CN110382020A - 细胞递送系统及操作细胞递送系统的方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种制备与治疗性处理有关的注射器的方法。该方法可以包括将注射器的柱塞从注射器的针筒移除，在水平方向上对准针筒，并且通过近端处的开口用粘性材料填充针筒的腔的至少一部分。该方法还可以包括将植入装置附接至在针筒的远端处联接至针筒的针座。该方法还可以包括按压柱塞直到细胞悬液充满植入装置，并且细胞悬液的液滴从植入装置的远端尖端排出。

Description

细胞递送系统及操作细胞递送系统的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年12月28日提交的申请号为62/439,818的美国临时申请的权益，该美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开总体涉及细胞递送领域，并且更具体地，涉及一种用于将高粘度细胞悬液递送至与治疗性处理相关的受试者的细胞递送系统。

背景技术

干细胞移植是一种新型治疗性处理，其依赖于将活细胞递送至靶部位以恢复受损组织的功能。干细胞移植已显示出治疗神经系统疾病和损伤诸如中风、帕金森病、创伤性脑损伤、瘫痪和外周动脉疾病的潜力。一种常见的移植手术是将干细胞直接注射到患者体内。这种手术特别是在靶部位较小或难以接近时通常需要使用具有小规格针头的注射器。此外，许多医生更喜欢使用细针以使对靶部位的损害最小化。

因此，当需要使用细针精确地将高浓度的细胞施用于靶部位时，就会出现困难。例如，某些干细胞治疗涉及递送浓度大于每20,000细胞/μL的细胞以便有效。然而，使用针来抽取如此高浓度的细胞会导致针路径的阻塞，这反过来又会导致细胞损伤和治疗结果不一致。

因此，需要一种能够准确且可靠地递送用于移植的高密度细胞悬液的解决方案。这种解决方案可减少细胞损伤并改善治疗效果。

发明内容

公开了一种制备与治疗性处理有关的注射器的方法。该方法可以包括将注射器的柱塞从注射器的针筒中移除。针筒可以具有近端、远端和在近端和远端之间的腔。该方法可以包括在水平方向上对准针筒，并且通过近端处的开口用粘性材料(例如，细胞悬液)填充针筒的腔的至少一部分。细胞悬液可以是由编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的后代细胞悬液。可以通过将微量移液器的移液器尖端穿过近端处的开口插入到针筒的腔中并使用微量移液器将细胞悬液注射到腔内来填充腔。

该方法还可以包括将柱塞的柱塞尖端插入到腔中以密封腔。柱塞尖端可以包括化学惰性聚合物材料。化学惰性聚合物材料可以包括聚四氟乙烯(PTFE)。该方法进一步可以包括将插管附接至注射器的针座(hub)。针座可以在远端处联接至针筒。该方法还可以包括按压柱塞直到细胞悬液填充插管并且细胞悬液的液滴从插管的远端尖端排出。

该方法进一步可以包括丢弃从插管排出的细胞悬液的液滴。排出的液滴的体积可以在10μL至30μL之间。该方法可以包括在填充针筒的腔之前将细胞悬液重悬，其中重悬包括用移液器重复移取细胞悬液直至细胞悬液变得均匀。

还公开了一种将粘性材料(例如，细胞悬液)植入与治疗性处理有关的受试者中的方法。细胞悬液可以是由编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的后代细胞悬液。该方法可以包括将注射器的柱塞从注射器的针筒中移除。针筒可以具有近端、远端和在近端和远端之间的腔。该方法还可以包括通过近端处的开口用细胞悬液填充针筒的腔的至少一部分并且重新插入柱塞。该方法进一步可以包括在一个或多个沉积部位使用注射器将细胞悬液注射到受试者体内。该方法可以包括在随后的注射之前使注射器围绕注射器的纵向轴线转动。

该方法可以包括在用细胞填充腔的至少一部分之前在水平方向上对准针筒。方法可以包括按压柱塞直到细胞悬液填充在针筒的远端处联接至注射器的植入装置，并且在注射细胞悬液之前，细胞悬液的液滴从植入装置的尖端排出并且丢弃。植入装置可以是针或插管，并且尖端可以是针尖端或插管尖端。

该方法可以包括以每分钟约5μL至每分钟约15μL、每分钟至少10μL或每分钟10μL的注射速率在受试者的五个沉积部位注射约15μL至约25μL、至少20μL或20μL的细胞悬液。该方法可以包括在注射细胞悬液之前将注射器放入立体定位框架中。该方法可以包括使用留在针筒中的细胞悬液的弯液面测量注射的细胞悬液的量(例如，体积)。

公开了一种用细胞治疗受试者的方法。该方法可以包括将注射器的柱塞从注射器的针筒中移除。针筒具有近端、远端和在近端和远端之间的腔。该方法可以包括在水平方向上对准针筒。

该方法还可以包括通过近端处的开口用细胞填充针筒的腔的至少一部分。细胞悬液可以是由编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的后代细胞悬液。填充腔的至少一部分可以包括通过将微量移液器的移液器尖端穿过近端处的开口插入到针筒的腔中并使用微量移液器将细胞植入腔内。该方法还可以包括将柱塞尖端重新插入腔中。

该方法进一步可以包括在针筒的远端处将植入装置联接至注射器。该方法还可以包括按压柱塞直到细胞填充植入装置，并且细胞的液滴通过植入装置的远端从植入装置排出并丢弃。植入装置可以是细胞递送插管或针。

该方法可以包括将植入装置放入稳定插管中，然后进行使用注射器和植入装置在受试者的第一沉积部位将一定量的细胞注射到受试者体内的第一次注射。该方法可以包括在第一次注射步骤之后使注射器和/或植入装置围绕注射器的纵向轴线转动。该方法还可以包括，在第一次注射之后，将注射器和细胞递送插管中的至少一个缩回预定距离，然后进行使用注射器和细胞递送插管在受试者的第二沉积部位将另一量的细胞注射到受试者体内的第二次注射。该方法可以包括进一步的缩回和再注射步骤(例如，第三次注射、第四次注射、第五次注射等)。预定距离可以在约1mm和10mm之间。第一沉积部位或第二沉积部位可以在受试者的脑和/或脊髓中。

