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CN110376092A - 一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法 - Google Patents

一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法 Download PDF

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CN110376092A
CN110376092A CN201910800712.4A CN201910800712A CN110376092A CN 110376092 A CN110376092 A CN 110376092A CN 201910800712 A CN201910800712 A CN 201910800712A CN 110376092 A CN110376092 A CN 110376092A
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extract
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张丹
吴建明
雷静
庄元春
陈斯玮
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Southwest Medical University
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Abstract

本发明公开了一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，具体涉及保健食品成分效果研究领域，包括复方山楂水提物与醇提物的制备、对照品及供试品溶液的制备、干膏率计算、有效成分含量测定、实验对象样品的配制、急性毒性实验、小肠运动实验、大鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率的测定、大鼠胃蛋白酶的测定和数据统计分析。本发明建立了复方山楂中绿原酸和橙皮苷的含量测定方法，并对比了复方山楂水提物和醇提物的有效成分含量和促消化效果，采用高效液相色谱法测定复方山楂水提物和醇提物中绿原酸和橙皮苷的含量，并进行综合评分，复方山楂水提物有效成分含量和促消化效果优于醇提物。

Description

一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法
技术领域
本发明涉及保健食品成分效果研究技术领域，更具体地说，本发明涉及一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法。
背景技术
消化不良是指一组慢性或复发性上腹疼痛或不适的症状，是临床上常见的功能性胃肠疾病，在中医理论中属于“胃脘痛”、“积滞”的范畴，辨证分可为脾虚气滞证、肝胃不和证和脾胃湿热证等。有文献报道消化不良的发病基础在于脾虚，肝郁为其诱因，而其临床症状产生的原因则在于胃气不降，主要与胃肠道蠕动、胃酸分泌有关，治疗上以健脾、疏肝、和胃为其治则。随着人们的生活水平不断提高，暴饮暴食、日常作息不规律都会造成消化不良。长期消化不良对人们的生理和心理健康都有不可忽视的影响，因此有必要对促消化的药物或功能性食品进行研究，以提高人类健康水平和生活质量。随着人们对养生与保健的日益重视，保健食品的种类和产量日趋增长，因此，开发预防消化不良的保健食品具有十分现实的意。
目前中医药治疗消化不良的主要方剂有柴胡疏肝散、香砂六君子汤、逍遥散、保和丸等。其中《丹溪心法》记载的经典名方保和丸在治疗消化不良、饮食积滞方面具有独特的优势，临床疗效显著。保和丸由山楂、神曲、半夏、茯苓、陈皮、连翅、莱菔子共七味药组成，其中山楂和陈皮是保和丸中的主要成分，能增加胃肠蠕动，排除消化道中的积气。山楂具有消食健胃、化浊降脂等功效，能收缩胃肠道平滑肌，增强消化道酶的活性。陈皮中的挥发油，具有行气健脾，芳香化湿的作用。
