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CN110423788A - 一种利用诱变产生的灰树花菌株生产灰树花多糖的方法 - Google Patents

一种利用诱变产生的灰树花菌株生产灰树花多糖的方法 Download PDF

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CN110423788A CN201910601981.8A CN201910601981A CN110423788A CN 110423788 A CN110423788 A CN 110423788A CN 201910601981 A CN201910601981 A CN 201910601981A CN 110423788 A CN110423788 A CN 110423788A
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Abstract

本发明公开了一种利用诱变产生的灰树花菌株生产灰树花多糖的方法，涉及食品微生物应用技术领域。通过紫外诱变获得一株灰树花新菌株，保藏编号为CCTCC NO:M 2018907，在检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料培养基进行液态发酵，高效转化米糠麸皮为灰树花菌丝体原料和更多的胞外粗多糖。发酵产物经多频超声提取、冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗除杂得到合格的灰树花多糖产物。本发明首次实现灰树花新菌株生产灰树花多糖的方法，同时本发明将低值的米糠麸皮转化成高值的具有多种保健功能的灰树花多糖，对降低生产成本、低端资源高效合理高值化利用、保护大众健康，都具有有益的社会和经济效果。

Description

一种利用诱变产生的灰树花菌株生产灰树花多糖的方法
技术领域
本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及一种使用诱变获得的新菌株生产多糖的方法，在该方法中新菌株在经检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料的液态培养基中进行发酵，生产出菌丝体原料和发酵液的发酵物后，经过多频超声辅助提取、冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗、冻干得到合格的多糖产物。
背景技术
许多药食两用真菌或药用真菌在中国有着悠久的使用历史和广泛的使用人群。现代科学揭示，现在常用珍稀真菌如灰树花、猴头菌、灵芝、桦褐孔菌、冬虫夏草等的菌丝体、子实体或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、核苷类、萜类化合物、黄酮类等多种活性成分或富集多种微量元素如硒、锌等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、增强肝脏功能、抗氧化等多种功效。正因为如此，国际国内各类人员研究和开发这类真菌的兴趣浓厚，在医药领域、食品领域、中医保健领域、农业和工业生产领域都有许多研究者和开发者，获得众多的研究成果或产品，如灵芝胶囊、灰树花胶囊及蝙蝠蛾拟青霉胶囊等，它们的经济价值较高。饼干中添加猴头菇则制成了猴头菇饼干，已经成为普通食品在国内超市进行销售。国际上新西兰、日本、美国、韩国等均产有类似的珍稀真菌保健食品或药品产品。
就灰树花而言，针对其的研究表明：灰树花在抗肿瘤、抗病毒、降血糖、延缓衰老、增强免疫力等方面均具有一定的生物活性，具有较高的药用价值(参考文献：①He Y,Li X,Hao C,et al.Grifola frondosa polysaccharide:a review of antitumor and otherbiological activity studies in China[J].Discovery Medicine,2018,25(138):159-176.②Mao G H,Ren Y,Feng W W,et al.Antitumor and immunomodulatory activity ofa water-soluble polysaccharide from Grifola frondosa[J].Carbohydr Polym,2015,134:406-412.③Chan Y Y,Chan E,Chan S W,et al.Enhancement of in vitro and invivo anticancer activities of polysaccharide peptide from Grifola frondosa bychemical modifications[J].Pharmaceutical Biology,2011,49(11):1114-20.④He X,Wang X,Fang J,et al.Polysaccharides in Grifola frondosa mushroom and theirhealth promoting properties:A review[J].International journal of biologicalmacromolecules,2017,101:910.⑤张宗启,刘力萍.灰树花多糖结构特点及其生物活性研究进展[J].中国酿造,2018(5).)。
