CN110384681B - 一种用于肺纤维化的纳米制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于肺纤维化的纳米制剂及其制备方法，即一种有黏蛋白降解的蛋白酶修饰的纳米制剂及其载体。首先借助蛋白酶降解黏蛋白的特性从而响应性释放纳米制剂，进而将治疗药物高效递送至肺纤维化损伤部位，实现高效靶向递送抗肺纤维化药物，达到高效治疗肺纤维化的目的。针对基于目前上市的气管及吸入给药剂型中普遍存在深层递送难的问题，即气道中杯状细胞过度分泌粘液而造成大量药物难以递送至肺泡深部发挥作用，提出利用肺纤维化气道微环境中的粘液过度分泌的变化，构建了响应型释放并且能够高效通过气道屏障的纳米制剂，进而将治疗药物高效递送至肺泡深处的肺纤维化损伤部位，提高纳米制剂到达肺泡深部的效率。
Description
技术领域
本发明公开了一种用于肺纤维化的纳米制剂及其制备方法，属于医药技术领域。
背景技术
特发性肺纤维化（IPF）是间质性肺病（ILD）的严重并且常见的形式之一。ILD是一种进行性的肺部疾病，病情发展到末期会造成肺纤维化。在疾病的发展过程中，损伤的肺泡上皮细胞会分泌大量的炎症因子，从而激活成纤维细胞过度增殖、同时向肌成纤维细胞转化，造成细胞外基质（ECM）过度沉积，使肺实质遭到破坏，最终导致病人因呼吸衰竭而亡。尽管新型的抗纤维化药物吡非尼酮（PFD）已被欧洲等国家批准用于临床治疗，但仍存在一定问题。由于吡非尼酮通常作为口服制剂治疗IPF，其生物利用度低且大量用药会对其他器官产生副作用甚至造成毒性。因此，提出通过吸入给药从而实现高效递送药物到达肺部的策略为IPF治疗提供了新思路和新方法。
在吸入给药剂型中，由于气道生理结构的限制而使得药物递送效率普遍偏低。气道中的粘液层是气管或吸入给药必须要克服的第一道屏障。粘液层主要由密集网状的粘蛋白纤维组成，粘蛋白是一种带负电的含有高密度聚糖的生物大分子。在晚期阻塞性肺病及纤维化患者中，由气道杯状细胞分泌的粘液会作为清除系统的一部分，通过空间位阻或粘连作用，将到达气道的药物捕获，随后将其从粘液中清除，导致到达肺部深处的药物减少，造成药物对疾病的治疗效果减弱。即便药物可以通过粘液层，肺泡仍然存在另一个屏障即脂质层中的巨噬细胞吞噬系统，其是II型肺泡上皮细胞（AT II）的保护性防御屏障。大量药物会在脂质层被巨噬细胞吞噬而不能起到治疗作用。
因此，对于需要在肺部深处起作用的药物，在递送过程中必须有效的克服这些障碍才能达到理想的治疗效果。
发明内容
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种抗纤维化药物纳米制剂及其制备方法，提高纳米制剂到达肺泡深部的效率。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种纳米制剂载体，所述纳米制剂载体包括Y-PEG-MAL和修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X，所述修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X连接在Y-PEG-MAL的亲水端形成Y-PEG-MAL-X；
其中，Y选自PLGA、PLA、PGA、PCL、PC、PS中的一种或几种； 蛋白酶X选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性或碱性蛋白酶、凝乳酶中的一种或几种。
进一步的，所述的纳米制剂载体，还包括与金属离子W配位的药物V，形成Y-PEG-MAL-X-W-V(PPV)，由Y-PEG-MAL、修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X和金属离子W配位的药物V组成；
其中W为金属离子，选自Mn2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Mg2+，Ti4+, Zr4+, Co2+,Al3+，Ca2+中的一种或几种。更优选的，金属离子W使用Fe3+作为配位金属离子。
另一方面，本发明还提供一种一种纳米制剂，采用所述的纳米制剂载体负载疏水性抗肺纤维化药物Z。更为具体的，所述的纳米制剂，包括：
Z-Y-PEG-MAL-X (PPZ)，由Y-PEG-MAL、修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X载体包载药物Z形成；
Z-Y-PEG-MAL-X-W-V (PPZV)，由Y-PEG-MAL、修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X和金属离子W配位的药物V包载药物Z形成。
所述疏水性抗肺纤维化药物Z为抗炎症因子分泌或抗纤维化的药物/缓解细胞氧化应激药物中的一种或几种，抗炎症因子为降低细胞分泌炎症因子及抑制胶原生成的药物或生物活性分子，缓解细胞氧化应激的药物为降低细胞单线态氧、超氧化物及过氧化物等产生的药物或生物活性分子。所述疏水性抗肺纤维化药物Z选自伊马替尼、吉非替尼、埃克替尼、达沙替尼、舒尼替尼、索拉非尼、尼罗替尼、曲美替尼、布洛芬、奈普生、双氯芬酸、萘普酮、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布、尼达尼布、吡非尼酮、可的松和强的松、环孢菌素中的一种或几种。
