CN110376380B - 一种电化学酶联免疫传感器及其制备与检测抗原的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电化学酶联免疫传感器及其制备与检测抗原的应用，属于蛋白检测技术领域。本发明制备了一种电化学酶联免疫探针，将抗原加入到磁珠与捕获抗体的生物共轭物中进行孵育，在外加磁场条件下移除上层清液后，加入纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物进行孵育，经过双抗体夹心反应后，即得到电化学酶联免疫探针。将该探针的分散液修饰在碳糊基底电极表面，得到电化学酶联免疫传感器，本发明所提出的电化学酶联免疫传感器(MB‑eElisa)的线性范围为：0.01‑6.0ng mL^‑1，检出限为：4.0pg mL^‑1(S/N＝3)；与现有的电化学免疫检测方法对比，该方法具有较低的检出限和较高的灵敏度。

Description

一种电化学酶联免疫传感器及其制备与检测抗原的应用

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，更具体地，涉及一种电化学酶联免疫传感器及其制备与检测抗原的应用。

背景技术

抗原是指能够刺激生命机体的免疫系统，诱导发生免疫反馈，产生体液免疫的抗体或细胞免疫的效应淋巴细胞，并在体内外与其反应的一类物质。此外，抗原在肿瘤疾病诊断和临床治疗方面具有十分重要的理论研究意义。目前发现与肿瘤疾病相关的抗原有很种，例如，癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异蛋白(PSA)、糖链抗原(CA19-9)，其中，CEA是目前肿瘤疾病最为广谱适用的检测对象，它是一种分子量约为200kDa的细胞表面糖蛋白，作为临床上诊断结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌和胰腺癌等疾病的典型肿瘤标志物。然而，抗原CEA在健康人的血液中一般呈现出非常低的含量(0-2.5ng mL^-1)；此外，在早期肿瘤形成过程中，抗原CEA在人体血液中的含量只会发生微小的变化。因此，抗原的临床测定应该具备快速、准确、高灵敏和高特异性等特点，以便于能够在复杂的生物样品中检测到抗原含量的微小变化。

电化学免疫传感技术具有便携、响应快、高灵敏和低成本等优点，因此其最常被应用于抗原的测定。然而，先前报道的大多数抗原电化学免疫传感器一般是在传感电极界面直接构筑的，这在应对复杂生物样品检测时常常会面临如下一些问题：冗长繁琐的检测步骤、低的检测通量和电极界面易于被蛋白质钝化等。研究表明，将磁珠(MB)引入到电化学免疫传感体系中，可以有效避免电极界面的钝化并且也可以简化免疫检测流程。相对于固定化的电极传感界面，MB在溶液中具有更快的反应动力学、更大的比表面积和更好的稳定性；此外，仅仅通过简单的化学反应和外加磁场清洗操作，在MB表面就可以很容易的修饰上各种各样的官能团、DNA、酶或抗体等。现有的研究表明，MB可以结合DNA探针或者抗体分子，已经被广泛地应用于DNA和生物蛋白的测定。但是，当前MB基电化学免疫传感器的信号放大策略绝大多数是依靠辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢(H₂O₂)的还原反应。然而，虽然HRP能够用多种氧化还原介质催化H₂O₂还原，但是H₂O₂的直接还原电位通常和这些介质很接近，导致了这种酶型传感器具有相对较差的信噪比，这非常不利于抗原的高灵敏测定。因此，如何快速、准确、高灵敏和高特异性测定复杂生物样品中抗原的含量依旧是人们关注的热门课题。

发明内容

本发明解决了现有技术中电化学免疫传感器检测灵敏度和准确性不高，以及特异性不强的技术问题。本发明制备了一种电化学酶联免疫探针，将抗原加入到磁珠与捕获抗体的生物共轭物中进行孵育，在外加磁场条件下移除上层清液后，加入纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物进行孵育，经过双抗体夹心反应后，即得到电化学酶联免疫探针。将该探针的分散液修饰在碳糊基底电极表面，得到电化学酶联免疫传感器，该传感器用于抗原检测时具有较低的检出限和较高的灵敏度。