不同溶剂的性质各异，所以同一物质经不同溶剂提取后的成分和含量也存在明显差别，水和乙醇作为最常用的溶剂，二者的极性存在明显差别，因此在提取工艺中对提取物的成分和含量有较大影响。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，通过建立了复方山楂中绿原酸和橙皮苷的含量测定方法，并对比了复方山楂水提物和醇提物的有效成分含量和促消化效果，复方山楂水提物有效成分含量和促消化效果优于醇提物。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其中测定的步骤：
S1、复方山楂水提物与醇提物的制备，具体包括：
S1.1、水提物的制备：称取陈皮饮片，用水蒸气蒸馏提取法提取挥发油，药渣再和山楂混匀加10倍量水回流提取90分钟，提取2次，合并三次药液，减压浓缩后定容；
S1.2、醇提物的制备：称取陈皮饮片，采用水蒸气蒸馏提取法提取挥发油，药渣再和山楂加10倍量70％乙醇回流提取90分钟，提取2次，合并三次药液，离心得上清液，减压浓缩后定容；
S2、对照品及供试品溶液的制备：分别精密称取一定量的绿原酸对照品和橙皮苷对照品置同一25ml容量瓶中，用甲醇溶解制成含绿原酸0.1207mg/ml，橙皮苷0.1017mg/ml的溶液作为绿原酸和橙皮苷混合对照品溶液，取复方山楂水提物和醇提物定容后的溶液作为供试品溶液，对照品及供试品均用0.22μm微孔滤膜过滤；
S3、干膏率计算：分别精密吸取提取液10ml，置于蒸发皿中水浴蒸干，转移至105℃烘箱中干燥3h，取出至干燥器中冷却后精密称定重量W，计算干膏率：
S4、有效成分含量测定：在设定色谱条件分别对水提物和醇提物供试品进样6μl测定峰面积，根据线性回归方程计算复方山楂水提物和醇提物中绿原酸和橙皮苷的含量；
S5、实验对象样品的配制，具体包括：
S5.1、阳性药物：将健胃消食片用研钵研磨成细粉，用水制成0.133g/ml的混悬液；
S5.2、模型药物：去掉洛哌丁胺胶囊的胶囊壳，其粉末用水溶解，造模剂量为5mg/kg；
S5.3、墨汁：称取阿拉伯胶10g，加水80ml，煮沸至溶液透明，称取活性炭粉末10g加至上述溶液中煮沸3次，室温冷却后定容至100ml，置于4℃冰箱中保存，临用前摇匀。
S5.4、复方山楂水提取物和醇提物溶液配制：将S1.1项定容后的提取物减压浓缩至含生药量1.35g/ml，将提取所得的挥发油加至浓缩后的药液中，同时向药液中加入相当于药液总体积2％的吐温80，混合均匀置于4℃冰箱中保存，临用前用含2％吐温80的水溶液稀释至给药浓度；
S6、急性毒性实验：分别取昆明小鼠40只、SD大鼠40只，雌雄各半，小鼠、大鼠均按性别随机分为2组，每组雌雄各10只，适应性喂养3天后开始急性毒性实验，小鼠灌胃给予108g/kg(按生药量计)的水提物和醇提物，大鼠灌胃给予45g/kg的水提物和醇提物，所有动物给药后观察一周，每天定时称其体重并观察动物状态；
S7、小肠运动实验：取雄性小鼠100只，按体重分为10个组，分别为空白组、模型组、阳性组、吐温组、水提物低中高剂量组及醇提物低中高剂量组，水提物和醇提物低中高剂量分别为(按生药量计)2.7g/kg、13.5g/kg、27g/kg，连续灌胃15天，每天定时灌胃一次，空白组和模型组给予蒸馏水，吐温组给予2％吐温，实验结束当天，给药组给予一次药物，空白及模型组给予一次蒸馏水，吐温组给予一次吐温，三十分钟后，给药组、模型组和吐温组给予洛哌丁胺造模，空白组给予同体积蒸馏水，三十分钟后，每组均给予墨汁，25分钟后处死动物，迅速打开腹腔分离肠系膜，剪取自幽门至回盲部的小肠，置于白纸上，分别测量小肠全长和从幽门到墨汁前沿的距离，计算墨汁推进率和墨汁推进率转换值；
推进率转换值：P：小鼠小肠推进率；
