgg catctgaagc 660

accaccagcg agcgagagct agagagaagg aaagccaccg acttcaccgc ctccgagctg 720

ctccgggtcg cgggtctgca gcgtctccgg ccctccgcgc ctacagctca agccacatcc 780

gaagggggag ggagccggga gctgcgcgcg gggccgccgg ggggaggggt ggcaccgccc 840

acgccgggcg gccacgaagg gcggggcagc gggcgcgcgc ccggcggggg gaggggccgc 900

gcgccgcgcc cgctgggaat tggggcccta gggggagggc ggaggcgccg acgaccgcgg 960

cacttaccgt tcgcggcgtg gcgcccggtg gtccccaagg ggagggaagg gggaggcggg 1020

gcgaggacag tgaccggagt ctcctcagcg gtggcttttc tgcttggcag cctcagcggc 1080

tggcgccaaa accggactcc gcccacttcc tcgcccctgc ggtgcgaggg tgtggaatcc 1140

tccagacgct gggggagggg gagttgggag cttaaaaact agtacccctt tgggaccact 1200

ttcagcagcg aactctcctg tacaccaggg gtcagttcca cagacgcggg ccaggggtgg 1260

gtcattgcgg cgtgaacaat aatttgacta gaagttgatt cgggtgtttc cggaaggggc 1320

cgagtcaatc cgccgagttg gggcacggaa aacaaaaagg gaaggctact aagatttttc 1380

tggcgggggt tatcattggc gtaactgcag ggaccacctc ccgggttgag ggggctggat 1440

ctccaggctg cggattaagc ccctcccgtc ggcgttaatt tcaaactgcg cgaccgtttc 1500

tcacctgcct tgcgccaagg cagggggcgg gaccctattc caagaggtag taactagcag 1560

gactctagcc ttccgcaatt cattgagcgc atttacggaa gtaacgtcgg gtactgtctc 1620

tggccgcaag ggtgggagga gtacgcattt ggcgtaaggt ggggcgtaga gccttcccgc 1680

cattggcggc ggatagggcg tttacgcgac ggcctgacgt agcggaagac gcgttagtgg 1740

gggggaaggt tctagaaaag cggcggcagc ggctctagcg gcagtagcag cagcgccggg 1800

tcccgtgcgg aggtgctcct cgcagagttg tttctcgagc agcggcagtt ctcactacag 1860

cgccaggacg agtccggttc gtgttcgtcc gcggagatct ctctcatctc gctcggctgc 1920

gggaaatcgg gctgaagcga ctgagtccgc gatggaggta acgggtttga aatcaatgag 1980

ttattgaaaa gggcatggcg aggccgttgg cgcctcagtg gaagtcggcc agccgcctcc 2040

gtgggagaga ggcaggaaat cggaccaatt cagtagcagt ggggcttaag gtttatgaac 2100

ggggtcttga gcggaggcct gagcgtacaa acagcttccc caccctcagc ctcccggcgc 2160

catttccctt cactgggggt gggggatggg gagctttcac atggcggacg ctgccccgct 2220

ggggtgaaag tggggcgcgg aggcgggaat tcttattccc tttctaaagc acgctgcttc 2280

gggggccacg gcgtctcctc ggcgagcgtt tcggcgggca gcaggtcctc gtgagcgagg 2340

ctgcggagct tcccctcccc ctctctcccg ggaaccggat ttggcggccg ccattttcat 2400

ggctcgcctt cctctcagcg ttttccttat aactctttta ttttcttagt gtgctttctc 2460

tatcaagaag tagaagtggt taactatttt tttttcttct cgggctgttt tcatatcgtt 2520

tcgaggtgga tttggagtgt tttgtgagct tggatcttta gagtcctgcg cacctcatta 2580

aaggcgctca gccttcccct cgatgaaatg gcgccattgc gttcggaagc cacaccgaag 2640

agcggggagg gggggtgctc cgggtttgcg ggcccggttt cagagaagat atcaccaccc 2700

agggcgtcgg gccgggttca atgcgagccg taggacaaag aaaccatttt atgtttttcc 2760

tgtctttttt ttcctttgag taacggtttt atctgggtct gcagtcagta aaacgacaga 2820

tgaaccgcgg caaaataaac ataaattgga agccatcggc cacgaggggc agggacgaag 2880

gtggttttct gggcggggga gggatattcg cgtcagaatc ctttactgtt cttaaggatt 2940