根据本发明第一方面，提供了一种电化学酶联免疫探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)磁珠与捕获抗体的生物共轭物的制备：将磁珠与捕获抗体进行孵育，使所述捕获抗体与磁珠共价连接，再加入封闭蛋白，所述封闭蛋白用于封闭所述磁珠表面未被捕获抗体键合的基团，得到磁珠与捕获抗体的生物共轭物；

(2)纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物的制备：将检测抗体和至少一种酶加入到纳米金溶液中，使检测抗体和酶共价连接到所述纳米金表面，再加入封闭蛋白，所述封闭蛋白用于封闭所述纳米金表面裸露的位点，得到纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物；

(3)电化学酶联免疫探针的制备：将抗原加入到步骤(1)得到的磁珠与捕获抗体的生物共轭物中进行孵育，所述抗原与所述捕获抗体以及与检测抗体能特异性地结合；在外加磁场条件下移除上层清液后，再加入步骤(2)得到的纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物进行孵育，经过双抗体夹心反应后，即得到电化学酶联免疫探针。

优选地，步骤(1)和步骤(2)所述的封闭蛋白为牛血清蛋白；所述酶为碱性磷酸酶、DT-心肌黄酶、辣根过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。

按照本发明的另一方面，提供了任一所述方法制备得到的电化学酶联免疫探针。

按照本发明的另一方面，提供了一种电化学酶联免疫传感器的制备方法，将所述的电化学酶联免疫探针的分散液滴涂在基底电极表面，所述基底电极为碳糊电极，待所述分散液晾干后，使所述电化学酶联免疫探针修饰在基底电极表面，即得到电化学酶联免疫传感器。

优选地，所述基底电极为氧化锌石墨烯纳米复合物修饰的碳糊电极。

按照本发明的另一方面，提供了所述方法制备得到的电化学酶联免疫传感器。

按照本发明的另一方面，提供了所述电化学酶联免疫传感器用于检测抗原的应用。

优选地，将所述电化学酶联免疫传感器置于含有底物的电解质中孵育，使所述底物与传感器表面的探针中的酶发生酶解反应，检测酶解产物的电化学信号，并计算得到所述抗原的浓度。

优选地，所述电解质中含有表面活性剂；

优选地，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠。

优选地，所述抗原为癌胚抗原、甲胎蛋白或前列腺特异蛋白；所述酶为碱性磷酸酶，所述底物为苯基磷酸盐；

优选地，所述底物为1-萘基磷酸盐或苯二基磷酸盐。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明解决了现有技术(固定化的电极传感界面)存在的冗长繁琐的检测步骤、低的检测通量和电极界面易于被蛋白质钝化等问题。本发明所提出的电化学酶联免疫传感器(MB-eElisa)的线性范围为：0.01-6.0ngmL^-1，检出限为：4.0pg mL^-1(S/N＝3)；与现有的电化学免疫检测方法对比，该方法具有较低的检出限和较高的灵敏度。此外，该传感器被应用于健康人和肿瘤病人血清中抗原(CEA)的测定，与标准检测方法(商业化的人CEA试剂盒)对比后，其测试结果具有很好的准确性。

(2)本发明中的电化学酶联免疫传感器，将磁珠(MB)引入到该体系中，可以有效避免电极界面的钝化并且也可以简化免疫检测流程。此外，利用纳米金与蛋白高度结合特性，可以实现其与检测抗体和酶进行高效结合。

(3)本发明优选地，利用高信噪比/可再生的氧化锌石墨烯纳米复合物修饰碳糊电极(ZnO@rGO/CPE)来构建一种碱性磷酸酶(ALP)信号转导的磁珠电化学酶联免疫传感器(MB-eElisa)，其具体制备方法为在电化学免疫检测抗原(CEA)时，同时引入磁珠(MB)，碱性磷酸酶(ALP)，表面活性剂(CTAB)和高信噪比/可再生(ZnO@rGO/CPE)等，极大地改善了MB-eElisa的检测流程和灵敏度。具体为，CTAB、碳糊电极和待测物均具备疏水特性，根据亲/疏水性吸附原理，即可有效增强待测物在碳糊电极表面的富集效率，进一步提升其传感灵敏度。