S8、大鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率的测定：取雄性SD大鼠，分为空白组、阳性组、吐温组、水提物低中高三个剂量组及醇提物低中高三个剂量组，每组10只，水提物和醇提物低中高剂量分别为0.95g/kg、1.89g/kg、9.45g/kg(按生药量计)，空白组给予蒸馏水，阳性组给予2g/kg的健胃消食片，吐温组给予含2％吐温80的蒸馏水，所有动物连续灌胃30d，每天定时灌胃一次，每周记录两次大鼠体重和食物摄取量，并根据体重变化调整给药量，实验结束时计算体重增重、摄食量和食物利用率；
食物利用率＝体重增加量/摄食量×100％；
S9、大鼠胃蛋白酶的测定，具体包括：
S9.1、蛋白管的制备：用毛细玻璃管吸满新鲜鸡蛋清，然后在热水中使鸡蛋清凝固，即得蛋白管；
S9.2、胃蛋白酶活性及排出量的测定：按S8项方法分组及给药，实验结束时用戊巴比妥钠麻醉大鼠，结扎大鼠幽门收集3h胃液并测定其体积，将收集的胃液按每1ml加入15ml盐酸置于离心管中混匀，加入新鲜制备好的蛋白管2根，密封，37℃恒温孵育24h后取出，用游标卡尺测量每根蛋白管两端透明部分的长度，求出四端的平均值，根据胃蛋白酶活性单位公式计算胃蛋白酶活性，根据胃蛋白酶排出量公式计算胃蛋白酶排出量；
胃蛋白酶活性单位(U·ml-1)＝四端蛋白管透明部分长度均值2×16
胃蛋白酶排出量(U·h-1)＝胃蛋白酶活性×胃液量/h；
S10、数据统计分析:实验所得数据以均数±标准差表示，数据采用Graphpad prism 5.0软件统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以p<0.05为具有统计学意义。
在一个优选地实施方式中，所述有效成分含量测定步骤中的设定色谱条件为色谱柱SHIMADZU Shim-pack GIST C18(250×4.6mm，5μm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸水；洗脱条件：0-25min：10％A～17％A；25-26min：17％～20％A；26-50min：20％～25％A；流速1ml/min，柱温30℃，检测波长：橙皮苷283nm，绿原酸327nm。
在一个优选地实施方式中，所述急性毒性实验步骤中所有动物给药前禁食12h，正常饮水，小鼠灌胃分2次给药，每次间隔6h，大鼠灌胃分3次给药，每次间隔4h。
在一个优选地实施方式中，所述小肠运动实验步骤中实验结束前动物禁食不禁水16h。
在一个优选地实施方式中，所述大鼠胃蛋白酶的测定实验步骤中实验结束时将所有大鼠禁食不禁水24h。
在一个优选地实施方式中所述蛋白管的制备步骤中，毛细玻璃管设置为内径1mm，长100mm，临用前将蛋白管制成40mm的长度。
本发明的技术效果和优点：
本发明通过建立了复方山楂中绿原酸和橙皮苷的含量测定方法，并对比了复方山楂水提物和醇提物的有效成分含量和促消化效果，采用高效液相色谱法测定复方山楂水提物和醇提物中绿原酸和橙皮苷的含量，并进行综合评分，通过保健食品功效学研究中的急性毒性、小鼠小肠运动、大鼠摄食量、食物利用率、胃蛋白酶测定等实验对比复方山楂水提物和醇提物的促消化效果，结果表明，复方山楂水提物有效成分含量综合评分(93.78)高于醇提物(80.04)，水提物和醇提物对大鼠、小鼠均无急性毒性，均能显著增加大鼠摄食量(p<0.05)；水提物的中、高剂量组及醇提物的高剂量组小鼠小肠推进率提高了26.88％、28.00％、26.55％(p<0.05，p<0.01，p<0.05)，大鼠胃蛋白酶排出量增加了38.59％、53.29％、36.64％(p<0.05，p<0.01，p<0.05)，醇提物的其他剂量组小肠推进率和大鼠胃蛋白酶排出量无显著性差异(p≥0.05)；水提物和醇提物的中、高剂量组大鼠胃蛋白酶活性增强了75.96％、125.07％、70.38％、109.38％(p<0.05，p<0.01，p<0.05，p<0.01)，复方山楂水提物有效成分含量和促消化效果优于醇提物。
附图说明
图1为本发明的复方山楂水提物和醇提物的HPLC图谱。
