CN110392735A - 胰腺祖细胞的维持和扩增 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及培养胰腺祖细胞的方法。所述方法包括使所述细胞与表皮生长因子(EGF)、视黄酸(RA)和转化生长因子β(TGF‑β)抑制剂和3T3‑J2饲养细胞接触。还提供了通过本发明的方法产生的细胞和当在该方法中使用时的试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月17日递交的新加坡申请No.10201700390Q的优先权的权益，为了所有目的将其内容在此通过引用全部并入。
发明领域
本发明是生物技术领域。特别地，本发明涉及培养胰腺祖细胞的方法。本发明还涉及培养基以及用于进行本文描述的方法的试剂盒。
发明背景
成人的胰腺包含三个主要的谱系：内分泌谱系、腺泡谱系和导管谱系。内分泌区位于朗格汉斯岛，且由分泌维持血糖正常所需激素的细胞组成，所述细胞包括分泌胰高血糖素的细胞和分泌胰岛素的β细胞且其失能导致糖尿病。腺泡细胞产生消化酶，并与导管细胞一起形成外分泌胰腺。人类胰腺的发育始于在卡内基阶段(CS)12背侧和腹侧胰芽从前肠后部的出现。这些基本(rudimentary)结构由多能胰腺祖细胞组成，该多能胰腺祖细胞广泛增殖并经历分枝形态发生，然后融合形成胰腺原基。在一系列细胞命运决定事件和形态学变化之后，三种主要的胰腺谱系中的每一种都从这些祖细胞获得。
在小鼠中的一系列遗传研究导致鉴定了许多调节胰腺发育的信号传导途径，从而激发了对用于从人多能干细胞产生胰腺祖细胞和随后的β样细胞的方案的开发。这些研究的最终目标是产生能够维持血糖正常并减轻糖尿病的功能性β细胞。然而，这些方案在技术上有挑战性且进行起来昂贵，通常导致低分化效率，部分地由于寻求概括β细胞的整个发育史的长的多步骤分化方案中固有的可变性。当将这些方案应用于遗传多样性胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)时，这些问题恶化。因此，需要开发多能性细胞的替代物作为胰腺细胞的来源，该来源克服或至少改善上述一种或更多种缺点。还需要开发支持这些替代物的长期自我更新的方法和培养条件。
概述
在一个方面，提供了培养胰腺祖细胞的方法，包括使所述细胞与以下接触：a.表皮生长因子(EGF)；b.视黄酸(RA)；c.转化生长因子-β(TGF-β)信号传导抑制剂；和d.3T3-J2成纤维细胞饲养细胞。
在一个方面，提供了根据本文所述方法产生的细胞。
在一个方面，提供了当在本文所述方法中使用时的试剂盒，其包含细胞培养基的一个或更多个容器，以及使用说明书。
定义
如本文所用，术语“祖细胞”是指具有更大发育潜力的细胞，即相对于其可通过分化产生的细胞更原始(例如，处于沿发育途径或演变更早的步骤)的细胞表型。通常，祖细胞具有显著的或非常高的增殖潜力。祖细胞可以产生具有较低发育潜力的多种不同细胞，即分化的细胞类型，或产生单一的分化细胞类型，这取决于发育途径和细胞发育和分化的环境。术语“胰腺祖细胞”是指可以产生胰腺谱系的多种不同细胞的细胞。应理解，与多能干细胞相比，胰腺祖细胞在发育上更接近特化的胰腺细胞。通常应理解，胰腺祖细胞可以使用本领域已知的各种各样的方法获得。在一个实例中，可以根据实验程序部分中描述的方法产生胰腺祖细胞。
如本文所用，饲养细胞语境中的“3T3-J2”是指按照Rheinwald JG，Green HRheinwald JG,Green H.Serial cultivation of strains of human epidermalkeratinocytes:the formation of keratinizing colonies from singlecells.Cell.1975年11月；6(3):331-43和Allen-Hoffmann BL,Rheinwald JG.Polycyclicaromatic hydrocarbon mutagenesis of human epidermal keratinocytes inculture.Proc Natl Acad Sci U S A.1984Dec；81(24):7802-6描述所获得的小鼠胚胎成纤维细胞系。
如本文所用，在信号传导语境中的术语“抑制剂”是指干扰信号传导途径的活性的分子或化合物。抑制剂可以干扰信号传导途径、其受体或下游效应物的一个或更多个成员。抑制剂可以结合信号传导途径、受体或下游效应物的一个或多个成员以抑制生物学功能。
如本文所用，措词“培养基”是指用于支持细胞生长的液体物质。根据一些实施方案，本发明使用的培养基可以是基于液体的介质，例如水，其可以包含物质诸如盐、营养成分、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质例如细胞因子、生长因子和激素的组合。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎胚泡的内细胞团中的天然存在的多能干细胞。这些细胞可以类似地从源自体细胞核转移的胚泡的内细胞团获得。胚胎干细胞是多能的，并且在发育过程中产生三个主要胚层：外胚层，内胚层和中胚层的所有衍生物。换句话说，当对特定细胞类型给予足够和必要的刺激时，它们可以发育成成人人体的多于200种细胞类型中的每一种。它们对胚外膜或胎盘没有贡献，即不是全能性的。
如本文所用，术语“诱导的多能干细胞”或iPSC意指，干细胞由已被诱导或改变(即被重新编程为能够分化成所有三个胚层或皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞)的分化的成体细胞产生。产生的iPSC是指非天然存在的细胞。
如本文所用，术语“分化”是未特化的(“不受约束的(uncommitted)”)或特化较差的细胞获得特化细胞例如神经细胞或肌细胞的特征的过程。分化的细胞或分化诱导的细胞是在细胞谱系中具有更具体的(“受约束的(committed)”)位置的细胞。术语“受约束的(committed)”当应用于分化过程时是指已在分化途径中行进到一个点的细胞，在该点，在正常情况下，它将继续分化成特定细胞类型或细胞类型的子集，并且在正常情况下，它不能分化成不同的细胞类型或恢复到分化程度较低的细胞类型。去分化是指细胞恢复到细胞谱系内特化(或受约束)较差的位置的过程。如本文所用，细胞的谱系定义细胞的遗传性，即它来自哪些细胞以及它可以产生什么细胞。细胞的谱系将细胞置于发育和分化的遗传时程之内。谱系特异性标志物是指与感兴趣谱系的细胞的表型特异性相关的特征，并且可用于评估不受约束的细胞向感兴趣谱系的分化。
贯穿本公开内容，某些实施方案可以以范围形式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所公开范围的范围的不容变更的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独的数值。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述具有特别公开的子范围，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的独单独的数，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
可选的实施方案的公开
在描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这些实施方案可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是意在是限制性的，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，因为应理解，修改和变化包含在本公开内容的精神和范围内。
本公开内容和实施方案涉及支持长期自我更新的培养胰腺祖细胞的方法。特别地，本发明提供了维持和扩增培养物中的胰腺祖细胞的因子的特定组合的知识。
因此，本发明提供了培养胰腺祖细胞的方法，包括使所述细胞与以下接触：a.表皮生长因子(EGF)；b.视黄酸(RA)；c.转化生长因子-β(TGF-β)信号传导抑制剂；和d.3T3-J2成纤维细胞饲养细胞。
在一个实施方案中，转化生长因子-β(TGF-β)信号传导抑制剂可以是激活素受体样激酶(ALK)的抑制剂。通常应理解，存在七种鉴定的ALK。ALK抑制剂可以抑制ALK1至ALK7中的一种或更多种。有利地，ALK抑制剂可以抑制ALK4、ALK5或ALK7中的一种或更多种。
在一个实施方案中，ALK抑制剂可以是小分子。在优选的实施方案中，ALK的抑制剂可以是SB431542。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以进一步与一种或更多种细胞培养补充物接触。细胞培养补充剂可用于替代细胞培养基中的血清并改善细胞活力和在培养物中的生长。在优选的实施方案中，胰腺祖细胞进一步与B27补充物接触。通常应理解，也可使用其他细胞培养补充剂或血清替代物。细胞培养补充剂的实例包括但不限于2-巯基乙醇、氨基酸溶液、牛血清白蛋白、胆固醇补充剂、CHO补充剂、谷氨酰胺、GlutaMax、原代细胞补充剂、HAT补充剂、HT补充剂、胰岛素、脂质补充剂、MEM维生素溶液、pluronic F68、血清替代品、丙酮酸钠、干细胞补充剂、转铁蛋白、酵母溶液、ITS-X补充剂、N2补充剂和G5补充剂。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以进一步与Notch信号传导抑制剂接触。在优选的实施方案中，Notch信号传导抑制剂可以是γ-分泌酶抑制剂。γ-分泌酶抑制剂的实例包括但不限于DAPT、RO4929097、司马西特(Semagacestat)、化合物E、γ-分泌酶抑制剂III、(R)-氟比洛芬、γ-分泌酶抑制剂I、BMS-708163、BMS 299897、γ-分泌酶抑制剂XI、JLK6、化合物W、MK-0752，二苯并氮卓(Dibenzazepine)、LY411575、PF-03084014、L-685,458、γ-分泌酶抑制剂VII、化合物34、γ-分泌酶抑制剂XVI。
在另外的优选的实施方案中，γ-分泌酶抑制剂可以是DAPT。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞可进一步与地塞米松、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、N2补充物或其组合接触。