注射的细胞的量可以是约15μL至约25μL、至少20μL或20μL。注射速率可为每分钟约5μL至每分钟约15μL/分钟、每分钟至少10μL或每分钟10μL。注射的细胞可以包含由编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质细胞的后代细胞。该方法还可以包括使用留在针筒中的细胞的弯液面测量注射的细胞悬液的体积。

本文公开的任何方法均可以用于治疗创伤性脑损伤的治疗性处理。治疗性处理还可用于治疗缺血性损伤、视网膜变性、神经变性疾病或其组合。

附图说明

图1A示出用于递送细胞的注射器的变型。

图1B示出图1A的注射器的柱塞。

图2A示出当在水平方向上对准注射器的针筒时填充注射器的微量移液器。

图2B示出重新插入注射器的柱塞。

图3A示出细胞递送插管的变型的透视图。

图3B示出从图3A的细胞递送插管的针座突出的近侧延伸部的特写透视图。

图4A示出附接至注射器的细胞递送插管的具有配合连接器的针座。

图4B示出附接至注射器的细胞递送插管的变型。

图5示出由立体定位框架固定的细胞递送插管和注射器以及放置在稳定插管内的细胞递送插管。

图6示出靶部位附近的施用轨迹和沉积部位的示意图。

图7A示出制备用于植入与治疗性处理相关的细胞的注射器和细胞递送插管的方法的变型。

图7B示出制备用于植入与治疗性处理相关的细胞的注射器和细胞递送插管的方法中的附加步骤。

图8示出作为治疗性处理的一部分植入细胞的方法。

具体实施方式

图1A示出用于移植或植入细胞的注射器100可以包括柱塞102、针筒104和针座106。针筒104可成形为细长的圆柱形管。针筒104可以具有针筒近端114、针筒远端116以及位于针筒近端114与针筒远端116之间的腔118。在一个变型中，针筒104可以由诸如硼硅玻璃等的陶瓷材料构成或包括诸如硼硅玻璃等的陶瓷材料。在其它变型中，针筒104可以由诸如聚四氟乙烯(PTFE)等的聚合物构成或包括诸如聚四氟乙烯(PTFE)等的聚合物。

在一个变型中，针筒104的外径可以在约6.00mm至10.00mm的范围。针筒104的内径可以在约1.25mm至5.00mm的范围。

针座106可以在针筒远端116处联接至针筒104并且包括能够容纳并固定针124的配合连接器120。针座106可以是锁定针座并且可以由聚合物、金属或诸如镀镍黄铜的金属合金或其组合制成或者包括聚合物、金属或诸如镀镍黄铜的金属合金或其组合。配合连接器120可以是鲁尔锁定连接器，例如凸鲁尔接头，并且可以由诸如PTFE的聚合物构成或包括诸如PTFE的聚合物。配合连接器120的内部连续孔可以使得针124紧密地配合在内部。针座106可以用作注射器100和针124之间的接口。

针124的外径可以在约0.40mm至0.90mm的范围。针124的内孔直径可以在约0.10mm至0.35mm的范围。

针124的壁厚可以在约0.10mm至0.35mm的范围。在一个变型中，可以使用具有在27至33规格的范围的针124的汉密尔顿注射器。

针124的尖端可以具有各种点样式，例如尖点、斜面点、弯曲点、非取芯点、钝点和圆锥点中的至少一个。在一个变型中，针124的尖端可以是圆形，以减少细胞植入期间对脑组织的损伤。在一些变型中，可以使用诸如图3A的细胞递送插管300的插管来代替针124。

注射器100的总体积可以在约10μL至500μL的范围。注射器100的配药体积可以大于或等于注射器100的总体积的10％。在一个变型中，配药体积可以在约1μL至50μL的范围。注射器100还可以包括在针筒104的外表面上蚀刻或以其它方式限定的体积标记122或刻度等级。在一个变型中，注射器100可以是Gastight1700系列注射器，例如100μL型号1710TLL注射器(PN/REF：81027)。

图1B示出柱塞102可以从注射器100的针筒104移除或缩回。如图1B所示，柱塞102可以从针筒近端114移除或缩回。当柱塞102从针筒近端114移除或缩回时，可以通过针筒近端114处的开口进入针筒104内的腔118。

如图1B所示，柱塞102可以包括柱塞杆108、从柱塞杆108的近端附接或延伸的柱塞头部110以及在柱塞杆108的远端处的柱塞尖端112。柱塞102可以由金属、金属合金、聚合物、聚合物复合材料或其组合制成或包括金属、金属合金、聚合物、聚合物复合材料或其组合。例如，柱塞102可以由不锈钢制成或包括不锈钢。柱塞杆108可以被成形为细长的圆柱体。柱塞尖端112可以涂覆有化学惰性聚合物材料。化学惰性聚合物材料可以包括聚四氟乙烯(PTFE)。柱塞尖端112可以是精密加工的PTFE柱塞尖端。柱塞尖端112可以在插入到针筒104的腔118中时形成无泄漏或气密密封。当柱塞头部110被按压并且柱塞尖端112穿过腔118朝向针筒远端116行进时，柱塞尖端112还可以从腔118的径向表面移除或擦除细胞碎屑。注射器100的腔118可以通过在腔118的表面覆盖或涂覆PTFE而设计成基本上是化学惰性的。

图2A示出可以在水平方向上对准针筒104，作为制备与治疗性处理相关的注射器100的方法的一部分。该方法可以包括将注射器100的柱塞102从针筒104中移除并且在水平方向上对准针筒104。该方法进一步可以包括通过针筒近端114处的开口用细胞悬液206填充针筒104的腔118。

在一个变型中，细胞悬液206可以使用微量移液器200递送。微量移液器200可以包括移液器尖端202，移液器尖端202可以穿过针筒近端114处的开口插入到针筒104的腔118中。移液器尖端202可以是无菌的一次性塑料吸头，诸如气溶胶过滤器吸管吸头。