图2为本发明的急性毒性实验中复方山楂水提物和醇提物对小鼠(A)和大鼠(B)体质量的影响图。
图3为本发明的复方山楂水提物和醇提物对小鼠小肠运动功能的影响图。
图4为本发明的复方山楂水提物和醇提物对大鼠胃蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量的影响图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其中测定的步骤：
S1、复方山楂水提物与醇提物的制备，具体包括：
S1.1、水提物的制备：复方山楂水提物与醇提物的制备水提物的制备：称取陈皮饮片，用水蒸气蒸馏提取法提取挥发油，药渣再和山楂混匀加10倍量水回流提取90分钟，提取2次，合并三次药液，减压浓缩后定容；
S1.2、醇提物的制备：醇提物的制备：称取陈皮饮片，采用水蒸气蒸馏提取法提取挥发油，药渣再和山楂加10倍量70％乙醇回流提取90分钟，提取2次，合并三次药液，离心得上清液，减压浓缩后定容；
S2、对照品及供试品溶液的制备：分别精密称取一定量的绿原酸对照品和橙皮苷对照品置同一25ml容量瓶中，用甲醇溶解制成含绿原酸0.1207mg/ml，橙皮苷0.1017mg/ml的溶液作为绿原酸和橙皮苷混合对照品溶液，取复方山楂水提物和醇提物定容后的溶液作为供试品溶液，对照品及供试品均用0.22μm微孔滤膜过滤；
S3、干膏率计算：分别精密吸取提取液10ml，置于蒸发皿中水浴蒸干，转移至105℃烘箱中干燥3h，取出至干燥器中冷却后精密称定重量W，计算干膏率：
S4、有效成分含量测定：在设定色谱条件分别对水提物和醇提物供试品进样6μl测定峰面积(分析结果见图1)，对照品和供试品HPLC图谱达到基线完全分离，各色谱峰未出现明显重叠或拖尾，分离度良好(A、B绿原酸和橙皮苷混合对照品的高效液相色谱图；C、D复方山楂水提物供试品的高效液相色谱图；E、F复方山楂醇提物供试品的高效液相色谱图；1：绿原酸，2：橙皮苷；A、C、E为326nm，B、D、F为283nm)，根据线性回归方程计算复方山楂水提物和醇提物中绿原酸和橙皮苷的含量，设定色谱条件为色谱柱SHIMADZU Shim-pack GIST C18(250×4.6mm，5μm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸水；洗脱条件：0-25min：10％A～17％A；25-26min：17％～20％A；26-50min：20％～25％A；流速1ml/min，柱温30℃，检测波长：橙皮苷283nm，绿原酸327nm；
按S3项方法测定干膏率和按S4项含量测定方法分别对复方山楂水提物和醇提物中绿原酸和橙皮苷进行含量测定，所得结果见表1：
表1复方山楂水提物和醇提物中绿原酸和橙皮苷的含量测定
结果表明，水提物中绿原酸和橙皮苷含量分别为0.039％和1.537％，干膏率为48.48％；醇提物中绿原酸和橙皮苷含量分别为0.037％和2.048％，干膏率为21.44％；对水提物和醇提物的绿原酸、橙皮苷含量和干膏率进行综合评分，结果表明水提物综合评分(93.78)比醇提物(80.04)高17.2％。
S5、实验对象样品的配制，具体包括：
S5.1、阳性药物：将健胃消食片用研钵研磨成细粉，用水制成0.133g/ml的混悬液；
S5.2、模型药物：去掉洛哌丁胺胶囊的胶囊壳，其粉末用水溶解，造模剂量为5mg/kg；
S5.3、墨汁：称取阿拉伯胶10g，加水80ml，煮沸至溶液透明，称取活性炭粉末10g加至上述溶液中煮沸3次，室温冷却后定容至100ml，置于4℃冰箱中保存，临用前摇匀。
S5.4、复方山楂水提取物和醇提物溶液配制：将S1.1项定容后的提取物减压浓缩至含生药量1.35g/ml，将提取所得的挥发油加至浓缩后的药液中，同时向药液中加入相当于药液总体积2％的吐温80，混合均匀置于4℃冰箱中保存，临用前用含2％吐温80的水溶液稀释至给药浓度；