表皮生长因子(EGF)可以以约1ng/mL至约200ng/mL、或约5ng/mL至约195ng/mL、或约10ng/mL至约190ng/mL、或约15ng/mL至约185ng/mL、或约20ng/mL至约180ng/mL、或约25ng/mL至约175ng/mL，或约30ng/mL至约170ng/mL、或约35ng/mL至约165ng/mL、或40ng/mL至约160ng/mL、或约45ng/mL至约155ng/mL、或约50ng/mL至约150ng/mL、或约55ng/mL至约145ng/mL、或约60ng/mL至约140ng/mL、或约65ng/mL至约135ng/mL、或约70ng/mL至约130ng/mL、或约75ng/mL至约125ng/mL、或约80ng/mL至约120ng/mL或约85ng/mL至约115ng/mL、或约90ng/mL至约110ng/mL、或约95ng/mL至约105ng/mL、或约95ng/mL至约100ng/mL的量使用。
在一个优选的实施方案中，EGF可以以约50ng/mL的量使用。
成纤维细胞生长因子10(FGF10)可以以约1ng/mL至约200ng/mL、或约5ng/mL至约195ng/mL、或约10ng/mL至约190ng/mL、或约15ng/mL至约185ng/mL、或约20ng/mL至约180ng/mL、或约25ng/mL至约175ng/mL、或约30ng/mL至约170ng/mL、或约35ng/mL至约165ng/mL、或40ng/mL至约160ng/mL、或约45ng/mL至约155ng/mL、或约50ng/mL至约150ng/mL、或约55ng/mL至约145ng/mL、或约60ng/mL至约140ng/mL、或约65ng/mL至约135ng/mL、或约70ng/mL至约130ng/mL、或约75ng/mL至约125ng/mL、或约80ng/mL至约120ng/mL、或约85ng/mL至约115ng/mL、或约90ng/mL至约110ng/mL、或约95ng/mL至约105ng/mL、或约95ng/mL至约100ng/mL的量使用。
在一个优选的实施方案中，FGF10可以以约50ng/mL的量使用。
视黄酸(RA)可以以约100nM至约10μM，或约200nM至约9μM，或约300nM至约8μM，或约400nM至约7μM，或约500nM至约6μM、或约600nM至约5μM、或约700nM至约4μM、或约700nM至约3μM、或约800nM至约2μM、或约900nM至约1μM的量使用。
在优选的实施方案中，RA可以以约3μM的量使用。
地塞米松可以以约1nM至约100nM、或约5nM至约95nM、或约10nM至约90nM、或约15nM至约85nM、或约20nM至约80nM、或约25nM至约75nM、或约30nM至约70nM、或约35nM至约65nM，或40nM至约60nM，或从约45nM到约55nM的量使用。
在优选的实施方案中，地塞米松可以以约30nM的量使用。
DAPT可以以约100nM至约10μM、或约200nM至约9μM、或约300nM至约8μM、或约400nM至约7μM、或约500nM至约6μM、或600nM至约5μM、或约700nM至约4μM、或约700nM至约3μM、或约800nM至约2μM、或从约900nM到约1μM的量使用。
在一个优选的实施方案中，DAPT可以以约1μM的量使用。
SB431542可以以约1μM至约100μM、或约5μM至约95μM、或约10μM至约90μM、或约15μM至约85μM、或约20μM至约80μM、或约25μM至约75μM、或约30μM至约70μM、或约35μM至约65μM、或约40μM至约60μM、或约45μM至约55μM、或约50μM的量使用。
在优选的实施方案中，SB431542可以以约10μM的量使用。
关于细胞培养补充剂，通常应理解细胞培养补充剂可以浓缩形式(例如10x，50x或100x)获得。因此，应理解细胞培养补充物可被稀释并以约1x、2x、3x、4x或5x的终浓度使用。
在一个优选的实施方案中，N27和B27可以以1x的终浓度使用。
因此，在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以与约1ng/ml至约100ng/ml的EGF、约100nM至约10μM的RA和约1μM至约100μM的SB431542接触。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以与约1ng/ml至约100ng/ml的EGF、约1ng/ml至约100ng/ml的FGF10、约100nM至约10μM RA、约1nM至约100nM的地塞米松、约100nM至约10μMDAPT、约1μM至约100μM的SB431542、约1x B27补充和大约1x N2补充剂接触。
在一个优选的实施方案中，胰腺祖细胞与约50ng/mL EGF、约50ng/ml FGF10、约3μM RA、约30nM地塞米松、约1μM DAPT、约10μM SB431542、约1x B27补充物和约1x N2补充剂接触。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以是胰腺祖细胞群。胰腺祖细胞群可以是基本上同质的(homogeneous)。如本文所用的基本上同质的意指群体中的大多数细胞是胰腺祖细胞。
胰腺祖细胞群可以是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％同质的。在优选的实施方案中，胰腺祖细胞群是超过99％同质的。
本发明的方法允许胰腺祖细胞的长期培养。在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以持续培养至少5代、至少10代、至少15代、至少20代或至少30代。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以源自干细胞。干细胞可以是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以表达内胚层和胰腺谱系的标志物。在一个实施方案中，胰腺祖细胞可以表达PDX1、SOX9、HNF6、FOXA2和GATA6中的一种或更多种。在另一个实施方案中，胰腺祖细胞可以不表达SOX2。
在一个实施方案中，培养胰腺祖细胞的方法阻止胰腺祖细胞的分化。在另一个实施方案中，培养胰腺祖细胞的方法促进胰腺祖细胞的增殖。
在本发明的另一个方面，提供了通过本发明的方法产生的细胞。
在本发明的另一个方面，提供了当在本发明的方法中使用时的试剂盒，其包含细胞培养基的一个或更多个容器。细胞培养基的组分可以单独或组合地提供在一个或更多个容器中。在一个实施方案中，试剂盒还包含3T3-J2饲养细胞。
本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一个或多个要素、限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包括”、“含有”等应当被广泛地理解而不受限制。另外，这里使用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制性的术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但应认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的本发明的修改和变化形式，并且这些修改和变化是被认为是在本发明的范围内。
本文已广泛和一般地描述了本发明。落入一般公开内容中的每个较窄物种和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括本发明中涉及附带条件或否定限制以从该属中去除任何主题的一般性描述，无论是否在本文中具体叙述了去除的内容。
其他实施方案在本发明的权利要求和非限制性实施例内。另外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式进行了描述。
附图简要说明
参考详细描述、结合非限制性示例和附图考虑时，本发明将被更好地理解，其中：
图1显示了来自糖尿病和健康兄弟姐妹的成纤维细胞的hiPSC细胞系的产生。图1A显示了几个糖尿病兄弟姐妹的同血缘的约旦人家庭的家谱。所有糖尿病兄弟姐妹在5周岁之前就发展了这种疾病。取自个体AK5和AK6的皮肤活组织检查用于产生成纤维细胞，hiPSC从该成纤维细胞获得。图1B显示了OCT4表达的细胞内流式细胞术分析，且图1C显示了对于hiPSC克隆AK5-11、AK6-13和AK6-8(未显示)的多能性的公认的标志物的免疫染色。比例尺，100微米。
图2显示了胰腺祖细胞的定向分化和来自不同的人多能干细胞系的培养的胰腺祖细胞(cPP)的产生。图2A显示了胰腺祖细胞分化方案的时间过程。在这些实验中，通过重复最后一天的处理，第1阶段延长至持续3天，而不是根据制造商的说明书持续2天。图2B显示了使用hES3 INS-GFP报告子hESC和内部hiPSC细胞系AK5-11和AK6-8，在分化的第8、10和15天的PDX1和NKX6-1的细胞内流式细胞术分析。在所有情况下，尽管个体的细胞系表现出可变的分化动力学，PDX1在NKX6-1之前被检测到。门控基于用同种型对照抗体染色的细胞。图2C显示了分化第15天PDX1+和/或NKX6-1+的百分比。每个圆圈代表包括2个hESC细胞系和6个hiPSC细胞系的31个独立实验中的一个。垂直黑条显示以下细胞的中位百分比:PDX1+细胞(95％)、NKX6-1+细胞(80％)或PDX1+NKX6-1+细胞(80％)。图2D显示了使用从第6代cPP细胞系收获的样品通过qRT-PCR测量的基因表达。该研究分析了来自以下多能细胞系的cPP细胞：H9和HES3 hESC、以及AK5-11、AK6-8和AK6-13 hiPSC。两个独立的谱系来源于H9和AK5-11细胞系。表达水平显示为相对于H9 hESC的表达水平归一化并以log2分度绘图。误差条表示三次技术重复的标准误差。
图3显示了cPP细胞系从hESC和hiPSC的衍生。图3A显示使用STEMdiff定向分化试剂盒分化15天后产生的胰腺祖细胞(PPd15细胞)被铺板并在补充有所示生长因子和信号传导抑制剂的培养基中的3T3-J2饲养细胞层上扩增。图3B显示了使用H9 hESC在分化的第8、10和15天对PDX1和NKX6-1的细胞内流式细胞术分析。图3C显示了被传代的cPP细胞作为聚集体(左)和单细胞(右)的相衬图像(phase-contrast image)。比例尺，100μm。图3D显示了使用从PPd15细胞和在早期(6-8)、中期(11-13)和晚期(14-18)传代的cPP细胞收获的样品通过qRT-PCR测量的基因表达。细胞衍生自AK6-13 hiPSC和H9 hESC。为了比较目的，显示了定形内胚层(definitive endoderm)(STMdiff分化4天后的H9 hESC)中的基因表达。值以log2分度绘制，且误差条表示三次技术重复的SE。ND，未检测到。图3E显示了cPP细胞的关键胰腺转录因子的免疫荧光染色。比例尺，100μm。图3F显示了cPP细胞的PDX1的细胞内流式细胞术分析。灰点代表用同种型对照抗体染色的对照细胞。cPP细胞的PDX1的细胞内流式细胞术分析。灰点代表用同种型对照抗体染色的对照细胞。