细胞悬液206可以结合细胞植入或移植程序通过针筒近端114装入到注射器100中。就本公开的目的而言，“移植”和“植入”是指将外源细胞引入受试者。外源细胞可以包括自体细胞和同种异体细胞。自体细胞可以从受试者获得，而同种异体细胞可以从受试者以外的个体获得。

细胞悬液206可以包括但不限于悬浮在缓冲溶液中的采集的细胞、培养的细胞、干细胞、基因工程细胞或其组合。缓冲溶液可以包括晶体溶液，例如来自百特国际公司(Baxter International Inc.)的勃脉力(Plasma-Lyte)

例如，细胞悬液206可以包括但不限于间充质细胞、间充质干细胞(MSC)、骨髓基质细胞(BMSC)、MSC或BMSC的后代细胞、其培养物或其组合。细胞悬液206或其前体可以从不同类型的结缔组织、脐带血、沃顿氏胶冻、脂肪组织或牙髓中采集。就本公开的目的而言，MSC可以指衍生自骨髓的粘附的非造血多能细胞。

细胞悬液206还可以包含来自骨髓贴壁干细胞(MASC)或人骨髓MSC的后代细胞，其中的任一种已经用编码Notch细胞内结构域(NICD)(例如，人Notch1细胞内结构域(NICD1))的载体瞬时转染，然后进行选择以及随后培养。此类细胞可称为NICD瞬时转染的MSC或DNTT-MSC的后代。DNTT-MSC还可以指由包括以下步骤的过程产生的细胞：提供MSC培养物、使MSC细胞培养物与包含编码NCID但不编码全长Notch蛋白的序列的多核苷酸接触、选择包含多核苷酸的细胞并在没有选择的情况下进一步培养所选择的细胞。例如，所选择的细胞可以在不存在任何添加的生长因子或分化因子(如果血清存在于培养基中，则除了可能存在于血清中的生长因子或分化因子)的情况下在标准培养基中进一步培养，可选择补充血清。该过程产生与其亲本MSC相比在体外显示出优异的血管生成和神经生成(即神经前体细胞的生长和分化)特性的细胞群体。细胞悬液206可以包括来自这种细胞群的细胞。

细胞悬液206可以包括下列中公开的细胞：于2006年1月24日发布的专利号为6,989,271的美国专利、于2010年3月23日发布的专利号为7,682,825的美国专利、于2013年1月29日发布的专利号为8,361,456的美国专利、于2012年3月13日发布的专利号为8,133,725的美国专利、于2016年3月3日发布的专利号为8,969,078的美国专利、于2016年7月26日发布的专利号为9,399,046的美国专利、于2016年9月13日发布的专利号为9,441,199的美国专利、于2012年1月10日发布的专利号为8,092,792的美国专利、于2015年2月3日发布的专利号为8,945,919的美国专利、于2014年7月22日发布的专利号为8,785,190的美国专利、于2016年5月3日发布的专利号为9,326,999的美国专利、于2017年5月23日发布的专利号为9,655,927的美国专利、于2017年11月28日发布的专利号为9,828,593的美国专利、于2017年5月2日发布的专利号为RE 46,382的美国专利、于2014年12月16日提交的申请号为14/572,177(公开号为US 2015/0104435 A1)的美国专利申请、于2016年6月24日提交的申请号为15/192,671(公开号为US 2016/0304835A1)的美国专利申请、于2010年8月23日提交的申请号为12/734,855(公开号为US2010/0310529)的美国专利申请、于2014年8月21日提交的申请号为14/465,344(公开号为US 2014/0363408A1)的美国专利申请、于2011年2月9日提交的申请号为12/736,665(公开号为US 2011/0136114A1)的美国专利申请、于2012年8月20日提交的申请号为13/589,849(公开号为US 2013/0210000A1)的美国专利申请、于2016年3月7日提交的申请号为15/063,290(公开号为US 2016/0263159A1)的美国专利申请、于2013年3月13日提交的申请号为13/800,585(公开号为US2014/0186316A1)的美国专利申请、于2014年9月13日提交的申请号为14/489,934(公开号为US 2015/0197741A1)的美国专利申请、于2014年4月3日提交的申请号为14/244,685(公开号为US 2014/0219976A1)的美国专利申请以及于2016年3月21日提交的申请号为15/076,378(公开号为US2016/0271181A1)的美国专利申请，所有这些美国专利和专利申请都通过引用整体并入本文。

涉及植入或移植干细胞或DNTT-MSC的治疗性处理可以通常涉及每次注射200万至1000万个细胞的递送或沉积。考虑到这些剂量，细胞悬液206可能太粘而不能通过注射器100的针124抽取并装入。例如，当通过针124的远端抽取时，细胞悬液206会堵塞针124。此外，通过针124抽取的细胞的活力可能受到施加在这种细胞上的剪切应力的不利影响。这样，通过注射器100的针筒近端114处的开口装入细胞悬液206提高了细胞存活力并且避免了设备故障。

另外，通过针筒近端114处的开口装入细胞悬液206还减少了不需要的气泡将随细胞悬液206一起注入的机会。这种不需要的气泡会破坏流动动力学、堵塞针124，并对细胞存活力产生不利影响。

当针筒104水平对准时，细胞悬液206可以通过针筒近端114装入到注射器100中。针筒104可以通过放置在平坦的水平表面上或由使用者握持而水平对准。水平对准针筒104而填充注射器100的一个益处是，细胞不太可能朝向针筒远端116沉降，并且倾向于沿着针筒104的长度均匀地分层。水平对准针筒104的另一个益处是缓冲溶液洗涤针筒并接触细胞悬液206中的更多细胞。水平对准针筒104的另一个益处是它可以防止细胞悬液206溢出或从针筒104中泄漏出来。

图2B示出在将细胞悬液206引入到针筒104的腔118中之后，柱塞102可以通过针筒近端114重新插回到针筒104中。当柱塞102重新插回到针筒104中时针筒104可以在水平定向对准。如图2B所示，柱塞尖端112可以通过针筒近端114重新插入腔118而无需将柱塞102进一步压入针筒104中。

图3A示出细胞递送插管300可以具有插管针座304，插管针座304构造成附接至注射器100的针座106。细胞递送插管300还可以包括填充插管300的内部容积的内管心针302、插管杆310和插管尖端308。