灰树花(Grifola frondosa)是一种珍贵的药食两用真菌，隶属于担子菌门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属，又名贝叶多孔菌、千佛菌、莲花菌、栗子蘑等，根据其生长地方的不同，灰树花有不同的别名，在西南地区称为莲花菌，在东北地区称其为栗蘑、在浙西南山区被叫做“云蕈”，日本称之为“舞茸”(Maitake)，美国称之为“林鸡”(hen of thewoods)。灰树花多生长在高山阔叶林橡树、栗树或常绿针、阔混交林中。寄生于树木的根部，是典型的森林白腐菌。在我国主要分布于云南、四川、河北、黑龙江、吉林、广西、西藏、福建等地。野生灰树花主要产于海拔800～1400m的阔叶林下，喜好温暖的气候和潮湿的土壤，其形态可分为菌丝体和子实体两大部分，其中菌丝体作为灰树花深层发酵的产物，颜色为乳白色，形态呈大小均匀的球形；而作为可食部分的子实体是一种富含蛋白质、维生素E和多种矿质元素的营养食品。灰树花的人工驯化栽培已进入产业化，在我国南方地区栽培基本为代料栽培，北方则以代料埋土栽培为主。灰树花子实体灰色至灰褐色到灰白色，边缘有一圈不规则尖凸，菌肉白色，肉质脆嫩，有柄且柄短呈珊瑚状分枝，重叠成丛。其外观层叠似菊，远观似层层云片，“云蕈”之名因此而得。现在灰树花的获取方式主要是人工栽培，以子实体或孢子粉入药，但人工栽培灰树花周期长、生产效率不高、劳动强度大，受季节、环境等限制，易遭病虫害，质量与产量不稳定。珍稀真菌发酵技术,可克服传统的子实体栽培的不足，采用液态或固态发酵的方法生产灰树花发酵物并加以深加工应用符合创新驱动的发展思路，具有良好的前景。对灰树花发酵物的研究和开发取得的进步都将进一步推动灰树花的应用，带来实际的社会和经济效益。正因为如此，才有必要研究新的灰树花发酵物及其深加工产品的生产方法，例如考虑将一些低端农产品加工副产品原料如麸皮、米糠高效转化为高价值的灰树花发酵物原料，可望高效利用低品位的农产品资源，降低灰树花发酵物的生产成本从而降低终产品如灰树花类保健食品或药品的价格，让利于普通人，促进大众健康，这也是本发明专利关注点之一。
中国是水稻和小麦的生产大国，米糠和麸皮资源丰富，年产量米糠约为1000万吨，小麦麸皮(本说明书麸皮均指小麦麸)约为3000万吨。米糠和麸皮作为稻谷或小麦加工的副产物，营养成分丰富，价格低廉。米糠中含有丰富优质的蛋白质、活性多糖、脂肪和生育三烯酚、生育酚等生理功能显著的活性物质，麸皮富含脂肪、蛋白质、矿物质、维生素和纤维素等营养成分，其中纤维素的含量可达麸皮总量的18％以上，所以，米糠和麸皮能为灰树花生长提供充足的碳源、氮源、维生素和矿物质。在灰树花纤维素酶及其它酶系的作用下，可将米糠和麸皮转化成所需营养物质进行生长代谢，合成灰树花菌丝体和各类功能性物质。因此，运用农副产品米糠、麸皮作为全部的碳源和氮源，进行灰树花液态发酵生产灰树花发酵物并深加工成保健食品或药品，具有技术可行性，并可带来较好的社会和经济效益。
多数食用菌液态发酵生产方法采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯或黄豆粉等作为培养基，即使会用到农副产品如米糠、麸皮等，也是将其作为辅助成分加入。原始的灰树花在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠麸皮全料液态培养基上生长状况并非为最好，加之米糠、麸皮原料中含有一些有害物质如铅、砷、黄曲霉毒素、呕吐毒素、农药残留物等影响到最终产品品质，故需要对灰树花的发酵麸皮米糠液态全料生产灰树花发酵物的方法进行创新研究。
本专利第一发明人刘伟民的研究小组十多年来对灵芝、灰树花、冬虫夏草等的液态发酵进行了大量的研究，先后形成硕士论文和发明专利等多个成果。刘伟民指导的硕士论文有：(1)杨锁华，灰树花发酵米糠制备多糖(2006年)；(2)顾慧敏，灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究(2009年)；(3)张建，物理法诱变灰树花液体发酵米糠麸皮产多糖的研究(2010年)；(4)郭春梅，灰树花的菌种诱变、液体发酵米糠麸皮产多糖及富硒研究(2011年)；(5)李亚楠，灰树花菌种诱变及发酵和性能研究(2013年)；(6)刘丽丽，高值转化米糠麸皮的灵芝液体发酵及菌种诱变(2012年)；(7)郭天龙，灵芝菌种诱变及液态发酵高值化转化全米糠麸皮研究(2013年)；(8)陈静，冬虫夏草液体发酵高值化利用米糠麸皮产多糖的研究(2014年)；(9)张笑飞，灵芝菌株(Ganoderma lucidum CFCC6043)液体发酵全米糠麸皮及多糖活性的研究(2014年)；(10)曹勋，灰树花诱变及新旧菌株液体发酵米糠麸皮研究(2015年)；(11)金雷，灵芝诱变及新旧菌株液体发酵米糠和麸皮研究(2015年)；(12)王雪梅，用冬虫夏草菌株液体发酵米糠麸皮全料的比较研究(2016年)；(13)李婷婷，冬虫夏草菌株诱变及新菌株液态发酵米糠麸皮全料新培养基的研究(2017年)。