负载的抗肺纤维化药物可以同时包括抗胶原生成和降低炎症因子分泌的多种或其中一种，配合物中抗氧化药物可以同时包括降低单线态氧，超氧化物分泌的多种或一种抗氧化剂。负载的抗肺纤维化药物具有一定疏水性，通过双亲性嵌段共聚物中的疏水段Y实现对具有一定疏水性抗肺纤维化药物负载，通过PEG实现聚合物胶束在体内的长循环；配合物中的抗氧化药物具有一定的亲水性，通过抑制杯状细胞氧化应激达到降低粘液分泌的目的，从而提高纳米粒的有效递送。通过修饰的蛋白酶X具有降解黏蛋白的作用，通过躲避被粘液清除实现肺部高效递送的目的。通过抗氧化药物的肺部深入递送，抗肺纤维化药物在肺部损伤部位通过抑制胶原表达和/或抑制炎症因子分泌实现治疗肺纤维化的目的。
更优选的，所述药物V为二甲双胍，疏水性抗肺纤维化药物Z为吡非尼酮。所述抗肺纤维化纳米制剂通过疏水嵌段负载吡非尼酮，通过Fe3+配位吸附二甲双胍作为肺纤维化的治疗体系。通过采用双药协同调控肺纤维化微环境，为抗肺纤维化药物的高效递送提供了一种新的治疗策略。
其中，负载的疏水性抗肺纤维化药物可以同时包括降低炎症因子表达或抗胶原生成的药物或活性分子中的多种或选自其中的一种。抗氧化剂为缓解细胞水平氧化应激降低单线态氧及超氧化物的药物或生物活性分子。
1）抗氧化剂：抗氧化活性成分：二甲双胍、谷胱甘肽、α-硫辛酸、类胡萝卜素、麦角硫因；
2）抗胶原或炎症因子生成药物：伊马替尼、吉非替尼、埃克替尼、达沙替尼、舒尼替尼、索拉非尼、尼罗替尼、曲美替尼、布洛芬、奈普生、双氯芬酸、萘普酮、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布、尼达尼布、吡非尼酮、可的松和强的松、环孢菌素。
所述抗肺纤维化药物包括缓解细胞水平氧化应激，降低胞内单线态氧或超氧化物的药物或生物活性分子，抑制炎症因子或胶原表达的药物或生物活性分子。
具体的，Z-Y-PEG-MAL-X-W-V (PPZV)的制备方法：
步骤（1）首先将疏水性抗肺纤维化药物Z与Y-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL（PPZ）；
步骤（2）将金属离子W与药物V及蛋白酶X按一定比例混合形成金属离子W介导配合物X-W-V，将负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL（PPZ）与金属离子W介导配合物X-W-V通过蛋白酶X上的巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰含有金属离子W的配位化合物，形成Z-Y-PEG-MAL-X-W-V；有助于纳米粒高效穿透气管中被过度分泌的粘液层；响应性释放的药物V能够缓解杯状细胞的氧化应激，降低粘液的分泌，提高纳米粒的递送效率；递送至深层的药物能够发挥抗纤维化的作用从而达到纤维化治疗的目的。
反应中，加入的Y-PEG-MAL聚合物纳米粒、蛋白酶X质量比为5:1~10:1；更优选为5:1。
反应中，加入的Y-PEG-MAL聚合物纳米粒、抗肺纤维化药物Z质量比为20:1~5:1；更优选为10:1。
反应中，加入的Fe3+、药物V质量比为40:1~10:1；更优选为30:1。
具体的，Z-Y-PEG-MAL-X (PPZ)的制备方法如下：
步骤（1）首先将疏水性抗肺纤维化药物Z与Y-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL（PPZ）；
步骤（2）将负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL（PPZ）与蛋白酶X进行接枝反应，通过蛋白酶X上的巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰蛋白酶X；纳米粒通过共价修饰的蛋白酶X，有助于纳米粒高效穿透气管中被过度分泌的粘液层；递送至深层的药物能够发挥抗纤维化的作用从而达到纤维化治疗的目的。
反应中，加入的Y-PEG-MAL聚合物纳米粒、蛋白酶X质量比为5:1~10:1；更优选为5:1。
反应中，加入的Y-PEG-MAL聚合物纳米粒、抗肺纤维化药物Z质量比为20:1~5:1；更优选为10:1。
Y-PEG-MAL-X-W-V (PPV)的制备方法如下：
步骤（1）首先将Y-PEG-MAL通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备纳米粒PP；
步骤（2）将金属离子W与药物V及蛋白酶X按一定比例混合形成金属离子W介导配合物X-W-V，将纳米粒PP与金属离子W介导配合物X-W-V通过蛋白酶X上的巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰含有金属离子W的配位化合物，形成Y-PEG-MAL-X-W-V；有助于纳米粒高效穿透气管中被过度分泌的粘液层；响应性释放的药物V能够缓解杯状细胞的氧化应激，降低粘液的分泌，提高纳米粒的递送效率。
反应中，加入的Y-PEG-MAL聚合物纳米粒、蛋白酶X质量比为5:1~10:1；更优选为5:1。
反应中，加入的金属离子W、药物V质量比为40:1~10:1；更优选为30:1。
作为对照，PP/药物的制备方法如下：
步骤（1）首先将抗肺纤维化药物（吡非尼酮）溶于DMSO，Y-PEG-MAL与药物的配比100:1~5:1，更优选方案10:1，包封率为71.6%，载药量为5.4%。
步骤（2）与Y-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗肺纤维化药物的纳米粒。
作为优选方案，所述的抗肺纤维化药物纳米制剂，Y-PEG-MAL中，其中Y的分子量范围为1000-50000，PEG的分子量范围为200-10000。更优选的使用分子量为2000的PEG。
优选地，所述抗肺纤维化药物纳米制剂的载药量5-25%，粒径大小在20 nm-500nm。
本发明要求上述纳米制剂载体、抗肺纤维化药物纳米制剂在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。