细胞递送插管300的外径可以在0.75mm至0.90mm之间和内径可在0.20mm至0.40mm之间。细胞递送插管300的长度可以在约15.0cm至20.0cm的范围。

细胞递送插管300可以由诸如304型不锈钢等的不锈钢构成或包括诸如304型不锈钢等的不锈钢。细胞递送插管300的内部体积可以在约15μL至50μL的范围。在一个变型中，内部体积可以为约20μL。插管杆310可以包括从插管针座304延伸到插管尖端308的腔。

例如，细胞递送插管300可以是或包括Pittsburgh细胞移植插管(协同零件号码SB 2023)的一部分。可以从插管针座304移除内管心针302以制备用于细胞植入或移植手术的细胞递送插管300。

图3B示出在从细胞递送插管300的腔移除内管心针302之后可以看到插管延伸部306。插管延伸部306可以从插管针座304突出。插管延伸部306可以是与细胞递送插管300的腔流体连通的刚性中空管。

插管延伸部306可以紧密地配合到注射器100的配合连接器120的内孔中。一旦插管延伸部306插入到注射器100的配合连接器120的孔中，细胞悬液206就可以直接通过注射器针座106、插管延伸部306和插管针座304从注射器100的腔118传递到细胞递送插管300的腔。

插管延伸部306的一个益处可以包括消除或减少插管针座304内的无效空间。针或插管针座内的无效空间可以保留注射后注射器中的大量样品。

图4A示出插管针座304可以包括配置成联接至配合连接器120的配合连接器。插管针座304的配合连接器可以由聚合材料，诸如不锈钢之类的金属或镀镍黄铜或其组合制成或包括聚合材料，诸如不锈钢之类的金属或镀镍黄铜或其组合。插管针座304的配合连接器可以是鲁尔锁定连接器，例如凹鲁尔接头。

图4B示出可以按压柱塞102以使细胞悬液206填充细胞递送插管300。可以按压柱塞102，直到细胞悬液206的液滴400通过插管尖端308从细胞递送插管300排出。虽然未在图中示出，但是本公开预期当针124而不是细胞递送插管300联接至注射器100时，按压柱塞102也可以使细胞悬液206填充针124并且细胞悬液206的液滴400可以从针124中排出。

液滴400的体积可以在10μL至40μL之间。例如，液滴400可以是约25μL。在将细胞悬液206注射到受试者体内之前，可以丢弃液滴400。排出细胞悬液206的液滴400的一些益处可以包括防止气泡被注射到受试者内并且消除细胞递送插管300中的无效空间。

注射器100的操作者，例如外科医生或手术室技术人员可以使用针筒104中的细胞悬液206的弯液面和针筒104上的标记122来确定递送的细胞悬液206的量以及剩余的细胞悬液206的量。

细胞递送插管300的插管尖端308可以包括可配置用于穿过脑组织的管心针。例如，插管尖端308可以是钝的或圆形的尖端。细胞递送插管300可以是如于2007年11月15日提交的申请号为11/940,868的美国专利申请(公开号为US 2008/0132878A1)中所述的细胞递送插管，其通过引用整体并入本文。

图5示出细胞递送插管300可被置于附接至立体定位框架502的稳定插管500内。在一个变型中，稳定插管500可以包括协同 SB2100稳定插管(密苏里州，圣查尔斯，协同公司)。注射器100也可以通过立体定位框架502或其它类型的框架固定。

稳定插管500可以是刚性的或比细胞递送插管300更具刚性。稳定插管500的长度可以短于细胞递送插管300的长度。

例如，细胞递送插管300的长度可以为约19cm。这样的长度对于细胞植入脑组织是有用的。在该示例中，稳定插管500的长度可以为约15cm或16cm。

稳定插管500的外径可以在约0.8mm至2.0mm的范围。在一个变型中，稳定插管500的外径可以约为1.5mm。稳定插管400的内部容积可以在约80μL和120μL之间。

稳定插管500可以具有双向旋塞、可移除的管心针或其组合。可移除管心针的直径可以等于细胞递送插管300的外径。

稳定插管500可以安装在立体定向框架502中或以其它方式固定。在一个变型中，立体定向框架502可以是莱克赛尔G型立体定向框架(GA，亚特兰大，医科达(Elekta)器械)。立体定位框架502可以包括安装稳定插管500的止挡部和引导部。在一个变型中，止挡部可以是止挡部(医科达零件号码48764-10)和引导部可以是引导部(医科达零件号码50150)。

稳定插管500首先可以插入受试者的组织中。例如，稳定插管500可以从沉积部位604插入受试者约4.00cm至10.0cm(参见图6)。然后，细胞递送插管300可以插入稳定插管500中，并且细胞递送插管300的插管尖端308可以从稳定插管500中伸出并且前进到靶部位600(参见图6)或远离靶部位600的部位。注射器100可以联接至细胞递送插管300，细胞递送插管300插入到稳定插管400中。

图6示出细胞悬液206可以被植入在与治疗性处理相关的受试者中的靶部位600处或附近。通过在靶部位600处或附近沉积一定量的细胞悬液206，细胞悬液206可以被植入受试者中。细胞悬液206可以使用注射器100和针124或细胞递送插管300植入。

靶部位600可以是损伤部位、推荐的施用部位或受试者体内的任何器官或组织区域。例如，当靶部位600是损伤部位时，损伤部位可以根据正在治疗的疾病或病症而不同。当正在治疗的疾病是中枢神经系统(CNS)疾病，例如中风、帕金森病或亨廷顿氏病时，损伤部位可以是基底神经节内的部位。在脑损伤的治疗中，损伤部位可以是病变处或病变附近的神经组织。在视网膜损伤的治疗中，损伤部位可以是玻璃体腔或视网膜下腔。

图6示出靶部位600附近的三个施用轨迹602。施用轨迹602可以是受试者体内的施用路径或通路。每个施用轨迹602可以包括多个沉积部位604或由多个沉积部位604限定，该沉积部位604包括初始沉积部位606和最终沉积部位608。施用轨迹602可以是直的、弯曲的或其组合。临床医生或使用者可以在手术之前预先确定施用轨迹602。

