CN110396492A - 一株核桃枝枯病拮抗细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株核桃枝枯病拮抗细菌及其应用，该细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002，保藏编号为CGMCC NO.18218，本发明发现QB002能够抑制核桃枝枯病菌菌丝生长，致使菌丝畸形、扭曲，产生多个分支，通过平板对峙培养测定其对核桃枝枯病病原菌的生长抑制率为88.6％，并且对苹果腐烂病、枣果黑斑病、李褐腐病、都有一定抑制作用，具有广谱抑菌能力；本发明提供的枯草芽孢杆菌QB002对核桃枝枯病具有良好的生防潜力，可用于防治核桃枝枯病。
Description
技术领域
本发明属于微生物学和植物病害防控领域，具体地说，涉及一种对多种植物病原具有良好抑制效果的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
核桃(Juglans regia L.)又称胡桃，是胡桃科胡桃属的木本油料树种，为四大干果之首，其营养价值和药用价值非常高。目前在我国20多个省市都有大面积栽培，种植数量和产量均居世界首位。新疆是核桃的原产地和主产区之一，新疆核桃产量已占到全国总产量的15％，核桃产业已成为新疆经济发展的重要组成部分。然而由真菌Juglanconisjuglandina引起的核桃枝枯病在新疆核桃产区发生严重，造成枝条褪绿、干枯，严重影响了树木的健康和核桃的产量及品质。该病菌同时还能够危害核桃的叶片和果实，受害叶片上形成近圆形病斑，发生后期叶片表面被病斑覆盖，严重影响树体的光合作用；核桃果实受害后在果实表面形成黑色病斑，影响果实的产量和品质(图1)。核桃枝枯病一般发病株率20％～30％，严重时发病株率达到50％以上，引起大量枝条枯死，直接影响树体生长和核桃的质量，给果农造成了巨大的经济损失。
目前，生产中对核桃枝枯病以化学防治为主，通过施用代森锰锌等杀菌剂控制病情蔓延，不仅破坏果园的生态健康，而且影响核桃品质，造成农药残留、土壤微生态失衡等问题。生物防治则从生态安全和保护环境角度出发降低病害的发生和扩展。因此，最大程度的降低枝枯病造成的损失，生防试剂的研制势在必行。近年来，通过生防菌株防控病害的研究较为广泛，杨海清等发现于核桃根际拮抗细菌能够较好的抑制桃褐腐病，并且证明了拮抗细菌的抑菌物质具抑菌活性强、稳定性好的特点。王阳等通过组织分离法和平板对峙培养法，筛选出一株对核桃腐烂病具有较强拮抗效果的菌株，最终鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
拮抗细菌作为生物防治的一种，对植物病害防治具有良好的应用前景，国内关于核桃病害的生物防治开展过相关研究。葛康康等研究发现对山核桃干腐病病原菌(Botryosphaeria dothidea)具有拮抗效果的生防菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。张晶晶，李建贵等筛选出假单胞菌属Pseudomonas sp.、芽孢杆菌属Bacillus sp.和链霉菌属Streptomyces sp.共7株拮抗核桃腐烂病菌株。傅本重等筛选的核桃内生菌XHE7可促进种子的根长和芽长。
核桃枝枯病(Juglanconis juglandina)是近年来在新疆核桃枝条、果实和叶片上新发现的一类病害，目前尚未有能够拮抗Juglanconis juglandina的生防菌株的相关研究。
核桃已成为新疆南疆农村经济发展和农民增收的主导产业，因此，针对核桃枝枯病为研究对象，迫切需要开发一批生防作用优良的菌株，用于核桃枝枯病的生物防治。
发明内容
本发明的目的是提供一种对核桃枝枯病病菌(Juglanconis juglandina)具有较好抑菌能力的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是从新疆维吾尔自治区采集的胡杨腐烂病病害标本中分离得到，命名为QB002。经形态学特征、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析，明确该拮抗菌株QB002为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。该菌株已于2019年7月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏号为CGMCC No.18218。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002的微生物学特性为：菌株QB002在NA培养基上培养24h后，单菌落呈淡黄色、形状不规则、中间有褶皱，不透明，质地湿润，表面不光滑。革兰氏染色呈现紫色，为革兰氏阳性菌，显微观察菌体为短杆状。
生理生化特性表明菌株为革兰氏阳性厌氧菌；可以对D-松二糖、D-水苏糖等23种碳源进行利用；接触酶试验呈阳性；苯丙氨酸酶试验、酪氨酸酶试验及反硝酸还原试验呈阴性；
本发明提供含有该枯草芽孢杆菌QB002的菌剂。
枯草芽孢杆菌QB002的发酵产物属于本发明的保护范围。
本发明提供了含有所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002或其发酵产物的菌剂。所述菌剂为单一菌的菌剂，也可为复合菌的菌剂。
本发明提供了含有所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002或其发酵产物的药物。
所述药物为抑制核桃枝枯病菌(Juglanconis juglandina)、苹果腐烂病菌(Cytospora salicicola，Cytospora mali)、枣果黑斑病菌(Alternaria alternata)和李褐腐病菌(Monilinia fructicola)的药物。