S6、急性毒性实验：分别取昆明小鼠40只、SD大鼠40只，雌雄各半，小鼠、大鼠均按性别随机分为2组，每组雌雄各10只，所有动物给药前禁食12h，正常饮水，适应性喂养3天后开始急性毒性实验，小鼠灌胃给予108g/kg(按生药量计)的水提物和醇提物，小鼠灌胃分2次给药，每次间隔6h，大鼠灌胃给予45g/kg的水提物和醇提物，大鼠灌胃分3次给药，每次间隔4h，所有动物给药后观察一周，每天定时称其体重并观察动物状态(急性毒性实验结果见图2，其中n＝20)；
复方山楂水提物和醇提物的急性毒性实验结果显示：给药后7天内小鼠、大鼠均未见中毒表现，对小鼠体质量增长无明显影响，动物的行为及外观均未见异常，观察期内无小鼠、大鼠死亡，说明复方山楂水提物和醇提物对小鼠最大耐受量>108g/kg，对大鼠MTD>45g/kg，根据急性毒性剂量分级标准，该样品的水提物和醇提物属无毒级；
S7、小肠运动实验：取雄性小鼠100只，按体重分为10个组，分别为空白组、模型组、阳性组、吐温组、水提物低中高剂量组及醇提物低中高剂量组，水提物和醇提物低中高剂量分别为(按生药量计)2.7g/kg、13.5g/kg、27g/kg，连续灌胃15天，每天定时灌胃一次，空白组和模型组给予蒸馏水，吐温组给予2％吐温，实验结束前动物禁食不禁水16h，实验结束当天，给药组给予一次药物，空白及模型组给予一次蒸馏水，吐温组给予一次吐温，三十分钟后，给药组、模型组和吐温组给予洛哌丁胺造模，空白组给予同体积蒸馏水，三十分钟后，每组均给予墨汁，25分钟后处死动物，迅速打开腹腔分离肠系膜，剪取自幽门至回盲部的小肠，置于白纸上，分别测量小肠全长和从幽门到墨汁前沿的距离，计算墨汁推进率和墨汁推进率转换值；
推进率转换值：P：小鼠小肠推进率；
消化不良与胃排空和肠蠕动有关，因此可通过测定小肠运动功能评价消化功能状态，洛哌丁胺为临床常用止泻药，过量服用则可导致便秘，可用于构建消化不良模型，为对比复方山楂水提物和醇提物对小鼠小肠运动功能的影响，对小鼠连续灌胃给药15d后，用洛哌丁胺构建消化不良模型，通过测定墨汁推进率评价复方山楂水提物和醇提物的促消化效果(结果如图3，其中###表示与空白组比较p<0.001；*表示与模型组比较p<0.05；**表示与模型组比较p<0.01)，与空白组(59.27±5.09)％相比，模型组小肠推进率(39.25±5.92)％降低了33.78％，具有统计学意义(p<0.001)，表明本实验的消化不良模型构建成功；与模型组相比，吐温组(40.82±4.76)％未见明显差异(p≥0.05)，阳性组(56.55±5.53)％、复方山楂水提物的中剂量组(49.8±3.88)％、高剂量组(50.24±8.19)％显著提高小肠推进率(p<0.05)，相对于模型组分别提高了44.08％、26.88％、28.00％，而醇提物仅在高剂量(49.67±4.19)％时显著提高小肠推进率(p<0.05)，相对于模型组提高了26.55％，且水提物中剂量组与醇提物中剂量组相比具有统计学意义(p<0.05)；
小肠推进率经转换后，与空白组(0.88±0.05)相比，模型组(0.68±0.06)小肠转换值降低了22.72％，具有统计学意义(p<0.001)，显示本实验便秘模型造模成功；与模型组对比，吐温组(0.69±0.05)小肠转换值无明显差异(p≥0.05)，阳性组(0.85±0.06)、复方山楂水提物中剂量组(0.78±0.04)、水提物高剂量组(0.80±0.08)、醇提物高剂量组(0.82±0.07)与模型组有统计学差异(p<0.05)，醇提物中剂量组的小肠推进率(43.88±5.10)％和小肠推进转换值(0.75±0.07)均无统计学差异(p≥0.05)，表明复方山楂水提物促进小肠运动的效果优于醇提物；
S8、大鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率的测定：取雄性SD大鼠，分为空白组、阳性组、吐温组、水提物低中高三个剂量组及醇提物低中高三个剂量组，每组10只，水提物和醇提物低中高剂量分别为0.95g/kg、1.89g/kg、9.45g/kg(按生药量计)，空白组给予蒸馏水，阳性组给予2g/kg的健胃消食片，吐温组给予含2％吐温80的蒸馏水，所有动物连续灌胃30d，每天定时灌胃一次，每周记录两次大鼠体重和食物摄取量，并根据体重变化调整给药量，实验结束时计算体重增重、摄食量和食物利用率；