如图6所示，沉积部位604可以分开部位间隔距离610。部位间隔距离610的范围可以从约2.0mm到10.0mm。例如，部位间隔距离610可以约为5.0mm。在一个变型中，部位间隔距离610可以是沿着一个施用轨迹602的相同距离。在其它变型中，部位间隔距离610可以沿着一个施用轨迹602而变化。部位间隔距离610也可以针对不同的施用轨迹602而变化。

图6还示出治疗性处理可包括围绕靶部位600的三个施用轨迹602，其中施用轨迹602中的每一个包括在五个沉积部位608处的细胞悬液206的五次注射。例如，细胞悬液206可以包括干细胞或干细胞的后代诸如DNTT-MSC，并且施用轨迹602中的每一个可以包括以每分钟10μL的速率的五次20μL的沉积。使用者可以使用注射器100的针筒104中的剩余细胞悬液206的弯液面和针筒104上的标记122来测量注射或沉积的细胞悬液206的量。

如图6中所示，初始沉积部位606可以位于靶部位600远侧的地方或位置。出于本公开的目的，靶部位600的远侧可以指经过靶部位600、远离操作或控制注射器100的使用者例如外科医生或医务人员的地方或位置。在其它变型中，初始沉积部位606可以位于靶部位600附近的地方或位置，该地方或位置是靶部位600之前最靠近使用者的地方或位置。

治疗性处理可以涉及将插管尖端308或针124的尖端推进到初始沉积部位606并在初始沉积部位606处注射一定量的细胞悬液206。插管尖端308或针尖端124可以使用磁共振成像(MRI)、超声波或其组合来引导。

当初始沉积部位606位于靶部位600的远端时，插管尖端308或针尖端可以缩回的距离基本上等于部位间隔距离610的距离。当使用细胞递送插管300时，插管尖端308可以在使用者调整细胞递送插管300相对于稳定插管500的位置时或在使用者调整稳定插管500相对于立体定向框架502的位置时缩回。插管尖端308或针124的尖端可以在靠近初始沉积部位606的方向上收回或拉动。

治疗性处理还可以涉及使用者在靠近初始沉积部位606的随后的沉积部位604处注射另一量的细胞悬液。在一些变型中，使用者可以在后续注射之前使注射器100的针筒104或者注射器100和细胞递送插管300都围绕注射器100的纵向轴线转动。例如，注射器100的针筒104或注射器100的针筒104和细胞递送插管300都可以沿顺时针或逆时针方向成角度地转动。在特定变型中，转动可以是约45度的顺时针或逆时针转动。在其它变型中，转动可以是约90度的顺时针或逆时针转动。可以转动注射器100和细胞递送插管300以防止留在注射器100和细胞递送插管300中的细胞悬液206沉降或堵塞。

治疗性处理可以涉及使用者在每次注射后缩回并转动注射器100或者注射器100和细胞递送插管300两者，直到针124的尖端或插管尖端308到达最终沉积部位608。在一个变型中，最终沉积部位608可以是靠近靶部位600的地方或位置。在其它变型中，最终沉积部位608可以是靶部位600处或之内的地方或位置或靠近初始沉积部位606但仍在靶部位600远端的地方或位置。在附加的变型中，最终沉积部位608可以是初始沉积部位606远端的地方或位置。一旦在最终沉积部位608处沉积或注射完成，针124或细胞递送插管300和稳定插管500的组合可以缩回到受试者体外。

虽然图6中示出三个施用轨迹602，但是本领域普通技术人员应理解的是，施用轨迹602的数量和沉积部位608的数量可以根据施用的细胞、治疗方案以及为特定治疗施用的治疗有效量的细胞而变化。如本文所用，“治疗有效量”或“治疗量”可以指降低与特定状况或病症相关的症状的严重性的移植或植入的细胞的数量或量。治疗有效量可以随损伤的类型和程度以及受试者的总体状况而变化。

治疗有效量的细胞可以指约2.0百万细胞至3,000万细胞之间的剂量。例如，当施用的细胞或细胞悬液206包含干细胞或干细胞的后代如DNTT-MSC时，治疗有效量的细胞可以包括250万个细胞、500万个细胞或1000万个细胞中的任意一种。

治疗有效量的干细胞或干细胞的后代，诸如DNTT-MSC可以被施用于损伤部位以治疗神经变性疾病、紊乱或与中枢神经系统(CNS)相关的病情。这些疾病、紊乱或CNS病情可以包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、创伤性脑损伤(TBI)、中风(缺血性和/或出血性)和脊髓损伤。

例如，DNTT-MSC可以合成并分泌促进神经元生成(新神经元的形成)和血管生成(新血管的形成)的因子。DNTT-MSC可以释放生物活性成纤维细胞生长因子(FGF2)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。间充质细胞包含大量的细胞内FGF2和FGF2异构体库，其可以对损伤组织部位发挥神经生成和血管生成作用。FGF2还可以是血管生成的有效诱导物和伤口愈合介质。将MSC及其衍生物或后代植入损伤的CNS部位所产生的治疗效果除其它外尤其可归因于从活体植入细胞分泌可溶性因子、植入细胞死亡后释放可溶性细胞内因子、通过植入细胞调节免疫功能、通过植入细胞产生神经支持性细胞外基质、以及通过植入细胞形成内源神经原细胞从神经源性生态位迁移至损伤部位的途径。

在示例性治疗中，可以在一次植入手术中植入约2百万到1千万个DNTT-MSC。此类治疗可以涉及在靶部位600处或附近的多个施用轨迹602，其中每个此类施用轨迹602包括多个沉积部位608。沉积部位608处的每次沉积或注射可以包括约10μL至20μL的细胞悬液206。例如，每个施用轨迹602可以递送总共100μL的细胞悬液206。

DNTT-MSC可以作为用于中风恢复的同种异体细胞治疗的一部分施用，中风恢复包括用于缺血性或出血性中风。DNTT-MSC可以促进脑内缺血组织的再灌注。例如，将治疗量的DNTT-MSC移植到脑中的缺血性损伤部位可以产生新的血管生长。