(4)本发明中的电化学酶联免疫传感器中的酶优选地为碱性磷酸酶(ALP)，该酶可以催化酶解1-萘基磷酸盐(1-NPP)为电化学活性的1-萘酚(1-NP)，构建了一个接近“零背景”信号转导体系。具体为，采用低背景电流的碳糊电极结合零背景的底物1-NPP，再引入氧化锌石墨烯纳米复合物和CTAB对酶解产物1-NP的进一步信号增敏，从而得到较高的信噪比。

附图说明

图1是ZnO@rGO/CPE传感界面构筑ALP基MB-eElisa的示意图。

图2是ZnO@rGO纳米复合物的XRD。

图3是ZnO@rGO纳米复合物的SEM。

图4是ZnO@rGO纳米复合物的XPS。

图5是ZnO@rGO纳米复合物Zn_2p XPS。

图6是ZnO@rGO/GCE(a,b,c)和ZnO@rGO/CPE(d,e,f)在不含有(a,d)和含有(b,c,e,f)1-NP的微分脉冲曲线；其中曲线(c,f)为进一步加入CTAB。

图7是6根ZnO@rGO/CPE修饰电极在1-NP中的微分脉冲图。

图8是AuNPs和Ab₂-AuNPs-ALP的紫外可见吸收光谱图。

图9是不同电极在铁氰化钾探针溶液中的循环伏安图，其中曲线(a)CPE；曲线(b)为ZnO@rGO/CPE；曲线(c)为Ab₁-MB-ZnO@rGO/CPE；曲线(d)为ALP-AuNPs-Ab₂-CEA-Ab₁-MB-ZnO@rGO/CPE。

图10是用CPE(a,b)和ZnO@rGO/CPE(c,d,e)在含有1-NPP的电解质溶液中通过此MB-eElisa法测定CEA的微分脉冲曲线；其中，(b,d)是存在CTAB，(e)为不存在CEA的条件下。

图11是CTAB对1-NP的电化学增敏机理图。

图12是MB-eElisa的检测CEA的Ab₂-AuNPs-ALP的用量优化图。

图13是MB-eElisa的检测CEA的酶解反应时间优化图。

图14是MB-eElisa的检测CEA的电解质溶液的pH优化图。

图15是MB-eElisa的检测CEA的修饰电极中ZnO@rGO加入量优化图。

图16是不同浓度CEA的微分脉冲响应曲线。

图17是不同浓度CEA相应响应信号的线性曲线图。

图18是MB-eElisa的稳定性测试图。

图19是MB-eElisa的选择性测试图；其中，(a)为CEA，(b-i)为在CEA中加入不同的干扰物：胰岛素(b)、前列腺特异抗原(c)、人血清蛋白(d)、人免疫球蛋白(e)、葡萄糖(f)、乳酸(g)、尿酸(h)、多巴胺(i)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明中电化学酶联免疫传感器MB-eElisa的构筑方法包括如下步骤：

(1)磁珠MB和捕获抗体Ab₁经过孵育反应后得到MB-Ab₁的生物共轭物。

(2)将碱性磷酸酶ALP和检测抗体Ab₂加入纳米金(AuNPs)溶液中经过孵育反应后得到Ab₂-AuNPs-ALP生物共轭物。

(3)将(1)和(2)所得生物共轭物均加入至含有抗原CEA的溶液中经过双抗体夹心免疫反应后得到MB-Ab₁-CEA-Ab₂-AuNPs-ALP生物探针。

(4)将(3)所得生物探针修饰至已制备好的氧化锌石墨烯纳米复合物修饰碳糊ZnO@rGO/CPE电极上，在室温条件下晾干备用。

(5)将(4)构筑的免疫探针电极先放置在含有1-萘基磷酸盐(1-NPP)和CTAB的电解质溶液中孵育一定时间进行酶解反应后，用微分脉冲伏安法(DPV)记录其酶解产物1-萘酚(1-NP)的电化学信号，其信号大小即可间接反映出被测物CEA的含量。

当步骤(2)中的酶为DT-心肌黄酶时，可催化亚硝基或硝基生成氨基；步骤(2)中的酶为辣根过氧化氢酶时，可催化过氧化氢还原；步骤(2)中的酶为葡萄糖氧化酶时，可催化葡萄糖氧化。