本发明提供了一种酶介导的响应型高效递送治疗药物达到治疗肺纤维化的目的。特点是该载体包括化学药物负载成份及气道响应型降解并有效递送成分。所述化学药物负载成份为末端具有马来酰亚胺修饰的两亲性聚合物，响应型降解的黏蛋白成份为巯基化的多肽。
本发明有黏蛋白降解的蛋白酶修饰的纳米制剂Y-PEG-MAL，Y选自PLGA、PLA、PGA、PCL、PC、PS。通过双亲性嵌段共聚物中的疏水段实现对具有一定疏水性的抗纤维化药物的负载，通过配位作用实现对抗氧化药物的负载。通过有黏蛋白降解的蛋白酶克服气道内粘液层屏障更进一步提高纳米制剂到达肺泡深部的效率，为抗肺纤维化药物的高效递送提供了一种新的治疗策略。
有益效果：本发明提供了一种酶介导的响应型高效递送治疗药物达到治疗肺纤维化的目的，与现有技术相比，具有以下优点：载体中的Y-PEG-MAL，其中Y为疏水段，可以很好的实现脂溶性的药物的包载，载体中的PEG可延长载体在血液中的循环时间，载体中的修饰的载体中金属离子W在粘液微酸性蛋白酶X在粘蛋白高表达的条件下，可以响应性释放药物V，通过调控杯状细胞氧化应激来减少粘液分泌而提高纳米制剂的递送效率，到达肺部深处的抗纤维化或抗炎症因子表达的药物可以通过降低炎症因子表达或抑制胶原分泌达到治疗肺纤维化的目的。此载体的应用可实现纳米药物的高效肺递送，酶响应及酸响应的双重响应性实现抗氧化应激药物的高效释放，到达肺泡深处的纳米粒可以有效的发挥抵抗肺纤维化进展的作用。本发明利用肺纤维化气管中高度分泌黏蛋白的微环境通过响应型释放纳米制剂进而将治疗药物高效递送至肺纤维化损伤部位，同时利用抗肺纤维化药物Z抑制纤维化进展，为抗肺纤维化药物的高效递送及有效治疗肺纤维化的药物设计提供了一种新的途径和策略。本发明通过蛋白酶X修饰纳米载体Y-PEG-MAL包载药物Z，金属离子W配位药物V的纳米制剂及其载体，首先利用在肺纤维化发生过程中，气管内的粘液分泌物显著增多，纳米制剂通过气管给药到达粘液层，通过响应型释放纳米制剂进而将治疗药物高效递送至肺纤维化损伤部位，避免被气管内粘液清除。金属离子WV在粘液微酸性条件下与纳米制剂PPZ发生解离，释放药物V，通过调控杯状细胞氧化应激来减少粘液分泌而提高纳米制剂的递送效率，而释放暴露蛋白酶X的纳米制剂PPZ，在气道粘液层中粘蛋白高表达的条件下，快速穿过气道粘液层到达肺部深处，提高抗纤维化药物的治疗效果。目前，利用双亲性嵌段共聚物中的疏水嵌段负载疏水性药物进行递送是常见的方法之一，PLGA（聚乳酸-聚羟基乙酸）、PLA（聚乳酸）、PGA（聚乙交酯）、PCL（聚己内酯）是常见的具有良好生物相容性的疏水嵌段，常在双亲性嵌段共聚物中作为疏水性内核，对大多数的疏水性药物具有较好的亲和力。同时，本文利用配位的方式包载抗氧化剂，其配合物在正常生理条件下具有良好的稳定性，在粘液层微酸的条件下可以实现响应型释放的目的。
在本发明中，利用蛋白酶X修饰的Y-PEG(X为疏水段，X为PLGA、PLA、PGA、PCL)纳米粒，通过双亲性嵌段共聚物中的疏水段实现对具有一定疏水性的双药/单药负载，通过PEG实现聚合物胶束在体内的长循环，和/或，金属离子W配位药物V的纳米制剂及其载体，在粘液层可以响应型释放，从而实现肺部高效递送。
附图说明
图1是实施例纳米制剂制备的流程示意图；
图2是实施例中所制备的纳米制剂的各成份最佳投料比；
图3是实施例各制剂的纳米制剂粒径图；
图4是实施例各制剂的纳米制剂电位图；
图5是实施例所涉及黏蛋白（木瓜蛋白酶）的透射电镜图；
图6是实施例制剂中蛋白酶可特异降解木瓜蛋白酶的透射电镜图；
图7是实施例所制备纳米制剂在酶敏感条件下不同时间点响应型释放后的纳米粒径图；
图8实施例所制备纳米制剂在酸敏感条件下不同时间点响应型释放后的纳米粒径图；
图9是实施例所制备纳米制剂在酸和酶同时存在条件下不同时间点响应型释放后的纳米粒径图；
图10是实施例所制备的纳米载体在体内水平考察不同纳米制剂在逆转肺纤维化的效果分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1 纳米制剂成份的合成及制备，如图1，图2所示：
一、包载双药/单药的PLGA-PEG-MAL纳米粒的制备
本发明优选的采用薄膜分散法制备包载抗肺纤维化药物Z的PLGA-PEG-MAL纳米粒。具体制备方法如下：
称取100 mg PLGA-PEG-MAL 和10 mg抗肺纤维化药物Z分别溶于2 mL 乙酸乙酯溶液中，超声溶解。在搅拌条件下，将乙酸乙酯溶液滴通过旋转蒸发仪旋干后，加入3mL蒸馏水超声溶解30 min，2500 rpm/min离心20 min除去未被包载的游离药。使用分子量10000的超滤管浓缩纳米粒至体积为500 μL。
抗氧化剂抗纤维化药物：
1）抗氧化剂：抗氧化活性成分：二甲双胍、谷胱甘肽、α-硫辛酸、类胡萝卜素、麦角硫因；
2）抗胶原或炎症因子生成药物：伊马替尼、吉非替尼、埃克替尼、达沙替尼、舒尼替尼、索拉非尼、尼罗替尼、曲美替尼、布洛芬、奈普生、双氯芬酸、萘普酮、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布、尼达尼布、吡非尼酮、可的松和强的松、环孢菌素。
（一）具有木瓜蛋白酶及金属离子W介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