刘伟民作为发明人的发明专利有：(1)使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，20101010579048.4；(2)用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株，201010579078.5；(3)用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株，201110150888.3；(4)用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灰树花多糖的菌株，201310274913.8；(5)一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，201310275061.4；(6)一种液态发酵米糠麸皮全料生产冬虫夏草多糖的方法，201310274914.2；(7)一种灰树花诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，201310274911.9；(8)用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株，201310274915.7；(9)富硒灵芝菌丝原料的生产方法，201510996120.6；(10)一株生产灰树花菌丝体的灰树花诱变菌株，201510990344.6；(11)生产冬虫夏草菌丝体的冬虫夏草诱变菌株，201510996118.9等。
由以上描述可知，本专利发明人刘伟民一直围绕转化利用米糠和麸皮高效高值化生产珍稀食用菌发酵物这一专题进行研究，实现发明创造的设想，并不断改进各种珍稀真菌发酵物的生产方法。
发明人刘伟民参加了国家十三五重点研发计划专项“现代食品加工及粮食收储运技术与装备”中项目“大宗米制品适度加工关键技术装备研发及示范(2017YFD0401105)”中课题“稻米加工副产物的食品化利用新技术与新模式”的研究，承担了其中的研究任务“米糠半固态发酵关键技术及新产品研发”。刘伟民结合上述研究任务，梳理了所指导的硕士研究生的论文及以前与本发明专利相关的发明专利，考虑与企业洽谈相关成果转让时所无法回答的问题，如以前的菌种种源说明不满足企业的要求，企业因而进行产业化开发的愿望不强烈等，发现如果要走向产业化道路，相关的专利技术和研究论文仍存在许多问题需要研究解决和获得创新。这些问题包括具有不同性能的珍稀真菌高效新菌株的获取和确认及开发、米糠麸皮原料标准的制定、珍稀真菌发酵物发酵方法创新、珍稀真菌发酵物分离纯化新方法使用以及这些需要创新对象的组合方式等。发明专利在设计时对授予发明专利权所必须的独特性、取得突出的实质性特点和显著进步的创新性和实用性要给予充分的考虑。所以，上述这些问题的组合创新应该保证相关的发明专利达到授予发明专利权所必须的独特性、创新性和实用性。
发明人正是基于上述考虑和对灰树花发酵物生产方法的研究，提出了本发明专利的申请，利用了从生产现场采摘到的灰树花子实体分离出了不同于以往灰树花菌株来源故发酵性能不同的灰树花原始菌株，进行诱变获得新菌株，并发酵米糠麸皮生产合格的灰树花多糖产物。
综上所述，本发明涉及的领域为将新菌株用于发酵麸皮和米糠全料生产发酵物并经深度加工处理后成为合格产品。区别于以往的研究和取得的成果：本发明要解决的关键问题之一为需要通过诱变的方法，提升原始菌种的发酵能力，获得一种未见报道的新菌株，并能对此新菌株进行基因测序，确保所用菌种正确；本发明要解决的关键问题之二为定出麸皮米糠原料标准，因为麸皮和米糠来源复杂，其中污染物种类及其水平不同，发明人以前的研究和专利在此方面未予以足够的关注，给后续产品开发带来不定后果；本发明要解决的关键问题之三为发酵物菌丝和发酵液均经深度加工处理后成为合格产品的生产方法。以上三点保证了本发明专利与其他发明者和本发明人刘伟民研究团队的各类成果均不同，具有独特性、创新性和实用性。
针对上述三个方面的关键问题提出的原因作进一步的解释。提出本发明要解决的关键问题之一，即提出了需要通过诱变的方法，提升原始菌种的发酵能力，获得一种未见报道的新菌株，并能对此新菌株进行基因测序，确保所用菌种正确。这一问题的背景是，发明人团队期望得到一株从未使用且具有良好的性能的菌株，并期望其能在麸皮米糠生物转化方面有良好表现，故考虑研究发酵麸皮米糠生产发酵物的方法。根据发明人的以往研究经验，这类珍稀真菌发酵麸皮米糠首先需要解决菌种的适应性问题。因此，我们需要对这一生产方法中的菌种的发酵能力进行考察，并通过菌种诱变的方法改善其发酵性能。另外在研究过程中，经大量的菌种处理步骤后要保证菌种不出现错误，应该进行基因测序。这在以往的研究中没有重视此事。如此，本专利从一开始就紧盯基因系列的测定，保证菌株正确。
提出本发明要解决的关键问题之二为定出麸皮米糠原料标准的背景是以前我们的研究和专利在此方面未予以足够的关注，给后续产品开发有时会带来意想不到后果。以前我们总希望所研究的成果能够处理各种麸皮和米糠，因此对麸皮米糠原料有意放宽使用限制，未进行原料标准制定，但这样做的结果是在最终产品质量表征时，出现了不在研究范围内的一些异常值，如以前的研究没有测定的某重金属测定结果超标问题，究其原因是因为麸皮和米糠原料来源复杂，品质难以保持相近水平，不明污染物最终进入终端产品。这样原来针对某些具体污染物及其可能的含量而设计的发明生产方法，有可能在产品中出现其它污染物，所以要重新设计发酵物的生产方法，应对可能出现的新的污染物。如此，麸皮和米糠原料品质的控制和标准制定问题就成为新发明专利设计必须考虑的问题。本发明提出原料麸皮和米糠的使用标准。