实施例1

本发明中电化学酶联免疫传感器的制备及高灵敏碱性磷酸酶标记磁珠电化学免疫检测抗原的方法，具有以下的过程和步骤：

(1)制备ZnO@rGO/CPE

基于改进的Kovtyukhova两步氧化剥离法，制备出高产率的氧化石墨烯凝胶(GO，1.0-100mg mL^-1)，取0.1-5.0mL GO超声分散于9.0mL的水中，随后加入10-80mg Zn粉和0.1-5.0mL NH₄Cl水溶液(0.2g mL^-1)，适当的转速磁力搅拌1-60min后静置，继续反应30min，然后将黑色产物用超纯水离心洗涤至少6次，最后在电烘箱中60℃干燥2-9h得到的最终产物(ZnO@rGO)。

准确称取0.05g ZnO@rGO和0.95g石墨粉在研铂中混合均匀后，加入200μL石蜡油机械研磨30min得到糊状混合物，将该混合物压入碳糊电极底部的空腔(CPE，直径3mm)，压实后电极表面在碳糊纸上打磨光滑备用(5％，ZnO@rGO/CPE)，此外，除不含ZnO@rGO纳米复合材料以外，裸CPE与ZnO@rGO/CPE制备方法类似；作为对比，ZnO@rGO修饰至玻碳电极(ZnO@rGO/GCE)同样被用于检测该体系酶解产物1-NP，GCE修饰之前先经过50nm Al₂O₃粉研磨抛光处理，随后用乙醇和二次水超声洗涤干净后备用。最后将5μL ZnO@rGO(DMF，1mg mL^-1)分散液修饰至洁净的GCE表面，在红外灯下烘干备用。

(2)制备MB-Ab₁

取1-40μL MBs(10mg mL^-1)至1.5mL PE管中，在外加磁场的协助下用PBST洗液至少清洗2次；然后加入EDC(30μL,50mg mL^-1)和NHS(30μL,50mg mL^-1)在多功能摇床上室温活化30min后，再进一步加入Ab₁(100μL,4μg mL^-1)后室温条件下隔夜孵育，多余的Ab₁在外加磁场条件下加入PBST洗涤3次移除；最后，加入BSA(100μL,1wt％)封闭MBs上未被Ab₁键合的羧基，多余的BSA用PBST洗液移除。最终得到的MB-Ab₁生物共轭物被重新分散在100μL 0.01MPBS(pH 7.4)，置于冰箱中备用(4℃)。

(3)制备Ab₂-AuNPs-ALP

首先，用0.2M K₂CO₃将1.0-2.0mL AuNPs(20nm)溶液的pH调至8.2，然后连续加入Ab₂(150μL,4μg mL^-1)和ALP(150μL,8μg mL^-1)室温孵育2h，再进一步加入BSA(200μL,1wt％)封闭AuNPs表面其他非特异性位点；最后将其混合物用冷冻高速离心机离心分离，得到的沉淀物用PBST用上述低温离心方法至少洗涤3次。最终的Ab₂-AuNPs-ALP生物共轭物被重新分散在200μL 1％BSA，置于冰箱中备用(4℃)。

(4)CEA的电化学免疫测定

将10μL CEA加入至20μL上述制备的MB-Ab₁生物共轭物中室温条件下孵育1h；在外加磁场条件下移除上层清液后，加入40μL Ab₂-AuNPs-ALP后在室温条件下再孵育1h；得到的MB-Ab₁-CEA-Ab₂-AuNPs-ALP生物探针用PBST洗涤3次后重新分散至10μL 0.01M PBS(pH7.4)中，取10μL MB-Ab₁-CEA-Ab₂-AuNPs-ALP的分散液修饰在ZnO@rGO/CPE表面上室温条件下晾干备用；将该构筑的免疫探针电极先放置在含有0.5mM 1-NPP和6μM的0.1M Tris-HCl电解质溶液中孵育15min进行酶解反应后，用微分脉冲伏安法(DPV)记录水解产物1-NP的电化学信号。