食物利用率＝体重增加量/摄食量×100％；
胃排空时间延长是消化不良的又一典型症状，消化不良导致食欲减退、摄食量明显减少，由此导致体重减轻、食物利用率下降；反之，消化功能越好则摄食量、体重增重越大、食物利用率越高，连续灌胃给予大鼠复方山楂水提物或醇提物30天，通过测定摄食量、体重增重、食物利用率评价复方山楂水提物和醇提物的促消化效果(结果如表5，其中n＝10)，阳性组、复方山楂水提物和醇提物对大鼠体重增重和食物利用率均无明显影响(p≥0.05)，但均能显著增加摄食量(p<0.05)，与空白组相比，吐温组摄食量无显著变化(p≥0.05)，阳性组摄食量增加了10.23％(p<0.05)，水提物低、中、高剂量组摄食量分别增加了9.53％、11.93％、12.54％，醇提物低、中、高剂量组摄食量分别增加了10.22％、13.4％、14.97％，水提物与醇提物相同剂量组之间相比均无统计学差异(p≥0.05)，表明水提物与醇提物增加摄食量的效果相当；
注：*表示与空白组比较p<0.05；**表示与空白组比较p<0.01；
S9、大鼠胃蛋白酶的测定，具体包括：
S9.1、蛋白管的制备：内径1mm，长100mm的毛细玻璃管吸满新鲜鸡蛋清，然后在热水中使鸡蛋清凝固，即得蛋白管，放入4℃冰箱保存，临用前制成40mm的长度；
S9.2、胃蛋白酶活性及排出量的测定：按S8项方法分组及给药，实验结束时用戊巴比妥钠麻醉大鼠，结扎大鼠幽门收集3h胃液并测定其体积，将收集的胃液按每1ml加入15ml盐酸置于离心管中混匀，加入新鲜制备好的蛋白管2根，密封，37℃恒温孵育24h后取出，用游标卡尺测量每根蛋白管两端透明部分的长度，求出四端的平均值，根据胃蛋白酶活性单位公式计算胃蛋白酶活性，根据胃蛋白酶排出量公式计算胃蛋白酶排出量；
胃蛋白酶活性单位(U·ml-1)＝四端蛋白管透明部分长度均值2×16
胃蛋白酶排出量(U·h-1)＝胃蛋白酶活性×胃液量/h；
通过测定胃蛋白酶活性和胃蛋白酶排出量来对比复方山楂水提物和醇提物的促消化效果(结果如图4所示，其中n＝10，*表示与空白组比较p<0.05；**表示与空白组比较p<0.01)：与空白组的胃蛋白酶活性(167.2±51.62)U·ml-1和胃蛋白酶排出量(76.97±47.66)U·h-1相比，吐温组的胃蛋白酶活性(157.18±41.26)U·ml-1和胃蛋白酶排出量(71.63±39.93)U·h-1无明显影响(p≥0.05)，阳性组(311.91±78.02)U·ml-1、复方山楂水提物和醇提物的中、高剂量(294.21±48.07、376.31±76.76、284.87±45.18、350.08±64.89)U·ml-1胃蛋白酶活性显著增强(p<0.05)，胃蛋白酶活性分别增强了86.55％、75.96％、125.07％、70.38％、109.38％；阳性组(106.48±42.17)U·h-1、水提物中、高剂量组和醇提物高剂量组(106.67±35.19、117.99±42.08、105.17±45.09)U·h-1胃蛋白酶排出量显著增加(p<0.05)，胃蛋白酶排出量分别增加了38.34％、38.59％、53.29％、36.64％，表明复方山楂水提物与醇提物均能显著增强胃蛋白酶活性，二者效果相当；水提物增加胃蛋白酶排出量的最低有效剂量为本实验的中等给药剂量，而醇提物的最低有效剂量为其高剂量，因此水提物增加胃蛋白酶排出量的效果优于醇提物；
S10、数据统计分析:实验所得数据以均数±标准差表示，数据采用Graphpad prism 5.0软件统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以p<0.05为具有统计学意义。
综上所述得到如下结论：