1. 具有木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Fe3+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Fe3+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端酶与Fe3+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的蛋白酶Z。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，如图3、图4所示，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一，核壳结构明显。
2. 具有木瓜蛋白酶及Mn2+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Mn2+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Mn2+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Mn2+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Mn2+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Mn2+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Mn2+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
3. 具有木瓜蛋白酶及Zn2+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Zn2+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Zn2+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Zn2+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Zn2+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Zn2+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Zn2+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
4. 具有木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Fe3+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Fe3+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Fe3+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
5. 具有木瓜蛋白酶及Cu2+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Cu2+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Cu2+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Cu2+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Cu2+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Cu2+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Cu2+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
6. 具有木瓜蛋白酶及Mg2+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Mg2+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Mg2+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Mg2+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Mg2+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Mg2+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Mg2+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
7. 具有木瓜蛋白酶及Si2+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Si2+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Si2+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Si2+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Si2+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Si2+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Si2+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
8. 具有木瓜蛋白酶及Co2+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Co2+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Co2+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Co2+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Co2+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Co2+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Co2+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
9. 具有木瓜蛋白酶及Al3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Al3+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Al3+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Al3+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Al3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Al3+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Al3+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
10. 具有木瓜蛋白酶及Ca2+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将金属离子Ca2+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Ca2+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Ca2+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Ca2+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Ca2+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Ca2+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
（二）具有蛋白酶X及Fe3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
1. 具有木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将Fe3+ 30mg与二甲双胍2 mg及木瓜蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Fe3+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的木瓜蛋白酶与Fe3+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的木瓜蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含木瓜蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、木瓜蛋白酶及Fe3+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
2. 具有酸/碱蛋白酶及Fe3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将Fe3+ 30mg与二甲双胍2 mg及酸/碱蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Fe3+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的酸/碱蛋白酶与Fe3+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的酸/碱蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含酸/碱蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含酸/碱蛋白酶及Fe3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、酸/碱蛋白酶及Fe3+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、酸/碱蛋白酶及Fe3+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