(5)实际样品的测定

实验所用的实际血清样品(健康人和癌症病人)是由华中科技大学同济医学院-协和医院提供，血清样品先在4000rpm离心5min后收集上层清液备用；用上述提出的MB-eElisa法测定血清样品之前，先将血清样品用PBST稀释100倍，其他检测流程均与上述测定标准样品CEA的一致。此外，采用商业方法-人CEA试剂盒(RAB0411-1KT,Sigma-Aldrich)进一步测定血清样品中CEA的含量，以验证本方法的准确性。

图1表明，该MB-eElisa体系采用磁珠基策略极大地简化了抗原及抗体的洗涤孵育时间；此外，采用ALP酶解反应和CTAB增敏效应极大地提升CEA的检测灵敏度。

图2表明，由ZnO和rGO的XRD的特征衍射峰可知该ZnO@rGO纳米复合物已经被成功地制备。

图3表明，ZnO@rGO纳米复合物SEM图呈现出典型的石墨烯褶皱形状，此外在其表面负载了很多棒状的ZnO纳米颗粒，这种独特的形貌结构可以为电化学传感应用提供大的比表面积和丰富的活性位点。

图4表明，XPS总谱证实了ZnO@rGO含有Zn、O、C三者的特征峰。

图5表明，XPS高分辨能谱可以进一步证实负载在rGO表面的棒状物质为ZnO纳米颗粒。

图6为ZnO@rGO/GCE和ZnO@rGO/CPE的1-NP的微分脉冲曲线，其中a和d为不含有1-NP的微分脉冲曲线，b和e是含有1-NP的微分脉冲曲线，c,f是进一步进入CTAB含有1-NP的微分脉冲曲线。与商业的玻碳修饰电极ZnO@rGO/GCE对比，该体系所构建可再生的ZnO@rGO/CPE对于这种ALP标记酶解产物1-NP的测定有更好的灵敏度和信噪比，由DPV响应信号可知，ZnO@rGO/CPE的响应电流为ZnO@rGO/GCE的12.5倍，而其背景电流仅是ZnO@rGO/GCE的0.05倍；此外，CTAB的引入可以改善ZnO@rGO/CPE的信噪比，而对ZnO@rGO/GCE造成了不利的影响。

图7表明，多根ZnO@rGO/CPE响应信号的标准偏差为0.8％，其重现性能优于商用的玻碳修饰电极。

图8表示，Ab₂-AuNPs-ALP的紫外可见吸收较AuNPs发生了红移现象，由纳米金表面等离子共振理论可知Ab₂和ALP成功地吸附在AuNPs上，即Ab₂-AuNPs-ALP生物共轭物的成功构建。

图9表示，CPE经过ZnO@rGO修饰后，其氧化还原峰电流和峰电位差都有明显地改善，说明ZnO@rGO/CPE有更好的电子转移能力；经过MB-Ab₁或ALP-AuNPs-Ab₂-CEA-Ab₁-MB修饰后，其氧化还原峰电流发生显著下降现象，且ALP-AuNPs-Ab₂-CEA-Ab₁-MB修饰后下降最为严重，这说明各种免疫生物探针的成功构建和MB-Ab₁与ALP-AuNPs-Ab₂之间发生了有效的双抗体夹心免疫反应。

图10表示，构建的该ALP标记MB-eElisa在ZnO@rGO/CPE上的灵敏度是优于CPE，在此基础上引入CTAB，ZnO@rGO/CPE的传感灵敏度有了显著地提升，此外，在相同的其他免疫反应条件下，唯独不含有CEA，可知MB-Ab₁与ALP-AuNPs-Ab₂之间免疫反应无法发生，曲线e上没有发现任何可识别的响应信号，即本方法构建的MB-eElisa对于CEA的测定接近“零背景”。

图11表示，由表面活性剂CTAB的增敏机理示意图可知，在疏水的碳糊电极表面的CTAB和疏水的1-NP酚类物质具有协同吸附和富集效应，故而产生传感信号增敏作用。

图12-15表示，由MB-eElisa的检测CEA的优化条件图可知；Ab₂-AuNPs-ALP的用量为40μL，酶解反应时间为15min，电解质溶液的pH值为8.5，修饰电极中ZnO@rGO的加入量5％。