本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002、其发酵产物或含有其的菌剂、药物在控制植物病害中的应用。
本发明所述植物包括但不限于核桃、新疆杨，箭杆杨，胡杨，柳树，苹果，桦树，沙枣或葡萄。
本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002、其发酵产物或含有其的菌剂、药物在防治核桃枝枯病菌(Juglanconis juglandina)、苹果腐烂病菌(Cytospora salicicola，Cytospora mali)、枣果黑斑病菌(Alternaria alternata)和李褐腐病菌(Monilinia fructicola)中的应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌QB002能够抑制核桃枝枯病菌菌丝生长，致使菌丝畸形、扭曲，产生多个分支，平板划线法测定其对核桃枝枯病的抑制率为88.6％，对核桃枝枯病菌(Juglanconis juglandina)、苹果腐烂病(Cytospora salicicola，Cytospora mali)、枣果黑斑病(Alternaria alternata)、李褐腐病(Monilinia fructicola)都有一定抑制作用，具有广谱抑菌能力；本发明提供的枯草芽孢杆菌QB002对核桃枝枯病具有良好的生防潜力，可用于防治核桃枝枯病，具有无污染，无残留，生物环保等特点，在植物病害的防控方面具有显著的效果。
附图说明
图1为核桃枝枯病田间危害症状，A图显示受害枝干，B图显示受害叶片，C图显示受害果实。
图2的A图为菌株QB002菌落形态，B图为QB002菌革兰氏染色，显示为紫色。
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002的系统发育树。
图4为实施例1菌株QB002对不同病菌的抑菌效果图，其中A图为受QB002抑制的核桃枝枯病菌(Juglanconis juglandina)的菌落形态；B图为正常生长的核桃枝枯病菌(Juglanconis juglandina)菌落形态；C图为受QB002抑制的苹果腐烂病菌(Cytosporamali)的菌落形态；D图为正常生长的苹果腐烂病菌(Cytospora mali)的菌落形态；E图为受QB002抑制的苹果腐烂病菌(Cytospora salicicola)的菌落形态；F图为正常生长的苹果腐烂病菌(Cytospora salicicola)的菌落形态；G图为受QB002抑制的枣果黑斑病菌(Alternaria alternata)的菌落形态；H为正常生长的枣果黑斑病菌(Alternariaalternata)的菌落形态；I图为受QB002抑制的李褐腐病菌(Monilinia fructicola)的菌落形态；J图为正常生长的李褐腐病菌(Monilinia fructicola)的菌落形态。
图5为显微镜下观察枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002对病原菌Juglanconis juglandina菌丝的影响，左图为受QB002抑制后的Juglanconis juglandina的菌丝，右图为正常病原菌Juglanconis juglandina的菌丝。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的核桃枝枯病病原菌(Juglanconis juglandina)由新疆农业大学林学与园艺学院病理实验室提供，分离自新疆伊犁巩留县野核桃受害组织，编号1429。
实施例中，核桃枝枯病病原菌的培养和平板对峙实验采用PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖14g、琼脂12g、水1000mL、pH值自然。
细菌培养采用NA培养基：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨10g、NaCl 5g，琼脂15g、蒸馏水补至1000mL、pH值7.0±0.1。
拮抗细菌发酵液采用NB培养基：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨10g、NaCl5g、蒸馏水补至1000mL，pH值7.0±0.1。
实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002的分离与鉴定
1、拮抗细菌的分离
在新疆不同地区采集病害标本，利用组织分离法分离出细菌菌株，挑取培养形状不同的单菌落平板划线在NA培养基上，28℃恒温培养24h后，对菌落大小、色泽、表面光滑度及边缘形状等进行观察记录，挑取单菌落4℃保存备用。
2、拮抗细菌的种类鉴定
2.1菌体形态观察及Biolog分析鉴定
观察QB002菌株的培养形态和革兰氏染色。菌株QB002在NA培养基上培养24h后，单菌落呈淡黄色、形状不规则、中间有褶皱，不透明，质地湿润，表面不光滑。革兰氏染色呈现紫色，为革兰氏阳性菌，菌体为短杆状(图2)。
生理生化特征表明菌株QB002为革兰氏阳性厌氧菌；可以对D-松二糖、D-水苏糖等23种碳源进行利用(表1)；接触酶试验呈阳性；苯丙氨酸酶试验、酪氨酸酶试验及反硝酸还原试验呈阴性。
根据Biolog全自动鉴定仪的规定程序对目的菌株进行鉴定。使用GP培养板将不同反应的数据与已知模式菌株的资料对照。筛选出Biolog自动鉴定系统数据库对比结果中可能性(Probability)和相似性(Similarity)较高的种类，最终将菌株QB002鉴定为Bacillussubtilis。
表1菌株QB002对95种碳源利用情况
注:“+”.阳性；“－”.阴性；“b”.居于阳性阴性之间。
Note:“+”.Positive；“－”.Negative；“b”.Intermediate.