含有干细胞或DNTT-MSC的细胞悬液206也可以被植入在与创伤性脑损伤(TBI)的治疗性处理相关的受试者的靶部位600处或附近。在这样的治疗中，沉积部位608可以位于与损伤周围皮质区域或内侧皮质对应的区域中。例如，DNTT-MSC或其它干细胞或其衍生物可以被植入到损伤部位远端或近端的半影区内。此外，DNTT-MSC或其它干细胞可以被植入到受损伤影响的运动通路附近。

另外，DNTT-MSC治疗上的有效量可以通过在神经源性生态位(例如，脑室下区(SVZ)或齿状回)与脑损伤部位之间形成生物桥以促进康复来改善运动功能和神经系统功能。移植的DNTT-MSC可以作为用于从神经源性生态位到脑损伤部位的宿主神经原细胞的远距离迁移的也称为生物桥的瞬时通路。治疗量的DNTT-MSC可以通过诸如颅内注射的直接注射方法局部施用以治疗上述病症。

含有干细胞或DNTT-MSC的细胞悬液206也可以被植入在与视网膜变性的治疗性处理有关的受试者眼睛中的靶部位600处或附近。例如，DNTT-MSC可以被植入到受试者的眼睛中以治疗包括但不限于下列的各种类型的视网膜变性病症：视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、乌谢尔(Usher)综合征、发身期前[视网膜]黄斑变性(Stargardt’sdisease)、无脉络膜症、巴-比二氏综合征(Bardet-Biedl syndrome)、雷夫叙姆病(Refsumdisease)、贝斯特氏病(Best’s disease)或小口氏病(Oguchi disease)。例如，包含DNTT-MSC的细胞悬液206可以施用于受试者的眼睛，以增强眼睛的某些光感受器活性或功能。而且，例如，包含DNTT-MSC的细胞悬液206可以施用于受试者的眼睛，以增强从视网膜到大脑视觉皮层的视觉信号的传递。在这样的治疗中，细胞悬液206可以直接使用注射器100的针124移植到受试者的眼睛中。在一个变型中，具有30号针的注射器可以用于将DNTT-MSC注入包括玻璃体腔或视网膜下腔的受试者的眼睛。

图7A示出制备与治疗性处理相关的注射器100和细胞递送插管300的方法700。方法700可以包括在步骤702中将细胞递送插管300的插管针座304附接至注射器针座106并且紧固插管针座304。在一个变型中，注射器100可以是100μL注射器和细胞递送插管300可以是匹兹堡细胞植入插管(PIC)。方法700还可以包括在步骤704中通过细胞递送插管300的插管尖端308吸入缓冲液来用缓冲液填充注射器100的针筒104的腔118的至少一部分。缓冲液可以包括勃脉力(Plasma-Lyte)可以提供包括约1mL的增量的各种量的缓冲剂。

方法700还可以包括在步骤706中按压注射器100的柱塞102以将缓冲液引入或递送到针筒104中。步骤704和706可以重复几次以冲洗注射器100和细胞递送插管300。此时，临床医生或外科医生可以检查附接至细胞递送插管300的注射器100，以确认细胞递送插管300正确地附接至注射器100，从而使插管300不会抽取气泡。在排出缓冲液之后，步骤706还可以包括通过插管尖端308重复吸入和排出空气，直到注射器100中没有残留缓冲液。

方法700进一步可以包括在步骤708中将插管针座304与注射器针座106分离并且将柱塞102从注射器100的针筒104中移除。柱塞102和细胞递送插管300可以放在一边。方法700可以包括在步骤710中在水平方向上对准针筒104并将针筒104放置在无菌平坦表面上。方法700还可以包括在步骤712中将无菌气溶胶移液器尖端202固定到微量移液器200，并且向下按压移液器柱塞204抽取缓冲液。无菌气溶胶移液器尖端202可以是无菌的一次性塑料吸头，例如气溶胶过滤器移液器尖端。在一个变型中，微量移液器200可以是20-200μL热电科学芬兰雷勃(Finnpipette)微量移液器。例如，微量移液器200可以设置为125μL以吸取125μL的勃脉力缓冲液。

方法700进一步可以包括将微量移液器200的移液器尖端202插入到水平对准的针筒104的腔118中。在步骤714中，微量移液器200的移液器尖端202可以通过针筒近端114插入到腔118中，并且缓冲液可以被注入腔118。移液器尖端202可以直接被压入针筒近端114中。缓冲液可被缓慢注入以防止缓冲液从针筒远端116排出。方法700还可以包括在步骤716中将移液器尖端202从针筒近端114移除并且将柱塞尖端112插入到针筒近端114处的腔118中以密封腔118。可以立即插入柱塞尖端112，直到针筒近端114的开口被密封。

方法700进一步可以包括在步骤718中将细胞递送插管300的插管针座304附接至注射器针座106并且按压柱塞102以从注射器100和细胞递送插管300排出缓冲液。当排出缓冲液时，柱塞102可以缓慢按下。此外，还可以吸入并且排出空气以清除注射器100和细胞递送插管300的缓冲液。

图7B示出制备与治疗性处理相关的注射器100和细胞递送插管300的方法的第二部分。方法700的第二部分可以包括在步骤720中在用移液器移取细胞悬液206之前将无菌气溶胶移液器尖端202固定在微量移液器200的端部上并将移液器柱塞204向下按压至第一止挡部。例如，微量移液器200可以是200μL的热电科学芬兰雷勃TM微量移液器。在一个变型中，微量移液器200可以吸取125μL的细胞悬液206。

方法700还可以包括在步骤722中用移液器移取细胞悬液206轻轻地上下移动几次直至悬液变得均匀。在一个变型中，细胞悬液206可以包括干细胞或干细胞的后代，诸如DNTT-MSC。例如，可以在步骤722中通过使用微量移液器200反复用移液器上下移动细胞来重新悬浮125μL的DNTT-MSC。还可以检查细胞悬液206的气泡。