含量测定结果及综合评分表明，水提物中绿原酸和橙皮苷含量分别为0.039％和1.537％，干膏率为48.48％；醇提物中绿原酸和橙皮苷含量分别为0.037％和2.048％，干膏率为21.44％；绿原酸和橙皮苷在水提物和醇提物中的含量高低不同可能是由于水与乙醇的极性不同，由有效成分含量和浸膏率的综合评分得出复方山楂水提物得分(93.78)高于醇提物(80.04)；
急性毒性实验表明复方山楂水提物和醇提物均为无毒级别，对小鼠、大鼠生长无影响，应用洛哌丁胺能够成功构建小鼠消化不良模型(p<0.001)，复方山楂水提物改善小鼠胃肠运动功能的效果优于醇提物(p<0.05)，通过对大鼠摄食量、胃液分泌量和胃蛋白酶活性的测定，结果表明：低、中、高剂量的复方山楂水提物和醇提物均能显著增加大鼠摄食量(p<0.05，p<0.01，p<0.01，p<0.05，p<0.01，p<0.01)，且二者效果相当；中、高剂量的水提物和醇提物显著增加胃蛋白酶活性(p<0.05，p<0.01)，水提物增加胃蛋白酶排出量的最低有效剂量低于醇提物，因此，综合而言，复方山楂水提物促消化效果优于醇提物；
复方山楂制剂因其促消化功能明确、无毒副作用的特点，在临床及生活中应用广泛，通过对比复方山楂水提和醇提两种提取物的有效成分含量和促消化效果，以期为相关新型产品开发提供更优的提取方法和药效学依据。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其特征在于：其中测定的步骤：
S1、复方山楂水提物与醇提物的制备，具体包括：
S1.1、水提物的制备：称取陈皮饮片，用水蒸气蒸馏提取法提取挥发油，药渣再和山楂混匀加10倍量水回流提取90分钟，提取2次，合并三次药液，减压浓缩后定容；
S1.2、醇提物的制备：称取陈皮饮片，采用水蒸气蒸馏提取法提取挥发油，药渣再和山楂加10倍量70％乙醇回流提取90分钟，提取2次，合并三次药液，离心得上清液，减压浓缩后定容；
S2、对照品及供试品溶液的制备：分别精密称取一定量的绿原酸对照品和橙皮苷对照品置同一25ml容量瓶中，用甲醇溶解制成含绿原酸0.1207mg/ml，橙皮苷0.1017mg/ml的溶液作为绿原酸和橙皮苷混合对照品溶液，取复方山楂水提物和醇提物定容后的溶液作为供试品溶液，对照品及供试品均用0.22μm微孔滤膜过滤；
S3、干膏率计算：分别精密吸取提取液10ml，置于蒸发皿中水浴蒸干，转移至105℃烘箱中干燥3h，取出至干燥器中冷却后精密称定重量W，计算干膏率：
S4、有效成分含量测定：在设定色谱条件分别对水提物和醇提物供试品进样6μl测定峰面积，根据线性回归方程计算复方山楂水提物和醇提物中绿原酸和橙皮苷的含量；
S5、实验对象样品的配制，具体包括：
S5.1、阳性药物：将健胃消食片用研钵研磨成细粉，用水制成0.133g/ml的混悬液；
S5.2、模型药物：去掉洛哌丁胺胶囊的胶囊壳，其粉末用水溶解，造模剂量为5mg/kg；
S5.3、墨汁：称取阿拉伯胶10g，加水80ml，煮沸至溶液透明，称取活性炭粉末10g加至上述溶液中煮沸3次，室温冷却后定容至100ml，置于4℃冰箱中保存，临用前摇匀；
S5.4、复方山楂水提取物和醇提物溶液配制：将S1.1项定容后的提取物减压浓缩至含生药量1.35g/ml，将提取所得的挥发油加至浓缩后的药液中，同时向药液中加入相当于药液总体积2％的吐温80，混合均匀置于4℃冰箱中保存，临用前用含2％吐温80的水溶液稀释至给药浓度；
S6、急性毒性实验：分别取昆明小鼠40只、SD大鼠40只，雌雄各半，小鼠、大鼠均按性别随机分为2组，每组雌雄各10只，适应性喂养3天后开始急性毒性实验，小鼠灌胃给予108g/kg(按生药量计)的水提物和醇提物，大鼠灌胃给予45g/kg的水提物和醇提物，所有动物给药后观察一周，每天定时称其体重并观察动物状态；