ccgtttaagt tgtagagctg actcatttta agtaatgttg ttactgagaa gtttaaccct 3000

tacgggacag atccatggac ctttatagat gattacgagg aaagtgaaat aacgattttg 3060

tccttagtta tacttcgatt aaaacatggc ttcagaggct ccttcctgta atgcgtatgg 3120

attgatgtgc aaaactgttt tgggcctggg ccgctctgta tttgaacttt gttacttttc 3180

tcattttgtt tgcaatcttg gttgaacatt acattgataa gcataaggtc tcaagcgaag 3240

ggggtctacc tggttatttt ctttgaccct aagcacgttt ataaaataac attgtttaaa 3300

atcgatagtg gacatcgggt aagtttggat aaattgtgag gtaagtaatg agtttttgct 3360

ttttgttagt gatttgtaaa acttgttata aatgtacatt atccgtaatt tcagtttaga 3420

gataacctat gtgctgacga caattaagaa taaaaactag ctgaaaaaat gaaaataact 3480

atcgtgacaa gtaaccattt caaaagactg ctttgtgtct cataggagct agtttgatca 3540

tttcagttaa ttttttcttt aatttttacg agtcatgaaa actacaggaa aaaaatctga 3600

actgggtttt accactactt tttaggagtt gggagcatgc gaatggaggg agagctccgt 3660

agaactggga tgagagcagc aattaatgct gcttgctagg aacaaaaaat aattgattga 3720

aaattacgtg tgacttttta gtttgcatta tgcgtttgta gcagttggtc ctggatatca 3780

ctttctctcg tttgaggttt tttaacctag ttaactttta agacaggttt ccttaacatt 3840

cataagtgcc cagaatacag ctgtgtagta cagcatataa agatttcagc tctgaggttt 3900

ttcctattga cttggaaaat tgttttgtgc ctgtcgcttg ccacatggcc aatcaagtaa 3960

gcttcagctt tcagtaattg ttatcttaga gattatgcca 4000

<210> 3

<211> 4000

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 3

aggattgtta ctttcccaat ccatatagaa ttttaacaat tttagtgttt attttggatg 60

aaaggaaatg actatctttt gttagcaaat taccataaga tctttttctt tagatttctg 120

aatactccaa ggagctcata taattccatc cttatttttt cagaggccct ccctgttcaa 180

tcacggtata aaaaaaggaa cacattaaga tgtcccagtc ctattttctg gctttttttt 240

tccgggggtg gtggtgcggt aatcactctc tatagtccag tctgggcttc aacgcctggc 300

aatccccagc ctcaagctcc caagtactgt cctgataagg atagaaggag tcgacctcct 360

tcacgctccc ctccgaggag ggctccttcc cagctccatt ccccggtcgg gagcccgtcc 420

cccacccgag agcgcgggcc tcgtggtcag cgcctccgcg gggagaaaca aaggcggcgg 480

cgggggctca agggcactgc gccacgggcc cgcgcctccc ccatccggcg gcggccacgt 540

agccgggagc gcgccgcagc ccggagcctc gggcctcgca gctgcagagc ctgaaccgct 600

ctctccctgc gggcctgcga cgaggctggg ggaggggagg cccgcgcttt gtctggagtc 660

tcggtagctg tcatccggct cccaccctca tgcacaattg tcccatctcc cccacgcacc 720

ggcgcggcgc ccgcctcagc gaggccccag ccggtttccc gcagcccgcg gcccacgggg 780

ctcgcagcct ccccgcaagc tcggacgcac ggagcatcct aaaccccacc acacgcaaga 840

tcgaaaaaaa gcaaaggcac gaacttcacc gctccgatgc tcagggccgc ggatcctgca 900

gagtctcccg cctgcgcgct tcggttcagc cacatccgag gggagggggc gcgggcagct 960

ccgccggggg ggagggggag caccgcccac gccctggccg cgcggggccc gccgggaacg 1020

cgtcctgcgg ggggcggcgc gcgcaatgct caccgtccgc ggcgtggcgc ccagggggtc 1080

tcctggctgg ggggaggggg gggaaggcgg gcaggaagga ccgcggaggc ctctctgcgt 1140