方法700进一步可以包括在步骤724中将柱塞102从注射器100的针筒104移除。柱塞102可以通过将柱塞102的一部分从针筒104的腔118中拉出穿过针筒近端114来移除。方法700还可以包括在步骤726中在水平方向上对准针筒104。

方法700进一步可以包括在步骤728中通过针筒近端114处的开口用细胞悬液206填充针筒104的腔118的至少一部分。腔118可以通过针筒近端114处的开口将微量移液器200的移液器尖端202插入到腔118中并且缓慢地将细胞悬液206注入腔118中来填充。

在步骤730中，在递送细胞悬液206之后，微量移液器200的移液器尖端202可以通过针筒近端114从腔118移除，并且柱塞102的柱塞尖端112可以插入到针筒近端114的开口中以密封腔118。柱塞尖端112可以仅稍微插入腔118中或仅插入到针筒近端114处的开口被密封。

方法700还可以包括在步骤732中将细胞递送插管300的插管针座304附接至注射器针座106并且紧固插管针座304。方法700进一步可以包括在步骤734中按压柱塞102直到细胞悬液206充满细胞递送插管300并且细胞悬液206的液滴400从插管尖端308排出。例如，当125μL细胞悬液206最初被引入注射器100中时，柱塞102可以缓慢地被按压直到细胞悬液206的弯液面处于或接近注射器100的100μL标记。在这种情况下，排出的细胞悬液206的液滴400可以相当于约25μL，使得约100μL的细胞悬液206保留在注射器针筒104中。可以使用一片无菌纱布来吸去细胞悬液206的液滴400。虽然未在图中示出，但是本公开预期方法700的某些步骤也可以通过联接至注射器100的针124而不是联接至注射器100的细胞递送插管300来执行。

图8示出一种将细胞悬液206植入与治疗性处理相关的受试者中的方法800。方法800可以包括在步骤802中将与填充有细胞悬液206(诸如来自方法700的步骤734中的细胞悬液206)的注射器100附接的细胞递送插管300插入稳定插管500中。稳定插管500可以安装在立体定向框架502中。在一个变型中，立体定向框架502可以是G型立体定向框架(GA，亚特兰大，医科达(Elekta)器械)。方法800还可以包括在步骤804中将一定量的细胞悬液206注射到受试者的初始沉积部位606。在一个变型中，DNTT-MSC可以沿着一个施用轨迹602以每分钟10μL的速率进行5次20μL的沉积注射。

方法800还可以包括在步骤806中使用留在注射器110的针筒104中的细胞悬液206的弯液面测量注射的细胞悬液206的体积或量。方法800还可以包括在步骤808中在每次注射之后，将注射器100和细胞递送插管300缩回距随后的沉积部位604诸如部位间隔距离610的预定距离。例如，细胞递送插管300可在每次注射或沉积之后缩回约5.0mm。方法800还可以包括在步骤810中使注射器100的针筒104(和连接的细胞递送插管300)围绕注射器100的纵向轴线转动。注射器100可以顺时针或逆时针转动约45°至90°。转动注射器100的一个益处包括防止细胞悬液206中的细胞沉淀出悬液。

方法800进一步可以包括在步骤812中将额外量的细胞悬液206注射到后续沉积部位604中。每次沉积中的细胞悬液206的量和沉积部位的数量可以随每次处理而变化。在一个变型中，细胞悬液206可以以每分钟10μL的速率注射，并且每次沉积可以包含约20μL的细胞悬液206。在该变型中，可以沿着一个施用轨迹602进行五次沉积以进行100μL的总沉积。植入时间的范围可以为约50分钟至70分钟，其中从细胞制备到最终植入的最大允许时间为180分钟。

方法800还可以包括在步骤814中将细胞悬液206注射到最终沉积部位608之后将细胞递送插管300从稳定插管500移除。在最后沉积部位608处的最后一次沉积之后，细胞递送系统可以准备进行额外的植入。可以使用一小瓶缓冲液诸如勃脉力通过方法700中描述的过程(参见图7A)冲洗细胞递送系统(包括注射器100和细胞递送插管300)。额外的细胞悬液206可以从第二小瓶或等分试样的细胞提供并根据方法700的步骤722重新悬浮(参见图7B)。可以为下一施用轨迹602重新定位稳定插管500。注射器100和细胞递送插管300可以使用方法700中描述的过程用额外的细胞悬液206来填充。可以根据施用轨迹的数量602按需重复该方法和步骤。

本文所述的方法可有效地将作为治疗性处理的一部分的粘性细胞悬液，例如干细胞或干细胞衍生物，例如DNTT-MSC递送给患者。图7A、图7B和图8中描绘的流程图不需要所示的特定顺序来实现期望的结果，并且某些步骤可以并行发生、省略或组合执行。

本文描述和示出的各个变型中的每一个具有可以容易地与任何其它变型的特征分离或与任何其它变型的特征组合的离散部件和特征。可以进行修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、过程动作或步骤适应本发明的目的、精神或范围。

本文所述的方法可以以逻辑上可能的所述事件的任意顺序以及所列举的事件顺序来执行。例如，附图中描绘的流程图不需要所示的特定顺序来实现所需的结果。此外，可以提供额外的步骤或操作，或者可以删除步骤或操作以实现期望的结果。

在提供数值范围的情况下，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该所述范围内的任何其它所述或中间值都包含在本发明内。而且，所描述的本发明变型的任意可选特征可以独立地阐述和要求保护，或者与本文描述的任意一个或多个特征组合。

除非本主题可能与本发明的主题相冲突(在这种情况下，本文中存在的内容为准)，否则本文提及的所有现有主题(例如，出版物、专利和专利申请)通过引用整体并入本文。提供的引用的事项仅仅是为了在本申请的提交日之前公开。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些材料。

对单数项目的引用包括存在多个相同项目的可能性。更具体地，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”包括复数指示物。还注意的是，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，本声明旨在用作与权利要求要素的叙述或使用“否定”限制有关的“单独”、“仅”等专用术语的先行基础。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

本公开不旨在限于所阐述的特定形式的范围，而是旨在覆盖本文描述的变型的替代、修改和等同方案。此外，本公开的范围完全涵盖了鉴于本公开内容对于本领域技术人员而言可能变得显而易见的其它变型。本发明的范围仅限于所附权利要求。