提出本发明要解决的关键问题之三为对发酵物进行深度加工处理使其成为合格产品的生产方法，其背景是在前两个关键问题解决的基础上考虑整个发酵物生产方法的合理合理性。既然麸皮米糠原料有可能带入不明污染物，在发酵后对发酵产物设计了冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗等分离提纯方法，得到合格的灰树花粗多糖最终产物。基于这一认识，本发明专利设计出更为合理的发酵物生产和处理方法。
本发明需要通过诱变的方法获得新菌株。微生物的选育方法主要有物理诱变、化学诱变、基因重组等，本发明为避免使用有毒有害的化学诱变剂和在食品领域还未被大众认可的基因工程方法，将利用相对简单易行的紫外诱变技术，使出发菌株处于诱变的极端环境，最大限度扩大突变位点的范围，提高得到正突变菌株的可能性。本发明采用紫外诱变这一常用诱变方法，此方法虽然不具有创新性，但此方法得到的菌株性能却发生了创新性的变化，在发酵麸皮米糠全料培养基时具有独特性、创新性和实用性。
发明人主要解决了上述三个关键性的新问题，构建了本发明的内容。
本发明所得发酵麸皮米糠全料液态培养基的新菌株为首次发明获得。
本发明的麸皮使用标准为执行原农业部食用饲料用麸皮标准NY/T 3218-2018，外加主要重金属铅、砷、汞、镉、铬的污染水平最高不超过3mg/kg,小麦种植过程中施用农药符合农技规范，小麦生长过程中无严重赤霉病害，收割季节无连续雨水导致小麦变质，小麦加工后麸皮储运不会导致霉变。米糠使用标准为执行原农业部标准NY/T122-1989外加主要重金属铅、砷、汞、镉、铬的污染水平限量最高不超过3mg/kg，水稻种植过程中施用农药符合农技规范，水稻生长过程中无严重病害，收割季节无连续雨水导致稻谷变质，稻谷加工后米糠储运不会导致霉变。
本发明给出上述新菌株在经检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料的液态培养基中进行发酵，制备多糖的方法，包括培养基的具体组成、发酵条件、提取及去杂方法、菌丝和多糖产量及多糖品质指标的测定值。所获得的总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和呕吐毒素的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量经过测定均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
发明内容
本发明用一种通过诱变获得的灰树花新菌株生产灰树花多糖的方法，在该方法中灰树花新菌株在经检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料的液态培养基中进行发酵，生产出灰树花菌丝体原料和发酵液的发酵物后，经过多频超声辅助提取、冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗、冻干得到合格的灰树花多糖产物。
本发明所采取的技术方案如下：利用一种经紫外诱变得到的灰树花新菌株，在经检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料的液态培养基中进行发酵，生产出灰树花菌丝体原料和发酵液的发酵物后，经过多频超声辅助提取、冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗、冻干得到合格的灰树花多糖产物。
在本发明的一个方面中，利用诱变产生的灰树花新菌株生产灰树花多糖的方法，按照下述步骤进行：
(1)检验麸皮和米糠，主要重金属铅、砷、汞、镉、铬的污染水平最高不超过3mg/kg，其余分别符合原农业部食用饲料用麸皮标准NY/T 3218-2018和米糠标准NY/T122-1989，小麦种植过程中施用农药符合农技规范，小麦生长过程中无严重赤霉病害，收割季节无连续雨水导致小麦变质，小麦加工后麸皮储运不会导致霉变，水稻种植过程中施用农药符合农技规范，水稻生长过程中无严重病害，收割季节无连续雨水导致稻谷变质，稻谷加工后米糠储运不会导致霉变；
(2)将米糠和麸皮加所需量的水121℃灭菌30min；
(3)将米糠和麸皮全料作为碳源、氮源直接用于灰树花新菌株保存编号CCTCC NO:M 2018907的菌株的发酵培养基，米糠浓度为0.1-10g/100mL，麸皮浓度为0.1-10g/100mL，米糠和麸皮浓度两者之和最高为10.1g/100mL，添加磷酸二氢钾0.015-0.25g/100mL，七水硫酸镁0.015-0.25g/100mL，pH自然，250mL摇瓶装料100mL，发酵罐装料率75％，接种量10％，培养温度20-25℃，摇床转速150r/min或发酵搅拌桨转速50-150r/min，发酵时间7-10d；
(4)将液体培养物离心分离得到菌丝体和发酵液，并测定发酵液中胞外多糖的产量；
(5)将所得菌丝体用70℃热水加35kHz和1.5kW的超声辅助液体循环浸提1.5h，离心分离取清液，并测定菌丝多糖产量；
(6)将两次离心分离所得清液合并，冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗、冻干得到合格的灰树花多糖产物；
(7)所得灰树花菌丝多糖和胞外多糖均采用苯酚硫酸法测定，所得灰树花多糖为菌丝多糖与胞外多糖之和，为总多糖。
(8)参照国标，测定灰树花多糖中的污染物铅、砷、汞、镉、铬、黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、多菌灵、阿维菌素、丁草胺的的含量。