图4显示，染色体计数和M-FISH分析揭示cPP细胞是遗传学上稳定的。图4A显示了来自不同传代数目的不同遗传背景的cPP细胞的染色体计数。显示的值是以给定数量的染色体的分散物(spreads)百分比，突出显示了每个cPP细胞系的模式染色体计数。模式(>80％的细胞共有的)染色体数目46指示正常核型和核型稳定性。分析的6个cPP细胞系中的5个在>6次传代后显示模式染色体计数为46，而没有片段或双着丝粒染色体的迹象，并且这5个细胞系被认为是核型稳定的。在H9谱系#1中，细胞在传代时逐渐获得另外的等臂染色体。传统的G带核型分析(数据未显示)随后发现这是i(12)(p10)[20]，一种在hESC培养物中通常观察到的等臂染色体。图4B显示，多色荧光原位杂交(M-FISH)使得能够以比单独的染色体计数显著更高的分辨率检测染色体结构异常。第20代AK6-13cPP细胞的M-FISH未能在被分析的20个分散物中的19个分散物中检测到非整倍性、易位或缺失。显示了单个染色体分散的代表性图像。
图5显示了RNA-seq对cPP细胞的转录组分析。图5A显示了来自在早期(6-8)、中期(11-13)和晚期(18)传代的三种不同遗传背景(H9、AK6-13和HES3)的cPP细胞的基因表达水平之间的关联。针对每种基因绘制通过RNA-seq测量的Log2转化的基因计数。对于比较，将cPP样品中的基因计数与肝脏进行比较。每对样品的Spearman相关系数显示在相应的图上。热色(heat color)表示转录物的数量。无论遗传背景或传代次数如何，cPP样本之间的基因计数强烈相关，但并不与肝脏强烈相关。图5B显示了肝脏、肺和结肠样品中特异性表达的基因的鉴定。发现与早期胰腺发育相关的基因通常不被这些组织特异性表达。图5C显示了cPP、PPd15、CS16-18PP和肝脏样品的Z-得分相关性。Z-得分在体外和体内胰腺祖细胞样品之间强烈相关，但在这些样品和肝脏之间并不强烈相关。
图6显示了RNA-Seq对cPP细胞的转录组分析。图6A显示，不同成体和胚胎组织的转录组之间的欧氏距离的分级群聚表明，体外和体内胰腺祖细胞表现出相似的基因表达模式。Log2-转化的基因计数值用于计算欧氏距离。关于这里使用的数据来源的详细信息，参见表1。图6B显示了体外和体内胰腺祖细胞的关键内胚层和胰腺标志物的log2-转化的基因表达水平的热图。脑中的水平是为了比较目的而示出。图6C显示了由cPP、PPd15和CS16-18胰腺祖细胞特异性表达的基因。将图6A中所示的遍布25个组织的每个蛋白质编码基因的变异系数(CV)相对于相应的Z得分作图。特异性表达的基因位于右上象限(CV>1且Z得分>1)并且包括在早期胰腺发育中具有被充分表征的作用的基因(标记的)。色度表示基因的数量。维恩图显示由cPP、PPd15和CS16-18胰腺祖细胞特异性表达的基因之间的重叠。图6D显示了与cPP细胞特异性表达的所有基因(上)或cPP细胞特异性表达、但PPd15或CS16-18胰腺祖细胞不表达的基因(下)相关的生物学过程基因本体论(GO)项目。仅显示与>5个基因相关和/或具有调整的p值<0.01的GO项目。图6E显示了与富集的GO项目，有丝分裂重组、DNA链延伸、端粒维持和DNA包装相关的基因表达水平的热图。显示了源自三种不同遗传背景(H9，AK6-13和HES3)的单独的cPP和PPd15群体相对于图6A中所示的跨25种不同组织检测到的最大值的水平。图6F显示了通过qRT-PCR测量的cPP和PPd15细胞中的选择的端粒酶途径基因的表达。误差线代表示三次技术重复的SE。
图7显示cPP细胞的维持和扩增需要一层3T3-饲养细胞和外源信号传导分子。图7A显示H9和AK6-13cPP细胞在以5×104、2.5×104和1.25×104个细胞/cm2的密度铺板的3T3-饲养细胞上在完全培养基中培养7天后的相衬图像。比例尺，100微米。图7B显示了通过qRT-PCR测量的对于从图7A中的培养物收获的样品的内分泌标志物基因(NGN3和NKX2-2)、导管标志物基因(KRT19和CA2)和腺泡标志物基因(CPA1和AMY2B)的基因表达。误差线表示三次技术重复的SE。图7C显示了在省略了不同组分的完全培养基中培养6天的cPP细胞的相衬图像。比例尺，100微米。图7D显示了通过qRT-PCR测量的(C)中收获的样品的PDX1和SOX9表达。误差线表示三次技术重复的SE。图7E显示了繁殖PDX1+SOX9+cPP细胞所需因子的微生物反应器阵列(MBA)筛选。从含有以下水平：EGF(50ng/mL)、RA(3μM)，DAPT(1μM)、SB431542(10μM)和FGF10(50ng/mL)的所有因子的完全培养基中减少或去除选定因子(EGF、RA、DAPT)的影响。上图：对每个腔室的总核、PDX1和SOX9平均核强度的影响。下图：对每个室的PDX1+SOX9+细胞总数和PDX1+SOX9+细胞百分比的影响。数据表示用给定条件处理的柱内10个腔室的平均值±SE。图7F显示了调节cPP增殖的信号传导途径的组分的RNA-seq表达水平的热图：EGF(EGFR)、FGF10(FGFR1-4、FGFR6和FGFRL2)、RA(RARA、RARB、RARG、RXRA、RXRB和RXRG)、SB431542(ACVR1B[ALK4]、TGFBR1[ALK5]和ACVR1C[ALK7])和DAPT(NOTCH1-4及其配体DLL1、DLL3、DLL4和JAG1、JAG2)。水平相对于跨在图6A中所示的所有25个组织中观察到的水平显示。
图8显示了繁殖cPP细胞所需因子的微生物反应器阵列(MBA)筛选。图8A显示接种到基质胶(Matrixgel)包被的MBA中的PDX1+SOX9+cPP细胞的相衬图像，并允许在定期进饲的情况下粘附20小时。每个MBA设备具有按S4D所示布置的270个腔室。比例尺，100微米。图8B显示了用于MBA筛选的方案。图8C显示用抗PDX1(绿色)和抗SOX9(红色)抗体染色的MBA装置(270个培养腔室)的独立的腔室。Hoechst 33342(未显示)用于细胞核鉴定。腔室被选择为显示在不同信号传导环境中观察到的增殖速率和蛋白表达的范围。比例尺，100微米。图8D示出了MBA中每个腔室的终点测量值。顶部的示意图显示了应用于MBA的每个列的培养基的组成(EGF，ng/mL；RA，μM；DAPT，μM)。细胞培养基顺着列从顶部(第1行)到底部(第10行)向下流动，从而自分泌因子被朝着列的底部浓缩。每列的平均测量值如下。QCF：标记图像处理期间的质量控制问题的数据。使用如以前描述的图像分割算法从诸如S4C中的那些图像中提取值。
图9显示了体外和体内cPP效力的测试。图9A显示饲养细胞耗尽的第15代H9 cPP细胞被重铺在基质胶(Matrigel)上并暴露于指示的因子，这些因子促进朝向内分泌、管道和腺泡谱系的多谱系分化。图9B显示了在3天、6天和12天后图9A中的内分泌、外分泌和导管基因表达分析。值相对于未分化的cPP细胞中的水平(第0天)显示。误差线表示三次技术重复的SE。图9C显示使用修订版本的Russ et al.(2015)将第10代AK6-13cPP细胞定向分化为胰岛素+b样细胞。图9D显示了在4天后经历分枝形态发生的分化球的相衬图像。比例尺，100μm。图9E表明，第4天细胞的细胞内流式细胞术分析显示约70％重新激活NKX6-1并维持PDX1。图9F显示第4天的PDX1和NKX6-1免疫染色。比例尺，100μm。图9G显示在第9天，大多数细胞是NKX2-2+，这些细胞中的一部分短暂地是NGN3+。比例尺，100μm。图9H显示了球体第16天的相衬图像。比例尺，100μm。图9I显示在第16天大约20％的细胞是C-肽+。图9J显示第16天C-肽+细胞不共表达胰高血糖素。比例尺，100μm。图9K显示了通过qRT-PCR测量的从图9C的分化方案收获的cPP细胞在第4、9和16天的基因表达。水平相对于未分化的cPP细胞和人胰岛中的水平显示用于比较目的。误差线表示三次技术重复的SE。图9L显示了移植的cPP细胞的内分泌(C-肽和胰高血糖素)、导管(角蛋白-19)和腺泡(胰蛋白酶)谱系标志物的免疫染色。比例尺，100μm。
图10显示了cPP的β细胞分化的优化。图10A显示了已发表的β细胞分化方案的NKX6-1诱导步骤对cPP细胞的应用。基于已发表的β细胞分化方案，该研究在完全cPP培养基中建立2D-单层、3D-基质胶和3D-悬浮培养物，然后将细胞暴露于生长因子方案。在每次治疗结束时拍摄相衬图像。比例尺，100μm。图10B显示了使用图10A中收获的样品通过qRT-PCR测量的基因表达。当使用3D基质胶平台将细胞暴露于Rezania和Pagliuca分化方案时，无法回收足以进行qRT-PCR分析的材料。误差线表示三次技术重复的标准误差。图10C显示了对Russ等人的分化方案的NKX6-1诱导步骤的优化。使用3D悬浮平台进行差异化。改变两种生长因子处理的时长以使重新激活NKX6-1表达的细胞的百分比最大化。通过细胞内流式细胞术分析测量PDX1和NKX6-1。显示了每种条件的三个独立实验。图10D显示了图10C中产生的PDX1+NKX6-1+细胞百分比。
实验部分
将通过参考具体实施例更详细地进一步描述本发明的非限制性实施例和对比实施例，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实验程序
人多能干细胞的培养和分化
在该研究中使用以下hESC细胞系：H9(WA09)购自WiCell，HES3(ES03)购自ES CellInternational Pte.Ltd.，而HES-3INSGFP/W报告细胞系是Stanley实验室的馈赠(Micallef等，2011)。本研究中使用的hiPSC细胞系内部地来源于人成纤维细胞，并命名为AK5-11、AK6-8和AK6-13(图1)。如前所述，将多能干细胞维持在包被有基质胶的组织培养塑料容器的mTeSR1培养基中，并使用STEMdiff胰腺祖细胞试剂盒(STEMCELL Technologies，05120)根据制造商的说明进行胰腺祖细胞的分化，具有以下修改：(1)细胞最初以106细胞/孔的密度接种到12孔板(Corning，353043)中，和(2)通过重复最后一天的处理将第1阶段延长至3天。所有组织培养均在37℃在5％CO2中进行。
hiPSC的产生