图16-17表示，由该MB-eElisa检测CEA良好的线性关系可知，其线性范围为：0.01-6.0ng mL^-1，检出限为：4.0pg mL^-1(S/N＝3)；与现有的电化学免疫检测方法对比，该方法具有较低的检出限和较高的灵敏度。此外，该传感电极ZnO@rGO/CPE通过简单的抛光处理即可实现传感界面更新再生，再与简单操作和高通量的MB-eElisa相结合，即可对大量CEA样品实现快速和低成本的测定。

图18表示，构建的MB-eElisa传感器分别放置7天和14天后再拿来测试，其响应信号较初始状态仅仅下降了4.66％和9.68％，表明其具有很好的稳定性。

图19表示，本工作选择了人体血清中潜在的干扰物(胰岛素、前列腺特异抗原、人血清蛋白、人免疫球蛋白、葡萄糖、乳酸、尿酸、多巴胺)，即使在较高浓度干扰物存在的条件下，该MB-eElisa传感器对CEA的响应信号基本不受影响，表明其具有很好的选择性。

表1

^a Ref.为采用商业方法-人CEA试剂盒测定血清样品中CEA的含量。

表1是通过此MB-eElisa法和商业ELISA试剂盒法测定健康人和癌症病人血清样品中CEA的含量，其中，健康人(A,B)、结肠癌(C)、乳腺癌(D)、肺癌(E)、胃癌(F)、胰腺癌(G)。由表1可知，利用该MB-eElisa传感器，通过标准加入法测定健康人和癌症病人血清中CEA的含量，其加标回收率在96.4％和109.7％之间，说明该方法具有很好的准确性。此外，本方法还采用商业化的人CEA试剂盒进行相同样品的测定，其测试结果与本方法所提供的结果高度一致，进一步说明本工作提出的ALP标记的MB-eElisa传感器在实际的人体血清样品中对于CEA的测定具有好的灵敏度和准确度。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种电化学酶联免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)磁珠与捕获抗体的生物共轭物的制备：将磁珠与捕获抗体进行孵育，使所述捕获抗体与磁珠共价连接，再加入封闭蛋白，所述封闭蛋白用于封闭所述磁珠表面未被捕获抗体键合的基团，得到磁珠与捕获抗体的生物共轭物；

(2)纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物的制备：将检测抗体和至少一种酶加入到纳米金溶液中，使检测抗体和酶共价连接到所述纳米金表面，再加入封闭蛋白，所述封闭蛋白用于封闭所述纳米金表面裸露的位点，得到纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物；所述酶为碱性磷酸酶；

(3)电化学酶联免疫探针的制备：将抗原加入到步骤(1)得到的磁珠与捕获抗体的生物共轭物中进行孵育，所述抗原与所述捕获抗体以及与检测抗体能特异性地结合；在外加磁场条件下移除上层清液后，再加入步骤(2)得到的纳米金、检测抗体和酶的生物共轭物进行孵育，经过双抗体夹心反应后，即得到电化学酶联免疫探针；

(4)将所述的电化学酶联免疫探针的分散液滴涂在基底电极表面，所述基底电极为碳糊电极，待所述分散液晾干后，使所述电化学酶联免疫探针修饰在基底电极表面，即得到电化学酶联免疫传感器。

2.如权利要求1所述的电化学酶联免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述的封闭蛋白为牛血清蛋白。

3.如权利要求1所述的电化学酶联免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述基底电极为氧化锌石墨烯纳米复合物修饰的碳糊电极。

4.如权利要求1-3任一所述方法制备得到的电化学酶联免疫传感器。

5.如权利要求4所述电化学酶联免疫传感器用于检测抗原的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述电化学酶联免疫传感器置于含有底物的电解质中孵育，使所述底物与传感器表面的探针中的酶发生酶解反应，检测酶解产物的电化学信号，并计算得到所述抗原的浓度。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述电解质中含有表面活性剂。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗原为癌胚抗原、甲胎蛋白或前列腺特异蛋白；所述底物为苯基磷酸盐。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述底物为1-萘基磷酸盐或苯二基磷酸盐。

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