3. 具有菠萝蛋白酶及Fe3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将Fe3+ 30mg与二甲双胍2 mg及菠萝蛋白酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Fe3+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的菠萝蛋白酶与Fe3+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的菠萝蛋白酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含菠萝蛋白酶及吡非尼酮），PPV/（含菠萝蛋白酶及Fe3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、菠萝蛋白酶及Fe3+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、菠萝蛋白酶及Fe3+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
4. 具有凝乳酶及Fe3+介导的配合物修饰的聚合物纳米粒制备
将Fe3+ 30mg与二甲双胍2 mg及凝乳酶30 mg在蒸馏水中充分混合过夜，将负载抗肺纤维化药物吡非尼酮的纳米粒与Fe3+介导配合物通过巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的凝乳酶与Fe3+的配位化合物共价结合；利用10000 rpm/min离心重悬三次，收集所制备的纳米粒，除去未反应的巯基化的凝乳酶。
利用本法所制备的PP/（吡非尼酮），PPZ/（含凝乳酶及吡非尼酮），PPV/（含凝乳酶及Fe3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、凝乳酶及Fe3+介导的配合物）的载药量在5%-25% ，粒径大小在50 nm-500 nm。本实施例制剂（PPZV/（同时含吡非尼酮、凝乳酶及Fe3+介导的配合物））的纳米制剂粒径分布，该纳米制剂粒径分布均匀，形态均一。
实施例2 木瓜蛋白酶可特异性降解木瓜蛋白酶
按照实施例1所述取粘液层中黏蛋白的类似物-木瓜蛋白酶作为研究对象，加入不同浓度的蛋白酶进行作用24 h，通过透射电镜（TEM）拍摄木瓜蛋白酶在透射电镜下的形态变化。通过透射电镜的结果表明，木瓜蛋白酶与黏蛋白相互作用24 h后可被黏蛋白降解，如图5，图6所示。
实施例3 纳米制剂在微酸及酶敏感条件下响应型释放的测定
按照实施例1所述制备PP/（吡非尼酮）、PPZ/（含蛋白酶X及吡非尼酮），PPV/（含蛋白酶X及Fe3+介导的配合物）及PPZV/（同时含吡非尼酮、蛋白酶X及Fe3+介导的配合物）的纳米制剂。将纳米制剂浓缩至200μL后加入1mL pH 6.8的PBS后，在4 ºC放置24 h后，应用粒径仪对不同环境下纳米粒的粒径大小及电位进行表征。
（1）马尔文帕纳科可视化粒径仪进行粒径的测定后，在微酸及酶作用后再次对粒径进行考察，观察粒径变化情况；
本实施例所测得的粒径数据如图7，图8及图9所示，通过刺激前后检测纳米粒子的粒径变化情况。在未经微酸环境及酶响应型刺激之前，纳米粒的粒径分布大致相似，经过微酸性及酶刺激后，纳米粒通过微环境响应性释放更小的纳米粒子，同时Fe3+介导的配合物被响应性释放到粘液层，而更小的纳米粒子则可以通过渗透作用到达肺部深处。
通过刺激前后检测纳米粒子的电位变化情况。在未经微酸环境及酶响应型刺激之前，含Fe3+介导的配合物纳米粒子的电位应为正电或偏低，经过微酸性及酶刺激后，纳米粒通过微环境响应性释放更小的纳米粒子，同时Fe3+介导的配合物被响应性释放到粘液层，而更小的纳米粒子主要呈负电性，其他研究中也证明PLGA-PEG自组装形成的纳米粒主要为负电，进一步表明，所构建的体系可以在微酸及酶高度表达的双重条件下达到响应性释放的目的。
实施例4纳米制剂PP，PPZ，PPV，PPZV在治疗过逆转肺纤维化的效果分析。
按照实施例1所述制备方法制备纳米制剂PP，PPZ，PPV，PPZV。Z为吡非尼酮，V为二甲双胍。
首先采用6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠进行肺纤维化模型的造模试验，造模时应用气管插管法对小鼠肺部直接造模。造模时应用盐酸博来霉素作为小鼠肺纤维化诱导剂，浓度为2 USP/Kg，三周以后待小鼠肺纤维化成型则继续进行纳米制剂PP，PPZ，PPV，PPZV在治疗过逆转肺纤维化的效果分析。将造模三周的小鼠随机分配为5组，每组5只，分别通过尾静脉注射纳米制剂PP，PPZ，PPV，PPZV 和生理盐水，以所注射的药物Z为2μg/g小鼠体重为标准。在治疗4周后，对于不同纳米制剂逆转肺纤维化效果通过H&E染色分析不同给药组抗肺纤维化的效果。由H&E染色结果可以看出，最终制剂PPZV组与BLM组相比较，肺泡间距明显缩小，且肺泡壁薄厚均匀，肺纤维化程度明显减弱，可以达到治疗肺纤维化的目的，表明通过介导循环纤维细胞的纳米制剂递送体系可以实现高效的肺部靶向及双药联合治疗可以有效的逆转肺纤维化，各制剂组的抗纤维化效果比较PPZV>PPZ>PPV>PP，结果如图10。
PLGA（聚乳酸-聚羟基乙酸）、PLA（聚乳酸）、PGA（聚乙交酯）、PCL（聚己内酯）是常见的具有良好生物相容性的疏水嵌段，常在双亲性嵌段共聚物中作为疏水性内核，对大多数的具有一定疏水性的药物具有较好的亲和力。在上述实施例中，利用PLA-PEG-MAL，PGA-PEG-MAL，PCL-PEG-MAL嵌段共聚物代替PLGA-PEG-MAL嵌段共聚物，同样可以负载具有一定疏水性的药物，形成聚合物胶束的目的，对于本领域技术人员来说，是清楚的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种纳米制剂载体，其特征在于，所述纳米制剂载体包括Y-PEG-MAL和修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X，所述修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X连接在Y-PEG-MAL的亲水端形成Y-PEG-MAL-X；