通过穿刺皮肤活组织检查获得成纤维细胞并重新编程以产生hiPSC。使用CytoTune TM-iPS 2.0Sendai重新编程试剂盒(Thermo Fisher Scientific，A16517)按照制造商的说明对成纤维细胞进行重新编程。在病毒转染后7天，将细胞传代并铺板在经辐照的小鼠胚胎饲养细胞上。此后，挑选17-28天之间的hiPSC克隆并维持在补充有以下的DMEM/F12(Sigma，D6421)中：20％Knock Out血清替代物(Thermo Fisher Scientific，10828-028)、0.1mM 2-巯基乙醇(Thermo Fisher Scientific，21985-023)、2mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific，25030)、0.2mM NEAA(Thermo Fisher Scientific，11140-050)和5ng/mL bFGF(Peprotech，100-18B)。使用以下抗体的染色确认多能性(图1)：NANOG(R&D Systems，AF1997,1：200)、OCT4(Santa Cruz，111351,1：200)、SOX2(R&D SystemsMAB2018,1：200)、SSEA3(Millipore，MAB4303,1：50)、SSEA4(Millipore，MAB4304,1：200)、TRA-1-81(Millipore，MAB4381,1：200)、TRA-1-60(Millipore，MAB4360,1：200)。通过从驴产生的Alexa-荧光团缀合的二抗(Thermo Fisher Scientific，1：500)识别一抗。该研究方案得到了新加坡国立大学机构审查委员会(NUS IRB 10-051)的批准。该研究是根据Helsinki宣言进行的，并且从参与者获得了书面知情同意书。
培养的胰腺祖细胞(cPP)的传代和维持
使用温和细胞解缔剂(STEMCELL Technologies，07174)将为聚集体的cPP细胞传代，然后将cPP细胞以1：6的分流比(0.5×106至1×106个细胞/cm2)接种到包含以下的培养基中的3T3-J2饲养层上：高级(advanced)DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific，21634010)、2mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific，25030)、100U/mL青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific，15140122)、1xN2补充物(Thermo Fisher Scientific，17502-048)、1x B27补充剂(Thermo Fisher Scientific，17504-044)、30nM地塞米松(STEMCELL Technologies，72092)、50ng/mL EGF(R&D Systems，236-EG-200)、50ng/mLFGF10(Source Bioscience，ABC144)、3μM RA(Sigma，R2625)、10μM SB431542(Calbiochem，616464)和1μM DAPT(Sigma，D5942)。如果铺板接种单个的cPP细胞，则在最初的48小时内向完全培养基补充10μM Y27632(Sigma，Y0503)。每2-3天彻底重新装满培养基。
3T3-J2饲养细胞的扩增
将3T3-J2饲养细胞(第9代)在组织培养塑料容器(用0.1％明胶(Sigma，G2625)包被30分钟)的3T3-J2培养基中扩增，并通过用0.25％胰蛋白酶Thermo Fisher Scientific，25200056)处理5分钟而作为单细胞被传代。3T3-J2培养基包括以下：高葡萄糖DMEM(ThermoFisher Scientific，11960)、10％胎牛血清(ES细胞合格的FBS，Thermo FisherScientific，16141079)、2mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific，25030)和100U/mL青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific，15140122)。通过γ辐射(20戈瑞30分钟)使饲养细胞的有丝分裂失活，然后冷冻在培养基+DMSO中。选择单个批次的FBS以使3T3-J2细胞能够维持cPP培养物，而3T3-J2细胞从未被培养超过12代，并且应以3.5-5×103个细胞/cm2接种并且不允许超过1.3×104个细胞/cm2。
3T3-J2饲养细胞-包被的培养容器的制备
将解冻的3T3-J2细胞以0.5-1×106个细胞/cm2接种到用0.1％明胶(Sigma，G2625)包被30分钟的组织培养板上，并在3T3-J2培养基中维持最多3天直至被需要。每批饲养细胞的最佳铺板密度必须根据经验确定，并且基于保持克隆形态而不显著阻碍生长的能力来评估，这是因为增加饲养细胞密度虽改善克隆形态并阻断分化，但导致增殖速率下降。含有饲养细胞的组织培养容器用DMEM洗涤一次以除去残留的FBS，然后加入cPP培养基。
中期分散物制备、染色体计数和M-FISH核型分析
将生长至～75-80％汇合度的细胞用100ng/ml Colcemid溶液(Gibco，15212012)处理6小时，胰蛋白酶消化并以1000rpm离心10分钟。将细胞沉淀重悬于75mM KCl中并在37℃水浴中孵育15分钟。向细胞加入1/10体积的3：1甲醇/乙酸，接着以1000rpm离心15分钟。然后通过重悬于3：1甲醇/乙酸溶液中固定细胞，在室温孵育30分钟，以1200rpm离心5分钟，并最后用固定剂再洗涤一次。将细胞重悬于少量固定剂中，滴在干净的载玻片上并留置风干。根据制造商的说明书(MetaSystems)进行多色FISH(MFISH)。使用Metafer成像平台(MetaSystem)进行染色体分散物的自动获取。Ikaros和Fiji软件用于确定每次分散的染色体数目并分析M-FISH图像。
基因表达的RNA-Seq分析
使用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN，目录号74104)分离从cPP和PPd15培养物收获的样品中的RNA。在RNA提取之前，使用饲养细胞去除微珠(Miltenyi Biotec，130-095-531)来耗尽cPP细胞的3T3饲养细胞。所有RNA样品的RNA完整指数均>9。使用NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒(NEB，E7530L)产生RNA-seq文库，并在Illumina HiSeq 2500系统上测序，产生100bp的单端读段。表1包含针对这些以及公共数据集的用于RNA-seq基因表达分析的元数据。
表1：用于RNA-seq基因表达分析的元数据
RNA-seq读段比对、基因计数计算和归一化
用SRA-toolkit(v 2.8.0)的fastq-dump功能下载原始fastq文件。该研究用STAR(v2.5.1a)使用基于参考基因组GRCh38和相应的基因注释gtf文件(GRCh38.83)的软掩蔽初级汇编(soft masked primary assembly)的索引映射读段。两者都是从Ensembl FTP站点获得的。读段突出部分设置为99bp，用于索引生成。保留默认的映射参数，具有以下例外：“--outFilterType BySJout”以减少虚假连接(spurious junction)的数量，“--alignSJoverhangMin 10”，对于未注释的连接的最小读段突出部分，“--alignSJDBoverhangMin 1”，对于注释的连接的最小读段突出部分，“--outFilterMatchNminOverLread 0.95”，如果没有找到更好的比对，允许最多5％不匹配的碱基(每对)，“--alignIntronMin 20”以允许短的内含子，“--alignIntronMax 2000000以“设置内含子长度的上限，“--outMultimapperOrder Random”以从最高得分的比对中随机选择初级比对，“--outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonicalUnannotated”以偏向朝向已知转录物的映射，和“--chimSegmentMin 0”以抑制任何嵌合性映射输出。然后，使用R(v3.1.2)中的“Rsubread”(v1.16.1)包中生效的featureCounts共同处理所有样本的映射读段。使用默认设置，具有以下例外：“annot.ext＝GTFfile，isGTFAnnotationFile＝TRUE，GTF.featureType＝'exon'”以使用与STAR索引中相同的gtf注释文件，“useMetaFeatures＝TRUE，GTF.attrType＝'gene'”以概括针对基因水平的计数，“allowMultiOverlap＝TRUE”以允许重叠基因计数，“isPairedEnd”被设置为适合各自的样本，“strandSpecific＝0”因为并非所有的文库都是链特异性的，且最后“countMultiMappingReads＝TRUE”。用edgeR(v3.8.6)中实施的TMM方法使用默认设置对得到的计数表格进行归一化以解释测序深度和计数分布。
生物信息学分析
使用每种组织类型中每种基因的归一化计数进行RNA-seq基因表达分析。如果对其他研究中描述的样品进行技术重复是可用的，则比对这些读段并分别确定基因计数，然后计算平均基因计数。此外，除非另有说明，cPP和PPd15细胞的基因计数是从源自H9和HES3hESC和AK6-13 hiPSC的细胞中收获的三个独立样品的平均值。对于基因表达谱的整体比较，我们比较了60,675个ENSEMBL基因或在至少一个样品中以>5的归一化计数表达的19,875个ENSEMBL蛋白质编码基因(如果指出的话)。除非另有说明，否则所有以下分析均使用基础包在R中进行。
RNA-Seq转录组的分级聚类(图6A)
使用R函数dist()计算多对log2转化的全部基因计数对之间的欧几里德距离，并使用hclust()函数将这些距离绘制为Dendrogram。
热图(图6B、6E和6F)
使用函数heatmap.2()绘制热图。
特异性表达的基因(图6C)