2.2拮抗菌株的16S rDNA分子鉴定
通过水煮法提取细菌总基因组DNA。
16S rDNA的扩增及测序：根据细菌16S rDNA的保守区，设计PCR引物。采用细菌的通用引物63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1387R(5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′，其中W为兼并碱基A或T)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系(50μL)：模板DNA2.5μL，引物各2.5μL，dNTP 4μL，10×Buffer 5μL，Taq聚合酶0.5μL，ddH2O补足50μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；95℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。取2μL PCR产物用1％琼脂糖电泳(120V/25min)检测PCR产物。目标片段由上海生物技术工程有限公司测序。将测序结果在GenBank网站上进行BLAST同源序列比对，用MEGA 6.0软件中的NJ(邻接法)法构建系统发育树，应用自展法(bootstrap)检验系统树，自展数据集为1000次。以Amphibacillus xylanus作为外群。
测序得到的序列在NCBI进行Blast比对，结果显示，菌株QB002与B.subtilis亲缘关系相近，同源性为100％，在基于邻接法构建的系统发育树上显示：菌株QB002与B.subtilis聚在同一分支且具有较高的支持率(99％)(图3)，综合菌株的形态学和培养特征、碳源利用情况及分子系统发育树最终确定菌株QB002为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。
上述实验结果表明，菌株QB002为枯草芽孢杆菌。该菌株已于2019年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏号为CGMCC No.18218。
实施例2枯草芽孢杆菌QB002对核桃枝枯病的生长抑制作用
采用平板对峙培养法测定菌株QB002对核桃枝枯病菌的抑制作用。打取直径为5mm的纯化培养的病原菌菌饼，置于PDA平板中央。将菌株QB002在NA培养基上进行活化，恒温培养24h，挑取单菌落在距离病原菌2cm处划线，以只接病原菌作为对照，每处理3次重复。28℃恒温培养，待对照菌落长满平板时观察、测量抑菌带宽度及病菌生长直径，计算菌落生长抑制率，并筛选出拮抗效果最佳的细菌。
经平板对峙法从5株拮抗细菌中筛选得到1株对核桃枝枯病菌(Juglanconisjuglandina)拮抗效果最好的菌株QB002(图4)，其对病原菌菌丝生长的抑制率达88.6％。
实施例3枯草芽孢杆菌QB002抑菌机理的初步研究
拮抗菌株QB002活性物质对核桃枝枯病菌(Juglanconis juglandina)菌丝的抑制作用采用平板对峙法，在PDA平板中央接入直径为5mm的病原菌菌饼，在距平板中心1cm的四周放置无菌盖玻片，菌丝生长后，将细菌QB002划线在距离盖玻片1cm处，30℃培养3d。以只接病菌的菌丝为对照，光学显微镜下观察拮抗细菌QB002活性产物对病菌菌丝形态的影响。结果表明，拮抗细菌对核桃枝枯病病菌生长的抑制率达到88.6％。受拮抗细菌抑制后的病菌(Juglanconis juglandina)菌丝表现出异常，最为典型的特征是菌丝扭曲、畸形，产生多个分支(图5的左图)。
实施例4枯草芽孢杆菌QB002的抑菌谱测定
以苹果腐烂病、枣果黑斑病、李褐腐病为供试病菌，采用平板对峙法，以不接拮抗细菌QB002为对照，每个处理3个重复，于28℃下恒温培养，待对照菌落长满平板时测量受拮抗菌抑制后的病菌菌落的生长直径，计算抑菌百分率。结果表明，菌株QB002不仅对核桃枝枯病菌1429-1有抑制作用，而且对苹果腐烂病、枣果黑斑病、李褐腐病都有一定抑制作用，表现出抑菌广谱性(图4)，病原菌生长抑制率如表2所示。
表2菌株QB002对不同病菌的抑菌结果
上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是可行的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 新疆农业大学
<120> 一株核桃枝枯病拮抗细菌及其应用
<130> KHP181118922.3
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggcctaac acatgcaagt c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggcggwgtg tacaaggc 18
Claims (9)
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002，保藏编号为CGMCC NO.18218。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002的发酵产物。
3.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002或其发酵产物的菌剂。
4.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002或其发酵产物的药物。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，所述的药物为对核桃枝枯病菌(Juglanconisjuglandina)、苹果腐烂病菌(Cytospora salicicola，Cytospora mali)、枣果黑斑病菌(Alternaria alternata)、李褐腐病菌(Monilinia fructicola)均具有抑菌效果的药物。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002、其发酵产物或含有其的菌剂、药物在控制或防治植物病害中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为核桃、新疆杨，箭杆杨，胡杨，柳树，苹果，桦树，沙枣或葡萄。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为核桃枝枯病(Juglanconisjuglandina)、苹果腐烂病(Cytospora salicicola，Cytospora mali)、枣果黑斑病(Alternaria alternata)和李褐腐病(Monilinia fructicola)。
9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QB002、其发酵产物或含有其的菌剂、药物在抑制核桃枝枯病(Juglanconis juglandina)病菌、苹果腐烂病(Cytosporasalicicola，Cytospora mali)病菌、枣果黑斑病(Alternaria alternata)病菌、李褐腐病(Monilinia fructicola)病菌中的应用。
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