在本发明的一个方面中，本发明步骤(3)中使用的灰树花新菌株，拉丁名为Grifolafrondosa，保存编号为CCTCC NO:M 2018907，是发明人自灰树花生产现场采摘的灰树花子实体分离得到的灰树花菌株经紫外诱变筛选所得，经生工生物工程(上海)股份有限公司DNA测序确定为一株灰树花新菌株，该灰树花新菌株已经于2018年12月19日保藏在位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018907，建议的分类命名为灰树花菌株JSULIUWANG18Grifola frondosa JSULIUWANG18，本发明所述灰树花新菌株均指此菌株。
在本发明的一个方面中，本发明步骤(3)中摇瓶时的装料量为摇瓶容积的40％，接种量为装料体积的10％，转速150r/min，培养时间为7-10d。
在本发明的一个方面中，本发明步骤(3)中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的75％，上罐时通风量为通气条件下每分钟通气体积与装罐液体体积之比为1：0.8，培养温度20-25℃，搅拌速率50-150r/min，上罐发酵7-10d。
本发明的有益效果
利用所述灰树花新菌株，在经检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料的液态培养基中发酵生产灰树花多糖，米糠麸皮全料培养基中米糠为7.0g/100mL，麸皮为3.1g/100mL，磷酸二氢钾为0.25g/100mL，硫酸镁为0.15g/100mL，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到3.151g/100mL、156.861mg/100mL、331.876mg/100mL和488.737mg/100mL。而上罐发酵时则可达到3.821g/100mL、183.021mg/100mL、247.665mg/100mL和430.686mg/100mL的水平。经检测，摇瓶发酵和上罐发酵得到的总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
本发明首次实现所述灰树花新菌株生产灰树花多糖的方法，在该方法中灰树花新菌株在经检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料的液态培养基中进行发酵，发酵产物经多频超声提取、冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗除杂得到合格的灰树花多糖产物。所采用的灰树花新菌株是发明人自己诱变得到的一株灰树花新菌株，该菌株可在液态米糠麸皮全料新培养基有效生长，并高效转化米糠麸皮为灰树花多糖，该菌株具有独特性，因而本发明也具有独特性。
本发明也取得了实质性特点和显著进步的创新性。灰树花新菌株菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到3.151g/100mL、156.861mg/100mL、331.876mg/100mL和488.737mg/100mL。总多糖为最终的灰树花多糖产物，达到488.737mg/100mL的生产水平，且灰树花多糖中污染物的含量低，符合食品原料的要求，说明灰树花新菌株在优化培养基中发酵性能好并高产灰树花多糖，本发明专利取得了具有实质性特点和显著进步的创新性。
本发明将低值的米糠麸皮转化成高值的具有多种保健功能的灰树花多糖，对降低生产成本、低端资源高效合理高值化利用、保护大众健康，都具有有益的社会和经济效果，因而具有实用性。
综上所述，本发明已经具备了授予发明专利所必须的独特性、取得了实质性特点和显著进步的创新性和实用性，产生了发明专利应该具有的技术、经济和社会的有益效果。
附图说明
图1为菌株灰树花CCTCC NO:M 2018907摇瓶液态发酵米糠麸皮全料新培养基时的外观图。
图2为菌株灰树花CCTCC NO:M 2018907在液态发酵米糠麸皮全料新培养基所得的菌丝产物。
图3为灰树花新菌株与的进化树。
具体实施方式
本发明提供了通过紫外诱变，选育在米糠和麸皮全料液态培养基上生长速度更快、多糖产量更高的灰树花新菌株的方法，所述方法包括下列步骤：
·取实验室保藏的原始菌株Grifola frondosa，为出发菌株；
·将所取出发菌株接种于PDA培养基上进行活化培养；
·菌体培养后用无菌生理盐水洗脱制得孢子悬液；
·将孢子悬液稀释所需倍数，在紫外灯下照射进行诱变后，接至米糠和麸皮筛选培养基上避光培养，初筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；将初筛的菌株进行遗传稳定性试验，复筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；
·用米糠和麸皮全料液态培养基进行摇瓶发酵，筛选出生长速率高和多糖产量高的菌株；
·筛选出的新菌株进行拮抗试验和基因测序。
在一个实施方案中，所用的PDA培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然。
在一个实施方案中，所述恒温为23℃。
在一个实施方案中，所述紫外诱变采用红光暗操作，在距离功率为20W的紫外灯20cm下分别照射40s。
在一个实施方案中，所述避光培养为在23℃下避光培养7天。