其中，Y选自PLGA、PLA、PGA、PCL、PC、PS中的一种或几种； 蛋白酶X选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性或碱性蛋白酶中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的纳米制剂载体，其特征在于，还包括与金属离子W配位的药物V，形成Y-PEG-MAL-X-W-V，由Y-PEG-MAL、修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X和金属离子W配位的药物V组成；
其中W为金属离子，选自Mn2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Mg2+，Ti4+, Zr4+, Co2+, Al3+，Ca2+中的一种或几种；所述药物V选自二甲双胍、谷胱甘肽、α-硫辛酸、类胡萝卜素、麦角硫因。
3.一种纳米制剂，其特征在于，采用权利要求1或2所述的纳米制剂载体负载疏水性抗肺纤维化药物Z。
4.根据权利要求3所述的纳米制剂，其特征在于，包括：
Z-Y-PEG-MAL-X，由Y-PEG-MAL、修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X载体包载药物Z形成；
Z-Y-PEG-MAL-X-W-V，由Y-PEG-MAL、修饰有黏蛋白降解的蛋白酶X和金属离子W配位的药物V包载药物Z形成。
5.根据权利要求3所述的纳米制剂，其特征在于，所述疏水性抗肺纤维化药物Z为抗炎症因子分泌、抗纤维化或缓解细胞氧化应激药物中的一种或几种，抗炎症因子为降低细胞分泌炎症因子及抑制胶原生成的药物或生物活性分子，缓解细胞氧化应激的药物为降低细胞单线态氧、超氧化物及过氧化物产生的药物或生物活性分子；
所述疏水性抗肺纤维化药物Z选自伊马替尼、吉非替尼、埃克替尼、达沙替尼、舒尼替尼、索拉非尼、尼罗替尼、曲美替尼、布洛芬、奈普生、双氯芬酸、萘普酮、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布、尼达尼布、吡非尼酮、可的松和强的松、环孢菌素中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的抗肺纤维化药物纳米制剂，其特征在于，Z-Y-PEG-MAL-X-W-V的制备方法：
步骤（1）首先将疏水性抗肺纤维化药物Z与Y-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL；
步骤（2）将金属离子W与药物V及蛋白酶X按一定比例混合形成金属离子W介导配合物X-W-V，将负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL与金属离子W介导配合物X-W-V通过蛋白酶X上的巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰含有金属离子W的配位化合物，形成Z-Y-PEG-MAL-X-W-V；有助于纳米粒高效穿透气管中被过度分泌的粘液层；响应性释放的药物V能够缓解杯状细胞的氧化应激，降低粘液的分泌，提高纳米粒的递送效率；递送至深层的药物能够发挥抗纤维化的作用从而达到纤维化治疗的目的。
7.根据权利要求4所述的抗肺纤维化药物纳米制剂，其特征在于，Z-Y-PEG-MAL-X的制备方法如下：
步骤（1）首先将疏水性抗肺纤维化药物Z与Y-PEG-MAL混合，通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL；
步骤（2）将负载抗肺纤维化药物的纳米粒Z-Y-PEG-MAL与蛋白酶X进行接枝反应，通过蛋白酶X上的巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰蛋白酶X；纳米粒通过共价修饰的蛋白酶X，有助于纳米粒高效穿透气管中被过度分泌的粘液层；递送至深层的药物能够发挥抗纤维化的作用从而达到纤维化治疗的目的。
8.根据权利要求2所述的抗肺纤维化药物纳米制剂，其特征在于，Y-PEG-MAL-X-W-V的制备方法如下：
步骤（1）首先将Y-PEG-MAL通过薄膜分散法、直接滴定法或反向溶剂法制备纳米粒Y-PEG-MAL；
步骤（2）将金属离子W与药物V及蛋白酶X按一定比例混合形成金属离子W介导配合物X-W-V，将纳米粒Y-PEG-MAL与金属离子W介导配合物X-W-V通过蛋白酶X上的巯基和纳米粒外壳暴露的MAL反应，在纳米粒的外端共价修饰含有金属离子W的配位化合物，形成Y-PEG-MAL-X-W-V；有助于纳米粒高效穿透气管中被过度分泌的粘液层；响应性释放的药物V能够缓解杯状细胞的氧化应激，降低粘液的分泌，提高纳米粒的递送效率。
9.根据权利要求3-8任一项所述的抗肺纤维化药物纳米制剂，其特征在于，Y-PEG-MAL中，其中Y的分子量范围为1000-50000，PEG的分子量范围为200-10000；
和/或，所述抗肺纤维化药物纳米制剂的载药量在5-25%，粒径大小在20 nm-500 nm。
10.权利要求1-2任一项所述的纳米制剂载体、权利要求3-8任一项所述的抗肺纤维化药物纳米制剂在制备治疗肺纤维化疾病药物中的应用。
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