特异性表达的基因定义为具有CV>1(方差系数)和Z-得分>1的基因。CV定义为平均值除以跨所有样品的标准偏差，在这种情况下的所有样品是前面提到的23个已发表的组织数据集加上此处描述的cPP和PPd15基因计数。Z得分定义为感兴趣的样品中的表达与所有样品的平均值之间的差除以跨所有样品的标准偏差。当计算胰腺样品的Z得分时，其他胰腺样品被排除。
基因个体发生分析(图6D)
使用http://www.webgestalt.org/的基因组分析工具试剂盒分析与cPP细胞特异性表达的基因相关的基因个体发生(GO)项目。蛋白质编码基因根据cPP细胞的变异系数和Z得分(参见上文)的乘积排序并选择前250个基因用于富集分析。使用过表征分析(ORA)工具计算生物学过程GO项目跨这250个基因中的倍数富集，使用所有蛋白质编码基因作为参考集，并通过Benjamini-Hochberg多重测试调整相应的p值。根据倍数富集对GO项目进行排序，并且从富集的集合中消除与<5个基因和/或调整的p值>0.01相关的那些GO项目。
多谱系分化
如本文所述的建立单层分化培养物。基础分化培养基由以下组成：高级DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific，21634010)、2.5g/30mL BSA(Sigma，A9418)、2mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher Scientific，25030)、100U/mL青霉素/链霉素(Thermo FisherScientific，15140122)和1x B27补充剂(Thermo Fisher Scientific，17504-044)。补充剂按以下添加：第1-3天(3μMRA[Sigma，R2625]、1μM DAPT[Sigma，D5942]、100μM BNZ[Sigma，B4560])和第4、7和10天(3μM RA、167ng/mL KAAD-环巴胺[Calbiochem，239807])。
体外分化
建立分化培养物
最初，将cPP细胞培养至汇合以消除饲养细胞，然后用温和的细胞解缔试剂处理以产生单细胞。将单细胞重悬于cPP培养基+10μM Y27632中，并根据分化平台接种。为了建立3D球体培养物，将2×106个细胞接种到超低粘附6孔板(Corning，3471)的每个孔的2mL培养基中，并置于章动器(nutator)上过夜。紧实的球体通常在24小时后形成。为了建立3D基质胶培养物，根据制造商的说明使用AggreWell 400板(Stemcell Technologies，27840)产生～200个细胞的球体。24小时后，将～1200个球体重新悬浮于500μL 1：5稀释的hESC合格的基质胶(Corning，354277)中，并沉积到24孔板的每个孔中。将平板在37℃孵育60分钟以使基质胶在添加培养基之前凝固。为了建立2D单层培养物，将细胞以6.65×105个细胞/cm2接种到包被有1:50稀释的基质胶的组织培养塑料容器上。
NKX6-1诱导测试
基于几个最近发表的方案(具有微小的改变)(Pagliuca等人，2014；Rezania等人，2014；Russ等人，2015；Zhang等人，2009)，用以下信号传导方案处理分化培养物。分化培养基1由以下组成：MCDB 131培养基(Thermo Fisher Scientific，10372-01)、2.5g/L碳酸氢钠(Lonza，17-613E)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素/链霉素、10mM葡萄糖(VWRInternational，101174Y)和2％牛血清白蛋白(Sigma，A9418)。分化培养基2由以下组成：高葡萄糖DMEM、2mM L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素/链霉素。基于Pagliuca等人描述的PP2诱导培养基的培养基由补充有以下的分化培养基1组成：50ng/mL FGF7(R&D Systems，251-KG)、0.25mM抗坏血酸(Sigma，A4544)、100nM RA、0.25μM SANT-1(Sigma，S4572)和0.5％ITS-X(Thermo Fisher Scientific，51500056)。每天彻底重新装满培养基，持续5天。基于Rezania等人描述的第4阶段培养基的培养基另外补充有300nM Indolactam-V(StemcellTechnologies，72312)和200nM LDN-193189(Stemcell Technologies，72142)，并且被每天彻底重新装满，持续5天。基于Zhang等人描述的第13-20天培养基的培养基由补充有以下的分化培养基2组成：10ng/mL bFGF、10mM烟酰胺(Sigma，24,020-6)、50ng/mL毒晰外泌肽-4(Sigma，E7144)、10ng/mL BMP4(R&D Systems，314-BP)和1％ITS-X。每天彻底重新装满培养基，持续5天。基于Russ等人描述的第7-9天培养基的培养基由补充有以下的分化培养基2组成：1X B27补充剂、50ng/mL EGF、1μM RA(第一个24小时)和50ng/mL FGF7(第二个24小时)。每天彻底重新装满培养基，持续2天。
β细胞分化
如本文所述建立分化球体培养物。基础分化培养基由高葡萄糖DMEM、2mM L-谷氨酰胺和100U/mL青霉素/链霉素组成。补充剂如下添加：第1-4天(1x B27补充剂、50ng/mLEGF、1μM RA[仅第1-2天]、50ng/mL FGF7[仅第3-4天])；第5-10天(1x B27补充物、500nMLDN-193189[STEMCELL Technologies，72142]、30nM TPB[EMD Millipore，565740]、1μMRepSox[STEMCELL Technologies，72392]、25ng/mL FGF7)；和第11-17天(低葡萄糖DMEM[Thermo Fisher Scientific，12320-032]、2mM L-谷氨酰胺、1x MEM非必需氨基酸[ThermoFisher Scientific，11140-050])。
移植测定
使cPP细胞生长至汇合以置换并消除饲养细胞，然后用温和的细胞解缔试剂处理以产生单细胞。将大约3×106至5×106个细胞重悬于50μL未稀释的基质胶中，并注射到8至12周龄免疫功能不全(NOD/SCID)小鼠的肾囊下。23-27周后，对移植的小鼠实施安乐死，并在切片和免疫染色前将其肾脏冷冻保存。该研究方案经新加坡国立大学机构审查委员会(NUS IRB 12-181)和生物医学研究理事会会IACUC委员会(151040)批准。
定量RT-PCR
使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen，cat#74104)从样品中分离RNA，并使用高容量逆转录试剂盒和随机六聚体引物(Applied Biosystems，4368814,1μg RNA/20μL反应)进行逆转录以产生cDNA。使用SYBR Select Mastermix(Applied Biosystems，4472908)进行定量RT-PCR。使用ΔΔCT方法分析数据，并将其针对每个样品中管家基因TBP的表达归一化。用于qRT-PCR的引物如表2所示。
表2：用于qRT-PCR的引物。
免疫荧光染色
以下一抗用于免疫荧光染色：小鼠单克隆抗PDX1(R&D Systems，MAB2419,1:50)、兔抗SOX9(Sigma，HPA001758，1:2000)、兔抗HNF6(ONECUT1)(Santa Cruz，SC13050，1:100)、山羊抗FOXA2(R&D Systems，AF2400，1:200)、兔抗GATA6(Cell Signaling Technologies，5851，1:1600)、绵羊抗NGN3(R&D Systems，AF3444，1:200)、小鼠抗NKX6-1(发育研究杂交瘤库，F55A12，1:80)、小鼠单克隆抗NKX2-2(BD biosciences，564731，1:400)、小鼠单克隆抗胰岛素原C肽(Millipore，05-1109，1:100)、兔单克隆抗胰高血糖素(Cell SignalingTechnologies，8233，1:400)、大鼠单克隆抗KRT19(发育研究杂交瘤库，TROMA-III-s，1:10)、绵羊抗胰蛋白酶(泛特异性(pan-specific))(R&D Systems，AF3586，1:13)。通过Alexa-荧光团缀合的Donkey中产生的二抗(Thermo Fisher Scientific，1:500)识别一抗。使用Olympus FV1000倒置共聚焦显微镜获取图像。
免疫荧光染色移植的肾脏
解剖小鼠肾脏、清理、纵向切片、包埋在Jung冷冻培养基(Leica，020108926)中，并在液氮中冷冻保存。将切片(6μm)固定在APES包被的玻璃载玻片上、干燥并在室温在4％多聚甲醛中固定10分钟。3次用PBS洗涤15分钟后，用含有0.3％Triton X-100的PBS透化样品10分钟，然后在啮齿动物封闭剂M(Biocare medical，RBM961H)和封闭缓冲液(PBS+20％正常驴血清+1％BSA+0.3％Triton X-100)中封闭1小时。3次用洗涤缓冲液(PBS+0.1％吐温-20+0.1％BSA)洗涤15分钟后，将样品与稀释在封闭缓冲液中的一抗在4℃孵育过夜。3次用洗涤缓冲液洗涤15分钟后，将样品与1：500稀释在封闭缓冲液中的二抗在室温孵育1小时。所有后续步骤均在黑暗中进行。用洗涤缓冲液洗涤1次后，将样品与稀释在PBS中的2μg/mLHoechst-33342(Thermo Fisher Scientific，62249)在室温一起孵育20分钟。最后，3次用洗涤缓冲液洗涤15分钟后，用Vectashield hard set封片剂(Vector Laboratories，H-1400)覆盖样品，盖上盖玻片并密封。
对培养的细胞进行免疫荧光染色
用PBS洗涤粘附的细胞2次，然后在4％多聚甲醛中在室温固定20分钟。用洗涤缓冲液(PBS+0.1％BSA)洗涤3次后，将样品与封闭缓冲液(PBS+20％正常驴血清+0.1％BSA+0.3％Triton X-100)在室温孵育1小时。然后将样品与稀释在封闭缓冲液中的一抗在4℃孵育过夜。3次用洗涤缓冲液洗涤15分钟后，将样品与1：500稀释封闭缓冲液中的二抗在室温孵育1小时。所有后续步骤均在黑暗中进行。3次用洗涤缓冲液洗涤持续15分钟后，将样品与稀释在PBS中的2μg/mL Hoechst-33342(Thermo Fisher Scientific，62249)在室温下一起温育15分钟。最后，将样品用PBS洗涤持续15分钟、2次并成像。