在一个实施方案中，所述避光培养所用培养基为米糠、麸皮固体平板培养基：米糠20g/L，麸皮30g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，琼脂20g/L，pH自然，米糠、麸皮全料使用，米糠和麸皮均必须符合标准。
在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。
在一个实施方案中，所述初筛步骤为：从紫外诱变避光培养的平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠和麸皮固体平板培养基中，从中选出相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株。
在一个实施方案中，所述复筛步骤为：将粗筛选出的较优菌株分别进行5代平板传代培养，挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠和麸皮固体平板培养基中，挑选出生长速度快、健壮、纯正的变异株。
在一个实施方案中，所述三筛步骤为：以复筛确定的高生长速率变异株作为三筛的对象，与出发菌株一起进行摇瓶发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将复筛选出的灰树花新菌株和原始出发菌株Grifola frondosa进行摇瓶发酵试验，连续发酵5代，按指标确定目标诱变株。
在一个实施方案中，所述灰树花诱变新菌株为第6号菌株，在复筛第五代平板上的生长速率为1.738cm/d，明显快于出发菌株第0号菌株的生长速率。
在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。
在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠7.0g/100mL，麸皮1.6g/100mL，磷酸二氢钾0.25g/100mL，硫酸镁0.25g/100mL，pH自然。
在一个实施方案中，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵。
在一个实施方案中，摇瓶装样量为40％，接种量为10％。
在一个实施方案中，培养温度23℃，转速150r/min，培养时间8d。
在一个实施方案中，所述指标为100mL发酵体积的纯菌丝干重、菌丝粗多糖重量和发酵液胞外粗多糖重量。
在一个实施方案中，菌丝粗多糖和胞外粗多糖为多糖分离前的产物，采用苯酚硫酸法测定。
在一个实施方案中，以拮抗性试验表征遗传性状，其结果如附图2所示，拮抗线明显，右边的灰树花诱变新菌株生长浓密、厚实，可见其生长性能强于出发菌株的性能，遗传性状发生了有益的变化。
在一个实施方案中，灰树花新菌株，保存编号为CCTCC NO:M 2018907，经生工生物工程(上海)股份有限公司DNA测序确定为一株灰树花新菌株。该灰树花新菌株已经于2018年12月19日保藏在位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018907，建议的分类命名为灰树花菌株JSULIUWANG18 Grifola frondosaJSULIUWANG18，本发明所述灰树花新菌株均指此菌株(见图3)。
本发明提供了一种使用诱变获得的灰树花新菌株生产灰树花多糖的方法，在该方法中灰树花新菌株在经检验符合污染物限量标准的米糠麸皮全料的液态培养基中进行发酵，生产出灰树花菌丝体原料和发酵液的发酵物后，经过多频超声辅助提取、冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗、冻干得到合格的灰树花多糖产物，所述方法包括下列步骤：
在一个实施方案中，检验麸皮和米糠，主要重金属铅、砷、汞、镉、铬的污染水平最高不超过3mg/kg，其余分别符合原农业部食用饲料用麸皮标准NY/T 3218-2018和米糠标准NY/T122-1989,小麦种植过程中施用农药符合农技规范，小麦生长过程中无严重赤霉病害，收割季节无连续雨水导致小麦变质，小麦加工后麸皮储运不会导致霉变水稻种植过程中施用农药符合农技规范，水稻生长过程中无严重病害，收割季节无连续雨水导致稻谷变质，稻谷加工后米糠储运不会导致霉变；
在一个实施方案中，灰树花新菌株CCTCC NO:M 2018907经生工生物工程(上海)股份有限公司DNA测序确定为一株灰树花新菌株，用作发酵菌株；
在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠浓度为0.1-10g/100mL，麸皮浓度为0.1-10g/100mL，米糠和麸皮浓度两者之和最高为10.1g/100mL添加磷酸二氢钾0.015-0.25g/100mL，七水硫酸镁0.015-0.25g/100mL，pH自然，250mL摇瓶装料100mL，发酵罐装料率75％，接种量10％，培养温度20-25℃，摇床转速150r/min或发酵搅拌浆转速50-150r/min，发酵时间7-10d；
在一个实施方案中，将液体培养所得的灰树花菌丝体进行离心分离，分别得到菌丝体和分离液，对分离清液用苯酚硫酸法测定胞外粗多糖；
在一个实施方案中，将灰树花菌丝体进行提取多糖操作，用60℃热水加35kHz和1.5kW的超声辅助液体循环浸提1.5h，离心分离取清液，并用苯酚硫酸测定菌丝多糖产量；
在一个实施方案中，所得发酵液和菌丝提取液合并，经过冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗、冷冻干燥的方法得到合格胞外多糖；