ctcggagcgc gccaaagcgg ggctccaccc acctccttgc ccggatcttg aaggccgggg 1200

agataaacag cggggttctt taagcaccac ctctcactag gcgcgggatc ccaaggcttg 1260

tggcatccgg ggtggtactt ggactaaaag tccttctggg agggaccgag tgagaacccc 1320

tttgggacgt gtagaaatat ttgtgtggtt cgagaatatt tgtgcggacg ggcttggcaa 1380

aggcgtagct gcagagagca cgcttgggtg gagagggccg cacgccccag cgccggccta 1440

agcccctccc gacggcgtta tttcaaactg cgcgaccgtt tctccgctcc ctacgcggag 1500

gtgggggccg gacctagttc cggacgtagt aacacgccga gcgcgagcct tccgcaattc 1560

acggaacaca gttgcgcaag tgatgtaaag cagtcccgct gtacctaaag ggggagtgtc 1620

acgtacttgg cgtaaggaga gtgtaggccc ttcccgccat tggcggcggt tagggcgttt 1680

acgtaacggc gtgacgtaag cggagacgcg ttagtggggg gaaggttcta gaaaagcggc 1740

ggtctcggct ccagcggcag tagcagcggc gccggtcccg tgtgcaggag ctcctttgcg 1800

gcccagtttc ttggccatcg cctgctctcc ccacagcgcc aggacgagtc ccgtgcgcgt 1860

ccgtccgcgg aggtctttct catctcgctc ggctgcggga aatcgggctg aagcgactga 1920

gtccgcgatg gaggtaacgg gtttgaaatc aatgagttat taaaaatggc atggcgaggc 1980

cgtaggcacc gcaatggaaa ccggccaccc gcctccgtgg tccggcggag gggatgcggc 2040

cactcgagtg gcggttggcc ttggcgagtt tctgaggggt cgttggagga ggcctctgat 2100

tgtccgaccg ccttccccgc cctcagccgc ccggcgccat ttccctcagt tggggtgggg 2160

gatgggaagt gcccgccgcg accgggctgg accgctaaag tagcgcgtga gcgggccatc 2220

gctggccttt cgatgtgcgc gggcctaggg gctcggttgt gttcgcggcg gaacgtttct 2280

ggggcccccc cggcttcccg gagcgagtct gcgaagcttc ccctcccccc tctcccggga 2340

accggatttg gcggccgcca ttttcccgtc tccttcctcg ccacgatttt gctttcaacg 2400

ctttaggttt actagtttgg ttttcttttt tcaccactgc gtagacgtgt ttagcgattt 2460

tcctttcttt tggaagtctt cataccgttt cgaggtggat ttagcgtttt gagcttgggt 2520

cttcagcgtc ctgcgcacct cgctaaaggc tctctgcctt cccctcgacg aaatggcgcc 2580

attgctttct gaagccaccg aggcgcgggg tgggggcggg gtggcggcgc tccacgagct 2640

ttactggaac aggcagagag aacgtagtac aaccgaggcc tgggcgggtg gctgaaggca 2700

gcgtcgctgc aaagagaccg ttttattttt cataatacgt aagattacgg gtgctgtagt 2760

aaagcacttg agcattagta tagtaggagg aagtcaaagt ggaaaaaatg ggagcgctca 2820

tcaggaagct agggaggcta tgttgagtgc agggttactt tccttttatt gcagaacttt 2880

tatctgctta aaggatcctc ggatcgaaat aattcaaatt ataagcattt ttaagggaat 2940

cttcgaattt gttggtaaag tcaacggatc cttagcacgt ggtgttcact ttaaggaagt 3000

gaaatagctg acttttcata gttagccttc gcttaaagcc tggttcagtg gacgaaaatc 3060

cacgtcctgg ctatataaaa acttagtttg gggtcacagt gtttgagcgt ggtcattcgg 3120

tttttttatt ttttatttgt ttgaaattat gatgcatcat tacactgata agcattagct 3180

ttcgaattga aaggggtctc cttggttatt ttctttgact ctaagcacac ttataaataa 3240

aataaccttg tttataatcg atagtggacg tctggtaagt ttggaaaaaa cccgaggtaa 3300

gtaaagagct tttgctttcg ttagtgatat gaaaaaacaa ggtgtattta atacttgcaa 3360

cttagtttaa ggaaagccaa tttactgaca ttttagtaga gctaccagaa acactatttg 3420