Claims (33)

1.一种制备与治疗性处理有关的注射器的方法，所述方法包括：

将所述注射器的柱塞从所述注射器的针筒移除，其中所述针筒具有近端、远端和在所述近端与所述远端之间的腔；

在水平方向上对准所述针筒；

通过所述近端处的开口用粘性材料填充所述腔的至少一部分；

将所述柱塞的柱塞尖端插入所述腔以密封所述腔；

将植入装置附接至所述注射器的针座，其中所述针座在所述远端处联接至所述针筒；以及

按压所述柱塞直到所述粘性材料充满所述植入装置，并且所述粘性材料的液滴通过所述植入装置的远端尖端从所述植入装置排出。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括丢弃从所述植入装置排出的所述粘性材料的所述液滴。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述液滴的体积在10μL和30μL之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述粘性材料是细胞悬液。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞悬液包括由编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的后代细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在填充所述针筒的所述腔之前所述粘性材料被重悬，其中重悬所述粘性材料包括用移液器重复移取所述粘性材料。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述植入装置是针和插管中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述柱塞尖端包括化学惰性聚合物材料。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述化学惰性聚合物材料是PTFE。

10.根据权利要求1所述的方法，其中填充所述腔的至少一部分包括通过所述近端处的开口将微量移液器的移液器尖端插入所述针筒的腔中，并且使用所述微量移液器将所述粘性材料注入所述腔中。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗性处理包括创伤性脑损伤的治疗、缺血性损伤的治疗、视网膜变性的治疗和神经变性疾病的治疗中的至少一种。

12.一种将粘性材料植入与治疗性处理相关的受试者中的方法，所述方法包括：

将注射器的柱塞从所述注射器的针筒移除，其中所述针筒具有近端、远端和在所述近端与所述远端之间的腔；

通过所述近端处的开口用粘性材料填充所述针筒的腔的至少一部分并且重新插入所述柱塞；

将针或插管联接至所述注射器的所述针筒的所述远端；

在一个或多个沉积部位处使用所述注射器将所述粘性材料注射到所述受试者体内；以及

每次注射后使所述注射器围绕所述注射器的纵向轴线转动。

13.根据权利要求12所述的方法，其中对于在多于一个沉积部位处的注射，所述方法进一步包括在每次注射之后使所述注射器围绕所述注射器的纵向轴线转动。

14.根据权利要求12所述的方法，进一步包括在用所述粘性材料填充所述腔的至少一部分之前在水平方向上对准所述针筒。

15.根据权利要求12所述的方法，进一步包括按压所述柱塞直到所述粘性材料充满在所述针筒的远端处、联接至所述注射器的所述针，并且在注射所述粘性材料之前，所述粘性材料的液滴通过针尖端从所述针被排出并且丢弃。

16.根据权利要求12所述的方法，其中注射所述粘性材料包括以每分钟至少10μL的注射速率在所述受试者的五个沉积部位处注射至少20μL或20μL的所述粘性材料。

17.根据权利要求12所述的方法，进一步包括在注射所述粘性材料之前将所述注射器放入立体定位框架中。

18.根据权利要求12所述的方法，进一步包括使用留在所述针筒中的所述粘性材料的弯液面测量注射的所述粘性材料的体积。

19.根据权利要求12的方法，其中所述治疗性处理包括创伤性脑损伤的治疗、缺血性损伤的治疗、视网膜变性的治疗和神经变性疾病的治疗中的至少一种。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述粘性材料是细胞悬液。

21.根据权利要求20的方法，其中所述细胞悬液包括由编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的后代细胞。

22.一种用细胞治疗受试者的方法，所述方法包括：

将注射器的柱塞从所述注射器的针筒移除，其中所述针筒具有近端、远端和在所述近端与所述远端之间的腔；

通过所述近端处的开口用所述细胞填充所述腔的至少一部分；

在所述针筒的所述远端处将植入装置联接至所述注射器；

使用所述注射器和所述植入装置在所述受试者的第一沉积部位将一定量的所述细胞注射到所述受试者体内；

使所述注射器和所述植入装置中的至少一个围绕纵向轴线转动；以及

使用所述注射器和所述植入装置在所述受试者的第二沉积部位将另一量的细胞注射到所述受试者体内。

23.根据权利要求22所述的方法，进一步包括在用所述细胞填充所述腔的至少一部分之前在水平方向上对准所述针筒。

24.根据权利要求22所述的方法，进一步包括按压所述柱塞直到所述细胞充满所述植入装置，并且在注射所述细胞之前，所述细胞的液滴通过所述植入装置的远端尖端从所述植入装置被排出并丢弃。

25.根据权利要求22所述的方法，进一步包括在所述第一沉积部位注射之后将所述注射器和所述植入装置中的至少一个缩回预定距离。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述预定距离在1mm和10mm之间，并且所述第一沉积部位和所述第二沉积部位中的至少一个在所述受试者的脑中。

27.根据权利要求22所述的方法，进一步包括在注射所述细胞之前将所述植入装置放入稳定插管中。

28.根据权利要求22所述的方法，进一步包括使用留在所述针筒中的所述细胞的弯液面测量注入的所述细胞的量。

29.根据权利要求22所述的方法，其中填充所述腔的至少一部分包括通过所述近端处的开口将微量移液器的移液器尖端插入所述针筒的所述腔中，并且使用所述微量移液器将所述细胞注射到所述腔中。

30.根据权利要求22的方法，其中在每个沉积部位注射的所述细胞的所述量是20μL。

31.根据权利要求22的方法，其中所述细胞包括由编码Notch细胞内结构域的多核苷酸瞬时转染的间充质干细胞的后代细胞。

32.根据权利要求22所述的方法，其中所述植入装置是插管和针中的至少一种。

33.根据权利要求22所述的方法，其中所述植入装置是插管，其中所述插管包括近端和远端，其中所述近端包括插管针座，其中所述插管针座包括插管延伸部，所述插管延伸部与所述插管的所述腔流体连通并且从所述插管针座突出使得其在所述注射器的远端处延伸到所述注射器的所述腔中。