在一个实施方案中，所述筛选得到的灰树花新菌株利用发酵培养基获得的发酵结果为：菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到3.151g/100mL、156.861mg/100mL、331.876mg/100mL和488.737mg/100mL。
在一个实施方案中，灰树花多糖产量达到488.737mg/100mL，说明灰树花新菌株在优化培养基中发酵性能好并高产灰树花多糖，本发明专利取得了具有实质性特点和显著进步的创新性。
在一个实施方案中，经检测，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例1
灰树花菌株采用本发明得到的灰树花新菌株。采用达到使用标准的米糠和麸皮原料。米糠使用量为7.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为3.1g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾0.25g/100mL，七水硫酸镁0.15g/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40％，接种量为10％，培养温度23℃，转速150r/min，培养时间7d。以下按前述技术方案的步骤(4)～(8)实施。结果为，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到3.151g/100mL、156.861mg/100mL、331.876mg/100mL和488.737mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量经过测定均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例2
灰树花菌株采用本发明得到的灰树花新菌株。采用达到使用标准的米糠和麸皮原料。米糠使用量为5.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为5.1g/100mL培养基，添加KH2PO40.25g/100mL，MgSO4·7H2O 0.15g/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40％，接种量为10％，培养温度23℃，转速150r/min，培养时间8d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到2.789g/100mL、160.045mg/100mL、364.586mg/100mL和524.631mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例3
灰树花菌株采用本发明得到的灰树花新菌株。采用达到使用标准的米糠和麸皮原料。米糠使用量为10.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为0.1g/100mL培养基，添加KH2PO40.015g/100mL，MgSO4·7H2O 0.015g/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40％，接种量为10％，培养温度25℃，转速150r/min，培养时间10d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到3.206g/100mL、124.712mg/100mL、163.722mg/100mL和288.434mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例4
灰树花菌株采用本发明得到的灰树花新菌株。采用达到使用标准的米糠和麸皮原料。米糠使用量为3.1g/100mL培养基，麸皮的使用量为7.0g/100mL培养基，添加KH2PO40.15g/100mL，MgSO4·7H2O 0.075g/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40％，接种量为10％，培养温度20℃，转速150r/min，培养时间7d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到2.117g/100mL、145.143mg/100mL、397.297mg/100mL和542.44mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例5
灰树花菌株采用本发明得到的灰树花新菌株。采用达到使用标准的米糠和麸皮原料。米糠使用量为0.1g/100mL培养基，麸皮的使用量为10.0g/100mL培养基，添加KH2PO40.25g/100mL，MgSO4·7H2O 0.25g/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40％，接种量为10％，培养温度23℃，转速150r/min，培养时间9d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到1.481g/100mL、106.819mg/100mL、344.594mg/100mL和451.413mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例6