对分化球体进行免疫荧光染色
用PBS+2％血清洗涤分化球体1次，然后在4％多聚甲醛中在室温固定30分钟。用洗涤缓冲液(PBS+0.1％BSA+0.1％Tween-20)洗涤1次，持续15分钟后，将样品在封闭缓冲液中封闭6小时(PBS+20％正常驴血清+1％BSA+0.3％Triton X-100)。然后将样品与稀释在封闭缓冲液中的一抗在4℃孵育过夜。2次用洗涤缓冲液洗涤15分钟后，将样品与1：500稀释在封闭缓冲液中的二抗在4℃孵育6小时。所有后续步骤均在黑暗中进行。用洗涤缓冲液洗涤1次、持续15分钟后，将样品与稀释在PBS中的2μg/mL Hoechst-33342(Thermo FisherScientific，62249)在室温一起孵育1小时。最后，将球体用PBS洗涤2次，持续30分钟，重悬于Vectashield hard set封片剂(Vector Laboratories，H-1400)中，安装在玻璃载玻片上，盖上盖玻片并密封。所有洗涤和孵育步骤均在1.5mL Eppendorf管中进行。
流式细胞术
使用accutase(Thermo Fisher Scientific，14190)产生单细胞，用PBS+1％血清洗涤1次，然后在4％多聚甲醛中在室温固定10分钟。用洗涤/透化缓冲液(BD，554723)洗涤细胞1次，然后将多达106个细胞与稀释于250μL洗涤/透化缓冲液中的一抗或同种型对照抗体一起孵育所需的时长(参见下文的抗体稀释和孵育时间)。对于未缀合的抗体，将细胞用洗涤/透化缓冲液洗涤1次，然后用稀释在洗涤/透化缓冲液中的二抗孵育15分钟。如果染色第二抗原，则用洗涤/透化缓冲液洗涤细胞1次，然后进行上述孵育步骤。用洗涤/透化缓冲液洗涤1次后，将细胞重悬于PBS+1％血清中，并使用BD FACSCalibur流式细胞仪分析。所有步骤均在室温进行，并通过在微型离心机中以6000rpm离心5分钟沉淀细胞。
使用了以下抗体：小鼠单克隆抗PDX1 PE-缀合物(BD biosciences，562161,1：50，45min)、小鼠IgG1 PE-缀合物(BD biosciences，556650，1：50，45min)、小鼠单克隆抗NKX6.1(发育研究杂交瘤库，F55A12，1：25，45min)、山羊抗小鼠IgG APC-缀合物(BDbiosciences，550828，1：400，15min)、小鼠单克隆抗Oct3/4Alexa Fluor 488-缀合物(BDbiosciences，560253，1：5，60min)、小鼠单克隆抗胰岛素原c-肽(Millipore，05-1109，1：100，60分钟)、抗小鼠IgG Alexa Fluor 488-缀合物(Thermo Fisher Scientific，A21202，1：300，30分钟)。所有流式细胞术实验的门控均使用仅用荧光团缀合的同种型对照(在直接缀合的一抗的情况下)或荧光团缀合的二抗染色的细胞。
cPP维持和增殖的微生物反应器阵列(MBA)筛选
使用微生物反应器阵列筛选外源信号传导分子组合对cPP细胞的影响。联合培养基在培养室上的连续流动，MBA提供组合的输入因子的混合。将MBA高压灭菌并用无菌PBS填充，然后用单次1mL注射的制造商推荐浓度的hESC合格的基质胶包被(2-4小时，室温)。然后将以5×106/mL悬浮在完全培养基中的cPP细胞接种在MBA中，得到50×106细胞/cm2的表面密度。使细胞附着总共20小时，每6小时进行一次培养基更换。随后，开始提供因子，初始填充步骤为300μL，然后以36μL/h持续灌注因子，持续3天的总培养时间。在终点，用PBS冲洗细胞，用2％PFA/PBS溶液固定30分钟，然后用PBS冲洗并用PBS+20％正常驴血清+0.1％BSA+0.3％Triton X-100封闭/透化30分钟。然后，用稀释在封闭缓冲液中的抗PDX1(R&DSystems，MAB2419,1：25)和SOX9(Sigma，HPA001758,1：1000)的一抗标记细胞，在4℃过夜。然后用0.1％BSA/PBS洗涤细胞，并用Alexa-荧光团缀合的二抗(Thermo FisherScientific，1：500稀释)和Hoechst 33342(2μg/mL)标记1小时。最后，用PBS冲洗细胞，并将MBA入口和出口塞住。然后将MBA安装在微孔板适配器中并成像。然后，与如前所述相似地进行PDX1和SOX9的核强度的核分割(nuclear segmentation)和定量。
登录号
在该研究中产生的初级RNA-seq数据集是在ArrayExpress以登录号ArrayExpress：E-MTAB-5731可获得的。
结果
源自hESC和hiPSC的cPP细胞的维持和扩增
由生长因子和小分子引导的定向分化有助于从多能干细胞产生不同的细胞类型。使用基于被设计为产生成熟β细胞的方案(图2A；Rezania等，2014)的早期阶段的试剂，从hESC和hiPSC(图1)产生胰腺祖细胞。该分化策略诱导PDX1接着是NKX6-1的顺序表达，并在15天后产生80％PDX1+NKX6-1+细胞的中值(PPd15细胞；图3B和2C)。然而，如在多能性细胞的定向分化期间经常观察到的，PDX1和NKX6-1表达的动力学在细胞系之间变化(图2B)。因此，本研究旨在捕获、同步化和扩增培养中的PPd15细胞。
3T3-J2小鼠胚胎成纤维细胞系已用于培养源自多种人组织的祖细胞，包括内胚层来源的肠干细胞。因此，该研究确定了如果提供适当的刺激，胰腺祖细胞是否能够被类似地扩增。测试了先前显示调节胰腺发育的一系列信号传导激动剂和抑制剂，包括EGFL7、BMP4、烟酰胺、LIF、WNT3A、R-Spondin-1、Forskolin(cAMP激动剂)、GSK3b抑制剂(CHIR99021)和BMP抑制剂(LDN-193189)和SHH(KAAD-环巴胺)信号传导分子。最终，发现EGF、视黄酸和转化生长因子β(TGF-β，SB431542)抑制剂和Notch信号传导分子(DAPT)的组合支持胰腺祖细胞的长期自我更新(图3A)。为了建立稳定的cPP细胞系，将PPd15细胞在这些因子的存在下重新铺在一层3T3-J2饲养细胞上。此后，cPP细胞作为聚集体常规每周传代一次，平均分流比为1：6，但是它们也能够以克隆密度形成克隆(图3C)。这表明培养的倍增时间为～65小时，类似于对于hESC当在小鼠胚胎成纤维细胞层上培养时常规观察到的61小时。
该研究能够使用两种hESC(H9和HES3)和三种hiPSC细胞系(内部来源的AK5-11，AK6-8和AK6-13)从四种不同的遗传背景产生自我更新的cPP细胞系；这些不同的cPP细胞表达可比水平的编码关键胰腺转录因子，包括PDX1和SOX9的基因(图2D)。所选择的用于进一步分析的两种cPP细胞系(H9#1和AK6-13)迄今已维持培养>20代，以使得在超过20周时能够扩增>1018倍。至关重要的是，cPP细胞可以冷冻和融化，而没有明显的增殖或活力丧失，这表明cPP细胞可以取代多能性细胞作为进一步向成熟胰腺细胞类型例如胰岛素分泌β细胞的起点。
为了确定cPP培养物是否由稳定且同质的细胞群组成，在mRNA和蛋白质水平测量关键胰腺转录因子的表达。胰芽细胞的许多标志物(包括PDX1和SOX9)的基因表达在培养的长时间段内保持恒定，表明培养条件维持稳定的胰腺祖细胞群(图3D)。
为了确定cPP培养物是否代表均一群体，对选择的胰腺标志物进行免疫染色，并发现这些标志物在蛋白质水平上几乎无所不在地表达(图3E)。此外，流式细胞术分析显示约85％的cPP细胞是PDX1+(图3F)。
然而，NKX6-1表达在培养时快速下调，并且通过免疫染色未检测到NKX6-1蛋白。此外，我们能够从第7、10和15天的分化培养物建立cPP细胞细胞系(数据未显示)，最早的时间点是在表达NKX6-1之前，并且表明cPP培养条件稳定了处于NKX6-1活化之前的发育状态的胰腺祖细胞。极少数细胞是NGN3+，NGN3+标志着早期内分泌祖细胞，表明在我们的培养条件下，分化在祖细胞阶段被阻断。最后，染色体计数显示六个cPP细胞中的五个携带46条染色体而没有结构变化，例如片段或双着丝粒染色体的存在的迹象(图4A)。对第20代的AK6-13细胞系的多重荧光原位杂交(M-FISH)分析证实不存在核型异常(图4B)。总的来说，这些数据表明cPP培养条件捕获了作为几乎同质的群体的胰腺祖细胞，这在延长的时间段内被稳定地维持并且能够广泛扩增。
转录组分析表明cPP细胞与它们的体内对应物密切相关
接下来，该研究通过RNA-seq确定来自三种不同遗传背景的cPP细胞系和PPd15分化培养物的转录组广泛基因的计数，所述cPP细胞系从PPd15分化培养物建立。用于RNA-seq的样品也取自早期、中期和晚期传代的cPP细胞。不同cPP样品之间的基因表达水平强烈相关，表明遗传背景和培养时间都不显著影响cPP转录组(图5A)。然而，为了完全消除对基因表达的供体特异性作用，以下分析使用源自H9和HES3 hESC和AK6-13 hiPSC的cPP(早期传代)和PPd15细胞的平均基因计数。
为了确定cPP细胞与其体外和体内对应物的相似程度，将cPP转录组与已发表的体外分化的胰腺祖细胞(Cebola PP)的转录组和来自CS16-18人胚胎(CS16-18 PP)以及各种各样的成体和胚胎组织的转录组进行比较。相对于非胰腺组织，cPP细胞表现出与PPd15和Cebola PP细胞相似的基因表达模式(图6A)。此外，在CS16-18处，cPP、PPd15和Cebola PP细胞与体内胰腺祖细胞非常相似，并且所有四种细胞群表达相似水平的与内胚层和胰腺发育相关的基因(图6B)。然而，如所预期的，cPP细胞不表达晚期胰腺祖细胞标志物NKX6-1、PTF1A和CPA1。当结合在一起时，这些数据表明，此处描述的培养条件维持cPP细胞处在与通过定向分化产生的胚胎人胰腺和胰腺祖细胞密切相关的发育状态。
为了进一步表征cPP细胞的转录物身份，该研究试图鉴定将cPP细胞与其他谱系区分开的基因。特异性表达的基因被定义为在上述25个组织的组中可变地表达(方差系数>1)并且其表达在cPP细胞中被上调(Z得分>1)的基因。总共鉴定了1,366个基因，包括许多被充分表征的胰腺祖细胞的标志物，例如PDX1、SOX9、MNX1和RFX6(图6C)。为了证实该方法的有效性，该研究证明这些基因不被其他内胚层衍生器官(包括肝，结肠和肺)表达(图5B)。令人鼓舞的是，cPP细胞特异性表达的约80％的基因是与CS16-18胰腺祖细胞和/或PPd15细胞共有的。此外，这三种胰腺细胞类型之间的基因Z得分高度相关，但不与肝脏高度相关(图5C)，进一步证明了cPP细胞和其他胰腺祖细胞之间的转录相似性。