S7、小肠运动实验：取雄性小鼠100只，按体重分为10个组，分别为空白组、模型组、阳性组、吐温组、水提物低中高剂量组及醇提物低中高剂量组，水提物和醇提物低中高剂量分别为(按生药量计)2.7g/kg、13.5g/kg、27g/kg，连续灌胃15天，每天定时灌胃一次，空白组和模型组给予蒸馏水，吐温组给予2％吐温，实验结束当天，给药组给予一次药物，空白及模型组给予一次蒸馏水，吐温组给予一次吐温，三十分钟后，给药组、模型组和吐温组给予洛哌丁胺造模，空白组给予同体积蒸馏水，三十分钟后，每组均给予墨汁，25分钟后处死动物，迅速打开腹腔分离肠系膜，剪取自幽门至回盲部的小肠，置于白纸上，分别测量小肠全长和从幽门到墨汁前沿的距离，计算墨汁推进率和墨汁推进率转换值；
推进率转换值：P：小鼠小肠推进率；
S8、大鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率的测定：取雄性SD大鼠，分为空白组、阳性组、吐温组、水提物低中高三个剂量组及醇提物低中高三个剂量组，每组10只，水提物和醇提物低中高剂量分别为0.95g/kg、1.89g/kg、9.45g/kg(按生药量计)，空白组给予蒸馏水，阳性组给予2g/kg的健胃消食片，吐温组给予含2％吐温80的蒸馏水，所有动物连续灌胃30d，每天定时灌胃一次，每周记录两次大鼠体重和食物摄取量，并根据体重变化调整给药量，实验结束时计算体重增重、摄食量和食物利用率；
食物利用率＝体重增加量/摄食量×100％；
S9、大鼠胃蛋白酶的测定，具体包括：
S9.1、蛋白管的制备：用毛细玻璃管吸满新鲜鸡蛋清，然后在热水中使鸡蛋清凝固，即得蛋白管；
S9.2、胃蛋白酶活性及排出量的测定：按S8项方法分组及给药，实验结束时用戊巴比妥钠麻醉大鼠，结扎大鼠幽门收集3h胃液并测定其体积，将收集的胃液按每1ml加入15ml盐酸置于离心管中混匀，加入新鲜制备好的蛋白管2根，密封，37℃恒温孵育24h后取出，用游标卡尺测量每根蛋白管两端透明部分的长度，求出四端的平均值，根据胃蛋白酶活性单位公式计算胃蛋白酶活性，根据胃蛋白酶排出量公式计算胃蛋白酶排出量；
胃蛋白酶活性单位(U·ml-1)＝四端蛋白管透明部分长度均值2×16
胃蛋白酶排出量(U·h-1)＝胃蛋白酶活性×胃液量/h；
S10、数据统计分析:实验所得数据以均数±标准差表示，数据采用Graphpadprism 5.0软件统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以p<0.05为具有统计学意义。
2.根据权利要求1所述的一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其特征在于：所述有效成分含量测定步骤中的设定色谱条件为色谱柱SHIMADZU Shim-packGIST C18(250×4.6mm，5μm)；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％磷酸水；洗脱条件：0-25min：10％A～17％A；25-26min：17％～20％A；26-50min：20％～25％A；流速1ml/min，柱温30℃，检测波长：橙皮苷283nm，绿原酸327nm。
3.根据权利要求1所述的一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其特征在于：所述急性毒性实验步骤中所有动物给药前禁食12h，正常饮水，小鼠灌胃分2次给药，每次间隔6h，大鼠灌胃分3次给药，每次间隔4h。
4.根据权利要求1所述的一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其特征在于：所述小肠运动实验步骤中实验结束前动物禁食不禁水16h。
5.根据权利要求1所述的一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其特征在于：所述大鼠胃蛋白酶的测定实验步骤中实验结束时将所有大鼠禁食不禁水24h。
6.根据权利要求1所述的一种复方山楂中绿原酸和橙皮苷含量测定及综合评价方法，其特征在于：所述蛋白管的制备步骤中，毛细玻璃管设置为内径1mm，长100mm，临用前将蛋白管制成40mm的长度。
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