灰树花菌株采用本发明得到的灰树花新菌株。采用达到使用标准的米糠和麸皮原料。米糠使用量为10.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为0.1g/100mL培养基，添加KH2PO40.075g/100mL，MgSO4·7H2O 0.075g/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40％，接种量为10％，培养温度23℃，转速150r/min，培养时间8d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到3.386g/100mL、181.027mg/100mL、282.810mg/100mL和463.837mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例7
灰树花菌株采用本发明得到的灰树花新菌株。采用达到使用标准的米糠和麸皮原料。米糠使用量为0.1g/100mL培养基，麸皮的使用量为10.0g/100mL培养基，添加KH2PO40.15g/100mL，MgSO4·7H2O 0.075g/100mL，pH自然，加水至所需的体积，121℃灭菌30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40％，接种量为10％，培养温度23℃，转速150r/min，培养时间9d。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为，菌丝的干重浓度、菌丝粗多糖浓度、胞外粗多糖浓度和总粗多糖浓度分别达到分别达到0.912g/100mL、84.413mg/100mL、358.737mg/100mL和443.151mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例8
采用灰树花新菌株。检验麸皮和米糠均符合本发明的使用标准。发酵罐装样量为发酵罐容积的75％，发酵温度为20℃，通风量为通气条件下每分钟通气体积与装罐液体体积之比为1：0.8，搅拌速度50r/min，罐表压0.05MPa，接种量10％，培养时间7d，发酵培养基为米糠10.0g/100mL，麸皮0.1g/100mL，KH2PO4 0.015g/100mL，MgSO4·7H2O 0.015g/100mL，pH自然。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为：菌丝干重3.424g/100mL，菌丝多糖为176.315mg/100mL，胞外多糖为330.521mg/100mL培养基，灰树花多糖为506.836mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。
实施例9
采用灰树花新菌株。检验麸皮和米糠均符合本发明的使用标准。发酵罐装样量为发酵罐容积的75％，发酵温度为25℃，通风量为通气条件下每分钟通气体积与装罐液体体积之比为1：0.8，搅拌速度150r/min，罐表压0.05MPa，接种量10％，培养时间10d，发酵培养基为米糠0.1g/100mL，麸皮10.0g/100mL，KH2PO4 0.25g/100mL，MgSO4·7H2O 0.25g/100mL，pH自然。以下按前述发明内容所描述技术方案中的步骤(4)～(8)实施。结果为：菌丝干重1.819g/100mL，菌丝多糖为112.396mg/100mL，胞外多糖为258.248mg/100mL，灰树花多糖为370.644mg/100mL，总多糖的真菌毒素黄曲霉毒素B1、B2和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量、重金属铅、砷、汞、镉、铬的限量及农药多菌灵、阿维菌素、丁草胺的残留限量均不高于GB2761-2017、GB2762-2017、GB2763-2016规定的限量值或未检出。

Claims (1)

1.利用诱变产生的灰树花新菌株生产灰树花多糖的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)检验麸皮和米糠，
(2)将米糠和麸皮加所需量的水121℃灭菌30min；
(3)将米糠和麸皮全料作为碳源、氮源直接用于灰树花新菌株保存编号CCTCC NO:M2018907的菌株的发酵培养基，米糠浓度为0.1-10g/100mL，麸皮浓度为0.1-10g/100mL，米糠和麸皮浓度两者之和最高为10.1g/100mL，添加磷酸二氢钾0.015-0.25g/100mL，七水硫酸镁0.015-0.25g/100mL，pH自然，250mL摇瓶装料100mL，发酵罐装料率75％，接种量10％，培养温度20-25℃，摇床转速150r/min或发酵搅拌桨转速50-150r/min，发酵时间7-10d；
(4)将液体培养物离心分离得到菌丝体和发酵液，并测定发酵液中胞外多糖的产量；
(5)将所得菌丝体用60℃热水加35kHz和1.5kW的超声辅助液体循环浸提1.5h，离心分离取清液，并测定菌丝多糖产量；
(6)将两次离心分离所得清液合并，冷冻浓缩、柠檬酸浸提置换重金属离子、醇沉醇洗、冻干得到合格的灰树花多糖产物。
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