为了确定cPP特异性基因的功能作用，该研究分析了相关的基因本体论(GO)项目。最丰富的项目是与内分泌胰腺发育相关的项目(图3D，上文)。为了确定培养条件如何影响cPP细胞的行为，该研究分析了与cPP细胞而非PPd15或CS16-18胰腺祖细胞表达的基因相关的GO项目(图6D，下文)。有趣的是，最丰富的项目是与细胞分裂和端粒维持的多个方面相关的项目。实际上，与cPP细胞所源自的PPd15群体相比，与这些丰富的项目相关的基因，例如编码端粒酶逆转录酶(TERT)和增殖细胞核抗原(PCNA)的基因在来自不同遗传背景的cPP细胞中被一致地上调(图6E和6F)。发明人得出结论，基于饲养细胞的培养系统将胰腺祖细胞保持为稳定的群体，同时上调长期自我更新所需的基因。
3T3-J2细胞的饲养层阻止cPP分化，而外源信号促进增殖
该研究接下来研究了培养系统的各个组分所起的作用，特别是被辐射的3T3-J2饲养细胞层、用EGF、FGF10和视黄酸(RA)的刺激，以及抑制TGFβ和Notch信号传导通路。为了评估饲养层的重要性，将cPP细胞继代培养在以递减密度铺板的3T3-J2细胞层上，并在完全cPP培养基中维持7天。在降低的饲养细胞密度，cPP细胞继续快速增殖，但很快改变其形态，而不能连续传代(图7A)。PDX1和SOX9的水平保持稳定，表明cPP细胞定向于胰腺谱系，而导管分化的标志物(KRT19和CA2)和腺泡分化的标志物(CPA1和AMY2B)被上调(图7B)。然而，未观察到内分泌标志物(NGN3和NKX2-2)的上调，表明3T3-J2饲养细胞是阻断向导管和腺泡的进一步分化所需要的。
为了确定生长因子和小分子在我们的培养基中所起的作用，其各自被单独除去，并评估对分化和增殖的影响。排除EGF或RA阻止cPP扩增，而去除TGF-β抑制剂SB431542导致克隆从饲养层脱离(图7C)。去除FGF10或g-分泌酶抑制剂DAPT在短期内不显著影响克隆大小或形态，但是当在多次传代中被从培养基中移除时，导致明显的存活力丧失。有趣的是，这些生长因子或信号传导抑制剂无一是维持PDX1或SOX9表达单独需要的(图7D)。实际上，去除RA实际上增加了PDX1表达。这些结果表明，我们的培养基中存在的生长因子和抑制剂主要用于驱动cPP细胞的增殖而不是维持其发育状态。
为了量化外源信号传导分子对cPP细胞的维持和扩增的影响，该研究使用微生物反应器阵列(MBA)筛选平台来测量分化和增殖。在没有饲养细胞的情况下将cPP单细胞接种在基质胶包被的培养室中并暴露3天以完成cPP培养基，其中EGF、RA和DAPT的水平是变化的(图8)。然后，该研究使用图像分割算法来识别单个细胞核并量化对PDX1和SOX9的免疫荧光染色，从而能够确定暴露于不同生长因子方案后双阳性细胞的百分比。降低这三种因子中的任何一种的水平导致细胞总数和PDX1+SOX9+细胞数量的减少(图7E)。然而，PDX1/SOX9的平均水平和PDX1+SOX9+细胞的百分比均不依赖这些因子的水平，表明它们主要起分裂素的作用。有趣的是，注意到PDX1+SOX9+细胞的数量和百分比的增加，但当将细胞暴露于更高浓度的自分泌信号时，总体增殖速率没有变化，特别是当提供最高水平的EGF、RA和DAPT时(图8D)。因此，独立于增殖，暴露于内源可溶性信号传导分子是维持PDX1和SOX9需要的。
当一起考虑时，这些观察结果表明cPP细胞的自我更新依赖EGF、FGF10和RA途径的活化以及Notch信号传导的抑制。实际上，cPP细胞及其体外(PPd15)和体内(CS16-18胰腺祖细胞)等同物表达高水平的EGF、FGF、RA和Notch信号传导的多种受体，以及TGFβ受体ALK4和ALK5(分别由ACVR1B和TGFBR1编码)，其被SB431542抑制(图7F)。与这些观察结果一致，周围间充质产生FGF10和RA对于小鼠胰芽的扩增是必需的，而EGFR在整个胰腺中表达并调节胰岛发育。细胞内Notch信号传导促进胰腺祖细胞的扩增并阻止它们进一步分化成内分泌细胞。因此，本研究观察到g-分泌酶抑制剂DAPT促进cPP细胞增殖有些令人惊讶。然而，已经表明FGF10在发育中的胰腺上皮中促进Notch活性，并且相对于图6A中描述的23种组织，cPP细胞表达中间水平的Notch效应物HES1(数据未显示)。因此，添加到cPP培养物中的相对低浓度的DAPT最有可能起到降低Notch活性的作用，并且异常高水平的Notch活性可能实际上抑制增殖。
cPP细胞在体外和体内分化为胰腺细胞类型
胰腺祖细胞的典型性质是它们分化成构成胰腺的三个谱系中的每一个的能力以及它们的功能衍生物。最初，该研究试图确定cPP细胞是否能够在体外定向到内分泌、管道和腺泡谱系。由于尚未开发用于胰管和腺泡细胞的定向分化的稳健方案，因此在不存在饲养细胞的情况下将cPP细胞重新铺板并暴露于促进多谱系分化的最小信号传导方案(图9A)。在12天的过程中，观察到内分泌标志物(NKX6-1、INS和GCG)、腺泡标志物(CPA1、AMY2B和TRYP3)和导管标志物(SOX9、KRT19和CA2)的上调，表明cPP细胞在体外保留多谱系效力(图9B)。
特别感兴趣的是产生能够响应于升高的葡萄糖水平分泌胰岛素的b样细胞的能力。几个小组最近发表了描述特定hESC和hiPSC细胞系分化为b样细胞的方案。在NGN3表达之前激活NKX6-1被认为对于成熟的功能性β细胞的形成是必需的。因此，选择了四种最有希望的方案(Pagliuca等，2014；Rezania等，2014；Russ等，2015；Zhang等，2009)并评估了它们在维持低水平的NGN3的同时诱导NKX6-1表达的能力。具体地，将cPP细胞培养为单层或聚集体，然后暴露于所示的每个分化方案的部分以诱导NKX6-1表达(图10A)。Russ等人(2015)描述的方案产生最高水平的NKX6-1表达和NGN3的最小活化，单层和悬浮培养产生非常相似的响应(图10B)。由于原始方案证明当细胞分化为聚集体时产生分泌胰岛素的b样细胞，因此本研究选择使用3D悬浮平台用于后续实验。使用Russ等人(2015)的方案，研究发现约40％的cPP细胞重新激活NKX6-1。然而，将前两种处理中的每一种的长度加倍使得能够产生近70％的双阳性细胞，类似于最初报道的数量(图9E、10C和10D)。有趣的是，这些PDX1+NKX6-1+细胞产生了复杂的结构，使人联想到胚胎胰腺的分支形态发生(图9D和9F)。进一步分化诱导内分泌标志物NKX2-2和NGN3的表达，后者在较小的细胞亚群中，反映其在内分泌定向期间的瞬时表达(图9G)。最后，在16天后，20％的细胞含有C-肽，代表胰岛素产生，类似于Russ等(2015)报道的25％。至关重要的是，C-肽+细胞不共表达细胞激素胰高血糖素，表明这些细胞不同于较早的几代方案产生的多激素细胞，后者不能响应升高的葡萄糖水平分泌胰岛素。然而，NGN3水平在该方案结束时仍然很高，INS mRNA水平显著低于分离的人胰岛，表明需要对该方案的进一步优化(图9K)。
最严格的发育效力测试是，祖细胞是否可以在体内分化成特定谱系。为了评估cPP细胞的效力，将这些细胞注射到免疫缺陷小鼠的肾囊下，并在>23周后对三种主要胰腺谱系的标志物进行免疫染色。能够鉴定到表达b细胞标记物C-肽以及管道标记物角蛋白19(KRT19)的大区域的细胞，但是该研究未能找到胰蛋白酶+腺泡细胞或胰高血糖素+内分泌细胞(图9L)。然而，在追随胰腺祖细胞移植的先前研究中也很少观察到胰蛋白酶+细胞，可能是因为腺泡细胞在没有带走它们分泌的消化酶的导管的情况下不能存活。表达胰高血糖素的细胞的不存在是出乎意料的，但是可能反映了在缺乏形成胰高血糖素+细胞所需的诱导信号的情况下默认地产生C肽+细胞。
C-肽+细胞不形成经典的胰岛样结构，而是形成一系列相互连接的囊性结构，正如其他人先前已经观察到的那样。此外，该研究未观察到移植后祖细胞群的扩增，表明cPP细胞在体内迅速分化成增殖性较弱的细胞。因此，尽管向每只小鼠移植了>3百万个细胞，但所评估的12只小鼠中没有一只表现出畸胎瘤形成。这些观察结果表明，cPP细胞保留了在体内分化为内分泌细胞和导管细胞的能力，但是还有待观察它们是否能够形成腺泡细胞。此外，没有畸胎瘤形成表明cPP细胞可能代表比直接从多能干细胞分化的细胞更安全的移植替代方案。
讨论
已经提出把多能干细胞作为用于建模和治疗糖尿病的β细胞的不受限制的来源。然而，来自不同的源自患者的hiPSC的功能性β细胞的常规产生仍然是一个挑战，部分原因在于长的、多步骤定向分化方案中固有的可变性。该研究描述了用于长期培养源自人多能干细胞的自我更新的胰腺祖细胞的平台。这些cPP细胞能够快速和长期扩增，从而提供方便的β细胞替代来源。此外，cPP细胞可以作为冷冻储存物储存和运输，并且cPP细胞已经培养至少25代而没有损失增殖性。观察到cPP细胞在体外分化时表达胰腺内分泌、导管和腺泡细胞的标志物，从而证明它们的多能性，并且该研究使用修正版本的Russ等人(2015)描述的β细胞分化方案能够产生高达～20％的C肽+细胞。发育效力的确定性测试是细胞是否能在体内分化成特定的谱系，并且虽然cPP细胞当移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下时确实产生大量的角蛋白-19+导管细胞和C-肽+b样细胞，但是尚不清楚它们是否保留在体内形成腺泡细胞的能力。
体外分化的细胞通常以不同步的方式进行，导致培养物随时间推移逐渐变得更异时性并且降低细胞能够定向到特定谱系的效率。因此，捕获和同步化正在分化的祖细胞的能力对于开发用于从不同遗传背景产生功能性β细胞的稳健方案是必不可少的。充分的分子表征揭示了由hESC和hiPSC产生的cPP培养物呈现为随时间推移始终表达早期胰腺转录因子的稳定细胞群。cPP转录组与CS16-18胰腺的祖细胞的转录组密切相关。然而，与不同发育阶段的人类胚胎进行比较表明，基于PDX1、SOX9、FOXA2和GATA4/6的强烈表达以及NKX6-1和SOX17的不存在，cPP细胞与CS12和CS13之间的胰芽细胞最相似。
近年来，几个小组报道了培养人内胚层衍生物的方法。两个单独的报告表明，如果在适当的促有丝分裂信号存在下培养在饲养层上，hESC衍生的定形内胚层可以连续传代和扩增。随后，另一个小组表明，前肠祖细胞可以在无饲养细胞的条件下培养。然而，缓慢的生长和不同品系之间的变化的基因表达限制了它们的效用。最近，表明源自重新编程的内胚层细胞的胰腺祖细胞可以扩增和传代。然而，这些培养物是高度异质的，并且不清楚所用的信号传导分子和抑制剂的最小组合是否足以培养来自不同遗传背景的细胞。因此，此处描述的培养体系首次能够使源自遗传多样性的hESC和hiPSC的多能胰腺祖细胞长期自我更新。
参考文献
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序列表
<110> 新加坡科技研究局
<120> 胰腺祖细胞的维持和扩增
<130> 9869SG4880
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 1