gagtcctgat taaggctttt gtaactattt tgactattta aaacaatttt ggtcgttttt 3480

attaaacatt tcaaaaccta aaaattgtaa acattggctt tttgagcaca ttttggagaa 3540

acttacaaat ttaggctata cagtaaaata acggatttgt tttataattt tgctttttca 3600

tttcgttgtg cagtcatagg tcctggatag tatgacctaa tttatgaaca tcttgataag 3660

tttttgtact tagctattgg aaagccagta ttaagtgcct gacaaaacca gatttaaggt 3720

gatatctgga gtttcagcat tcttcatgga gcttgtttca gagttgcagg attttttttt 3780

ttcatcttga gatacttaca attaacacca gagggggcag ctcagggaaa agcaaatatg 3840

ccacttttca gaaactgaat cttggaagtg gtgaatttgg aaacaggttt tttaaatttt 3900

ttttaaatct aaaaagtagt aaattttgga cttgggttgt agaatttaat gaattacaaa 3960

agaattcttt aatacccttt aaatgaccta agagctgggt 4000

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<400> 4

tgtaaaatac ttagtatgac ngg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的

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<223> n 是 a, c, g, 或 t

<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成的

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<222> (21)..(21)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<400> 7

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Claims (21)

1.一种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含整合在所述细胞的基因组基因座内的外源性核酸序列，其中所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述基因座是选自下组的基因组区域：核不均一核糖核蛋白A2(hnRNPA2)的启动子和周围区域、TATA结合蛋白(TBP)的启动子和周围区域、β-肌动蛋白的CpG岛/启动子和周围区域以及PDCD2的CpG岛/启动子和周围区域。

3.根据权利要求1所述的细胞，其中所述基因座包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

5.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是ES细胞或受精卵。

6.根据权利要求1所述的细胞，其中所述外源性核酸序列包含外源性目标基因(GOI)。

7.根据权利要求1所述的细胞，其中所述外源性核酸序列包含外源性启动子。

8.根据权利要求1所述的细胞，其中所述外源性核酸序列编码蛋白。

9.根据权利要求1所述的细胞，其中所述外源性核酸序列包含一个或多个重组酶识别序列。

10.根据权利要求9所述的细胞，其中所述重组酶识别序列选自下组：attP位点、attB、LoxP位点、Lox511位点、Lox2272位点、Lox2372位点、Lox5171位点、Loxm2位点、Lox71位点、Lox66位点、LoxFas位点、frt位点、由phiC31整合酶识别的位点、由Bxb1整合酶识别的位点和由Tn3整合酶识别的位点。

11.一种方法，所述方法包括：

将外源性核酸引入哺乳动物细胞，其中将所述外源性核酸整合至所述基因组的基因座，所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因座是选自下组的基因组区域：核不均一核糖核蛋白A2(hnRNPA2)的启动子和周围区域、TATA结合蛋白(TBP)的启动子和周围区域、β-肌动蛋白的CpG岛/启动子和周围区域以及PDCD2的CpG岛/启动子和周围区域。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因座包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核苷酸序列。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞是ES细胞或受精卵。

16.根据权利要求15所述的方法，还包括将所述细胞发育成生物体。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述外源性核酸包含外源性目标基因(GOI)。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述外源性核酸包含重组酶识别序列。

19.一种方法，所述方法包括：

(a)提供一种细胞，所述细胞包含整合在所述细胞的基因组基因座内的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列包含与外源性启动子可操作地连接的外源性GOI，和其中所述基因座包含延伸的无甲基化CpG岛；和

(b)在能够使所述外源性GOI表达的条件下培养(a)中的所述细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述外源性GOI编码目标蛋白(POI)，并且其中所述方法还包括：

收集所述POI。