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catggccaag attgacaacc t 21
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cacacgagac ccactttttc 20
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ccgccaagta ttttgtttgt 20
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gtgttgcctc tatccttccc at 22
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cgctccgctt agcagcat 18
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cctgctggga tattagctcc a 21
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cagcggtagg tgtcgaagc 19
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<223> 引物序列
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aagtctacca aagctcacgc g 21
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gtaggcgccg cctgc 15
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tgagaagcaa cccttgtcat c 21
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tcatcaacag actgactgca ttc 23
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<212> DNA
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atggagacgt ttgaccccac 20
<210> 44
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<212> DNA
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cgtagttgag ccagcgatag t 21
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ccgctgacca aggatcgag 19
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agggaacggg tttggctttc 20
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agcggatcaa tacctgtctc agaa 24
<210> 48
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<400> 48
gcataaagaa tgcaccgtgg taag 24
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<211> 20
<212> DNA
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<223> 引物序列
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gaacgcacat caagacggag 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
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agttctggtg gtcggtgtag 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 51
ccccagactc cgtcagtttc 20
<210> 52
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<220>
<223> 引物序列
<400> 52
tccgtctggt tgggttcag 19
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 53
tataatccca agcggtttgc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物序列
<400> 54
gcacaccatt ttcccagaac 20
<210> 55
<211> 19
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<220>
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<400> 55
aaatgcggcc cctgtttct 19
<210> 56
<211> 19
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<400> 56
cagtgcgtct tgaggagca 19
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
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<223> 引物序列
<400> 57
catcaatgcg gccaagatca 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物序列
<400> 58
ggaattgatg acggcaggtg 20
Claims (24)
1.一种培养胰腺祖细胞的方法，所述方法包括使所述细胞接触：
a.表皮生长因子(EGF)；
b.视黄酸(RA)；
c.转化生长因子-β(TGF-β)信号传导抑制剂；和
d.3T3-J2成纤维细胞饲养细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述转化生长因子-β(TGF-β)信号传导抑制剂是激活素受体样激酶(ALK)受体的抑制剂。
3.权利要求2所述的方法，其中所述激活素受体样激酶(ALK)受体的抑制剂是SB431542。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞进一步与B27补充物接触。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞进一步与Notch信号传导抑制剂接触。
6.权利要求5所述的方法，其中所述Notch信号传导抑制剂是γ-分泌酶抑制剂。
7.权利要求6所述的方法，其中所述γ-分泌酶抑制剂是DAPT。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞进一步与地塞米松、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、N2补充物或其组合接触。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞与以下接触：
a.约1ng/ml至约100ng/ml的EGF；
b.约100nM至约10μM的RA；和
C.约1μM至约100μM的SB431542。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞与以下接触：
a.约1ng/ml至约100ng/ml的EGF；
b.约1ng/ml至约100ng/ml的FGF10；
c.约100nM至约10μM的RA；
d.约1nM至约100nM的地塞米松；
e.约100nM至约10μM DAPT；
f.约1μM至约100μM的SB431542；
g.约1x B27补充剂；和
h.约1x N2补充剂。
11.权利要求10所述的方法，其中所述胰腺祖细胞与以下接触：
a.约50ng/mL EGF；
b.约50ng/ml FGF10；
c.约3μM RA；
d.约30nM地塞米松；
e.约1μM DAPT；
f.约10μM SB431542；
g.约1x B27补充剂；和
h.约1x N2补充剂。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞是胰腺祖细胞群。
13.权利要求12所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群是基本上同质的。
14.权利要求13所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群是至少60％同质的。
15.权利要求14所述的方法，其中所述胰腺祖细胞群是至少99％同质的。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞被培养至少5代、至少10代、至少15代或至少20代。
17.权利要求1至16中任一项所述方法，其中所述胰腺祖细胞源自干细胞。
18.权利要求17所述的方法，其所述细胞是人胚胎干细胞(hESC)。
19.权利要求17所述的方法，其中所述干细胞是诱导的多能干细胞(iPSC)。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述胰腺祖细胞表达PDX1、SOX9、HNF6、FOXA2和GATA6。
21.权利要求20所述的方法，其中所述胰腺祖细胞不表达SOX2。
22.一种根据权利要求1至21中任一项所述的方法产生的细胞。
23.一种试剂盒，所述试剂盒当被用于权利要求1至21中任一项所述的方法时，包含细胞培养基的一个或更多个容器，以及使用说明书。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含3T3-J2饲养细胞。
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